（生物物理学专业论文）atp生物发光法检测微生物总量及其自动原位分析的研究.pdf

浙江大学硕士学位论文 y 6 7 n 7 n 3 摘要 微生物广泛分布于自然界中，对生态系统的物质交换和能量流动起着不可 替代的作用，同时微生物与人类健康有着密切的关系。对微生物的研究关乎整 个自然界和人类社会。微生物检测技术为微生物的研究提供了有力的手段。传 统的微生物检测方法费时费力，难以满足不同情况下的检测要求，而a t p 生物 发光法作为一种快速、简便的微生物检测方法，在环境监测、食品卫生、生命 科学、医药等领域都有广阔的发展前景。其自动原位检测技术的研究更是国内 外的首创，可以解决长期连续监测和极端环境下无法进行人工检测等问题，具 有重要意义。 本文从a t p 生物发光法的基本原理切入，系统分析了反应中的各种影响因 素，包括离子和盐度、p l g 值、游离态a t p 、温度以及荧光素酶活性，得到最佳 的p 珏值范围为7 7 0 8 ，0 ，温度为2 5 。c 左右。同时分析了其他几种影响因素对反 应的影响程度的大小，并提出相应的措施，去除干扰。掌握并优化a t p 生物发 光法，将其应用于实际水体微生物量的测量，按照淡水和海水两种情况，分别 测量了西湖和海洋的水体微生物量，得到西湖水体微生物的水平分布情况和海 洋水体微生物的垂直分布情况。还对赤潮的预警做了可行性研究，认为a t p 生 物发光法结合自动原位监测仪，可以实现赤潮的预警。最后，作为a t p 生物发 光法检测微生物量的进一步研究，提出一套可行的自动原位监测仪的设计方案。 关键词微生物；a t p ；生物发光法：自动原位：检测 浙江大学硕士学位论文 d e t e c t i o no fb i o m a s sb ya t pb i o l u m i n e s c e n c ea n dr e a l i z a t i o no f a u t o m a t i co n l i n em o n i t o r i n g a b s t r a c t l o uk a i k a i ( b i o p h y s i c s ) d i r e c t e db yy es h u m i n g m i c r o o r g a n i s m s ，w h i c hw i d e l ye x i s ti nn a t n r e ，p l a yi m p o r t a n tr o l e i nt h em a s s e x c h a n g ea n dt r a n s f e ro fe n e r g y t h e r ei sa na f f i n i t yb e t w e e nm i c r o o r g a n i s m sa n d h u m a nh e a l t h t h er e s e a r c ho f m i c r o o r g a n i s m sc o n c e r n st h ew h o l en a t u r ea n dh u m a n s o c i e t yn e a r l y t h em e a s u r e m e n tt e c h n o l o g yf o rm i c r o o r g a n i s ms u p p o r t st h er e s e a r c h o fm i c r o o r g a n i s m sa sap o w e r f u lt 0 0 1 h o w e v e r , t r a d i t i o n a lm e a s u r e m e n tm e t h o d t a k e st o ol o n gt i m et om e e tw i t hd i f f e r e n tc o n d i t i o n s a t pb i o l u m i n e s c e n c e t e c h n o l o g y , a sar a p i da n dc o n v e n i e n tm e a s u r e m e n tm e t h o df o rm i c r o o r g a n i s m s ，h a s ag r e a tp r o s p e c ti n a p p l i c a t i o ni nt h ef i e l d s o fe n v i r o n m e n t a lm o n i t o r i n g ，f o o d h y g i e n e ，l i f es c i e n c e ，m e d i c i n e ，e t c t h er e s e a r c ho fa u t o m a t i co n l i n em e a s u r e m e n t t e c h n o l o g yi si n n o v a t i v ea