（生物物理学专业论文）哈茨木霉h13形态及生理特征的研究.pdf

摘要 木霉菌是一种广泛存在于土壤、植物根际和叶面的腐生型真菌，对多种植 物病原真菌具有拮抗作用。因而被当作一种生防菌种进行使用，并引起了众多微 生物学家和植物病害研究者的高度重视。 本项研究采用对比研究法，与对照菌株相比，将试验菌株培养后，从菌落， 菌丝体，细胞形态等宏观层次阐明主要差异；从菌物对环境物质吸收、转运及利 用，阐明对环境物质选择性吸收的可调控性；从对目的物合成种类与星的分析， 阐明相关酶基因表达能力与效果变化规律；为生产实践提供技术参数。 文中采用将试验菌株与原菌株分别点接在p d a 培养基平板上，3 0 下培养 3 天，肉眼观察菌物呈圆斑状，菌斑上的菌丝大部分呈白色，菌斑的局部有色素 合成，呈现淡黄色。在液体培养基中，木霉菌丝相互缠绕在起，呈球状，显淡 黄色。普通光学显微镜观察表明，木霉菌丝纵横交错，呈网络状。扫描电镜观察 表明，对照菌株孢子基本呈圆形，表面粗糙，中间略有凹陷，试验菌株孢子表面 光滑，棱角清晰，呈馒头状，有的甚至呈方形，中问略有凹陷。 通过对发酵液残留糖含量的测定，试验菌株培养液中还原糖的浓度明显低于 对照菌株，说明试验菌株对碳源的吸收利用速率明显要高于对照菌株。 在进行产几丁质酶和纤维素酶的试验中，分别以胶态几丁质和羧甲基纤维素 钠作为相应的产酶培养基中的唯一碳源，通过测定几丁质酶的酶活以及纤维索酶 水解圈的大小，得出离子束诱变后，试验菌株的产酶基因的表达比对照菌株有了 较大的增强，试验菌株几丁质酶的酶活最高可达0 2 9 2 u m l ，而对照菌株酶活只 有0 2 2 8u m 1 故产几丁质酶最佳培养基是在原培养基中添加1 o 的酵母粉：纤 维素酶也是木霉抑菌的又一酶制剂，文中采用羧甲基纤维素钠( c m c ) 作为唯一碳 源的产纤维素酶培养基，以c m c 水解圈的大小来衡量纤维素酶的酶活，则试验菌 株的水解圈的直径偏高于对照菌株。 通过上述试验表明，离子束对木霉的生物学特性改造产生积极影响，经2 0 代转接，木霉的遗传稳定性未见明显衰退，提高了木霉对环境物质吸收转化利用 的选择性；发现几丁质酶、纤维素酶量与活性均有定向提高。一 总结上述，离子柬诱变在生防菌株木霉的改良上起着重大的作用，改良后 的菌株对外界环境的适应性比对照菌株提高，遗传性状较对照菌株稳定，试验菌 株对酸碱、高温及渗透压的耐受性增强，所有这些特点表明改造后的菌株更适合 用作生防菌株。 关键词：木霉，几丁质酶，纤维素酶，试验菌株，对照菌株 a b s t r a c t t f i c h o d e r m aw h i c he x i s t si nt h es o i l p l a n tr o o tz o n ea n dl e a f s u r f a c ew i d e s p r e a d i sat y p i c a lr o tf u n g ia n di ti sa r ta n t a g o n i s t i cb a c t e r i u mo fa g a r i c u ss pa ： s o妇1,wndistresspathogenst r i c h o d e r m au s e da sb i o c o n t r of a c t o r sa n da t t r a c t sm u c ha t t e n t i o n o f m a n ym i e r o b i o l o g i s t sa n d1 e a i t l e r so np l a n td i s e a s e s c o n t r a s t i n gm e t h o dw a sm a d eu s eo fi n t h i se x p e r i m e n t a f t e rc u l t u r i n gt h e m u t a n ts t r a i n 。m a i nd i f f e r e n c e sw e r ec o n c l u d e db yc o l o n y ，m y c e l i aa n de e l l m o r p h o l o g yi nc o n t r a s tt ot h ew i l ds t r a i n f r o mt h ea s s i m i l a t i o n ，t r a n s p o r t a t i o na n d u t i l i z a t i o no fn u t r i e n t sm a d eb yt h em u t a n ts t r a i n ，t h er e s u l tw a sc o n c l u d e dt h a tt h e a s s i m i l a t i o nf o rn u t r i e n tw a sc o n t r o l l a b i e f r o mt h ek i n d sa n dq u a n t i t yo ft a r g e t p r o d u c t s ，ac o n c l u s i o nw a sc o n c l u d e dt h a te x p r e s s i