（应用化学专业论文）动物组织中痕量四环素类抗生素分析方法的研究.pdf

北京化工大学硕士学位论文 动物组织中痕量四环素类抗生素的分析方法研究 摘要 本论文针对我国动物源性食品中痕量抗生素残留分析方法的不 足，以土霉素、四环索、金霉素三种四环素类抗生素为主要研究对象， 研究了动物组织中三种四环素类抗生素的准确检测方法，确定了样品 的前处理技术，并建立了准确测量动物组织中三种四环素类抗生素的 高效液相色谱法( 四l c u v d ) 和高效液相色谱一电喷雾多级质谱 ( 珊l c e s i m s m s ) 联用法。 样品前处理过程采用液国提取结合c 1 8 小柱固相萃取( s p e ) 净化。 论文对提取过程和固相萃取净化过程的条件分别进行了优化，得到了 最佳的实验条件。通过该前处理方法的得到的三种四环素类抗生素的 回收率范围在8 3 9 9 3 7 之间，重复实验的相对标准偏差在2 4 以9 之间，满足痕量分析的要求。 确定了 玎) l c 。e s i 力v i s m s 和，l c u v d 分析三种四环素类抗生 素的分析条件。通过对液相色谱条件和电喷雾多级质谱条件的优化， 使得三种四环素类抗生素能够有效的分离， 口l c _ e s i m s m s 和 ，l c u v d 重复分析不同浓度的四环素类抗生素标准混合溶液的相对 标准偏差分别在0 9 5 0 之间和o 7 o 9 之间，方法的检测限( 3 倍信噪比) 分别为o 0 5 0 1 6 n g g 和1 l 3 2n g 儋，说明实验阶段仪器 精密度高。 用已建立前处理方法和分析方法测定了数种海产品、畜禽肌肉和内 脏组织中的三种四环素类抗生素的残留，并通过对比两种分析方法的 检测结果，得出闭) l c e s i m s 力订s 方法更适用于复杂动物组织基体样 北京化工大学硕士学位论文 品中四环素类抗生素的残留分析，具有较高可靠性。从样品中的四环 素类抗生素的残留分析结果来看，三种四环素类抗生素在动物组织样 品中均有残留，尤其是畜禽内脏组织中残留较多，因此加强动物组织 中抗生素残留检测的意义重大。 关键词：四环素类抗生素，前处理方法，高效液相色谱，高效液相色 谱一电喷雾多级质谱，分析方法 i i 北京化工大学硕士学位论文 s t u d i e so nt 珏ea n a i j y s i sm e t h o do fr e s i d u e t e t r a c y c l i n ea n t i b i o t i c si na n i m lt i s s u e a b s t r a c t i nt h i sp a p e r ，a na c c u r a t ea n a l y s i sm e t h o df o rt h et r a c et e t r a c y c l i n e a n t i b i o t i c s ( t c s ) ，s u c ha so x y t e 仃a c y c l i n e ，t e t r a c y c l i n e ，c h l o r t e 仃a c y c l i n ei n a n i m a lt i s s u ew a si n v e s t i g a t e ds y s t e m a t i c a l l yi no r d e rt oi m p r o v et h e t r a d i t i o n a lt e c 王1 1 1 i q u e s t h ep r e t r e a t m e n tp r o c e d u r eo fa n i m a lt i s s u es 踟p l e s w a sa l s od i s c u s s e d ，锄dt h ea c c u r a t eh p l c - e s i m s m sa n d h p l c u v dm e t l l o d sm a ts i m u h a n e o u s l yd e t e m i n a t eo x y t e t r a c y c l h 抡， t e t r a c y c l i n ea n dc h l o r t e t r a c y c l i n ew e r es e tu p d u r i n g 也ep r e t r e a t i n e n tp r o c e d u r e ，t h ee x 仃a c t i o no f t h et h r e et c sw a s c a r r i e do mb y1 i q u i d s o l i de x t r a c t i o n ，a n ds 0 1 i d - p h a s ee x t r a c t i o n ( s p e ) w i m c 1 8c o l u m nw a su s e dt oc l e a nu pt 1 1 ee x t m c t t h eo p t i m u mp r e t r e a t m e m c o n d i t i