th o m ea n da b r o a d i tc a l ls o l v et h ep r o b l e m so fl o n g t e r m c o n t i n u a lm o n i t o r i n ga n dm e a s u r e m e n t si nt h ee x t r e m ee n v i r o r a n e n t sw h i c ha r en o t s u i t a b l ef o rh u m a na c t i v i t y t h e r e f o r e ，t h er e s e a r c ho fa u t o m m i co n l i n em e a s u r e m e n t t e c h n o l o g yi se x t r e m e l ys i g n i f i c a n t 。 t h i ss t u d y , b a s e df i nt h ee l e m e n t a r yr e a c t i o np r i n c i p l e ，a n a l y z e dd i f f e r e n tf a c t o r s w h i c hi n f l u e n c e dt h ea t pb i o l u m i n e s c e n c er e a c t i o n ，i n c l u d i n gi o n sa n ds a l i n i t y , p h v a l u e ，d i s s o c i a t i v ea t p , t e m p e r a t u r ea n dt h ea c t i v i t yo fl u e i f e r a s e t h eo p t i m a lp h v a l u ew a sb e t w e e n7 7a n d8 , 0a n dt h et e m p e r a t u r ew a sa b o u t2 5 。c t h ea f f e c t i o n l e v e lo fo t h e rf a c t o r sw a sa l s oa n a l y z e d , a n ds o l u t i o n sw e r ep r o p o s e dt oe l i m i n a t et h e i n t e r f e r e n c e f u r t h e r m o r e ，a t pb i o l u m i n e s e e n c et e c h n o l o g yw a sa p p l i e d i nt h e d e t e c t i o no fm i c r o o r g a n i s m si nr l i l 加r a lw a t e r r e s e a r c ho b j e c t sw e r ew a t e r si nw e s t l a k ea n dm a r i l i ei nt e r m so ff r e s hw a t e ra n ds a l tw a t e r a sr e s u l t s m i e r o b i a l 2 浙江大学硕士学位论文 h o r i z o n t a ld i s t r i b u t i o no fw e s tl a k ea n dm i c r o b i a lv e r t i c a ld i s t r i b u t i o no fm a r i n e w e r eo b t a i n e d m o r e o v e r f e a s i b i l i t yo ff o r e c a s tt or e dt i d ew a ss t u d i e d t h er e s u l t i n d i c a t e dt h a ta ：t pb i o l u m i n e s e e n c et e c h n o l o g y , c o m b i n e dw i t ha u t o m a t i co n l i n e m e a s u r e - m e t e r , c o u l dr e a l i z et h ef o r e c a s tt or e dt i d e f i n a l l y , a sf u r t h e rs t u d yo f t h e d e t e c t i o no fm i c r o o r g a n i s m sb ya r pb i o l u m i n e s c e n c et e c h n o l o g y , af e a s i b l ed e s i g n o f a u t o m a t i co n l i