蛋白质组学研究技术.ppt

09.12.2019,1,蛋白质组学研究技术,09.12.2019,2,第一节概述,1985年由贝尔杜科等提出，1990年正式启动并于2019年学成的人类基因组计划使生命科学的研究进入了后基因组时代。,蛋白质组学的产生,09.12.2019,3,第一节概述,蛋白质组是澳大利亚学者Williams和Wilkins于1994年首先提出，源于蛋白质（protein）与基因组（genome）两个词的杂合,意指proteinsexpressedbyagenome，即“一个细胞或一个组织基因组所表达的全部蛋白质”。,09.12.2019,4,第一节概述,各国政府支持，国际著名研究和商业机构加盟：2019年澳大利亚建立了世界上第一个蛋白质组研究中心（AustraliaProteomeAnalysisFacility，APAF）,09.12.2019,5,第一节概述,美国国立癌症研究院（NCI）投资1000万美元建立肺、直肠、乳腺、卵巢肿瘤的蛋白质组数据库。NCI和FDA共同投资数百万美元建立癌症不同阶段的蛋白质组数据库。,09.12.2019,6,第一节概述,英国建立三个蛋白质组研究中心对已完成或即将完成全基因组测序的生物体进行蛋白质组研究。,09.12.2019,7,第一节概述,Celera公司投资上亿美元独自启动了全面鉴定和分类汇总人类组织、细胞和体液中的蛋白质及其异构体，构建新一代的蛋白质表达数据库的工作。,09.12.2019,8,第一节概述,2019年召开了第一次国际“蛋白质组学”会议2019年在美国旧金山召开了第二届国际蛋白质组学会议2019年1月在英国伦敦举行了应用蛋白质组会议,09.12.2019,9,第一节概述,我国也于2019年启动了蛋白质组学研究，在中科院上海生物化学研究所举办了两次全国性的蛋白质组学研讨会,09.12.2019,10,第一节概述,2019成立了中国人类蛋白质组组织（CHHUPO），并分别于2019年9月、2019年8月以及2019年8月召开了中国蛋白质组学首届、第二届及第三届学术大会，2019年10月在中国北京召开了第三届国际蛋白质组学会议。,09.12.2019,11,第一节概述,科技部已将疾病蛋白质组研究列入我国“973”计划项目和“863”计划项目；国家自然科学基金委员会也将“蛋白质组研究”列为重点项目。我国在鼻咽癌、白血病、肝癌和肺癌蛋白质组研究方面取得了较大的进展。,09.12.2019,12,第一节概述,蛋白质组的概念：,2019年，由Wasinger等在Wlectrophoresis中定义为一个基因组编码的全部蛋白质。,1977年，在Williams和Wilkins有关蛋白质组研究的专著ProteomeResearch:NewfrontiersinFunctionalGenomics中定义为一个基因组或组织所表达的全部蛋白质。,2019年进一步定义为一个细胞的整个生命过程中由基因组表达的以及表达后修饰的全部蛋白质。,09.12.2019,13,第一节概述,蛋白质组是：,1、对应于基因组的所有蛋白质构成的整体，不是局限于一个或几个蛋白质。2、同一基因组在不同细胞、不同组织中的表达情况各不相同。3、在空间和时间上动态变化着的整体。,09.12.2019,14,第一节概述,蛋白质组学(proteomics),指应用各种技术手段来研究蛋白质组的一门新兴科学，其目的是从整体的角度分析细胞内动态变化的蛋白质组成成份、表达水平与修饰状态，了解蛋白质之间的相互作用与联系，揭示蛋白质功能与细胞生命活动规律。,09.12.2019,15,荧光染色的细胞内蛋白质,09.12.2019,16,第一节概述,与单一蛋白质研究比较，蛋白质组学的特点是：,蛋白质组学采用高通量和大规模的研究手段，在研究有关生命活动机制的基本规律方面达到了空前的规模和速度。