o no fs o m ee n z y m eg e n e sw a s e n h a n c e d i nt h i st e s t i n o c u l a t e dt h em u t a n ts t r a i na n dt h ew i l ds t r a i no nt h ep d am e d i u m p l a t er e s p e c t i v e l y c u l t u r i n gu n d e r3 0 f o rt h r e ed a y s t h e r ew a sr o u n dp l a q u e a p p e a r i n go nm e d i u mp l a t e ，m o s tm y c e l i ao nt h ep l a q u ew a sw h i t e ，a n ds o m e p a r t so ft h ep l a q u ew e r e1 i g h ty e l l o wb e c a u s eo fs y n t h e s i so fp i g m e n t ， w h e nt o u c h i n gt h ep l a q u e ，i tf e l ts os m o o t ha n ds l i m y w h e nt r i c h o d e r m a w a sc u l t u r e di nl i q u i dm e d i u m t h em y c e l i al o o k e db a l l l i k ea n dl i g h ty e l l o w w h e n w a t c h e db yc o r n m o nm i c r o s c o p e t h em y c e l i ar a m i f i e di i k ef i s h i n g - n e t w h e n w a t c h e d b ys c a n n i n ge l e c t r o nm i c r o s c o p e ，t h es p o r eo f t h ew i l ds t r a i nw a sr o u n da n d i t ss u r f a c ew a sv e r yr o u g h b u tt h es p o r eo f t h em u t a n ts t r a i nw a ss m o o t h ，l i k eal o a f o f b r e a d a c c o r d i n g t ot h el e v e lo fl e f g l u c o s ec o n c e n t r a t i o ni nt h ef e r m e n t a t i o hl i q u i d t h eg l u c o s el e v e li nt h ef e r m e n t a t i o nl i q n i do fm u t a n ts t r a i nw a sl o w e rt h a nt h el e v e l i nt h ef e r m e n t a t i o nl i q u i do fw i l ds t r a i n ，t l l i sc o n c h i s i o nc o n f i r m e dt h a t t h em u t a n t s t r a i nm e t a b o l i z e df o rc a r b o ns o u r c e sf i a s t e rt h a nt h ew i l ds t r a i n w h e ne x p e r i m e n t so fp r o d u c i n gc h i t i n a s ea n dc e l l u l o s ew e r ed o n e ，g l u e l i k e c h i t i na n dc m cw e r es e l e c t e dr e s p e c t i v e l ya su n i q u ec a r b o ns o u r c e b ye n z y m e a c t i v i t yo fc h i t i n a s ea n dt h es i z eo ft h eh y d r o g e nc i r c l eo fc m c ，t h ef a c tt h a t e x p r e s s i o no fd t l z y m eg e n eo fc h i t i n a s ea n de e l l u l o s ew a se n h a n c e da f t e rb e i n g m u t a t e db vn + i o nb e a mw a sf o u n d a n de n z y m ea c t i v i t yo fm u t a n ts t r a i n ! c a m eu pt o 0 2 9 2 u m l ，b u tt h ew i l ds t r a i