（生物化学与分子生物学专业论文）胶陀螺多糖的提取纯化及结构研究.pdf

中文摘要 从胶陀螺( b u l g a r i ai n q u i n a n s ) 中分别以7 5 乙醇回流、冷水、 热水浸提得到三个粗糖级分b pi 、b p l i 、b p i i i ，b p l l i 经乙醇分级后得 到三个级分b p i l a 、b p l u b 、b p i i i c ，其中b p i i i b 冻融除杂后经s e p h a r o s e c l 一4 b 柱层析，d e a e s e p h a d e xa 一2 5 柱层析和醋酸纤维素薄膜电泳检 验，b p i i i b 为单一狭窄对称峰且电泳呈单一谱带。纯度鉴定表明b p i i i b 在分子量大小和极性上都较为均一。 组分分析表明b p i i l b 的单糖组成为g l c 、m a n 、g a l ，摩尔比为 3 7 3 ：1 o o ：0 7 6 。 b p i i l b 的结构分析采用了部分酸水解，碘反应，高碘酸氧化，s m j t h 降解，g c 分析，甲基化分析等方法，甲基化产物经永解、还原、乙 酰化后用g c - m s 联机分析。 ( 分析结果表明：b p i i i b 多糖结构分枝少，平均每8 个单糖残基中 有l 、个分枝。( 1 6 ) g l c ，( 1 6 ) m a n 构成主链的核心部分，在0 3 处有分枝。支链和主链的边缘由较多的不可氧化( 1 3 ) g 1 c ，( 1 3 ) m a n 和较少的可氧化( 1 6 ) g a l 和( 1 6 ) 6 1 c ，( 1 6 ) m a n 构成。 分枝点糖残基有( 1 3 ，6 ) g l c 和( 1 3 ，6 ) m a n ，其中大多数为( 1 3 ， 6 ) g l c 。上 关键词l 胶陀螺多糖分气纯恢结构研瞅 a b s t r a c t t h r e ek i n d so fc r u d ep o l y s a c c h a r i d e sb pi ，b pi i ，b p mw e r e e x t r a c t e df r o mb u l g a r i ai n q u i n a n sb y7 5 e t h a n o l ，c o o lw a t e r , b o i l i n g w a t e rr e s p e c t i v e l y a f t e re t h a n o lg r a d i n g ，t h ec r u d ep o l y s a c c h a r i d eb p1 1 w a sd i v i d e di n t ot h r e ec o m p o n e n t sb p i i i 文b p i i i ba n db p i i i c t h e nt h e i m p u r i t yi nb p i i i bw e r ee l i m i n a t e db yf r e e z i n ga n dt h a w i n gr e p e a t e d l y t e s t e d b ys e p h a r o s e c l 一4 bc h r o m a t o g r a m ，d e a e - s e p h a d e x a - 2 5 c h r o m a t o g r a m a n d e l e c 仃o p h o r e s i s ，b p1 i i bw e r e p r o v e d t ob e h o m o g e n e o u sp o l y s a c c h a r i d eo nm o l e c u l a rw e i g h ta n dp o l a r i 够a sw e l l g c a n a l y s i ss h o w e d t h a tb p bw e r em a d e u p o fo l c m a na n dg a l w h i c hm o lr a t i ow e r e3 7 3 ：1 0 0 ：0 7 6 p a r t i a lh y d r o l y s i sw i t ha c i d ，p e r i o d a t eo x i d a t i o n , s m i t hd e g r a d a t i o n , i r ，a n dm e t h y l a t i o nw e r eu s e do i lt h es t r u c t u r ea n a l y s i so fb p h i b a f t e r a c e t y l a t i o n ，t h em e t h y l a t e dp r o d u c t i o nw e l ea n a l y z e db yg c m s t h er e s u l t sr e v e a l e dt h a tb p i i i bw e r eak i n do f l e s sb r a n