最终目标：构建出细胞的“功能图”,09.12.2019,17,第一节概述,与基因组比较，蛋白质组学的特点是：,09.12.2019,18,主要研究内容,了解某种特定的细胞、组织或器官制造的蛋白质种类；,明确各种蛋白质分子是如何形成类似于电路的网络的；,描绘蛋白质的精确三维结构，揭示其结构上的关键部位，如与药物结合并且决定其活性的部位。,09.12.2019,19,第一节概述,蛋白质组学研究的意义,Genome-导演RNome-编剧Proteome-演员,09.12.2019,20,Centraldogma,09.12.2019,21,mRNA水平的基因表达研究取得进展，但mRNA与蛋白质间的相关系数仅为0.40.5，mRNA的种类与含量不能代表蛋白质的种类与含量。支原体的蛋白质数目较基因多24%，对于人，蛋白质的数目至少多3倍。蛋白质自身特点难以从DNA和mRNA水平得到解答：复杂的翻译后修饰、蛋白质的亚细胞定位或迁移、蛋白质蛋白质相互作用等,基因与其编码产物蛋白的非线性关系,第一节概述,09.12.2019,22,第一节概述,蛋白质组学研究范围及意义,表达蛋白质组学研究选择具有重要生物学意义且已完成DNA测序的生物体，鉴定出生物体/某种组织（细胞）所表达的全部蛋白质，建立其蛋白质表达谱数据库。进展较快的领域：一些重要的疾病及微生物组。有难度的领域：估计人类的蛋白质组由50万个蛋白质组成，真核生物细胞表达的蛋白质也超出1万个,09.12.2019,23,第一节概述,功能蛋白质组学研究识别、鉴定生物体（组织，细胞）与某一种生理现象或病理过程相关的所有蛋白质。,重要生命过程或重要疾病的比较蛋白质组学选取重大生命活动或重要疾病中几个相继阶段，识别、鉴定其差异表达的蛋白质，然后从核酸、蛋白质水平对差异蛋白的功能进行分析，从而确定重要生命活动的蛋白质基础或疾病的生物标志物。,09.12.2019,24,第一节概述,亚细胞复合物和细胞器蛋白质组分析了解蛋白质的功能和细胞定位。识别、鉴定蛋白质翻译后的修饰。药物靶标的发现蛋白质不仅是多种致病因子作用于机体的重要靶分子，也是大多数药物的靶标。一项统计表明：20世纪90年代中期，全世界制药业用于寻找新药的靶标483个，其中蛋白质占73%，而当时正在使用的药物共2000种，其中85%都是针对483种药靶。,09.12.2019,25,09.12.2019,26,第一节概述,发展高通量、高灵敏度、高准确性的研究技术平台是现在乃至相当一段时间内蛋白质组学研究中的主要任务。,09.12.2019,27,第二节蛋白质组学研究的技术体系,蛋白质组学的三大支撑技术,分离技术：双向电泳技术鉴定技术：质谱技术生物信息学：计算机图像分析与大规模数据处理技术,09.12.2019,28,第二节蛋白质组学研究的技术体系,蛋白质组学的三大支撑技术,分离技术：双向电泳技术鉴定技术：质谱技术生物信息学：计算机图像分析与大规模数据处理技术,09.12.2019,29,第二节蛋白质组学研究的技术体系,蛋白质组学两条互补的技术流程,两条互补的实验流程基于凝胶的工作流程（Gel-basedworkflow）基于液相色谱的工作流程（LC-basedworkflow）,09.12.2019,30,蛋白质组研究的技术路线流程图,09.12.2019,31,09.12.2019,32,蛋白质组学实验室所需的条件,09.12.2019,33,第二节蛋白质组学研究的技术体系,双向电泳TwoDimensionalElectrophoresis,09.12.2019,34,第二节蛋白质组学研究的技术体系,二维凝胶电泳（2-DE）目前唯一能将数千种蛋白质同时分离与展示的分离技术工作原理是根据蛋白质的两个一级属性：等电点和分子量的特异性，将蛋白质混合物通过等电聚焦电泳（IEF）和聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE），在两个水平上进行分离。