n ，m e r e l y0 2 2 8u m 1 s ot h eo p t i m u mm e d i u m f o rp r o d u c t i o no fe h i t i n a s ew a st h ep r e v i o u sm e d i u mp l u s l _ 0 y e a s t e x t r a c ti o n c e ll u l a s ew a sa n o t h e re n z y m ep r o d u c e db yt r i c h o d e r m a i nt h i s e x p e r i m e n t ，t f i c h o d e r m aw a sc u l t u r e di nm e d i u mi nw h i c hc m cw a sau m q u e c a r b o ns o u r c e a c c o r d i n gt ot h es i z eo fh y d r o g e nc i r c l eo fc m c e n z y m ea c t i v i t yo f m u t a n ts t r a i nw a sh i g h e rt h a nw i l ds t r a i n t h ee x p e r i m e n t sa sa b o v ec o n f i r m e dt h a ti o nb e a mp l a y e dp o s i t i v ee f f e c to n b i o l o g i c a lc h a r a c t e r so ft r i c h o d e r m a 1 n o c u l a t e dt h em u t a n ts t r a i nf o r2 0g e n e r a t i o n s a n dt h es t a b i l i t yo fh e r e d i t yo f 丹i c h o d e r m aw a sn o to nt h ew a n e ，a n dt h em u t a n t s t r a i na s s i m i l a t e da n du t i l i z e dn u t r i e n t sm o r ee f f e c t i v e l y a n de n z y m ea c t i v i t ya n d q u a n t i t yo f c h i t i n a s ea n dc e l l u l o s eo f m u t a n ts t r a i nw e r cb o t ho nt h ei n c r e a s e i naw o r d , i o nb e a mp l a y e da l li m p o r t a n tr o l eo np r o m o t i n gt r i c h o d e ，m 4 1 1 增 m u t a n ts t r a i ni sg o i n gt os u i tt h es u r r o u n d i n g sb e t t e rt h a nt h ew i l ds t r a i n a n dt h e c h a r a c t e r so fh e r e d i t yo ft h em u t a n ts t r a i nw a sm o r es t a b l e a n da tt h es a m et i m e ，t h e m u t a n ts t i r i l lc o u l dt o l e r a t ep h , t e m p e r a t u r e ，a n do s m o t i cp r e s s u r em u c hb e t t e rt h a n t h ew i l ds t r a i n a b o v et h i sa l lc o n f i r m e dt h a tt h em u t a n ts t r a i nw a sm o r es u i t a b l et ob e b i o c o n t r o lf a c t o r k e yw o r d s ：t r i c h o d e r m a , c h i t i n a s e , c e l l u l o s e , t h em u t a n ts t r a i n ，t h ew i l ds t r a i n 独创性声明。 