c h e ds t r u c t u r e o n a v e r a g e ，t h e r ei s ib r a n c hi ne a c h8m a i nc h a i nr e s i d u e s 1 1 m a i n c h a i ni sc o m p o s e do f ( 卜- 6 ) 4 i n k e d - g l ca n d ( 1 6 ) - l i n k e d - m a n ，w h i c hi s s u b s t i t u t e da t0 - 3 t h ee d g eo ft h em a i nc h l i i 】na n dt h es i d ec h a i nw e r e m a i n l y m a d e u p o f ( 1 3 ) g l e a n d ( 1 3 ) m a n k e yw o r d s ：g u g a r i ai n q u i n a n s p u r i f i c a t i o n p o l y s a c c h a r i d es e p a r a t i o n s t r u c t u r es t u d y 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工 作及取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地 方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含 为获得东北师范大学或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。 与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明 确的说明并表示谢意。 学位论文作者签名：2 匝盥日期：2 竺兰! ! 堑 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解东北师范大学有关保留、使用学位论文 的规定，即：东北师范大学有权保留并向国家有关部门或机构送交学 位论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。本人授权东北师范 大学可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可 以采用影印、缩印或其它复制手段保存、汇编学位论文。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权书) 剿泼文1 馓：趟进捌导亳撇： e t 舰地曼：垒日规 学位论文作者毕业后去向 工作单位： 通讯地址： 电话： 溢 引言 蛋白质、核酸、多糖是最重要的三种生物大分子。蛋白质和核酸 在生命现象中的重要性为世人所知，以基因重组为代表的生物工程已 经并将大大地造福于人类社会。而糖类的研究已有近百年的历史， 糖类的生命科学几乎与蛋白质的生命科学同时诞生。1 。但是，糖类研 究却远远落后于蛋白质和核酸的飞速发展。之所以如此，有两个重要 原因：首先是理论上的简单化。人们过低地估计了糖类对生命过程的 贡献，科学工作者认为糖类只不过是一种能源和细胞内支撑物：其次 是在研究方法上较困难。从自然界分离的粗多糖是非常复杂的混合物， 其中包括各种生物大分子的混合，不同多糖( 中性多糖、酸性多糖、 杂多糖) 的混合以及不同分子大小，不同糖苷键构成的同多糖的混合， 因此必须采取适合其结构特点的方法进行分离、分级和纯化。多糖结 构的复杂性也大大增加了多糖研究的难度啪。直到2 0 世纪6 0 年代以 后，随着三次革命性的进展，大大推动了糖类的研究。近几十年来， 由于相关研究包括膜的化学功能，免疫物质的研究以及对新药物资源 的寻找等，人们发现糖类在生物体中不仅是作为能量资源或结构材料， 更重要的是它参与了生命科学中细胞的各种活动，具有多种多样的生 物学功能。到目前为止，已有近3 0 0 种的多糖类化合物从天然产物中被 分离提取出来。其中，从植物中尤其是从中药中提取的水溶性多糖最为 重要。这些活性多糖的生理活性，化学结构以及构效关系成为多糖研究 的前沿阵地，取得了很大的进展“。 一、多糖的多种生物活性 j 、多糖的抗肿瘤及免疫调节作用* 埘 6 0 年代以来，糖类作为光谱免疫促进剂而引起了医学界的广泛关 注、多糖不但对机体的免疫系统受到严重损伤的癌症有明显疗效，又能 治疗多种免疫缺失疾病，如慢性病毒性肝炎和某些耐药细菌和病毒引 起的慢性疾病，有的还能诱导干扰素的产生。已发现有1 0 0 多种中药所 含多糖类化合物具有免疫促进作用。 抗癌活性是多糖类化合物所显示的重要生物活性，其特点是毒副 作用小，能提高机体免疫功能并抑制肿瘤生长，与化疗药物适当组合 有协同作用并可降低或免除化疗药物的毒副作用，多糖抗肿瘤方式大 致可归纳为两类，以细胞毒为主的直接抗癌方式和以免疫为主的间接 抗癌方式。 多糖能在多条途径、多个层面对免疫系统发挥调节作用。