1975年首先由OFarrell等创立,09.12.2019,35,09.12.2019,36,第二节蛋白质组学研究的技术体系,特点：,1、可分离10100KDa分子量的蛋白质2、高灵敏度和高分辨率3、重复性高4、便于计算机进行图像分析处理5、与质谱分析匹配,09.12.2019,37,第二节蛋白质组学研究的技术体系,重复性高的技术前提：,1、样品制备的重现性2、等电聚胶的pH梯度的稳定性及重现性3、一向胶条与二向胶之间的接触是否良好4、二向聚丙的聚合均匀程度及重现度5、凝胶显色方法的选择及显色时间的控制实验人员的操作技能,09.12.2019,38,2D-SDS-PAGE重复性,09.12.2019,39,09.12.2019,40,第二节蛋白质组学研究的技术体系,1、样品制备,通常可采用细胞或组织中的全蛋白质组分进行蛋白质组分析。也可以进行样品预分级，即将细胞或组织中的全体蛋白质分成不同部分，分别进行研究。,09.12.2019,41,第二节蛋白质组学研究的技术体系,过程1）收集生物样品2）破碎3）抽提,09.12.2019,42,第二节蛋白质组学研究的技术体系,抽提蛋白质常用到的试剂1）去污剂，有助于溶解膜蛋白质，并有助于膜蛋白质与脂类的分离2）还原剂，用于还原二硫键或防止蛋白质氧化3）变性剂，用于改变溶液离子强度和PH，破坏蛋白质-蛋白质相互作用，破坏蛋白质的二级结构和三级结构。4）酶，用于消化污染的核酸、糖和脂类。,09.12.2019,43,第二节蛋白质组学研究的技术体系,可能干扰蛋白质组分析的某些试剂1）苯甲基黄酰氟2）去污剂,09.12.2019,44,第二节蛋白质组学研究的技术体系,样品预分级的主要方法蛋白质溶解性：可溶性蛋白、非溶性蛋白等蛋白质定位：膜蛋白、核蛋白等蛋白质细胞器定位：线粒体、高尔基体、叶绿体等样品预分级主要作用在于提高低丰度蛋白质的上样量和检测灵敏度。,09.12.2019,45,第二节蛋白质组学研究的技术体系,分步提取法采用三种溶解性能不同的裂解液分步提取细胞总蛋白质组分，然后分别进行双向电泳分离。各步提取液：40mmol/LTris-base；8m/L尿素、4%CHAPS、100mmol/LDTT、40mmol/LTris-base、0.5%的两性电解质；5m/L尿素、2mol/L硫脲、4%CHAPS、2%SB3-10、2mmol/LTBP、40mmol/LTris-base、0.5%的两性电解质。,09.12.2019,46,09.12.2019,47,第二节蛋白质组学研究的技术体系,2、等电聚焦OFarrell系统：小分子载体两性电解质形成pH梯度。当电压加在载体两性电解质混合物间时，高pI的分子移向阴极，低pI的分子移向阳极，形成一个连续的pH梯度。缺陷梯度胶稳定性差，电泳时易因电渗而出现阴性漂移,09.12.2019,48,第二节蛋白质组学研究的技术体系,固相pH梯度等电聚焦是80年代建立起来的一种等电聚焦技术，其所用的介质是一些具有弱酸或弱碱性质的丙稀酰胺衍生物，它们于丙稀酰胺和甲叉双丙稀酰胺有相似的聚合行为。固定化电解质一端的双键可以在聚合中共价结合到聚丙烯酰胺介质中，其另一端的R集团为弱酸或弱碱，可在聚合物中形成弱酸或弱碱的缓冲体系，利用缓冲体系滴定终点附近一段pH范围就可行成近似线性的pH梯度，所以固相pH梯度在凝胶聚合时形成而不随环境电场条件的改变而改变，固相pH梯度等电聚焦比传统等电聚焦具有更高的分辨率，更大的上样量，其分辨率可达到0.001pH，是目前分辨率最高的电泳方法之一。,09.12.2019,49,09.12.2019,50,第二节蛋白质组学研究的技术体系,IPG优点克服了载体两性电解质阴极漂移等缺点。稳定的可以随意精确设定的pH梯度。尤其可在较窄的pH范围内进行第二轮分析，大大提高了分辨率及重复性。重现性好上样量大,09.12.2019,51,第二节蛋白质组学研究的技术体系,3.聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）第二相的分子量分离：制胶；IPG胶在SDS平衡液中还原和烷基化；第一向胶成分移至第二向胶上；电泳；蛋白检测,09.12.2019,52,第二节蛋白质组学研究的技术体系,IPG胶在SDS平衡液中还原和烷基化平衡液：使胶条上的蛋白质变性，破环蛋白质的高级结构及亚基间相互作用SDS:阴离子去污剂，1mmol/L,结合使蛋白带负电荷过量，在电场作用下，迁移速率主要有分子量决定尿素、还原剂（DTT）、烷化剂（IAA）,09.12.2019,53,第二节蛋白质组学研究的技术体系,第一向胶成分移至第二向胶上最关键步骤注意事项：第一向胶和第二向胶接触好：避免引入气泡，封胶均匀：避免二向电泳时胶条的移动SDS-PAGE电泳,09.12.2019,54,09.12.2019,55,09.12.2019,56,09.12.2019,57,EttanDalttwelve电泳系统,09.12.2019,58,EttanDaltsix电泳系统,09.12.2019,59,09.12.2019,60,09.12.2019,61,可能原因：样品含高丰度Pr,可能原因：TCA残留致使Pr丢失,09.12.2019,62,可能原因：Tris质量不好,可能原因：Urea不纯,09.12.2019,63,第二节蛋白质组学研究的技术体系,蛋白检测检测某种蛋白是否存在用Westernblotting进行分析；显示蛋白质全谱时多用银染色法检测，或用灵敏度较高的荧光标记与同位素标记检测；当双向电泳蛋白分离后紧跟质谱鉴定时，多用考马斯亮兰R-250、Cu染或Zn-咪唑负性染色法。,09.12.2019,64,第二节蛋白质组学研究的技术体系,图像分析系统图像采集硬件和图像分析软件Melanie3、PDQuest6.0、Imagemaster2DElit3.10等基本功能确定蛋白质斑点的位置、大小、染色深浅、pI和分子量；图谱间的比较、差异蛋白质斑点的确定；图谱质量的优化、数据的储存管理、数据库分析等内容。,09.12.2019,65,ImageScanner,09.12.2019,66,全自动斑点切取系统（EttanSpotPicker）,09.12.2019,67,第二节蛋白质组学研究的技术体系,新型非凝胶分离技术液相色谱法liquidchromatography，LC毛细管电泳capillaryelectrophoresis，CE,09.12.2019,68,第二节蛋白质组学研究的技术体系,生物质谱与蛋白质鉴定,09.12.2019,69,第二节蛋白质组学研究的技术体系,蛋白质的鉴定方法主要利用蛋白质的各种属性参数，如分子量、等电点、序列、氨基酸组成和肽质量指纹谱等，在蛋白质数据库中检索，寻找与这些参数相符的蛋白质。如果在数据库中找不到，有可能是发现了新蛋白，进一步要进行序列分析，合成探针，分离相应基因来表达，进一步鉴定这一蛋白质生物质谱技术在蛋白质组鉴定中起非常重要的作用,09.12.2019,70,第二节蛋白质组学研究的技术体系,质谱仪的发展简史1912年：世界第一台质谱装置1940年代:质谱仪用于同位素测定1950年代：MS商品化广泛用于有机物结构分析1960年代：研究GC-MS联用技术1980年代：研究LC-MS联用技术1990年代：生物分析的需要，新的离子化方法,09.12.2019,71,第二节蛋白质组学研究的技术体系,生物质谱技术质谱分析法是通过测定样品离子的质量与电荷比值-质荷比(mass/charge，m/z)来进行未知化合物的成分和结构分析的分析方法。质谱分析所获得的结果即离子的相对含量与质荷比之间的关系图就称为质谱图（亦称质谱）,09.12.2019,72,09.12.2019,73,第二节蛋白质组学研究的技术体系,质谱法的特点,1、信息量大，应用范围广，是研究有机化学和结构的有力工具。,2、由于分子离子峰可以提供样品分子的相对分子量的信息，所以质谱法也是测定分子量的常用方法。