n em e a s u r e m e t e rw a sp r o p o s e d k e y w o r d sm i c r o o r g a n i s m ；a t p ；b i o l u m i n e s c e n c e ；a u t o m a t i co n l i n e ；m e a s l 】r e m e m 3 浙江大学硕士学位论文 图表目录 图2 ，1a t p 生物发光法检测微生物的流程图1 5 图2 2a t p 浓度与相对发光值的标准曲线19 图3 1 不同n a + 浓度下的相对发光值的变化图2 1 图3 2 不同m g ”浓度下相对发光值的变化图2 3 图3 1 3 不同c a 2 + 浓度下的相对发光值的变化图2 4 图3 4 不同k + 浓度下的相对发光值的变化图2 5 图3 ，5 不同盐度下的相对发光值的变化图2 6 图3 6 在n a c l 、m g c l 2 和混合盐三种不同情况下r l u s 随盐度变化的对照图2 7 图3 7 存在不同浓度的n a + 和m f + 时r l u s 随离子浓度变化的对照图2 8 图3 8 不同p h 值下的相对发光值的变化图2 9 图3 9 不同温度下相对发光值的变化图3 2 图3 1 0 新鲜酶试剂所做的数据流3 4 图3 1 l 在- 2 04 c 下放置2 1 天后的酶试剂所做的数据流3 4 图3 1 2 在2 5 下放置4 小时后的酶试剂所做的数据流3 5 图4 1 西湖采样点分布图3 8 图4 2 西湖水体微生物相对分布图4 0 图4 3 进水口到湖心的微生物浓度变化曲线4 1 图4 4 养鱼池对湖水微生物浓度的影响曲线4 2 图4 5l 号站点微生物浓度随深度的变化图一“ 图4 62 号站点微生物浓度随深度的变化图4 4 图4 7 不同浓度的绿藻与相对发光值的对应图4 6 图5 1 自动原位监测仪的结构图4 8 表3 1 海水中主要阳离子的浓度2 0 7 表3 - 2 不同n a + 浓度下的相对发光值2 1 表3 3 不同m f + 浓度下的相对发光值2 2 表3 4 不同c a 2 + 浓度下的相对发光值2 3 表3 5 不同k + 浓度下的相对发光值2 4 表3 6 不同盐度下的相对发光值2 6 表3 , 7 在n a c l 和m g c l 2 单盐不厨盐度下的相对发光值2 7 表3 8 不同口h 值下的相对发光值2 9 表3 9 不同样品中微生物a t p 浓度和游离态a t p 浓度的比较3 0 表3 1 0 不同温度下的相对发光值3 1 表3 1 l 不同温度下酶活性下降后的相对发光值3 3 表4 1 西湖各采样点微生物浓度3 9 表4 2 合同区两个站点水体微生物量4 3 浙江大学硕士学位论文 第1 章综述 1 1 引言 微生物广泛分布于自然界中，无论是高山平原、江河湖海、动植物体内外， 乃至一般生物无法生存的臭氧层、海洋底部和岩芯中，都有微生物的存在。微 生物在自然生态系统中当担着不同的角色，有的是生产者，如光合细菌、蓝细 菌、盐细菌和单细胞藻类；有的是消费者，如原生动物；有的是分解者，如所 有的真菌和大部分的细菌，它们在生物地球化学循环中发挥着重要的作用，是 大自然元素平衡的调节者【1 捌。此外，微生物还对生态系统乃至整个生物圈的能 量流动起着独特的、不可替代的作用明。另一方面，从人类的角度看，微生物 活动对环境并不都是有益的，有时也可能产生负面影响，对环境造成污染，并 对人类产生危害。病原性微生物以及一些微生物的代谢产物能引起环境污染和 危害。因此，无论从自然界还是人类的角度考虑，微生物的研究都具有及其重 要的意义。 微生物的检测是微生物研究的重要组成部分。传统的微生物检测方法，如 培养计数法，也是国家标准方法【4 】，检测细菌总数需要2 天，酵母和霉菌需3 5 天，费时费力，难以满足一些特定条件下的检测要求，如在线环境监测、食品 卫生检测等都需要及时的数据。而目前快速的微生物检测方法发展的并不完善， 尤其是在线自动检测的方法与仪器则更少。本文就此迫切要求，对a t p 生物发 光法快速检测微生物进行了深入研究。 1 2 国内外研究现状 国外对于a t p 及生物发光现象的研究较早，m c e l r o y 和s t r e h l e r 5 增先提出 了基于a t p 的生物发光的反应机理，在荧光素酶( r l ) 和m 9 2 + 的作用下，荧 光素( l ) 与a t p 发生腺昔酰化活化反应，被活化后的荧光素与荧光素酶相结 合，形成l a m p 的复合体，放出焦磷酸( p p i ) 。该复合体被分子氧氧化，导 致荧光素产生电激发，放出c 0 2 和h 2 0 ，当荧光素从激发态回到基态时发射光。 9 浙江大学硕士学位论文 最后l a m p 脱离酶，形成荧光素l 和a m p ，反应所产生的光和a t p 含量成正 比，根据发光的强弱就可以定量测定a t p 的含量。