大量免 疫实验证明多糖不仅能激活t 、b 淋巴细胞、巨噬细胞、自然杀伤细胞 ( n k ) 等免疫细胞，还能活化补体，促进细胞因子生成，对免疫系统发挥 多方面的调节作用。 2 、抗凝血及抗血栓作用 从动物肠粘膜中提取的肝素是硫酸化的葡萄糖胺聚糖物质，在临 床上用于预防输血凝血及其它血栓性疾病。从虾蟹壳中提取的壳聚糖 也具有抗血栓、预防心血管病变的功效“。 3 、抗病毒作用 邵传森“”等报道了中华猕猴桃多糖体外抗轮状病毒作用。1 9 8 7 年， 德国的b a y e r 公司研制的木聚糖硫酸酯对艾滋病有较好的疗效。日本 的研究也表明，地衣多糖及右旋糖酐经硫酸化修饰对h i v 一1 病毒有明 显的抑制作用。中科院上海有机所田庚元等于1 9 9 6 年报道，牛膝多糖 硫酸酯有抗乙肝病毒的活性“1 。人们对将多糖应用于因病毒感染所 致艾滋病等疑难疾病的治疗寄予很大的希望。 4 、降血糖、血脂作用 南瓜多糖、人参多糖、麻黄多糖、知母多糖、高山红景天多糖等 经实验证明均有降低血糖作用。茶多糖具有明显的降血糖的作用，其 中有降血糖作用的多糖为半乳葡聚糖2 4 1 。 5 、保肝作用 冬虫夏草多糖治疗慢性乙型肝炎，可在免疫调节、保肝和抗病毒 2 等三方面发挥作用。取得较好疗效。香菇多糖对慢性肝炎有免疫调节 作用，主要是促进t 细胞活性，具有抗病毒及诱生i f n 保护肝脏的作 用。中华猕猴桃多糖具有较强的清除活性氧自由基的能力，并且还有 与机体内源性抗自由基体系相类似的作用能力，刺五加果多糖、云芝 胞内多糖对四氯化碳造成小鼠的肝脏损伤具有一定的防护作用。”。 6 、抗氧化及抗衰老作用 许多中药多糖都具有提高抗氧化酶活性、清除自由基、抑制脂质 过氧化，从而保护生物膜的作用。y e u n g 报道云芝多糖能增强g s h p x 的 活性，促进h ：吼的清除”。 7 、抗炎活性 银杏细胞培养物胞内多糖( i c p ) 及胞外多糖( e c p ) 均能显著抑铡 乙酸所致小鼠毛细血管通透性的增高和小鼠耳肿胀o 。 二、糖的结构研究进展及其构效关系 分析多糖结构的方法发展至今，有三大类：化学法、物理学法、 生物学法。在组分分析中，一般采用酸水解法( 部分或全部水解) ，检 测水解产物可通过纸层析、薄层层析和气相层析分析。些特殊的取 代基团有专门的测定方法，甲基化分析用来阐明多糖中相邻单糖基的 连接键型，应用较多的是h o k e u n o r i 法；相邻单糖基间的连接方式最经 典的方法是采用高碘酸氧化和s m i t h 降解法分析，另外还有b a r r y 降 解、三氧化铬氧化降解及脱氨基降解等。物理分析法有红外光谱、喇 曼激光光谱、核磁共振光谱( n m r ) 、气相层析( g c ) 、质谱( m s ) 以及 g c 一精s 联用等方法，其中红外光谱是用于分析确定多糖中毗喃糖的糖 苷键构型，以及观察其它官能团的吸收；喇曼吸收光谱作用与红外光 谱类似，其优点除测水溶液外还可测固体样品；瑚r 用于分析多糖中 糖苷键的构型、单糖基的连接方式以及重复结构中单糖的数目与顺序： g c 用来分析可挥发糖类衍生物，需样品少( u g ) 、灵敏、准确；目前， 高效液相色谱和圆二色性及旋光色散分析法在多糖结构中应用也很普 遍4 3 ”。 多糖具有多种生物活性是与它的化学结构密切相关的。就其一级 结构而言，多糖中单糖的组成、糖苷键的类型以及一些官能团对其生 物活性都有影响。一般而言，多糖主链上b ( 1 3 ) 糖苷键是其活性 前提。在高级结构层次上，多糖立体结构中b 一螺旋具有较强生物活性， 可拉伸带状有一定生物活性，而其它两种结构无生物活性。另外，多 糖的分子量、溶解度、旋光度、粘度等性状也影响其生理功能。多糖 结构的化学修饰有时可提高其生物活性，如羧甲基化、硫酸酯化、乙 酰化等。但至今为止，多糖构效关系的研究还没有更大的突破，许多 研究结果存在片面性，还需要研究人员的进一步努力。 多糖的高级结构的研究还较少，但科学家已肯定多糖的高级结构 对功能的影响比级结构重要得多。x 一衍射分析表明，香菇多糖及长 褶多糖均具1 3 一三股绳状螺旋型立体结构，在香菇多糖加入尿素或二甲 亚砜，其活性就丧失，这二者多糖在水溶液的比旋光度不同在尿素或二 甲亚砜中的旋光度，暗示在尿素或二甲亚砜中，多糖立体构型改变了， 从而引起活性的丧失，这充分证实立体构型对多糖活性的显著性影响。 多糖的构效关系的研究是多糖生物学的一个主要领域，至今还不完 善。通过得到活性多糖较为准确的一级结构，将特定的物理常数计算和 现代分析方法联合，推断多糖的高级结构，并利用多糖高级结构模型与 生命细胞受体模型推断多糖的作用方式，可为人们筛选活性多糖，改造 多糖为更具活性的物质提供必要的理论基础”1 。 三、胶陀曩的研究进展 本文选材为胶鼓菌( b u l g a r i ai n q u i n a n s ) ，别名胶陀螺、猪咀蘑， 隶属于子囊菌亚门、盘菌刚、锤舌菌科、胶陀螺属。因形式陀螺，质 地为胶质，故名胶陀螺：日本人视为橡胶质，称为橡胶菇。胶陀螺广 泛的分布于北半球温带地区，在我国分布于吉林、河北、甘肃、四川、 云南等省。主要生长于山毛榉、蒙古栎、麻栎等阔叶树的倒木或枯枝 上。