本人声明所呈的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作 及取得的研究成果据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方 外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为 获得安徽农业大学或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料与 我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确 的说明并表示谢意 鬻翥鬈耄黔 签字日期：h 叻年二月归 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解安徽农业大学有关保留使用学位论文 的规定，有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子 文件，允许论文被查阅和借剧本人授权安徽农业大学可以将学1 立论文 的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印缩印或扫 描等复制手段保存汇编学位论文( 保密的学位论文在解密后适用本授 权书) 黧嚣艚 签字日期：叫卵诈6 耳日 学位论文作者毕业后去向： 工作单位： 通信地址： 指导教师签名：蟊兰兰堑 签字日期：，鲫7 年石月拥 电话 邮编 文献综述 1 、木霉菌的特征及生防机制 木霉属 t r i c h o d e r m a ( p e r s ) f r 1 在真菌分类中属于半知菌亚门、丝孢纲、丝 孢目、粘孢菌类，木霉属真菌分布广泛，是典型的土壤和木材腐生真菌。木霉属 真菌菌丝密集如毡；分生孢子梗从菌丝的侧枝上生出，直立，分枝，小枝常对生， 顶端不膨大，上生分生孢子团；分生孢子球形，浅色或无色u 】。由于其产生纤维 素酶( 特别是zr e e s e i s i m m o n s ) 瞳4 ”及其它水解酶呻1 和抗生素“1 而具有经济重 要性；有些木霉被用作生防因子【”“1 ；哈茨木霉是蘑菇病害病原物的重要拮抗菌 “”1 。绿色木霉( t v i r i d e p e r s e x f r ) 产生抗菌素，施入土壤中对丝核菌所致的 土传病害有一定的防治效果。而康宁木霉( zk o n i n g i io u d ) 则可使木材变绿。 自1 9 3 2 年w e i n d l i n g 发现木素木霉寄生于多种植物病原真菌后，木霉作为一类 生防菌显示出巨大的应用前景。由于木霉菌的适应性强，抗菌普较广及多机制性， 一直是植病生防学家研究的重点对象。随着生物工程技术的飞速发展，木霉菌已 有单一地从自然界中分离筛选发展到有目的利用基因工程技术进行改造以获得 新型菌株的阶段，如根癌农杆菌介导的遗传转化，将c r y ，爿例基因转入生防真 菌哈茨木霉中，转化子不但保持了原菌株良好的抑菌活性，而且表现出一定的杀 虫效果木霉菌所具有的抗菌广谱性，良好的适应性及多机制作用特点，使其在 生防方面明显优于其他种类的菌种。 1 1 木霉抗菌的广谱性 据报道，木霉菌能够对多种植物病原真菌发生作用，如镰孢霉，曲霉，辣椒 疫霉，齐整小菌核，腐霉病，立桔丝核菌【1 帅3 ，灰霉病，黄瓜枯萎病等。据目前 统计，作为生防菌使用的绿色木霉、哈茨木霉、康氏木霉、钩状木霉和多孢木霉， 它侣至少对1 8 属2 9 种病原菌在体外或在活体上具有拮抗作用。 1 2 木霉菌的适应性强 木霉，俗称绿霉，木霉的适应性强，在4 4 2 范围内都能生长繁殖，甚至阳 光也晒不死，繁殖速度快，片段菌丝也能迅速分枝蔓延形成菌落。木霉菌是土壤 微生物区系的重要组成部分。据报道称，白田间枯萎病棉株根际分离到的3 5 个 哈茨木霉菌系，其中的一个菌系t - 3 5 可以有效地抑制棉花枯萎病菌。在温室实 验中，将该菌系的泥炭糖蜜制剂( 在1 ：1 的糖蜜和泥炭混合物上培养的t - 3 5 ) 施入土中，或制成分生孢子悬浮液进行拌种，可降低枯萎病发病率。每公斤土壤 中含哈茨木霉分生孢子2 1 0 6 2 1 0 7 个时，可降低土壤枯萎病菌群体数量，抗 生菌在土壤中可连续存活三年并可增殖。木霉菌的适应性还表现在它对一些杀菌 剂的抗性，例如木霉菌对溴甲烷，五氯硝基苯，克菌丹，代森锰等有天然抗性， 并且木霉孢子的萌发能适应各种湿度范围和较广的p h 范围。如绿色木霉可在p h 4 7 5 的培养基上快速生长，这一特性能确保木霉在土壤中保持一段时期的高数 量水平，而不会在短时期内消失，这样有利于其抑菌效果的发挥。 1 3 木霉抑菌作用的多机制性 木霉菌的抑菌作用机制几乎包括了各种可能机制o ”，并因此收到广泛的中 使，这也是木霉用途广泛，效果明显的重要原因之一。目前已经研究的较为透彻 的机制主要包括一下几种机制： 抗生：木霉在生命过程中可产生拮抗性化学 物质，这些物质包括挥发性抗生素和非挥发性抗生素，在p h 值低时尤其如此。 1 9 3 2 年w e i n d l i n g 确定木素木霉产生一种称为胶霉素g l i o t o x i n 的抗菌物质，随后 多种抗生素和胞外酶相继被分离和鉴定。木霉产生的抗真菌代谢产物至少有3 2 种以上。多数种类可产生不止一种抗生素，如哈茨木霉1 2 种，康氏木霉9 种， 绿色木霉1 0 种，钩状木霉7 种，长枝木霉3 种，多孢木霉2 种，木素木霉2 种 。木霉在培养中产生的抗菌类物质有木霉素、胶霉素、绿啶和抗菌肽以及挥发 性抗菌素一乙醛。这些抗生素的化学性质各不相同，包括了戊酮，辛酮，类萜， 多肽和氨基酸衍生物等几大类。 重寄生作用：木霉是植物病害生物防治最有 效的菌寄生物。