o n sw e r eo b t a i n e db yo p t i m i z i n gt 1 1 ec o n d i t i o n so ft h ee x 打a c t i o na n d c l e a n i n gu p a h v e r a g er e c o v e r i e so b t a i n e db y “sp r e t r e a t m e m 掣o c e d u r e r a n g e d 丹o m8 3 9 t o9 3 7 ，a n dt h er e p e a t e dr e l a t 沁es 诅r l d a r dd e v i a t i o n ( r s d ) f o rt h er e c o v e r yr a n g e d 矗o m2 4 t o2 9 t h ec o n d i t i o n so fh p l c e s i ，m s m sa n dh p l c u v dw e r e d e v e l 叩e df o rs i m u l t a n e o u sd e t e h n i n a t i o no ft h r e et e t r a c y c l i n ea 1 1 t i b i o t i c s i na t l i m a lt i s s u es 姗p l e s u n d e rt 1 1 0 s ec o n d i t i o n s ，t h e s et 1 1 r e et c sc o u l d b e w e l l s e p a r a t e d ，a n dt h er 印e a t e dr s d so fh p l c e s i m s m sa n d h p l c u v df - o rm ea n a b s i st c sm i x e dc r i t e r i o ns a n l p l ew e r eo 9 5 o a n do 7 o 9 t h el i m i t so fd e t e c t i o nf o rt h et w om e t l l o d sr e a c h e da t 0 0 5 0 1 6 n g 儋a n d1l 3 2 n g 儋( s n ri s3 ) i th a ss h o w nm a t t l l ep r e c i s i o n i i l 北京化工大学硕士学位论文 o tm e s et w om e t h o d s 、v a sh i 班 t h ee s t a b l i s h e dp r e t r e a t m e n ta n da i l a l y s i 8m e t l l o dw e r e a p p l i e d s u c c e s s 如l l yt on i n ea n l m a lt i s s u es a n l p l e so b t a i n e d 矗o md i f f 醯e mr e g i o n s f o rm ed e t e n n i n a t i o no ft h r e et e t r a c y c l i n ea n t i b i o t i c s t h ea n a l y s i sm e t h o d o fh p l c e s i m s m si st h eb e t t e rm e t h o do fd e t e r m i n i n 2r e s i d u e t c si na n i m a lt i s s u e b yc o m p a r i n gt h ed e t e 咖i n a t i o nr e s u l t so f h p l c - e s i m s m sa n dh p l c u v d t h er e s u hs h o w e dm a tm o s to f s a m p l e sh a v eb e e np o l l u t e di nd i f f - e r e n tl e v e l sa i l dr e l a t i v eh i g hl e v e l so f t c sw e r ef o u n di ni n t e m a lo r g a j l s s oi ti s v e r yi m p o r t a n tt h a tt l l e d e t e r m i n a t i o no fr e s i d u ea n t m i o t i c si na n i m a lt i s s u e s h o u l d b e s t r e n g 盐e n e d k e yw o r d s ：t e t r a c y c l i n ea n t i b i o t i c s ， p r e t r e a t m e n tm e t h o d ， h p l c - u v d ，h