在资料记载中胶鼓菌属于有毒菌，它含有卟啉类物质，误食可发 生光敏性皮炎四肢皮肤痛痒、烧灼感、黏膜肿胀、嘴厝翻肿，并 4 伴有恶心、呕吐、腹痛、腹泻等症状。如见目光病情加重。但如用草 木灰或碱水浸泡后，再食之则别有风味。 国内外对胶鼓菌的研究均较少，其中杨晓静等在特产研究及 中草药中的研究表明胶鼓菌对肝癌、宫颈癌、肉瘤和艾氏腹水癌 细胞具有明显的抗抑作用。能明显降低血淤状态下动物的体外血栓形 成长度，干重“6 ”1 。崔东滨等从中分离到麦角淄醇、半乳糖醇和草酸 “”“。s t a f l l e r m 等提取到三种新化合物，其中b u l g a r i a l a c t o n e a ( i ) 和b ( i i ) 具有抗菌、细胞毒素和杀线虫的作用嘞。r a g m o n dle d u a r d s 等对胶陀螺的色素进行了研究，并得到b u l g a r h o d o i n ( i ) ， b u l g a r e i n ( i i ) 4 ，9 - d i h y d r o x y e n e 一3 ，1 0 一q u i n o n e ( i i i ) 三种色素单体 r s l 。也有包海鹰等对胶鼓菌的营养成分进行了分析，为它的食用价值 提供了依据。“。但没有一篇文章对胶鼓菌的抑瘤等活性的原理给予阐 述，对它的多糖的研究也未见报道。因此，本文对胶鼓菌多糖进行了 提取、纯化、性质研究和结构测定，为胶鼓菌多糖构效关系的研究提 供基础。 ( 一) 实验材料 一、结果与讨论 实验所用胶陀螺购自抚松县长白山区。经植物教研室肖洪兴教授 鉴定。 ( 二) 粗多糖的研究 1 粗多糖的分离提取 胶陀螺子实体用0 5 k o h 浸泡脱敏，后经7 5 乙醇回流、冷水、 热水浸提得到三个粗糖级份b pi 、b pi i 、b p i i i ，收率分别为4 8 、0 9 、 3 4 。 2 物理性状 胶陀螺粗多糖为棕褐色粉末，b pi 、b p i i 溶解性较差，b p m 易溶 于热水。 3 组成分析 气相色谱分析检出g l c 、g a l 、m a n ，摩尔比依次为b p i ：1 0 7 ：1 ，0 ：1 2 ；b p l i ：2 4 ：1 2 ：1 0 ；b p i ：2 0 ：1 0 ：1 0 。 4 s e p h a r o s ec l 一4 b 柱层析 经柱层析，苯酚硫酸法测得分子量分布较宽。 ( 三) b p i i i 的分级纯化和b p i l l b 的纯度鉴定 1 b p i h 的分级纯化 b p m 饱和糖溶液加入9 5 乙醇至总体积的4 0 、8 0 及原体积的三 倍，分别得到三个级份b p i i i a 、b p i i i b 、b p l i i c 。 6 其中b p i u b 的5 糖溶液在一2 0 c 冷冻两天，取出于室温缓慢融化， 离心( 5 0 0 0 r p m ) 除去杂质，反复多次至无沉淀为止 2 b p i i i b 的纯度鉴定 s e p h a r o s e c l 一4 b 凝胶柱与紫外( 2 8 0 a m ) 检测仪相连，柱层析后苯 酚一硫酸法测糖分布，b p i i i b 呈单一狭窄对称峰，蛋白蜂与糖峰一致无 游离蛋白( f i 9 1 ) 。 蓬) d e , 4 e - s e p h a d e x - 2 5 柱层析。用0 1 m 一3 9 m n a c l 直线梯度洗脱， 苯酚一硫酸法测糖分布为单一狭窄对称峰( f i 9 2 ) 。 醋酸纤维素薄膜电泳检查，b p i i l b 图谱呈单一谱带。 比旋光分析，b e l i i b 在不同浓度的低浓度乙醇溶液中，多糖的比 旋度近似，证明b p l i b 为均一级份。 以上纯度鉴定结果表明，b p i i i b 为纯度较好的多糖样品，可以进行 结构研究。 ( 四) 嗍b 的研究 1 物理性状 ( i ) b p i i i h 为浅棕色粉末，易溶于热水。 比旋光度 a i f = + 5 0 0 4 。 分子量约为7 3 万。 2 糖含量及组成分析 经苯酚一硫酸法测定，查标准越线b p i b 的糖含量为8 6 7 。气相 色谱分析表明单糖组成为g l c 、m a n 、g a l ，摩尔比为 3 7 3 ：1 0 0 ：0 。7 6 ( f i 9 3 ) 。 3 蛋白含量测定 用f o l i n 一酚法铡得结合蛋白含量为1 1 6 。 4 红外光谱分析 在1 0 0 0 1l o o c m 一，1 4 0 0 1 5 3 0 c f f l ，2 8 0 0 2 9 0 0 c m 3 1 0 0 3 5 0 0 c f f l 均有多糖的特征吸收峰( f i 9 4 ) 。 5 碘反应实验。 碘反应呈阴性，说明b e i i i b 不含d ( 1 4 ) 糖苷键。 6 部分酸水解 将b p i i i b 用0 0 5 m 三氟乙酸进行部分酸水解，水解过程中出现沉 淀，水解完成后，离心，沉淀于燥作g c 分析( f i 9 5 ) 。上清用无水乙醇 蒸除三氟乙酸至中性，透析，袋外部分干燥后做g c 分析( f i 9 6 ) ，袋内 部分加乙醇醇析，上清部分干燥后做g c 分析( f i 9 7 ) ，沉淀的一部分做 g c ( f i 9 8 ) ，另一部分做高碘酸氧化。