反应过程如下： a t p + r l + l 一屿r l l a m p + p p i r l l a ，+ 0 2 + r l + a m p + c 0 2 + y a t p 作为代谢作用的能量载体，存在于所有的动物、植物和微生物的活体 细胞中【6 1 ，当微生物死亡后，其体内的a t p 会很快降解掉，不会对活体微生物的 测量产生影响 7 1 。对于一定生理时期内的活体微生物，其体内的a t p 浓度基本稳 定，使得a t p 浓度与活体微生物量之间有较好的线性关系【8 1 。a t p 的这些特点， 即广泛性、易降解性和它与活体微生物量之间的相关性，使其成为较好的活体 微生物的检测指标。h o l m - h a n s c n 和b o o t h t 7 1 也是基于这些特点提出利用a t p 来检 测活体微生物量。 早期检测a t p 的方法是色谱法，但这种方法的精度不高，很难准确测量微 量的a t p 。随着荧光素荧光素酶反应体系的发现与研究，出现了一种全新的方 法，即a ，r p 生物发光法。结合荧光仪等检测装置，使得该方法具有很高的测量 精度，能够满足不同范围的检测要求。生物发光法的高灵敏度以及a t p 自身的 特点，使a t p 生物发光法能够很好地用于微生物量的检测。s t r e h l e r 9 1 对该方法 进行了进一步的研究，提出适宜的反应温度和p h f 卣。c h a p p c l l e _ ；| j l e w i n 10 】则将 该方法应用于细菌的检测。 要检测微生物体内的a t p ，必须先破碎细胞，提取细胞内的a t p 。早期主要 采用加热煮沸法来提取a t p ，不同的人采用的加热法基本一致，只是使用的缓 冲液有所不同 1 1 , 1 2 。后来又相继出现了三氯醋酸( t r i c h t o r o a c e t i ca c i d ，t c a ) 法、超声波法等。l u n d i n 和t h o r e n i r a 及b a n c r o f t 1 4 j 等对各种方法进行了比较， 认为三氯醋酸法是比较实用的方法。a t p 提取方法的完善，使生物发光法得以 检测微生物体内的a r p ，进而得到微生物的量。 荧光素酶在反应中起着重要作用，由于早期的技术限制，荧光素酶的提取 1 0 浙江大学硕士学位论文 和纯化费用很高，使a t p 生物发光法的研究受到了很大的限制，但随着分子生 化技术的不断发展，能够大量制取纯度很高的酶，大大促进了a t p 生物发光法 的研究与应用。 用于a t p 生物发光法测量的仪器也在不断发展，液闪计数器、专门的照度计 等不断出现b ”l 。但或多或少存在着操作不便、灵敏度不商、不能自动化等问题。 随着仪器的不断改进，出现了一些商用仪器，如美国t u r n e r b i o s y s t e m s 公司的 t d - 2 0 2 0 荧光光度计等，检测限达到1 0 1 6t o o l a t p ，能够达到大多数的检测要求。 但在线自动检测方面的仪器还是一个空白。 国内的研究起步较晚，基本原理方面的研究较少，只是对a t p 的提取方法 进行了一些研究【。相对而言，应用方面的研究较多，主要集中在食品卫生方 面。 1 3 应用研究 1 3 1 食品卫生领域的应用 微生物检验是食品制造及流通过程中卫生学检验和质量管理的重要项目。 食品的细菌学检验通常采用琼脂平板菌落计数法，一般需要2 3 天，检验结果往 往滞后。a t p 生物发光法作为一种简便、快速的微生物检验方法和食品生产环 境清洁度的检测方法，近年来在国内外倍受瞩目，并得以广泛应用。 王东黎等人采用a t p 掌物发光法的实验表明，不论是细菌还是食物残渣，能 量物质的含量均与其发光值存在很大的相关性c 17 】( r 0 9 9 ) 。此外，美国r o l f 作 了该法与传统微生物检验方法( a d o c 法和d v c 法) 的比对，结果证明这两种方 法的检测结果具有很高的相关性【1 8 】。 与传统微生物检测方法相比，a t p 生物发光法具有简便、灵敏、快速等优点， 小型化的测试仪器便于随身携带，菲常适合现场卫生监测。在现场使用，可迅速发 现可能存在的污染环节，及时采取措施，从而尽可能避免产品和资金的浪费1 9 】。作 为快速的检测方法，将具有很好的应用前景。 浙江大学硕士学位论文 1 3 2 生命科学领域的应用 聚合酶链反应( p c r ) 用于病原微生物的检测，其扩增产物主要采用凝胶 电泳法分析，操作繁琐，因此用于临床的p c r 检测大多为定性分析。姚群峰等 建立了一种基于生物发光技术的定量检测p c r 产物的方法，并用于乙型肝炎病 毒( h b v ) 定量p c r 检测。首先利用a t p 硫酰化酶( a t ps u l f u r y l a s e ) 将焦磷 酸( p p i ) 定量转化成a t p ，然后利用虫荧光素酶( l u c i f e r a s e ) 系统发光检测 a t p ，从而确定样品中p p i 含量，进而确定样品中h b vd n a 模板的量。