p l c e s i m s m s ，a n a l y s i sm e t h o d 北京化工大擘硕士学位论文 英文缩写 a p c i a p p i c 1 8 c a p c e c t c d m c t c e s i f a 0 f l o r i s i l g c h p l c i a c l l e l o d l o q m r m m s p d m a e m a r s e m s 0 t c p d a d r r t r s d 符号说明 大气压化学电离 大气压光电离 十八烷基( c ) 键合相硅胶 氯霉素 毛细管电泳法 金霉素 去甲基金霉素 电喷雾电离 联合国粮农组织 合成硅酸铝镁载体( 弗罗里硅土) 气相色谱( 法) 高效液相色谱法 免疫亲和色谱 液液萃取 检测下限 定量下限 多级反应监测 基质固相分散 微波辅助萃取 微波快速溶剂萃取 质谱( 法) 土霉素 光二极管阵列检测器 相对保留时间 相对标准偏差 北京化工大学硕士学位论文 s f e s n r s p e s p m e s r m t c t c s t l c u s e u v d w h o 超临界流体萃取 信噪比 固相萃取 固相微萃取 选择反应监测 四环素 四环素类抗生素 薄层色谱法 超声波提取 紫外检测器 世晃卫生组织 x 北京化工大学 学位论文原创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的 指导下，独立进行研究工作所取得的成果。除文中已经注明 引用的内容外，本论文不含任何其他个人或集体已经发表或 撰写过的作品成果。对本文的研究做出重要贡献的个人和集 体，均已在文中以明确方式标明。本人完全意识到本声明的 法律结果由本人承担。 学位论文作者签名： 乏 沙；年j 月 日 北京化工大学硕士学位论文 第一章绪论 1 1 课题来源 本课题属于“十五”国家重点科技专项重要科技标准研究，课题名称为痕 量污染物权威检测技术及计量基标准的研究，专题名称为多氯联苯等持久有机 污染物标准物质研究。 1 2 抗生素概述 某些微生物或动植物所产生的物质( 例如青霉素) 能抑制另些微生物细胞 壁、细胞膜、蛋白质的合成，核糖核酸和脱氧核糖核酸的转录复制，抗代谢物溶菌 酶的形成，把此类化学物质统称为抗生素 ”。在畜禽养殖业、水产养殖业、养蜂业 等生产过程中，抗生素作为药物用于预防和治疗疾病，促进生长和繁殖及提高饲料 利用率等。1 9 4 3 年后美国的青霉素形成大批量工业化生产，同时产生的抗生素发 酵废渣被一些饲养业用作饲料来喂猪，以后发现这些饲料与普通饲料相比可使猪 长得更快，1 9 4 6 年又发现添加少量链霉素能够促进雏鸡的生长。在2 0 世纪6 0 年 代，许多抗生素品种相继问世并用于工业化生产，而每种抗生素均有促进动物生 长的作用。其后，不仅所有抗生素发酵残渣都被用作家禽、家畜的饲料添加剂， 抗生素产物( 如发酵液和提纯的抗生素) 也被用来促进动物生长【2 】。资料载明：美 国曾检出1 2 肉牛、5 8 犊牛、2 3 猪和2 0 禽肉残留抗生素；日本曾有6 0 牛和 9 3 猪被检出有抗生素残留i 3 j 。这些抗生素类药物在生物体内被残留后，经过食物 链进入人体，对人体健康产生有害的影响，主要表现在如下几个方面：耐药性增 加及肠道菌的紊乱、产生过敏性反应及中毒、干扰激素平衡及癌变、急性中毒、 污染环境及生态毒性【4 】。因而严格监控动物源性食品中抗生素类药物的残留量成为 维护人类身体健康，保护人类生存环境，促进畜禽产品的出口刨汇的前提条件。 常见抗生素一般分为以下几类：b 一内酰胺类，四环素类，大环内酯类，氨基糖苷 类，氯霉素类等【5 j 。抗生素因其种类不同，其杀菌、抑菌的机理也不同，如：青霉 素类阻碍细菌的细胞壁合成；四环素类影响蛋白质合成等f 6 】。青霉素对神经系统有 影响，特别是对0 7 1 0 的人有过敏反应，过敏性休克的人达0 0 0 4 o 0 1 5 ，严 北京化工大学硕士学位论文 重者可致死。链霉素对第8 对脑神经有损害，可造成耳聋。氯霉素可抑制骨髓造 血细胞线粒体内蛋白质的合成，引起再生障碍性贫血，虽发生少，但病死率却高 达8 0 。动物治疗用药和在饲料中添加的药物，前者用量大，时间短，后者添加 量少，但每天都会摄入，两者都会在动物性食品中造成残留，这样就会给人类造 成危害。美国曾发生食用以氯霉素治疗后的屠宰的牛肉造成的中毒死亡事故，从 而说明其会给人类健康带来很大危害【_ ”。美国、加拿大、日本、韩国、欧盟等一些 国家已限制甚至明令禁止进口含有青霉素、四环素等畜禽产品【8 l 。2 0 0 2 年年初起， 动物源性食品抗生素残留问题给中国的食品出口带来极大的影响。欧盟宣布：“自 2 0 0 2 年1 月3 1 日起禁止从中国进口供人类消费或用作动物饲料的动物源性产品”， 使我国当年在欧盟市场丢掉了1 3 万吨水产品的市场份额和造成6 亿多美元的经济 损失。同年2 月7 日，英国以氯霉素超标为由停止销售中国蜂蜜。欧盟其他国家 纷纷效仿，以抗生素残留超标为由将中国蜂蜜挡在国门之外，欧盟是我国蜂蜜传 统出口市场，2 0 0 1 年我国对欧盟出口蜂蜜4 3 万吨，占其进口蜂蜜总量的2 7 左 右，占我国出口总量的4 1 。