实验结果如下： 表1 部分酸水解各部分g c 分析 l g l cm a ng a l 袋外部分 + + + + 袋内上清 + + 袋内沉淀 + 十十 水解沉淀 + 十+ 由表1 可知； ( 1 ) 水解过程产生的沉淀及袋内沉淀g c 分析都只检出g l c 、m a n ， 说明g l c 、m a n 构成主链及主链的核心部分。 ( 2 ) 袋内上清检出6 1 c 、m a n ，它们以寡糖片段形式与主链分离。 它们是支链或主链边缘的组成成分。 ( 3 ) 袋外部分检出g l c 、m a n 、g a l ，位于糖链末端或与易被氧化残 基相邻。 ( 4 ) g a l 只在袋外部分检出，说明位于支链或主链边缘部分。 7 高碘酸氧化和s m i t h 降解 实验原理：高碘酸氧化是一种选择性的氧化反应，它只能作用于多糖 分子中连二羟基及连三羟基处。当连二羟基的c - c 键被断开后，产生 相应的醛：当断裂连三羟基的c - c 键时，产生甲酸及相应的醛。此反 应定量进行，每断开l m o lc _ c 键，消耗l m o l 高碘酸，由此也可知， 每生成l m o l 甲酸必然对应消耗2 m o l 高碘酸。因此，通过测定高碘酸 消耗量及甲酸生成量，便可以判断糖苷键的位置、直链多糖的聚合度 及支链多糖的分枝数日等。 商碘酸氧化产物经n a b 地还原，得到的多糖醇用稀酸在温和条件 下水解，可发生特异性降解，即s m i t h 降解。s m i t h 降解的特点是只 打断被高碘酸破坏的糖苷键，而未被高碘酸氧化的糖残基仍连在糖链 上。这样，多糖醇经s m i t h 降解，就可以得到小分子的多元醇和未被 破坏的多糖或寡糖片段，对这些产物进行分析，便可以推断出糖苷键 的键型及其位置。 下面以葡聚糖为例，反应式如下图： 以1 一键合( 1 6 类似) h 甲酸 以l 一2 位键合( 1 2 ，6 类似) 甘油 以1 4 位键合( 1 4 ，6 类似) 赤藓酵 以l 一3 位键合( 1 3 ，6 、l 一2 ，3 、1 2 ，4 、卜- 3 ，4 、1 2 ，3 ，4 类似) n a b h 4 9 h h 扣归 l “ + h h 扣叫p 甜“i 蚋 h h 归叶 扣 h h h c jcic 2 耋i 删 蔗b - 1 小结：( 1 ) 1 一、l 一6 键型消耗2 m o l 高碘酸，生成l m o l 甲酸： l 一2 、1 2 。6 、1 4 、1 4 ，6 键型只消耗高碘酸，不生成甲 酸： ( 2 ) 不被高碘酸氧化的己糖残基键型为： l 一3 、1 2 。3 、1 2 ，4 、l 一3 ，4 、1 3 ，6 、1 2 ，3 ，4 ： ( 3 ) 产生甘油的键型为：1 一、1 6 、1 2 、l 一2 ，6 ： 产生赤藓醇的键型为：l 一4 、l 一4 ，6 。 实验结果：b p i i i b 和b p i i i b ( 部分酸水解袋内醇沉沉淀) 的高碘酸氧化 结果见表2 ( f i 9 9 1 2 ) 。 表2 b p mb 和b p i i i b 高碘酸氧化结果及比较 样品反应高碘酸高碘酸消甲酸生甲酸生成 量时间消耗量耗量己成量量己糖 mm o lhmm o l糖量mm o 量 m o l m o lm o l m o l b p l i b0 1 5 42 40 2 4 01 5 2 80 “50 7 5 2 b p i l i b o 1 5 32 40 2 6 61 7 3 60 1 2 90 8 4 2 由表2 司知： ( 1 ) b p i i i b 与b p b 高碘酸氧化完成时高碘酸的消耗量几乎等于 甲酸生成量的二倍，说明可被高碘酸氧化的糖残基都可生成甲酸，即 存在1 一、1 6 键型，或不消耗高碘酸也不产生甲酸的1 3 、1 2 ，3 、 1 2 ，4 、l 一3 ，4 、l 一3 ，6 、1 2 ，3 ，4 键型 ( 2 ) b p i i i b 是部分酸水解袋内沉淀部分，位于多糖核心部分。b p i i i b 每摩尔己糖消耗的高碘酸量大于b p i i i b 消耗的量，说明多糖整体 结构与核心结构不均一，不可被氧化的糖残基较多的集中在多糖核心 以外的部分。 ( 3 ) b p i i i b 有7 5 2 的糖残基可被高碘酸氧化。 1 0 表3 s m i t h 降解产物分析 完全酸水解袋外袋内上清袋内沉淀 b p i b甘油3 3 3 2 6 8 g l c1l m a no 5 60 6 3 g a l微量微量 甘油 1 3 51 3 9 b p i l i b g l c11 m a n0 2 50 1 9 g a l 由袤3 可知： ( 1 ) b p i i i b 经完全酸水解后g c 分析检出g l c 、m a n 及微量的g a l ， 说明各种单糖均有不被高碘酸氧化的键型，即1 3 、1 2 ，3 、l 一2 4 、 1 3 ，4 、l 一3 ，6 、1 2 ，3 ，4 。g a l 主要以被氧化的键型存在，既1 一、 1 6 键。 ( 2 ) b p i i i b 及b p m b s m i t h 降解后均检出较多甘油，说明有产甘 油键型，既1 一、1 2 、l 一6 、1 2 ，6 。 ( 3 ) b p i i i b 降解后袋内部分无沉淀，说明主链部分完全被氧化，又 由部分酸水解可知主链部分e hg l c ，m a n 构成，故可推测：主链核心部 分f h ( 1 6 ) g l c ，( 1 - - , - 6 ) i d a n 构成。b p m h 降解后袋外有微量的 g i c ，m a n ，说明有微量的g l c ，m a n 以不被氧化键型存在于靠近主链的支 链部分。 综合部分酸水解和高碘酸氧化、s m i t h 降解的分析结果，推测b p i l l b 可能的结构： ( 1 ) 主链核心部分由g l c 、m a n 构成，二者主要是1 - - 6 键型，在主 链、支链或主链边缘都存在g l c 、m a n 。 ( 2 ) g l c 、m a n 都有能被高碘酸氧化的键型和不被高碘酸氧化的键 型，绝大多数g a l 以被高碘酸氧化的键型存在，位于多糖支链或末端。 8 甲基化分析 实验原理：甲基化分析是确定糖链连接次序所必不可少的实验手段。 其基本原理是先将多糖中各种单糖残基中的游离羟基全部甲基化，进 而将多糖中的糖苷键水解，水解后得到的化合物，其羟基所在的位置， 即为原来单糖残基的连接点。同时根据不同甲基化单糖的比例，可以 推测出此种连接键型在多糖重复结构中所占的比例。 用此种方法得到的羟基及n a b h 4 还原醛基后产生的羟基，经乙酰 化可得到甲基化的糖醇乙酸酯( 此产物易挥发，可进行g c 分析) ，再 经g c 与g c - m s 联机分析，通过气相色谱的出峰顺序和对质谱谱 图的主要离子碎片的分析便可以较准确地确定糖的连接键型。 反应通式如下： 00 i il j 1 h 3 c c h 3 + n a o h - h 3 c ch _ ，n a + 二甲基亚枫 二甲基亚砜磺酰阴离子 0 i l 0 2 h 3 c 一c h - 2 n a + + r - - o h 一, - r - - o n a + 4 - h 3 c g c 糖糖羟基一醇钠 。 r o n a + + h 3 c i r o c h 3 + n a l 碘甲烷 甲醚甲基化糖 以a ( 1 4 ) 葡聚糖为例 l水解、还原 工 2 ，3 ，4 ，6 - o - 四甲基2 ，3 ，6 廿三甲基g l c2 ，6 - 0 - - - 甲基g l c 另外，甲基化衍生物的裂解规律为： 各种单糖甲基化衍生物的基峰均为4 3 ，为c 也c o + ： 被甲基化，乙酰化的单糖分子中，带有甲氧基的碳原子容易与 相邻碳原子间发生断键，形成正离子。 下面以1 ，5 - d i a c e t y l 一2 ，3 ，4 ，6 - t e t r a o m e t h y l d g l c 为例，表 示断裂方式如下： 露 审 壬。o。缸盼 毋一 主要碎片( m e ) 为：4 5 1 1 7 1 6 1 2 0 5 由1 6 1 、2 0 5 进一步裂解为7 1 8 7 1 0 1 1 2 9 1 4 5 。图示如下： m e 1 6 1 臣叱 一乙醇 m e 1 0 1 乙烯酮厂一o c 1 ：矽一8 7 丑厂嚆 o h 2m e 7 1 m e 1 4 5 m e 2 0 5 由此可知，实际所得碎片为：4 5 7 1 8 7 1 0 1 11 7 1 2 9 1 4 5 1 6 1 2 0 5 对于酸性糖的甲基化分析，必须先进行c m c 酯化还原因为糖醛 酸只有经过酯化还原后才能被乙酰化而进行g c m s 分析。这样，通过比 较酯化还原前后各甲基化单糖的摩尔比，得到甲基化单糖的增加值，才 可以计算出糖醛酸中各种连接方式的摩尔比。 实验结果：b p i i b 经甲基化( i r 检查甲基化完全) 、水解、还原、乙酰 化后得到甲基化糖醇乙酰酯，g c m s 色质联机分析。通过与标准质谱 图对照，参考文献的相对保留时间和不同单糖的主要离子碎片( m e ) ， 樗甲基化分析结果，列于表4 、表5 ( f i 9 1 3 - 2 4 ) 。 1 4 表4 b p i i i b 甲基化产物分析 峰甲基化单糖键型摩尔主要离子碎片 号 比 l2 ，3 ，4 ，6 一g l c l 1 0 04 34 57 18 71 0 11 1 71 2 91 4 5 1 6 12 0 5 22 ，3 。4 ，6 一m a r ll 一 0 。9 l4 34 55 97 18 71 0 11 1 71 2 9 1 4 51 6 12 0 5 32 ，3 ，4 ，6 一g a l1 0 2 44 34 57 i8 71 0 11 1 71 2 91 4 5 1 6 12 0 5 42 ，4 ，6 一g l cl 一3 1 2 04 34 57 18 71 0 11 1 71 2 91 6 1 52 ，4 ，6 一m a nl 一3 0 6 04 34 57 18 71 0 11 1 71 2 91 6 1 62 ，3 ，4 一g 1 cl 一67 9 14 38 79 91 0 11 1 71 2 91 6 11 8 9 72 ，3 ，4 一m a n1 62 0 24 37 l8 99 91 0 11 1 71 2 91 6 1 1 8 9 82 ，3 ，4 一g a l1 62 8 44 35 98 99 91 0 11 1 71 2 91 6 1 1 8 9 92 。