认为该 方法是一种操作简便、灵敏度高的定量p c r 方法1 2 m 。 瑞典学者r o n a g h i 禾1 n o r d s t r o n 等发明了一套利用生物发光进行快速核酸序 列分析的装置。由一套计算机控制的蠕动泵及其阀门构成连续进样系统，并在 d n a 聚合反应体系中加入腺苷三磷酸双磷酸酶、a t p 硫酸化酶( s u l f u r y l a s e ) 及 荧光素酶。当聚合反应中产生的焦磷酸被a t p 硫酸化酶转化为a t p 时，通过荧光 素酶产生荧光信号，该信号被发光仪记录；而未参与反应的脱氧核苷酸三磷酸 ( d n t p ) 被腺苷三磷酸双磷酸酶消化，这样，只要不断通过进样系统将四种脱氧 核苷酸三磷酸分别注入反应体系，并同时检测发光信号，就可实现模板d n a 序列 的快速判读 2 1 , 2 2 。 o l e j n i k 等人在研究昆虫细胞培养过程中杆状病毒的感染以及重组蛋白的产 生过程时，采用a t p 生物发光法测量细胞内的a t p 量，进而分析病毒以及重组蛋 自的量，取褥较好的结果，认为该方法的最大优点是灵敏度高和即时性好引。 1 3 3 医药领域的应用 在化疗药物疗效检测上，a t p 生物发光法与现今较常用的四唑蓝快速比色 法( m t t 法) 相比，有很多优势：成功率及重复性高，细胞用量少，测量范围 大，于扰因素少，捡澳 效率高，自动化程度高。a t p 生物发光法的临床应用，将 有助于临床医师确定化疗药物组合及制定肿瘤个体化疗方案。使肿瘤病人可以 在整体上优化治疗过程，减少治疗开支，降低药物的毒副作用，达到增加化疗 药物疗效、延长生存期的目的 2 4 1 。 a t p 生物发光法检测技术还能用来表征正常细胞和感染细胞的生存能力。 浙江大学硕士学位论文 z h i v k oz h e t e v 等人在研究吩噻嗪对白血病细胞系和正常囊依赖性淋巴细胞的生 存能力和增值过程的影响时，就采用了该方法嘲。 1 3 4 生态环境领域的应用 传统的衡量可生化性的方法b o d j c o d 。法操作不太方便，采用测定仪， 则比较昂贵，且准确性不高。a t p 生物发光法就很好的解决了这些问题。微生 物对污染物的氧化降解过程，实际上是能量代谢过程，因而通过测定其细胞内 a t p 的量，就能反映其活性程度，从总量上就反映出活体微生物的量。孙洪伟 等人对这种方法进行了阐述，认为该方法具有较高的准确度，且操作方便、快 捷【2 6 1 。 a t p 生物发光法也可用于海洋生态的研究。k a r i nm b j 6 r l o n a n 和d a v i dm k a r l 在测量海水中的a t p 时，先浓缩a t p ，然后用生物发光法进行测量。在海洋 的透光层( o 一1 7 5 m ) ，a t p 的浓度最高，再往深处，浓度变低且较为稳定。通过 a t p 的测量，进而反映微生物在海洋中的分布，以及微生物群体的代谢、营养 状况和能量流动1 i 膏况1 2 7 1 。m a l l l y a m a 等人在测量海水中微生物量时，也采用t a t p 生物发光法f 28 1 。 1 4 存在的问题 a t p 生物发光法检测微生物量的技术发展到现在，已经有了很大的进展， 但仍然存在一些不足。如在海洋、食品、医药等方面的检测中，会受到盐分及 其他化学物质、游离态a t p 等非目标, a t p 的干扰【1 6 刀川，如果忽略这些干扰因素， 必然会使检测结果受到影响。 荧光素酶的反应活性受到盐浓度的影响。溶液中的盐浓度过高，会使蛋白 酶变性，从而使其反应活性降低或受到抑制。所以，检测高盐度的试样时，首 先要脱盐，去除盐分的干扰。另外，由于荧光素酶在环境温度下活性下降较快， 如果前后钡量的时间间隔太长，所得结果就会有较大偏差，所以不宜进行长时 间的连续测定。 a t p 生物发光法虽然还存在一些问题，但其所具有的测量快速即时、测定 1 3 浙江大学硕士学位论文 范围广、可以实现自动化等优点，是传统微生物测量方法无法比拟的，有着很 好的发展前景，如果能够实现在线自动检测，将是这一技术在应用领域的又一 重大突破。 1 4 浙江大学硕士学位论文 第2 章a t p 生物发光法的检测基础 本章是a t p 生物发光法检测微生物量的基础，介绍了实验的基本知识，包 括实验中用至4 的主要试剂与仪器、a t p 的提取方法、标准曲线的制作、样品的 测量，以及实验中的一些注意事项。 a t p 生物发光法检测微生物，需要先将微生物体内的a t p 提取出来，测量 其发光值，再对照由标准a t p 试剂测量所得的标准蓝线，得到a t p 的浓度，最 后转化为微生物的浓度。