同时美国、日本、加拿大等其他国家相继提高了对 中国蜂产品药物残留的检出限量要求，是我国峰产品出口严重受阻，损失达一亿 美元【9 】。我国对兽药残留的研究尚处在起步阶段。杨军等【l o 针对我国外贸畜禽出口 产品因受药物残留影响，出口量急骤下降的形势以及国内自销的畜禽产品药残监 测尚未建立完善的体系等情况，首次对国内上市的鲜猪肉、白条鸡进行了青霉素药 残检测，结果其所检测的猪、鸡药残检出率分别为5 0 和6 0 。石如彦等”分别 用蜡样芽孢杆菌，藤黄八叠球菌微生物培养杯碟法检测了四川西部地区主要生猪 产区7 市3 9 县7 2 4 份样品，四环素总阳性检出率为1 1 2 9 ，残留量为o 1 1 5 o 1 4 5 g ；青霉素总阳性检出率为2 1 1 3 ，残留量为0 1 0 3 7 0 1 0 4 5 “g g ；王春 奕等检测了3 5 批2 5 份西宁市售消毒鲜牛奶中青霉素的残留量，其结果超过了 w h o 和f a o 规定的牛奶中青霉素含量为o 的标准；1 9 9 5 年许明贞等【1 3 l 对广州某 乳牛场使用抗生素后的乳牛1 3 5 头及未使用抗生素健康乳牛1 0 头进行随机抽取生 奶样4 4 0 份和市售定型包装消毒奶5 3 份，奶粉4 l 份进行青霉素、链霉素、庆大霉 素、土霉素、呋喃西林不同药物给药途径和剂量造成不同残留时间的比较实验， 总阳性率也高达3 4 。在畜禽食品出口贸易方面，韩国对我国出口的禽及其制品 规定：所含抗生素、农药、激素、重金属、放射性元素等有损公众健康的残留物 质不能超过韩国政府规定的标准。目前，我国也已开始对动物源性食品中抗生素 2 北京化工大学硕士学位论文 的残留量制定了标准，如蜂蜜中四环素残留量限量标准为：o 0 5 m g ，k g ( g b l 3 0 1 9 1 9 ) 【1 。 食品中的抗生素的残留已构成了对人体健康的潜在威胁，因此，发展快速、可 靠、灵敏和实用的抗生素分析技术无疑是环境监测、保证食品安全和避免国际间 有关贸易争端的基础。 1 3 分析方法现状及发展趋势 抗生素的分析过程主要包括样品采集及制备、样品的提取与净化以及定性定量 分析三部分，其中样品的提取和净化过程称之为样品的前处理过程，是分析过程 中永远不可忽视的重要环节，样品前处理是否快速有效最终影响到分析方法的可 靠性、准确性以及分析通量。 1 3 1 样品采集及制备 采集的样品应有代表性，能客观的代表被研究的对象。在采样现场，样品中 预测组分的潜在损失和污染的可能性非常高，所以要采取足够的措施避免这些可 能的发生。采集的样品应尽量快的送到实验室，在抗生素残留分析前，动物组织 样品要在4 以下低温保存。样品制备时，将动物肌肉组织、内脏组织等用绞肉机 绞碎，并用组织匀浆机制成匀浆待用。此外，在样品的制备过程中，也应注意避 免样品的交叉污染，特别是当待测物的污染水平相差很大时。 1 3 2 样品提取 提取是指采用适当的溶剂将待测物从样本中转移至易于净化和分析的液态。 但是，由于抗生素的种类繁多、性质各不相同，所用的提取溶剂也各有差别。溶 剂的选择主要依据样品的成分、水分和脂肪含量、待测物的理化性质和在样品中 的存在形式而定。动物组织样品提取液中含有大量的蛋白质等干扰组分，这些干 扰组分会影响某些抗生索在固相萃取柱上的保留，使其回收率降低，所以萃取净 化和富集前必须对提取液进行脱蛋白处理。常用的溶剂有甲醇、乙腈、三氯乙酸、 丙酮、乙酸乙酯、适当p h 值的酸溶液或酶解液。文献【5 埘】中涉及到的动物组织中 抗生素的提取方法主要有：液一液萃取法( l l e ) 、固相萃取( s p e ) 、固相微萃取 ( s p m e ) 、基质固相分散( m s p d ) 、超声波提取( u s e ) 、微波辅助萃取( m a e ) 、微波 北京化工大学硕士学位论文 快速溶剂萃取( m a r s e ) 、超临界流体萃取( s f e ) 等，这些方法在应用时各有其优 缺点。 l l e 方法是根据被测物的性质，在酸或碱性条件下分别提取净化，萃取溶剂 有三氯乙酸、乙醚、乙酸乙酯或者不同溶剂的混合物2 2 1 。该方法操作简便，但需 耗费较多的时间和有机溶剂，并容易引入新的干扰( 如溶剂中的杂质等) ，溶剂的 大量挥发对实验人员健康会造成较大的危害，样品经多次转移浓缩造成的分析误 差较大，回收率比较低，但是由于该方法易于操作和成本较低，仍然被各实验室 广泛采用。 u s e 是一种简便、快速、适用面较广的提取方法。这种方法曾被用于用提取 禽肉、动物肝脏肾脏和海产品中残留的四环素类抗生素，获得了满意的结果2 3 1 。 超声波搅拌使固一液更密切接触，而产生的和缓的加热有助于萃取过程，从而提 高萃取效率。王曼霞等 1 月用超声波振荡提取法萃取动物组织中残留的8 种磺胺类 药物，萃取的有机相经旋转蒸发浓缩后加入乙腈饱和正己烷溶液进行纯化分离， 结果表明，这种提取纯化方法适用于动物组织中磺胺类药物的残留分析。 s p e 是利用固体吸附剂将液体样品中的目标化合物吸附，与样品的基体和干 扰化合物分离，然后再用洗脱液洗脱，达到分离和富集目标化合物的目的【2 4 1 。