早在1 9 3 2 年w e i n d l i n g 就发现木素木霉( zl i g o r u m ) 和立枯丝核 菌( r h i z o c t o n i a s o l a n i ) 之间存在寄生关系汹1 ，以后又陆续在很多藻类、半知菌、子 囊菌和担子菌中发现有木霉寄生。目前已发现木霉至少可寄生1 8 属2 9 种植物病 原真菌。木霉寄生于病原菌的菌丝上可以抑制其活性，寄生于菌核上可以有效地 减少感染的数量。此外，木霉还能侵染根状菌索、菌核和许多真菌的子实体啪1 。 寄生菌靠趋化性与特异性植物凝集素的凝集作用来识别寄主，然后缠绕于病原菌 的菌丝上或侵入菌丝内使菌丝死亡。在部分被寄生的细胞壁上可观察到侵入孔 ( 图1 ) ，这是由于寄生菌产生的能溶解病原菌细胞壁的葡聚糖酶、甲壳酶等的 结果。 溶菌作用：木霉有时不与寄生菌丝直接接触，同样可以引起它们的解 围1 哈茨木霉在腐霉菌细胞壁上的侵入孔 f i g1e n t e r i n g 嘶h o l eo nc e l lw a l lo f p y t h i r ma p h a n i d e r m a t u mb yt r i c h o d e r m ah a r z i a n a m 2 体，并最终消失。这与木霉分泌产生的的b - 1 ，3 葡聚糖酶、几丁质酶、木聚糖 酶、蛋白酶和纤维素酶等有关啪】。它通过酶的作用使真菌细胞壁遭到破坏，继而 引起原生质解体。有研究发现，在对植物病原菌不产生抗生素的抗生作用中溶菌 酶占重要地位。 毒性蛋白：核塘体钝化蛋白t r i c h o l i n 能抑制足s o l a n i 的生长 与繁殖。 竞争作用：包括空间位点竞争和营养竞争。木霉的生长速度远比 一般土传病原真菌快，是空间和营养源的有力竞争者。但许多环境因素，如土壤 p h 值或对木霉有毒害作用的化学杀菌剂均能影响木霉的竞争能力。用适量的c s 。 作土壤消毒剂能使假蜜环菌( a r m i l l a r i am e l l e a ) 活力变弱，提高木霉的竞争优势 而成为假蜜环菌的拮抗剂。h u b b a r d 等发现，土壤中含有低剂量的铁离子或吸附 铁的荧光假单孢( p e s u d o m o n a s f l u o r e s c e n s ) ( 产生含铁细胞) 能降低哈氏木霉的生 防活性。s i v a n 等( 1 9 8 9 ) 研究证明木霉的竞争在镰刀菌病害防治中有重要作用， a h a m a d 和b a k 盱( 1 9 8 7 ) 也有类似报道。 诱导抗性：y e d i d i ai ，b d n h a m o un 和c h e ti 观察到木霉穿入黄瓜根部主要抑制了根部表皮和外表皮，在真菌刺穿位 点外发现形成障碍的沉积物，壁添加物包括大量胼胝质。生物化学分析表明，接 种木霉可分别在4 8 、7 2 小时提高过氧化物酶、几丁质酶的活性。哈茨木霉处理 根、叶明显诱导黄瓜的抗性形成。总之，木霉菌通过以上几种机制来抑制一些 植物病菌，而实际上木霉的生防效果往往是以上几种机制综合作用的结果。此外， 某些木霉菌株还有提高出苗率和刺激植物生长的作用。“3 2 捌。 2 、木霉菌的生物学作用及其应用效果 2 1 、木霉在植物病害防治方面的应用及效果 水稻纹枯病( r h i z o c t o n i as o l a n i ) 是我国水稻的主要病害之一，分布广、 危害重【3 5 l 。2 0 世纪6 0 年代以来，随着矮杆品种和杂交水稻的推广，密植和施肥 水平的提高，此病害日益加剧。水稻纹枯病主要危害叶片、叶鞘，严重是导致叶 片枯死，从而影响光合产物的积累和运输，导致秕谷率增加，千粒重下降，受害 轻的减产5 一1 0 ，重的可达5 0 - - 7 0 。因此，纹枯病的防治是水稻高产栽 培的关键措施之一。在水稻育种方面，目前还没有选育出真正抗纹枯病的品种， 现在主要采用化学防治的方法控制该病。化学防治见效快，效果好，但是成本高， 环境污染严重，甚至引起药害。生物防治可以扬长避短，可对水稻进行全生育期 保护，对环境无污染。 利用木霉来防治水稻的一些真菌病害已见报道，并且取得了很好的效果。 沈永安【3 6 1 等人已经用绿色木霉来防治水稻纹枯病，效果较为显著。据林志伟 3 7 1 等人报道称，哈茨木霉、康氏木霉、绿色木霉和黄绿色木霉四种木霉菌对水稻稻 瘟病菌都有这不同程度的抑制作用。另据徐同【3 8 】等人的研究声称，经过哈茨木 霉种子处理过的水稻幼苗较未经处理的对照组表现出对稻瘟病菌和白叶枯病菌 较明显的抗性。此外，张广志、文成敬【3 9 】用木霉来防治玉米纹枯病，也取得了 很好的效果。 大豆根腐病是大豆上最重要、最难防治的病之一，在大豆的各种植区均有 发生，且今年来呈逐年上升的趋势【柏l 。该病发生时，大豆严重减产，甚至颗粒 无收。大豆根腐病致病菌包括镰刀菌、腐霉菌、立枯丝核菌、紫青霉菌等，由镰 刀菌引起的根腐病是最常见的大豆根腐病，目前生产上对该病的主要防治是以化 学药剂控制为主。孙冬梅嘲等人利用黄绿木霉的诱变菌株对大豆根腐病进行防 治，取得了初步的成效。 草莓灰霉病是草莓栽培中最普遍的一种病害，主要发生在果实、花瓣、萼 片及枝叶等部位上，特别是保护地草莓，在果实趋于成熟时最易发病。如果遇到 长时间阴雨天气，发病最为严重，会造成草莓大面积严重减产【4 1 1 。田连生h i 等 人利用木霉对草莓灰霉病进行防治，并且取得了较明显的防治效果。 