检测过程如图2 1 所示： 图2 1a t p 生物发光法检测微生物的流程图 f i 9 2 1f l o w d a a r t o f d e t e c t i o no f m i c r o o r g a n i s m s b y a t p b i o l u m i n e s c e n c e 2 1 试剂与仪器 2 1 1 试剂 a t p 生物发光法检测微生物的实验中用到的主要试剂如下 1 荧光素荧光素酶试剂( r l l ) 浙江大学硕士学位论文 将解冻后的1 2 m lr e e o n s t i m t i o nb u f f e r 与r l ，l 粉剂混合，轻轻摇晃( 不能 振荡) 使其溶解，第一次使用前在室温下放置1 小时，以后只需2 0 m i n 左 右。不用时要放置在- 2 0 ( 2 下保存， 2 标准a r p 试剂 a 取o5 m l 的标准a t p 试剂( 1 0 7 m ) 到5 0 m l 的容量瓶中，加入缓冲 滚定容，得到i o 的标准a 评试荆。 b 用移液管取5 m l1 0 部“的标准a t p 试剂到5 0 t o 的容量瓶中，加入 缓冲液定容，得到1 0 9 m 的标准a t p 试剂。 c 重复以上过程，依次得到1 0 邶m 和l o d l m 的标准a t p 试剂。 3 缓冲液 以t r i s - a c e t a t e 作为缓冲液。称取一定量的t r i s 碱，使定容后的浓度为 o 0 5 m ，定容前需要先调节p h 值。将p h 计插入t r i s 溶液中，慢慢滴加乙 酸溶液，直到p h 值为7 8 ，然后定容，在4 c 下保存。 4 a t p 提取剂 采用三氯醋酸( t c a ) 作为a t p 提取帮，浓度为3 0 0 - k _ 00 4 ( w v ) ，在毒 下保存。对于不同的微生物，采用不同的浓度进行提取，细菌和真核细胞 的提取浓度一般为o 5 - 2 5 ，酵母、真菌类则适当高一些。提取结束后， 要用缓冲液将t c a 的浓度稀释到一定的浓度，再进行测量，以减少t c a 对反应的影响引。 2 1 2 仪器 a t p 生物发光法检铡微生物的实验中用到的主要仪器如下： 1 ，t d 一2 0 2 0 荧光光度计 用于检测反应产生的荧光值。数值范围o ，9 9 9 9 9 9 9 ，检测前需要先调整灵敏 度，使检测值在适当的范围内。采用峰值检测法，在反应开始后的一段时 间( 整合时间) 内，每o 2 s 记录一个数据，计算其平均值。也可以实时记 录发光值，作出一条数据流曲线，从而反映整个反应情况。还可以设置延 迟时间，即放入试剂后多长时间开始计时。 1 6 浙江大学硕士学位论文 2 抽滤器及真空泵 用于样品的预处理，可以浓缩、去除杂质等。过滤微生物时，采用o 2 2 1 m a 的滤膜。 3 p h 计 用于调节缓冲液的p h 值，测量样品的p h 值等。 2 2 a t p 提取 在测量微生物的a t p 前，需要将a t p 从微生物内提取出来，a t p 的提取效 率直接影响生物量测定结果。因此，a t p 的提取也就成为a t p 生物发光法测定 生物量的重要步骤之一。其中t c a ( 三氯醋酸) 法和加热煮沸法是两种常用的 a t p 提取方法。 2 2 1t c a 法 t c a 法是目前最常用的a t p 提取方法。t c a 对活细胞有两种作用：一是 破裂细胞膜，释放a t p ，二是使a t p 水解酶失活1 3 】。提取普通微生物中的a t p 时，t c a 浓度为1 5 ，在此浓度下，t c a 对a t p 与荧光素酶的生物发光反应 有较强的抑制作用，必须在反应前对提取液进行中和、稀释，使t c a 浓度等于 或小于0 1 ，此时t c a 对反应的影响基本可以忽略口1 j 2 1 。一般采用口h7 8 左 右的t r i s a c e t a t e 缓冲液进行稀释。 具体提取过程如下：取样品2 m l 置于试管中，加入2 m i t c a 溶液，震荡提 取3 m i n 。完全提取后，取l m l 提取液置于5 0 m l 容量瓶中，用p h 7 8 的t r i s a c e t a t e 缓冲液定容，此时t c a 的浓度为0 0 3 ，不会对反应产生影响。稀释后的提取 液置于44 c 下保存待测。 2 2 2 加热煮沸法 加热煮沸法是前期研究中采用较多的a t p 提取方法。该方法先将样品中的 微生物过滤出来，再将其置于缓冲液中加热煮沸，提取a t p 。抽滤装置包括真 空泵、滤瓶、缓冲瓶，滤膜采用0 2 2 1 s i n 孔径的醋酸纤维滤膜，直径4 7 r a m 。高 浙江大学硕士学位论文 温加热的作用主要是破碎细胞同时使细胞内a t p 水解酶失活。 具体操作过程如下：先将装有8 m l 缓冲液的试管置于沸水浴中。量取一定 体积的样品进行抽滤，抽滤后迅速将滤膜转移到沸水浴的缓冲液中，提取5 r a i n ， 提取后迅速放入冰水浴中冷却，然后将提取液转移到1 0 m l 容量瓶，试管中残留 的提取液用少量t r i s a c e t a t e 缓冲液冲洗两次，冲洗液一并转移到容量瓶中，并 定容，混和均匀后置于4 下保存待测。 2 3a t p 检测 检测样品中a t p 的浓度，需要先用标准a t p 试剂作一条标准曲线。测量得 到样品的相对发光值，与标准曲线对比，得到样品中的a t p 含量。