它 是2 0 世纪8 0 年代后期发展起来的样品前处理技术，它与传统的l l e 方法相比具 有显著的优势，如提高了样品处理通量、大大减少了溶剂的消耗、回收率高、重 现性好、杂质干扰极低、易于实现自动化控制等。g s t o e v 等【1 6 】固相萃取法提取动 物源食品中残留的磺胺类药物时，对比乙腈、甲醇、乙酸乙酯、水、二氯甲烷几 种萃取溶剂，发现乙腈和乙酸乙酯是最合适的溶剂，与此同时，又以乙酸乙酯作 为一次萃取溶剂，丙酮作为二次萃取溶剂，结果表明，磺胺类药物的回收率超过 8 0 。a n d e r s e n 等【1 7 j 应用6 m l h l b 固相萃取柱提取牛奶和虾中的四环素类抗生素， 目标物的回收率达到7 7 9 3 ，相对标准偏差在1 0 以下，说明s p e 技术是一种 较好的提取手段。由于大部分的抗生素的挥发性不强，因此，s p e 技术在抗生素 的提取上得到了广泛的应用。s p m e 是2 0 世纪8 0 年代末由加拿大w a _ m o o 大学 a n h u r 和p a w l i s z y n 【1 8 】提出的一项萃取技术，它是针对s p e 存在的问题，基于聚二 甲基硅氧烷吸附而发展的微萃取技术，他的优点在于排除了基质对采样影响的能 力，技术简易，便于使用以及减少溶剂消耗或无溶剂消耗，但此方法在国内还处 于研究阶段，还未普及。 北京化工大学硕士学位论文 m a e 是1 9 8 6 年由匈牙利学者g a i l z l e r 提出的，其利用微波能量，快速有选择 地萃取克服了传统萃取方法的不足，是一种萃取速度快、溶剂用量少、回收率高、 灵敏以及易于自动控制的新固态样品提取技术 2 5 】。而m a r s e 是在m a e 的基础上 由加拿大环保局和美国c e m 共同开发的一种萃取新技术，该方法在回收率和重复 性上优于其他萃取方法，同时不受含水量的影响，可以用在萃取动物肝脏和组织 中兽药代谢和残留，但此方法还未普及推广。 s f e 是一种近年来新兴的固相萃取技术 2 0 】，该技术因其特殊的物化性和萃取 效率高、传质快等优点，在残留分析中的应用中越来越广泛。尤其是采用超临界 状态c 0 2 的s f e 技术具有无毒、无害、无残留、无污染、惰性环保、可避免产物 氧化和萃取温度低等优点，更适合脂溶性、高沸点、热敏性物质和生物活性物质 的萃取和净化。p e n s a b e n e 等将鸡蛋样品与基体分散剂混合，在4 0 ，6 8 m p a 的条 件下用c 0 2 作流体进行超临界流体萃取，用h p l c u v d 检测其中的磺胺类药物， 该法检测限为2 5 斗g k g ，回收率在8 l l o l 之间。p e n s a b e n e 等用s f e 对鸡蛋 中的氯霉素残留进行提取与净化，用h p l c 检测，结果表明净化效果很好，当加 标浓度为o o l m 蛞，回收率7 7 4 8 6 6 ，相对标准偏差4 3 。s f e 可与很多 分析仪器离线或在线联用。在线联用能直接分析萃取的目标物，从而提高灵敏度。 由于s f e 商品化时间不长，现有的产品尚不能立即投入常规萃取工作，但是基于 该技术的众多优势会在抗生素残留分析的前处理方法中占有一席之地。 m p s d 是b a r k e r 等人在1 9 8 9 年提出并给予理论解释的种快速理论萃取技术， 它是在s p e 技术的基础上改进的样品前处理方法。它的优点在于处理样品耗时短、 节省溶剂、样品用量小，在食品的抗生素残留分析中得到广泛的应用，显示了其 良好的通用性和发展潜力【2 6 】。m s p d 浓缩了传统的样品前处理中所需的样品匀化、 组织细胞裂解、提取净化等过程，避免了样品前处理过程造成过多的待测物损失。 奉夏平等b l j 利用m s p d 技术，用g c ，m s 负化学电离离子源和选择离子模式进行分 析检测动物源性食品中的氯霉素，方法的检出限为5 p g 。m s p d 是简单高效的提取 净化方法，它不仅能提高分析速度，使现场检测成为可能，而且能减少试剂用量， 适于自动化分析。 传统的提取方法如l l e 、u s e 等技术都有耗时、耗溶剂、低重复性、高误差 等缺点，已不能满足现代抗生素残留分析发展的要求，而新兴的萃取技术也不能 完全代替传统的方法，在很多的情况下，这些新技术对样品的前处理是在经典的 北京化工大学硕士学位论文 方法配合下完成的，使得操作更为简便，样品及溶荆用量更少，自动化程度高， 更适合多残留的分析。在实验室中，通过测量加标样品的回收率，也可以加入放 射性同位素如1 3 c 、d 5 等标记化合物，用以测定提取效率与矫正分析丢失。 1 3 3 净化技术 样品经预处理后，在共提取物中还存在一定量的干扰组分，还不能直接进入色 谱分离，所以有效的净化步骤是必须的。目前，在某些抗生素残留分析中，提取 和净化一步完成。常规的抗生素分析的净化方法主要有液一液分配法和吸附柱固 相净化技术，免疫亲和色谱技术等【2 ，2 0 0 7 1 。 