辣椒白绢病、立枯病、疫霉病【4 2 4 3 】是辣椒栽培中三种常见的土传真菌瘸害， 并且危害性很大，这三种病害常在辣椒栽培期间爆发，造成辣椒死苗及成株死亡， 进而造成严重的经济损失。这几种病害都属于土壤传播的病害，防治困难。长期 以来，人们一直以化学手段防治为主，但是由于致病菌抗药性的增强j 造成了这 几种病害成逐年上升的趋势。同时，由于长期使用化学药物，造成有毒物质的残 留，而且还抑制了土壤中的其他有益的微生物。因此，生物防治成了人们选择的 最佳防治手段。浙江大学胡东维等人报道称，哈茨木霉n f 9 菌株和t c 3 对辣椒疫 霉病具有强烈的抑制作用。另据刘任、卢兆金【4 3 】等的研究称，哈茨木霉菌株 ( t r i c h o d e r m ah a r z i a n u m ) t 2 对辣椒疫霉( p h y t o p h t h o r ac a p s i c il e o n i a n ) 、齐整小菌 核( s c l e r o t i u mr o l f s i is a c c ) 、立枯丝核菌( r h i z o c t o n i as o l a n ik t h n ) 等辣椒土传真菌 病害的病原菌都有着较强烈的抑制作用。 周红型”1 等人的研究结论表明，绿色木霉处理过的黄瓜苗灰霉病发病几率 明显降低。除灰霉病外，黄瓜枯萎病，作为一种土传真菌病害，也一直困扰着黄 瓜栽培，并且呈现出逐年加重的趋势，该病害流行时可使黄瓜减产2 0 以上。目 前对付黄瓜枯萎病还没有较好的防治方法，因为枯萎病菌的菌丝和孢子在土壤中 越冬，其厚垣孢子在土壤中存活年限较长，且枯萎病菌一旦进入植株体内，化学 药荆防治十分困难。蒲金基等人在研究中发现，绿色木霉对黄瓜枯萎病有着较强 的抑制作用，并且在木霉的培养基中补施一定的营养物( 如葡萄糖) 可以增强木 霉对枯萎病菌的抑制作用。 我国是一个烟草生产和消费国，种植的烟草除了自身消费以外，其余全部 用于出口。中国的烟草出i s l 每年给中国带来大量的外汇，烟草出口是我国得外汇 的重要来源之一。但是烟草病害严重的降低了烟草的产量，影响了烟草的品质， 4 给国家带来了较大的经济损失。在烟草病害中，烟草赤星病 4 5 4 6 4 7 1 是目前我国 各烟草种植区烤烟成熟期日益严重的主要病害，在我国各烟区都普遍发生。王革 l 4 6 j 等人在研究中发现，木霉t v 1 菌株在是室内条件下可以极强的抑制烟草赤星 病菌。方敦煌【4 7 l 等人的研究也发现木霉菌对烟草赤星病有着一定的防治作用。 此外，陶刚f 4 5 】等人还发现木霉产的几丁质霉对对赤星病菌的孢子萌发有明显的 抑制作用，并且在刚开始作用的1 2 d , 时内抑制率最高，可达6 6 9 。 槁花黄萎病是一神世界性的、对棉花危害极大的病害，它是由大丽轮枝孢 菌【4 9 】引起的。自1 9 1 4 该病害在美国首次被发现并报道以来，现在已在世界各大 产棉区流行起来。由于我国在1 9 3 5 年从美国进口斯字棉，该病害也随之传入我国， 后来随着棉种调运，棉花黄萎病在我国不断蔓延开来。尤其是在2 0 0 2 - - 2 0 0 3 年， 该病在全国各大产棉区大面积连续流行【4 8 】，病害面积高达3x1 0 6 h m 2 ，给棉农造成 了直接的经济损失。由于该病是通过土壤进行传播，防治难度较大，现在使用的 一些常规防治手段也只是治标不制本。目前，在缺乏有效防治手段的情况下，生 物防治将是一种重要的辅助防治方法。山东省科学院的杨合同等人在研究中发 现，在盆栽条件下，木霉s m f 5 菌株对棉花丝核菌立枯病、棉花枯萎病及棉花黄 萎病均有较好的防治效果。同时，山东大学的宋晓妍等人在试验中也发现，5 、 木霉菌株生长快，可迅速地占领生长空间，并能产生多种胞外细胞壁降解酶类， 同时产生耐热的抑菌物质，两者能够协同作用于棉花黄萎病菌，可以增强抑菌效 果。 药用植物的生长、药材的品质及产量均受病虫危害影响较大，尤其是受土 传病害较为普遍。麦冬【5 0 1 、j i i 芎 5 3 1 、丹参1 1 、黄芪5 2 1 等四种根部入药的名贵药 材一直遭受根腐病的侵害。引起麦冬和川芎根腐病的病原菌是尖孢镰刀菌，当这 种病在田间爆发时，会造成麦冬减产2 0 一8 0 ，川芎减产3 0 以上：引发黄芪 和丹参根腐病的病原菌是腐皮镰刀菌，腐皮镰刀菌发病时，会导致这两种药材的 根部完全腐烂成黑褐色，产量显著降低，其外观性状和品质均不再符合药用要求。 曾华兰( 四川省农科院) 发现木霉菌株哈茨木霉t 2 3 制剂和t 1 5 8 n 剂对尖孢镰刀 菌引起的麦冬根腐病有着显著地控制作用，防治效果优于化学农药代森锰锌。随 后，曾华兰等人又将这两种木霉制剂用于尖孢镰刀菌引起的川芎根腐病的防治 上，也取得了较好的防病增产效果。曾华兰在研究中还发现，木霉对腐皮镰刀菌 引起的丹参根腐病也有着很好的防治效果。另据膦艳萍【5 2 】( 西北农林科技大学) 研究报告称，木霉制剂在室内和盆栽试验中，对黄芪根腐病菌有一定的防治效果。 