测量荧光所 用的仪器是t d 2 0 2 0 荧光光度计，一般将仪器的设置延迟时间设为l s ，整合时 间设为6 0 s 。 2 3 1 标准曲线制作 在测定管中加入5 0 l z l 一定浓度的标准溶液和5 0 u 1 缓冲液，测定管置于样 品室中，加入1 0 0 - t lr l l 反应剂后迅速盖上样品室的盖子，开始检测。标准液 浓度分别为1 0 、1 0 一、1 0 母、1 0 邶、1 0 1 1 m ，空白值用去a t p 水代替不同浓度 的标准液进行测定，重复3 次取平均值。 以a t p 浓度( m ) 的对数值为横坐标，荧光反应发光值r l u s 的对数值为纵坐标 ( 均为对数坐标) ，绘制标准盥线( 图2 2 ) 。由标准曲线可见，在一定的范围内， a t p 浓度与荧光反应发光值之间有较好的线性关系，样品中a t p 浓度与相对发光 值对应。 2 ，3 2 样品测定 用5 0 m 样品提取液代替标准a t p 试剂，具体操作与制作标准曲线时一样。 最后a t p 浓度与微生物浓度之间的转化，是基于每个微生物包含5x1 0 。1 6g a t p ( t d 2 0 2 0 操作手册) 。需要注意的是，荧光素酶的活性衰减很快，在室温下荧 光素酶试剂只能保存8 小时，如果测定过程超过8 小时则应将荧光素酶反应剂 浙江大学硕士学位论文 图2 2a t p 浓度与相对发光值的标准曲线 f i g2 2s t a n d a r dc u r v eb e t w e e nr l u sa n d c o n c e n t r a t i o n so f a t p 分装在多支小管中，于4 。c 避光保存。每次使用时都要提前将酶试剂取出，并在 室温下放置一段时间，使其恢复到室温。如果样品测定要持续较长时间，可将 分装的酶试剂于2 0 c 冷冻保存，保存过程中要避免反复解冻。如果两个样品测 量的间隔时间较长，就需要重新制作标准曲线，以保证测定的准确性。 1 9 斩江大学硕士学位论文 第3 章a t p 生物发光法的影响因素分析 化学或生物反应都需要在一定的条件下进行，反应底物中的干扰成分以及 外界环境因素的变化，都会对反应产生影响。利用a t p 生物发光法测量微生物 总量时，荧光素酶荧光素反应体系同样会受到各种因素的干扰，如样品中的离 子、p h 值和游离a t p ，以及环境温度、酶活性等。要得到可靠的检测结果。必 须对各种影响因素进行分析，了解其影响程度的大小，寻求解决方法，同时为 实现a t p 生物发光法的自动原位监测提供理论依据。 3 1 离子及盐度对反应的影响 有些水体中存在着大量的离子。会对发光反应产生较大的影响，在检测这 类水体中的微生物时，必须考虑到离子对检测的干扰。 离子本身的影响和离子所形成的盐度的影晌并不一样。一般而言，n a + 本身 对反应的影响较小，但浓度达到一定值后，其盐度就会影响酶的活性，进而影 响反应。这在一定程度上就可以代表盐度对反应的影响。另外，某些离子对反 应有特别的影响，如m 矿+ 就参与了荧光反应体系，所以需要进一步分析，找出 敏感浓度的范围，对反应起促进作用还是抑制作用，考虑是否需要在检测前去 除该离子。 海洋是二十一世纪的研究热点和重点，这部分就针对海洋中微生物的检测， 以海水为研究对象，分析海水中的离子及其盐度对a t p 生物发光反应产生的影 响。海水的平均盐度为3 5 ，主要的阳离子浓度如表3 1 所示： 表3 1 海水中主要阳离子的浓度 t a b l e3 ic o n c e n t r a t i o n so f m a i nc a t i o n si nt h es e aw a t e r 离子n rm f + c a 2 +k + 浓度m 0 4 6 50 0 5 4 2 0 0 0 9 8 2 0 0 1 0 3 2 0 渐江大学硕士学位论文 3 1 1n a + 对反应的影响 n a + 是海水中含量最多的阳离子，也是其他水体中最常见的阳离子之一。分 析n a 对a t p 生物发光反应的影响，有其必要性和重要性。参照海水中n a ? 的 浓度，用n a c l 配制含n a + 浓度为0 0 2 、0 ，0 5 、o 1 、o 2 5 、o 5 、l 、2 5 m 的缓冲 液，以标准试剂为空白作比较。先称取7 3 1 9 n a c l 溶于5 0 m l 的缓冲液中，得到 2 5 m 的溶液，再稀释至u 其它浓度。试样选用1 0 8 m 的标准a t p 试剂。检测结果 如表3 - 2 所示； 表3 2 不同n a + 浓度下的相对发光值 t a b l e3 2r l u sa td i f f e r e n tc o n c e n t r a t i o n so f n a + n a + 浓度m 0 0 0 2o 0 50 1o 2 50 5l 2 5 r l u s6 3 2 5 5 4 2 94 6 5 33 6 7 61 9 3 19 4 7 14 1 2 6 1 0 7 5 图3 1 不同n a + 浓度下的相对发光值的变化图 f i g3 1c h a n g e so f r l u sa td i f f e r e n tc o n c e n t r a t i o n so f n a + 2 l 浙江大学硕士学位论文 由以上数据及图3 1 可知，随着n a + 浓度的增大，相对发光值p l u s 不断减 小。