液液分配法是一种经典的净化方法，抗生素类药物大多数属于有机酸或有机 碱类化合物，因此通常通过调节萃取液的p h 值、极性、离子对形成等手段以提高 萃取效率，同时也会使一些蛋自类的物质沉淀，但是此方法的净化效果往往不 是很理想，而且会耗费大量的有机溶剂。 吸附柱固相净化技术就是使被测试样各组分在吸附柱中的吸附剂上被吸附与 被解析的反复过程，是最常见的净化方法。常用的吸附柱填料有弗罗里硅土 ( f l o r i s i l ) 、氧化铝、聚酰胺、硅藻土、硅胶、c 。8 等。考虑到共萃干扰物一般具有 极性，因此一般用弱极性的淋洗液以达到较好的净化效果。陈毓芳 2 7 1 在测定动物 组织中残留的四环素类抗生素时，比较了l c c 8 、l c c i s 、l c n h 2 、l c s c x 、 h l b 五种萃取小柱，结果表明，h l b 在提取液无需调节p h 值的条件下，获得了 良好的萃取效果，且吸附容量高，6 0 m g 的h l b 吸附剂可替代2 0 0 5 0 0 m g 的c 1 8 吸附荆。 i a c 是以抗原抗体的特异性、可逆性免疫结合反应为原理的色谱技术1 2 】，它的 最显著的的优点在于对待测物的高效、高选择性保留能力，特别适用于复杂样品 极稀组分的净化和富集。v a n d ew a t e r 等报道了猪肌肉、蛋和牛奶中氯霉素的i a c 净化法，样品经提取、离心、过滤和稀释后用1 a c 柱净化，h p l c u v d 测定， 1 0 蚌g ，k g 加标回收率7 0 9 9 ，牛奶样品的检测限最低可达2 0 n l 。该技术时 目前净化和富集效能最强的样品前处理技术，但尚处在探索阶段，仍仅限于常规 技术净化困难的重要残留组分样品处理过程。 由于生物样品的基质十分的复杂，通常只用一种净化技术是不够的，需要采 笄j 几种净化方式联用技术。沈崇钰f 2 8 肄采用豫s 柱和c 1 8 柱双柱净化方法处理蜂 6 北京化工大学硕士学位论文 产品，使得蜂产品中氯霉素的回收率达到9 6 以上。目前，在抗生素残留分析的 前处理过程中，提取和净化的界限越来越模糊，往往一步完成，很多新技术是在 经典方法的配台下完成的，反映了样品前处理技术简便高效、高选择性、样品用 量少、溶剂消耗量少、自动化程度高、适合多残留分析等的发展方向。 1 3 4 测定方法 2 0 世纪5 0 年代，动物组织样品中抗生素残留分析技术发展缓慢，仅限于化学 分析法、比色法以及生物测定法，这些方法灵敏度低、特异性差，很难满足分析 要求。薄层色谱法( t l c ) 的出现使残留分析技术有所发展，但其检测能力仍很低。 2 0 世纪6 0 年代，g c 的飞速发展以及许多高灵敏检测器的广泛应用，解决了许多 抗生素残留分析中存在的问题。随后，h p l c 的快速发展大大拓宽了抗生素残留分 柝的范围。目前许多抗生素残留的分析方法仍以高效液相色谱法为主【2 9 3 ”。 h p l c 是以经典的液相色谱为基础，以高压下的液体为流动相的色谱过程，随 着高效液相色谱技术的飞速发展，出现了许多高灵敏度的检测器，解决了许多过 去难以解决的问题。因此高效液相色谱及其联用技术在抗生素残留分析中的优越 性是无需质疑的，尤其是近年来高效液相色谱和新型检测器广泛应用于抗生素残 留分析，大大提高了检测灵敏度、标准性和可靠性，缩短了分析时间。其中应用 较为广泛的是紫外检测器( u v d ) ，具有结构紧凑、造价低、操作维修方便、灵敏度 高的优点，它分为固定波长、可变波长和二极管阵列检测三种类型。可变波长紫 外吸收检测器由于可选择的波长范围很大，既提高了检测器的选择性，又可选用 组分的最灵敏吸收波长进行测定，从而提高检测灵敏度。光二极管阵列检测器 ( p d a d ) 是8 0 年代发展起来的一种新型紫外吸收检测器，它以普通紫外检测器的 区别在于进入流通池的不再是单色光，获得的检测信号不是在单一波长上，而是 在全部紫外光波长上的色谱信号，因此它不仅可进行定量检测，还可提供组分的 光谱定性的信息。v i 矗a s 等【2 9 悃h p l c u v d 法在2 5 分钟内同时检测出蜂蜜中的六 种四环素类抗生素，六种目标物完全达到基线分离，方法检测限为1 5 3 0 n g 佗。杨 元等【3 0 】采用h p l c 方法测定猪、牛、鸡、鱼肌肉组织及动物肝脏、肾脏组织中的抗 生素残留量，对7 种抗生素检测最低检出限为0 2 0 4 “g 瓜g ，此方法简便、快速、 灵敏、准确。刘媛等【3 i 】应用反相高效液相色谱建立了分析动物组织中阿莫西林残 北京化工大学硕士学位论文 留量的有效方法，该方法测定阿莫西林残留的最低检出限低于1 0 p g ，k g ，加标回收 率为7 0 9 8 6 8 ，相对标准偏差为3 2 1 6 4 ，均符合痕量残留物检测的要求。 质谱( m s ) 是通过对样品离子的质量和强度的测定来进行定量分析的一种技 术手段，可以检测多种样品，具有很高的灵敏度，可以获得不同与常规h p l c 检 测器的大量而丰富的结构信息，然而，尽管m s 常常可以得到化合物分子离子及 碎片的信息，但混合物的质谱解析往往难以实现。液相色谱与质谱联用，可以首 先将混合物分离为单一组分，之后再用质谱检测器进行检测。如此过程可以在一 定程度上排除基质干扰，克服离子抑制现象，优化质谱检测信号。