4 一g 1 c 1 3 ，6 2 2 94 38 71 0 11 1 71 2 91 8 9 1 02 ，4 一m a n1 3 。60 3 l4 38 71 1 7 1 2 91 8 9 1 5 单糖残基甲基化糖 甲基化分析摩尔比 6 c 分析 摩尔比 6 1 c2 ，3 ，4 ，6 一g 1 e l3 2 3 3 7 3 2 ，4 ，6 一g i c1 1 9 9 2 ，3 ，4 6 1 c7 9 1 2 ，4 一g 1 c2 2 9 m a n2 ，3 ，4 ，6 一m a no 9 l1 o o1 0 0 2 ，4 ，6 一m a no 6 0 2 ，3 ，4 m a n2 0 2 2 ，4 一m a no 3 l g a l2 ，3 ，4 ，6 - g a lo 2 40 8 0o 7 6 2 ，3 ， g a l2 ，8 4 由表5 可知： ( 1 ) 甲基化分析所得的单糖摩尔比与g c 分析结果基本一致。 ( 2 ) 末端残基有：g l c ，m a n ，g a l ，摩尔比为1 0 0 ：0 9 1 ：0 2 4 。 ( 3 ) 分支点糖残基有：( 1 3 ，6 ) g l c ，( 1 3 ，6 ) m a n ，摩尔比为 7 3 9 ：1 0 0 。 ( 4 ) g l c ，m a n 均有四种键型被检出：1 一、1 3 、1 6 、1 3 ，6 。 ( 5 ) 6 a l 检出l 一、l 一6 键型，均是可被高碘酸氧化键型，可能由 于不被氧化的键型含量太低，朱被检出。 ( 6 ) 表5 不被氧化的g l c 与m a n 单糖残基的比值与高碘酸氧化实验 1 6 结果一致。 ( 7 ) 由表4 中数据计算出高碘酸理论消耗量为1 5 4 m o l m o l 己糖， 甲酸理论生成量为0 7 7 m o l m o l 己糖，可被氧化糖残基的百分率为 7 7 2 ，与实测值基本一致。平均每8 个糖残基有1 个分枝，分枝较少。 以上分析结果均与部分酸水解、高碘酸氧化、s m i t h 降解分析结 果相致。 9 结论 综合i r 分析、g c 分析、部分酸水解、高碘酸氧化、s m i t h 降解、 甲基化分析，推测的b p i i i b 结构如下： ( 1 ) ( 1 6 ) g l c ，( 1 6 ) m a n 构成主链的核心部分，支链和主链 的边缘由较多的不可氧化( 1 3 ) g l c ，( 1 3 ) m a n 和较少的可氧化 ( 1 6 ) g a l 和( 1 6 ) g l c ，( 1 6 ) m a n 构成。 ( 2 ) 分枝少，平均每7 5 个单糖残基中有1 个分枝。分枝点糖残基 有( 1 4 3 ，6 ) g l c 和( 1 3 ，6 ) m a n ，其中大多数为( 1 3 ，6 ) g l c 。 ( 3 ) 末端残基有：g l c ，m a n ，g a l 。 二、实验方法 ( 一) 粗多糖的分级纯化方法 1 b p i i i b 的纯化流程如图 浓缩，3 倍 乙醇沉淀 加9 5 乙醇至 总体积的4 咙 1 小时 复三次 至原体积的兰倍 b p m a b p bb p h i c 冻融除杂，冻千 b p i i b 2 冻融分级 将多糖配成5 的溶液，置于一2 0 冰箱中冷冻两天，取出于室温 缓慢融化，离心( 5 0 0 0 r p m ) ，重复数次。 1 8 ( 二) 一般方法 1 常规干燥法 醇析后的样品依次用9 5 乙醇、无水乙醇脱水，再用乙醚脱去乙 醇后，置于盛有p ：o ；及n a o h 的真空干燥器内真空干燥。 2 甲醇解“3 ” 彻底干燥的糖样l o m g ，加入无水h c l 一甲醇2 m l ，充n 。封管，8 0 c 甲醇解2 0 小时，凉至室温后，用无水k o h 一甲醇中和至p h = 6 ，然后4 0 减压旋转蒸于，常规干燥。 3 硅烷化( t m s 衍生物制备) o “1 向彻底干燥的甲醇解产物中加入0 2 m l 无水毗啶( 内含饱和甘露 醇作内标) ，7 5 c 溶解3 0 分钟，然后加入0 3 m l 硅烷化试剂( 六甲基二 硅胺烷：三甲基氯硅烷= 2 ：1 ) ，摇匀，静止几分钟，即可取上清进行分 析。 4 完全酸水解 2 0 m g 糖样加入1 mh 2 s 0 42 m l ，封管，1 0 0 。c 水解8 小时，然后用b a c o 。 中和，过滤，滤液留作分析。 ( 三) 、糖的有关性质测定及纯度鉴定方法 1 总糖含量测定( 酚城酸法) 嘲 将l o m g l o o m l 糖溶液。6 的酚溶液，浓h 。s o 。依次按l ：0 5 ：2 5 的比例加入，振荡，静止，冷却，然后在4 9 0 a m 波长下比色，所得数 值查标准曲线可得总糖含量。 2 分子量测定“1 将糖样上s e p h a r o s ec l _ 4 b 柱层折，用生理盐水洗脱，得洗脱体 积数值查标准曲线得分子量。 