当n a + 浓度为o 4 6 5 m ，即接近海水中n a + 的浓度时，r l u s 约为1 0 2 ，与空 白标样相比减少了8 3 9 ，严重地抑制了a t p 生物发光反应。这种影响主要是 由于n a c i 所形成的盐度造成的，而非n a + 本身的干扰。 3 1 2m 9 2 + 对反应的影响 m 9 2 + 是海水中的重要阳离子，也是参与a t p 生物发光反应的物质，有必要 分析m 9 2 + 对反应的影响。参照海水中m 9 2 + 的浓度，用m g c l 2 配制含m 9 2 + 浓度 为o 0 2 、o 0 5 、o ，1 、o 2 5 、o 5 m 的缓冲液，以标准试剂为空白作比较。即称取 2 3 7 5 9m g c l 2 ( 或5 0 7 5 9m g c l 2 6 h 2 0 ) 溶于5 0 m l 的缓冲液中，得到o 5 m 的 溶液，再稀释到其它浓度。试样选用1 0 - a m 的标准a t p 试剂。检测结果如表3 3 所示： 表3 , 3 不同m 矿浓度下的相对发光值 t a b l e3 3r l u sa td i f f e r e n tc o n c e n t r a t i o n so f m 9 2 + m 矿浓度m oo 0 2o 0 50 10 2 50 5 r l u s6 3 2 95 3 4 24 0 8 12 3 2 41 1 i2 4 8 9 由以上数据及图3 2 可知，随着m 9 2 + 浓度的增大，相对发光值r l u s 不断 减小。当m 矿+ 浓度为0 0 5 4 m ，即接近海水中m 9 2 + 的浓度时，r l u s 约为3 9 0 ， 与空白标样相比减少了3 8 4 ，对a t p 生物发光反应产生了较大的影响。 虽然m 矿+ 参与了a t p 生物发光反应，但并没有因为m 9 2 + 的增加而促进反 应的进行，这说明m 9 2 + 本身对反应的影响并不大。 浙江大学硕士学位论文 图3 2 不同m 9 2 + 浓度下相对发光值的变化图 f 培3 2c h a n g e so f r l u sa td i f f e r e n tc o n c e n t r a t i o n so f m 9 2 + 3 1 3c a 2 + 对反应的影响 c a 2 + 也是海水中的重要组分，分析c a 2 + 对反应的影响时，参照海水中c a 2 + 的浓度，用c a c l 2 配制含c a 2 + 浓度为0 0 0 5 、0 0 1 、0 0 2 、0 0 5 、o 1 m 的缓冲液， 以标准试剂为空白作比较。称取0 5 5 5 9 c a c l 2 溶于5 0 m l 的缓冲液中，得到o 1 m 的溶液，再稀释到其它浓度。试样选用l o m 的标准a t p 试剂。检测结果如表 3 4 所示： 表3 4 不同c a 2 + 浓度下的相对发光值 t a b l e3 4 p l u s a t d i f f e r e n tc o n c e n t r a t i o n so f c a 2 + c a 2 浓度m o 0 0 0 5 0 0 1 0 0 20 0 50 1 r l u s6 3 3 25 7 7 74 9 2 84 4 6 12 7 3 31 5 4 9 浙江大学硕士学位论文 图3 3 不同c 矿浓度下的相对发光值的变化图 f i g3 3c h a n g e so f r l u sa td i f f e r e n tc o n c e n t r a t i o n so f c a 2 + 由以上数据及图3 3 可知，随着c a 2 + 浓度的增大，相对发光值r l u s 不断减 小。当c a 2 + 浓度为o 0 1 m ，即接近海水中c a 2 + 的浓度时，r l u s 为4 9 2 8 ，与空 白标样相比减少了2 2 2 ，对a t p 生物发光反应产生了较大的影响。 3 1 4 f 对反应的影响 k + 和n a 十的性质相似，分析k + 对反应词典影响时，参照海水中k + 的浓度， 用k c l 配制含k + 浓度为o 0 1 、o 0 2 、0 0 5 、0 1 m 的缓冲液，以标准试剂为空白 作比较。称取o 3 7 9k c l 溶于5 0 m l 的缓冲液中，得到o i m 的溶液，再稀释到 其它浓度。试样选用1 0 8 m 的标准a t p 试剂。检测结果如表3 5 所示： 表3 5 不同心浓度下的相对发光值 t a b l e3 5r l u sa td i f f e r e n tc o n c