h p l c 的分离能 力与质谱检测器的丰富信息与高灵敏度，使采用质谱检测器作为h p l c 检测手段 的液一质联用技术成为目前检测复杂基体组织中痕量抗生素发展最迅速的分析手 段之。m a s a l l i k ot a k i n o 等f 3 2 】采用l c a p p i m s 和l c a p c 卜m s 检测鱼肉样品 中的氯霉素( c a p ) 残留量，并对两种不同界面的方法进行了评价和比较：a p p i 引起的干扰峰和基线较a p c i 低，不足以引起干涉，a p p i 和a p c i 的保留时间及 峰强分别为0 6 、5 5 和0 7 、1 3 7 ，表明l c a p p i m s 法具有较高的选择性和 灵敏度及较低的基线效应：另外，a p c i 源易被污染，重复检测时c a p 离子强度 会减弱，而a p p i 则不会因为一种中等污染物而使电离效率降低从而影响c a p 的 离子强度，因而，l c a p p i m s 方法是检测动物组织中氯霉素残留的理想方法。 随着液质技术的发展和成熟，利用高效液相色谱配合多级质谱技术( l c m s “) 测定痕量抗生索在蜂产品、畜禽肉类及内脏类产品和海产品中的残留越来越 多的被采用【2 83 ”。l c m s “一般是利用电喷雾( e s i ) 或大气压化学( a p c i ) 软 电离模式，通过碰撞诱导解离( c i d ) 产生准分子离子，特征分子离子碎片用离子 阱或三级四级杆分离收集。m s “主要通过子离子扫描、母离子扫描、中性丢失扫 描和选择性反应监测( s r m ，又称多级反应监测m 蹦) 作为定性、定量的主要手段， 与其他检测抗生素的方法比较，l c m s “具有选择性高，定性定量准确，检测限 和定量限低，无需衍生化等优点，可以有效抑制基质的影响嘲。沈崇钰等采用 l c m s “方法快速准确地测定了蜂蜜、王浆中的氯霉素残留，结果表明：加标样 品平均回收率达到7 0 8 0 ，定量下限( l o q ) 可以达到o 1 肛g k g ，检测下限 ( l o d ) 可以达到0 0 5 肛鲫唱。回收率和检测限、定量限均达到了比较满意的结果 可以满足现在对出口蜂产品的检测要求。虽然液质联用对分析技术和仪器的要求 高，但它是一种很有利用价值的高效率、高可靠性分析技术。l c m s 对简单样品 8 北京化工大学硕士学位论文 可进行分析前净化并具有几乎通用的多残留分析能力，用于对初级监测呈阳性反 应的样品进行在线确证，其优势明显，但l c m s 以其价格昂贵，液相色谱和质谱 技术尚不成熟。 抗生素的其他检测手段还有生物免疫分析法、毛细管电泳法( c e ) 、气相色 谱法( g c ) 以及气质联用法( g c m s ) 。生物免疫分析法是近几十年发展起来 的新技术，主要包括微生物法、酶联免疫法、放射免疫法等，具有操作简便、样 品处理简单、检验快速、检验容量大等优点，适合现场检测和活体检测，但是检 测灵敏度低，定量不准确，难以适合实验室检测要求。毛细管电泳防3 5 】( c e ) 是 经典电泳技术和现代微柱技术的结合产物，与色谱技术相比较，c e 分离速度快， 所需样品量少，对样品的预处理要求较低。而与普通的平板电泳相比，因为用高 电场作驱动力，分离速度快得多，而几乎可以与各种检测器( 如m s ) 联用，但 c e 澳m 定成本高，适用范围不广泛。气相色谱法( g c ) 在动物组织中残留抗生素的 定性定量检测中也比较常见，尤其是g c m s 技术，是检测有机污染物的主要手 段口6 。3 9 】。但由于一般的抗生素为非挥发性化合物，在分离前须先进行衍生化，若 衍生化反应不完全，则会影响灵敏度。另外，气相色谱柱的出峰时间较液相柱长 因此g c m s 并不很适合于进行批量样品分析的实验室。 1 4 论文研究的目的、意义及内容 1 4 1 论文研究的目的和意义 抗生素作为抗菌药可用于治疗家畜的疾病，有时也用作动物生长促进素、消毒 剂、杀虫剂等，但在动物肌肉及各器官组织内会有一定的残留，是有机污染物的 一种。当抗生素残余量超过w h o 允许标准时，不仅影响食用者的身体健康，而且 动物源产品的出口也会受到影响，同时造成潜在的环境污染。世界上很多发达国 家已对进口食品中抗生素的最大残留和检测方法都有严格而具体的规定，如：日 本于1 9 9 7 年规定乳中抗生素残留限量为o 1 m g 瓜g ，欧洲和美国已经禁止在食品中 使用氯霉素( c a p ) 。但在我国食品卫生标准中对有些食品的抗生素残留允许量仍 未有具体规定，因此我国每年都会发生因抗生素残留超标而导致进口国拒收、退 货、索赔、终止合同的事，不仅给我国经济造成巨大损失，在政治上也带来了严 重影响。 为此，本论文将依据目前的动物组织中痕量抗生素的前处理方法，参照相应 北京化工大学硕士学位论文 的国内和国际标准，探索新的适用于常规分析方法的前处理路线，建立并完善我 国动物组织中痕量抗生素的分析方法，并将其广泛推广应用，从而加强对我国进 出日动物源性食品的检验，使我国的经济利益在世界一体化进程中得以保证，并 保护我国消费者的日常生活健康。 