3 比旋光度测定酬 将l o m l 饱和糖液用国产w x g 一6 型自动旋光仪，钠灯光源，以蒸馏 水调零点，i d m 管室温下测定。 1 9 4 s e p h a r o s ec l - 4 b 柱层析 糖样5 m g ，以0 9 n a c i 溶液洗脱( 1 2 m l 1 2 m i n ) ，b s - i o o a 自动 部分收集器收集，酚硫酸法测糖分布。 5 d e a e s e p h a d e xa 一2 5 柱层析 糖样5 m g ，先以0 1 m o l 1 n a c l 溶液洗脱，再用0 1 m o l 1 n a c 5 0 0 m i + 3 9 m o l ln a c l5 0 0 m l 进行直线梯度洗脱，b s - i o o a 自动部分收 集器收集，苯酚一硫酸法测糖分布。 6 醋酸纤维素薄膜电泳。5 ” 醋酸纤维素薄膜2 x 8 c m ，缓冲液为硼砂- n a o h ( p n = z o ) ，甲苯胺蓝 染色，9 0 乙醇作漂洗液，无水乙醇一冰醋酸( 3 ：1 ) 作透明液。 7 蛋白含量测定“1 取i m l 样品溶液( 约含2 0 2 5 0 u g 多肽或蛋白质) ，加入5 m l f o l i n 一 酚试剂甲，混匀，于2 0 2 5 放置1 0 分钟。再加入0 5 m l f o l i n 氏试 剂，立即振摇均匀，在2 0 2 5 。c 保温3 0 分钟，然后于5 0 0 n m 处比色。 以l m l 蒸馏水替代样品作为空白对照。比色结果查标准曲线得蛋白含 量。 ( 四) 、仪器分析方法 l - 红外光谱法( i r ) “1 s p e c o r di r 型红光谱仪，样品与k b r 压片，常规方法测定。 2 气相色谱法( g c ) 仪器：v a v i a n3 4 0 0 气相色谱仪附f i d 检测器 h p 3 3 6 5 化学工作站 色谱柱：s e 一3 0 5 0 r m x o 2 0 响x o 2 5 1 m 气化：3 0 0 检测：3 0 0 柱温：1 2 0 c ( 2 m i n ) ! ! 竺2 5 0 c ( 3 0 m i n ) 载气：高纯氮气 3 色质联机( g c _ m s ) 色质联机h p 5 8 9 0 ( i i ) g c f p 5 9 8 酬s h p s 石英毛细管柱2 5 m 0 2 2 n n x 0 ，2 n m 进样口：2 7 0 。c 离子源：2 0 0 。c 程序升温：1 2 0 ! ! ： - 1 4 0 1 2 ( 五) 、多糖的结构研究方法 1 碘反应 将糖液滴于白瓷板上，加一滴碘液。 2 部分酸水解”“ 称取8 0 m g 样品加入0 0 5 m 的三氟乙酸2 m l ，9 5 6 c 水解1 6 小时。 离心，沉淀干燥做g c 分析；上清液用无水乙醇蒸除三氟乙酸至中性。 置透析袋内用蒸馏水透析2 4 h ，袋外部分干燥后做g c 分析，袋内部分 醇析，上清部分干燥后做g c 分析，沉淀的一部分做g c 分析，另一部 分做高碘酸氧化。 3 高碘酸氧化和s m it h 降解删 ( 1 ) 高碘酸氧化 称取糖样3 0 m g ，用少量水溶解于5 0 m l 容量瓶中，然后加入3 0 m m o l ln a l 0 , 2 5 r a l ，定容，使n m 0 4 终浓度为1 5 mm o 几。 放置在暗处反应( 室温) ，间隔时间( 0 、6 、1 2 、2 4 、3 6 、4 8 、6 0 小时) 取样0 1 m l ，用蒸馏水稀释2 5 0 倍，用7 5 2 型分光光度计，以蒸 馏水作空白对照，在2 2 3 n m 波长处测光密度值，直到光密度值恒定为 止。加乙二醇终止反应，高碘酸氧化完成。 而后通过查标准曲线，就可计算出高碘酸的消耗量。 ( 2 ) 甲酸测定 取2 m l 上述氧化液，加1 滴溴甲酚( 红) 紫作指示剂，用0 0 0 5 2 3 n n a o h ( 用邻苯二甲酸氢钾标定) 滴定，计算得甲酸生成量。 ( 3 ) s m i t h 降解 将乙二醇处理后的溶液透析，流水2 4 小时，蒸馏水2 4 小时。 浓缩，加入n a b h 还原过夜。用5 0 9 6h a c 中和至p h 为6 7 ，透析，流 水及蒸馏水各2 4 小时。取1 3 干燥后做g c 分析，剩余部分进行s m i t h 2 t 降解。 加入等体积的1m o l lh 。s o , ，2 5 c 水解4 0 小时，b a c o a 中和 至d h 为6 ，用定量滤纸过滤，滤液用蒸馏水透析4 8 小时，袋外部分 干燥做g c 分析，袋内加乙醇醇析，离心，上清及沉淀部分干燥后分别 做g c 分析。 4 甲基化分析”7 1 ” ( 1 ) 糖样溶解 称取2 0 m g 彻底干燥糖样，溶于6 m l 二甲亚砜( d m s o ) 中，d m s o 以 4 a 分子筛脱水：充n 2 封管后，4 0 c 磁力搅拌1 5 小时，至糖样充分溶 解为止。 ( 2 ) n a o h - d m s o 混悬液的制备 将2 4 0 m g8 0 目过筛的n a o h ( 7 0 ( 2 真空干燥) 与6 m ld m s o 混合，充 n ：密封，2 5 c 磁