2 2 、木霉的促生长作用研究概况 关于木霉能够促进植物生长方面的报道已有很长时间了，不仅术霉，毛壳 菌属( c h a e t o m i u m ) 、黑根霉( r h i z o p u sn i g r i c a n s ) 和粉红镰孢霉( f u s u r i u mr o s e u m ) 在悉生条件下能够促进植物生长，说明促进植物生长不仅仅局限于木霉属真菌， c h a n g t “j 通过实验证明当用泥土和糠作为基质的哈茨木霉培养物或分生孢子处 理土壤后，辣椒、长春花和菊花等植物均出现高的发芽率、开花早而多、植株及 植株湿重增加的现象。1 9 8 6 年，美国和俄国科技人员发现当木霉生物农药和生物 肥料在田伺应用时，作物夜色浓绿、叶片变宽变厚、茎干变粗壮、产量明显提高 嘲。美国克罗拉多洲大学w i n d h a m l 5 6 1 在固定的悉生环境下，进行了哈茨木霉和 康宁木霉刺激植物生长的试验，在玉米、士豆、烟草及红萝卜等作物上均表现出 了高发芽率、出苗率及植物干重增加的现象，木霉刺激植物生长的程度与植物生 长的基质有着紧密联系。k 1 e i f e l d 和c h e t 发现用泥土或糠作为基质的哈茨木霉菌 株培养物在刺激辣椒生长方面比以孢子悬浮液作为种子包衣剂有更为明显的效 果，提示了泥土或糠能提供丰富的营养来源，而使它能够在土壤中大量增殖【5 ”。 c a l v e t 5 8 1 观察了用绿色木霉和一种固根菌混合处理金盏花后，出现了明显的促生 长作用，深绿木霉本身不会对终极腐霉菌产生抑制作用，但当它和这种固根菌混 合后，就会对终极腐霉产生抑制，促进了植物的生长，因而试验证明植物根际微 生物在木霉促进植物生长过程中起着重大作用。尽管美国和以色列一些实验室对 哈茨木霉的根际能力进行了大量的研究，并获得了大量的数据，但并没有提及与 刺激植物生长有关的致病菌和哈茨木霉相互作用的机理1 5 ”，实验中使用的木霉 并不是对所有植物都起作用，并且在同一实验室，使用同一菌株的情况下，前后 两次试验结果不一样，说明木霉在刺激植物生长过程中易受其它外界条件的影 响。 早在上个世纪初有一种广为流传的观点删认为：木霉刺激植物生长的作用 是在其抑制土中壤其它病原茵的生长过程中产生的。从这种观点我们可以推断 出，所有生长在开放环境中的植物由于或多或少受到病原菌的干扰而不能达到其 生长的最大极限。在植物根际施加木霉厚，抑制了病原菌对植物的侵害，使植物 的生长潜能得到发挥。 为了证明木霉是通过抑制土壤中其它病原菌地方式来促进植物生长这种观 点的正确性，许多科研工作者在土壤病原菌被完全消除地情况下，进行了木霉刺 激植物生长方面的研究，最明显的例子是在悉生地环境下，即实验中只包括植物 和木霉两种活体有机物，但由于悉生环境与真正的土壤环境相距太大，因此其结 果的可靠性值得认真考虑。 木霉的根际能力可能是其产生刺激植物生长的有力证据。大多数分布广泛 的木霉菌株的根际能力非常有限。a h a d 和b a k e r , , j 木霉的一些菌株的根际能力进 行了详细的研究，他们使用苯莱特杀真菌剂诱变了哈茨木霉、康宁木霉及绿色木 霉菌株，筛选出了对苯莱特具有抗性的菌株，同时也使这些菌株的根际能力有了 6 提高原先的试验目的是想获得对苯莱特有抗性的菌株，以使木霉能与苯莱特一起 使用，但没有想到的是，大多数经过诱变对苯莱特有抗性的菌株在除去苯莱特后， 却获得了较高的根际能力【6 l 彤】，根际能力强的菌株可以更有效地利用碳水化合 物，诸如棉绒、微小晶装纤维、木质素及木聚糖中的碳源。根际能力测定结果表 明：未经诱变的菌株只扩展到根长的3 c m 内，而诱变菌株则扩展到整个根部，直 到根尖8 c m ，其差异非常显著。在对几种不同植物的刺激生长作用实验中，哈茨 木霉突变种均能提高植株的出苗率和促进植物生长，并且大大地减少了根尖区终 极腐霉地数量而抑制了终极腐霉的侵染致病。此外，环境因素诸如土壤p h 值、 温度、土壤中微生物及寄生植物等因素都能影响木霉在根际的定殖。 b a r c a 、b r o w 和h u s s a i n 等的研究证明，在植物的生长发育过程中，根际微 生物产生的植物激素确实起到了一定的促生长作用。但是当前对微生物促进植物 生长的研究大部分还只局限于菌种的筛选和作用效果的比较上，至于根际微生物 为什么可以促进植物生长，提高产量的机制还缺乏充分的试验证据。仅目前已有 的报道而言，根际微生物促进植物生长的机制可能包括以下几种： ( 1 ) 产生促进植物生长的物质据报道，根际微生物在其生命过程中产生 的植物激素、维生素、核酸及水杨酸类物质均可以促进植物的生长。h 啦s a i n 报 道，在大田试验中，由于接种了固氮菌，玉米的产量增加了1 6 。并把此效果归 因于此种菌产生的植物激素。y o u n g 等报道了微生物产生的细胞分裂素在生理作 用浓度范围内与植物根的伸长有着一定的相关性。维生素在生物体内是许多酶的 辅酶或辅基，起着十分重要的作用。早在5 0 年代，原苏联的c o o p e r 就报道了微生 物能产生维生素，如烟酸、生物素、v b l 2 等。人为添加这些维生素可促进橡树和 松树的生长，如v d 3 可促进插条不定根的形成和莴苣种子的萌发。根际微生物在 生长过程中还会分泌一些核酸类物质及其衍生物。刘更另惭肄认为捌酸降解物 可促进植物根系对磷钾的吸收，还可增加植物的光合作用。 ( 2 ) 增加植物对营养元素的吸收i k r a m 6 7 等报道p g p r ( 植物根际促长细 菌) 可引起土壤中的磷发生很大的变化：d eb r i t o 6 s 1 发现p g p r 可以溶解溶解度较 低的磷，b a y a 等研究了根际细菌产生的维生素与磷酸二钙溶解之间的关系，发现 核黄素( v b 2 ) 、生物素、泛酸与溶解难溶性的磷有关。 l ( 3 ) 有机酸对作物生长的促进作用关于有机酸的促作物生长作用，目前看 法不一。一种观点认为其主要作用是作为鳌合剂，促使土壤中磷钾的释放，或对 土壤中的磷钾起到酸溶的作用；另一种观点认为，有机酸本身就可以作为一种活 性物质t 可以促使植物生长。y o s h i k a n a 6 9 研究指出，l ：l 的琥珀酸与乳酸的混 合物在极低的浓度下( 1 0 p p m ) 时，就可促使水培玉米生长。而微生物在生长代 谢过程中会产生一些有机酸，并把它们排出体外，作为次生代谢产物。 7 3 、木霉产胞外酶方面的研究 3 1 、木霉产几丁质酶的开发研究 几丁质是主要由n 一乙酰一8 - d 氨基葡萄糖以o - - 1 ，4 糖苷键连接组成的直 链装高分子聚合物。它是真菌细胞壁以及昆虫和节肢动物甲壳的主要组成部分 删。自然界中几丁质资源十分丰富，据统计，几丁质的年生物合成量超过1 0 。吨 叭1 ，是仅次于纤维素的可再生资源。但是，当前这些资源并没有得到充分利用， 综合利用几丁质已引起了人们的兴趣，目前已有用几丁质酶降解几丁质废料生产 单细胞蛋白魄1 ，以及乙醇“”的报道。由于几丁寡糖和n _ 乙酰氨基葡萄糖具有抗 肿瘤等许多重要的药用价值咖，而用化学方法生产又面临很多困难盯町，因此，利 用几丁质酶生产n _ 乙酰氨基葡萄糖。”和几丁寡糖“7 1 也已越来越引起人们的重 视。 自m o n r e a l 呻1 等报道t v i r i d e 产生几丁质酶以来，由于木霉几丁质酶在生物 防治及真菌细胞壁降解删等方面的独特作用，有关研究开始增多。u l h o a 等。“ 人对t h a r z i a n u m 生产几丁质酶培养基的碳源和氮源组成进行了优化；使酶活由 0 0 5 4 u 提高到0 1 9 7 u 。 木霉几丁质酶具有较长货架保存期，利用协同增效作用的原理可以与少量化 学杀菌剂混合，也可与生防细菌混合，用以防治温室或大田作物病害，有开发应 用前景邮3 。 3 2 纤维素酶的开发研究 木霉的纤维素酶是胞外酶，可经过过滤、离心等生物学方法从木霉菌体发酵 液中提取出来。里氏木霉是目前产纤维素酶的丝状真菌中研究得最多的一种。 该种木霉能产生一系列纤维素酶，包括纤维二糖水解酶和内切葡聚糖酶。1 9 9 9 年，江苏的余晓斌汹1 等进行了分批与流加发酵法生产纤维素酶的研究。他们采用 了里氏木霉r u t c - 3 0 ，对2 5 l 罐分批和流加发酵产酶条件及其优化方法进行了系 统的研究。通过研究不同浓度的s o l k a f l o c ( 纤维素粉) 对分批发酵产酶的影响， 发现菌体浓度与产酶量随底物浓度增加而增加。但是高浓度底物则会对菌体初始 生长产生强烈抑制，使产酶量下降。 黑龙江曹亚彬嘲等对纤维素酶的固体发酵培养法进行了研究，通过对菌株 产酶能力的测定，确定了绿色木霉( t r i c h o d e r m a v i r i d e ) h w 0 7 作为生产菌株，研究 了培养基组成、培养条件和培养过程对产酶能力的影响，确定了固体发酵生产纤 维素酶的生产工艺，研究了纤维素酶的酶学特性。 浙江夏黎明研进行了纤维废料固体发酵生产纤维素酶，以木制纤维废料为 主要原料，采用里氏木霉固态发酵生产纤维素酶。实验中发现，在同二固态发酵 8 培养基上，至少可以重复进行三批产酶试验。每批的培养周期依次缩短，纤维二 糖酶活力分批一次增大。 广东吴慧清、黄小茉、吴清平删等使酶活回收率达到2 1 0 - 2 4 5 ，采用丹宁 作为纤维素酶的沉淀剂，可将纤维素酶从酶一丹宁复合物中透析出来。丹宁、p e g 的用量与酶液中的蛋白质含量有关，p e g 超过解析酶用量的一定范围，因激活纤 维素酶使酶活回收率超过1 0 0 ，过多p e g 会使系统发生相变化，从而使酶失活， 使酶活的回收率急剧下降。 3 3 木霉产木聚糖酶的开发研究 刘超纲等刚对里氏木霉进行了选择性合成木聚糖酶的研究，发现在一定条件 下，里氏木霉可选择性的合成木聚糖酶，选择性合成程度与碳源种类、浓度及碳 氮比的大小有关。以低纤维素污染的木聚糖为碳源，适当降低碳源的浓度，提高 碳氮比可以木聚糖酶选择性合成的程度。以玉米芯粗木聚糖为碳源，采用添加碳 源和氮源的方法控制发酵过程中的碳源浓度在5 9 l 下，碳氮比在1 1 2 以上时， 产生的木聚糖酶和纤维素酶酶活分别为3 5 5 u m l 、0 2 u m l ，两种酶活的比值 为1 1 7 5 。 毛连山等删以里氏木霉( t r i c h o d e r m a y e e s e i ) r u tc - 3 0 为产酶菌，进行了以 酶解渣为碳源制备木聚糖酶的研究，发现低聚木糖制备过程中以酶解渣为碳源可 诱导产生含低纤维素酶活( 0 1 0 6 i u m 1 ) 的木聚糖酶( 1 5 4 6 7 i u m 1 ) ，两种酶活的 比值达1 4 5 9 ，与以粗木聚糖为碳源产木聚糖酶相比，木聚糖酶活提高了i 6 7 倍， 而纤维素酶活没有增加。此酶在5 0 条件下分解粗木聚糖和酶解渣时，p h 5 时酶 解效果最好，水解产物通过高效液相色谱(