1 4 2 论文研究的主要内容 由于抗生素的种类繁多，论文主要选择土霉素、四环素、金霉素三种四环素 类抗生素作为研究对象，以海产品和畜禽肌肉、内脏组织为研究体系，研究复杂 生物基体组织的前处理及液相色谱多级质谱联用对四环素类抗生素的的检测技 术。 前处理方法的研究主要包括：对拟采用的液一固提取，通过对提取液p h 值的 选择、提取次数等条件的讨论，确定最佳提取方案。样品的净化采用固相萃取净 化，考察淋洗液、淋洗体积、洗脱体积和洗脱速率的选择及方法回收率。 选择h p l c e s i m s m s 和h p l c u v d 两种检测技术对三种四环素类抗生素 进行定性定量检测，通过对液相色谱和质谱条件的优化确定了分析条件。 在此基础上采用已建立的提取和净化方法对海产品和畜禽肌肉、内脏组织进 行前处理，通过对比h p l c e s i m s m s 和h p l c 。u v d 两种方法对其中的四环素 类抗生素进行定性定量分析的结果来检验所建立的检测方法的可靠性。 北京化工大学硕士学位论文 第二章实验部分 2 1 实验仪器 离心机 离心机，型号为l d 5 2 a ，北京医用离心机厂。 振荡器 型号为s a 一3 1 ，日本y a m a t o 公司；型号为m s 。2 ，i k a 公司。 s p e 装置组成 固相萃取柱：型号l c 一1 8s p e 固相萃取柱，3 m l ，s u p e l c o 公司；固相萃取装 置：型号1 4 6 0 2 ，l i d a 公司。 液相色谱仪 l u m t e c h 液相色谱仪，型号为k - 2 6 0 0 ；配可变波长紫外检测器，四元低压混合 单元泵，德国l u m t e c h 公司。 液质联用仪 f i i l l l i g a l ll t q 液相色谱一质谱联用仪，美国t h e 彻。公司。 色谱柱 型号为b u r o s p h e r - 1 0 0c 1 8 ，2 5 0 4 o m m ，5 ，o 岬，德国l u m t e c h 公司；型号为 z o r b a xx d b c 1 8 ，1 5 0 2 1 m m ，5 o 岬l ，美国a n g i l e m 公司。 分析天平 l 一2 0 0d 型：最大称量量2 0 0 9 ，最小分辨0 0 5 m g ，不确定度0 1 5 m g ，日本 s h i m a d z u 公司；m e m e r m 3 型：最小分辨o 0 0 1 m g ，不确定度0 0 0 3 m g ：m e m e r m e 2 1 5 s 型：最小分辨0 o l m g ，不确定度o 1 0 m g 。 p h 计 型号为o r l 0 n 一3 ，美国t h e h n o 公司。 氮气吹扫装置 型号d c y 【i i 水浴浓缩仪，北京金科精华苑技术研究所；高纯氮，纯度 9 9 9 9 9 3 ，北京普莱克斯实用气体有限公司。 过滤装置 北京化工大学项士学位论文 溶剂过滤器，天津津腾公司；水相过滤膜，型号为a n - l 0 0 6 ，直径5 0 m m ， 孔径0 4 5 岬，上海安谱公司。 器皿：1 5 m l 聚四氟乙烯离心管，1 0 0 m l 圆底烧瓶，1 0 0 r 1 1 l 锥形瓶，1 0 m l 安瓿瓶， 5 m l 安瓿瓶，2 m l 安瓿瓶，长滴管，5 m l 玻璃注射器，0 4 5 岬针式滤膜，1 0 0 l 0 0 0 p l 移液器，2 0 2 0 0 此移液器，5 0 此进样针( 平头) 。 2 。2 实验试剂和样品 三种抗生素标准品分别为土霉素( 0 t c ，含量为9 7 o ) 、四环素( t c ，含量 为9 5 o ) 、金霉素( c t c ，含量为9 5 o ) ，由国家标准物质研究中心提供，采用 重量法配置。 定量分析内标：去甲基金霉素甲醇，浓度为1 0 0 g m l ，由国家标准物质研究 中心提供。内标溶液置于冰箱中4 下保存，使用时用甲醇稀释至、5 0 0n m l 。 试剂：甲醇， p l c 级，美国f l l l j ( a 公司：乙腈，h p l c 级，j t b a l ( e r 公司； 冰醋酸，分析纯，美国f l u k a 公司；醋酸铵，分析纯，北京益利精细化学品有限公 司：e d t a ，纯度9 9 ，北京欣经科生物技术有限公司；磷酸二氢钠，分析纯， 天津市化学试剂六厂三分厂；柠檬酸，分析纯，北京化工厂：氨水，分析纯，北 京益利精细化学品有限公司；高氯酸，分析纯，北京南尚乐化工厂：超纯水，m i l l i q g r a d i e n ta 1 0 ，o 2 2 u m ，m i l l i p o r e 公司。 样品：f 1 ) 海产品类：海虾、鲷鱼，产于中国大连附近海域；鳕鱼，产于新西 兰海域；银鳕鱼，产于福建海域。将虾头、皮和鳍去除，鱼类样品去皮和鱼骨， 取其肌肉组织绞碎，高速组织匀浆后置于冰箱4 下存放备用。 ( 2 ) 畜禽肌肉、内脏类：鸡肉、猪肉、牛肉和猪肝，产地均为北京，鸡 肝，产地为山东。将肌肉或内脏组织绞碎，高速组织匀浆后置于冰箱4 下存放备 用。 2 3 实验内容 2 3 1 标准溶液及流动相的配制 2 3 1 - 1