,3、分析速度快、灵敏度高、高分辨率的质谱仪可以提供分子或离子的精密测定。,4、质谱仪器较为精密，价格较贵，工作环境要求较高，给普及带来一定的限制。,09.12.2019,74,第二节蛋白质组学研究的技术体系,质谱能够提供的信息：相对分子质量低分辨质谱就可以确定相对分子质量，高分辨质谱可精确到0.0001；分子式(样品的元素组成)用同位素丰度比法（低分辨法）或高分辨质谱仪测得的准确相对分子质量,均可以确定分子式；,09.12.2019,75,第二节蛋白质组学研究的技术体系,鉴定某些官能团如甲基(m/z15)、羰基(m/z28)、甲氧基(m/z31)、乙酰基(m/z43)分子结构信息由分子结构与裂解方式的经验规律,根据碎片离子的m/z及相对丰度RA提供分子结构信息；人机问答，给出可能的化合物。,09.12.2019,76,09.12.2019,77,Source,HexapolePre-filter,Q1MassFilter,Detector+/-ions,Q3MassFilter,Q2semi-circularCollisionCell,250l/sTurbo,Interlock,09.12.2019,78,质谱分析原理,09.12.2019,79,第二节蛋白质组学研究的技术体系,离子源离子源的作用是将欲分析样品电离，得到带有样品信息的离子。质谱仪的离子源种类很多:,09.12.2019,80,第二节蛋白质组学研究的技术体系,1、电子电离源(ElectronIonization，EI)2、化学电离源(ChemicalIonization,CI)。3、快原子轰击源（FastAtomicbombardment,FAB）4电喷雾源(ElectronsprayIonization，ESI)5大气压化学电离源(AtmosphericpressurechemicalIonization,APCI),09.12.2019,81,第二节蛋白质组学研究的技术体系,质谱仪的分类按用途分：有机质谱；无机质谱；同位素质谱按原理分：单聚焦质谱；双聚焦质谱；四极质谱；飞行时间质谱；回旋共振质谱按联用方式分：气质联用；液质联用；质质联用,09.12.2019,82,第二节蛋白质组学研究的技术体系,质谱分析法原理将样品转化为运动的带电气态离子碎片，然后按质荷比(m/z)大小分离并记录的分析方法,09.12.2019,83,第二节蛋白质组学研究的技术体系,仪器组成按质量分析器(或者磁场种类)可分为静态仪器和动态仪器，即稳定电磁场(单聚焦及双聚焦质谱仪)和变化电磁场(飞行时间和四极杆质谱仪)MS仪器一般由真空系统、进样系统、电离源、质量分析器和检测系统构成,09.12.2019,84,第二节蛋白质组学研究的技术体系,真空系统质谱仪中所有部分均要处高度真空的条件下(10-4-10-6Pa),其作用是减少离子碰撞损失。真空度过低，将会引起：a)大量氧会烧坏离子源灯丝b)引起其它分子离子反应，使质谱图复杂化c)干扰离子源正常调节d)用作加速离子的几千伏高压会引起放电,09.12.2019,85,第二节蛋白质组学研究的技术体系,一般质谱仪都采用机械泵预抽空后，再用高效率扩散泵连续地运行以保持真空。现代质谱仪采用分子泵可获得更高的真空度,09.12.2019,86,第二节蛋白质组学研究的技术体系,进样系统对进样系统的要求：重复性、不引起真空度降低（1）间接进样适于气体、沸点低且易挥发的液体、中等蒸汽压固体。注入样品(10-100g)贮样器(1-3L)抽真空(1Pa)并加热到15000C样品蒸汽分子(压力梯度)漏隙高真空离子源,09.12.2019,87,09.12.2019,88,第二节蛋白质组学研究的技术体系,（2）直接探针进样适于高沸点液体及固体样品探针杆通常是一根规格为25cm6mmi.d.,前端有一容纳样品的陶瓷小凹槽，当探针插入或拉出时，斜置的封闭阀就可将真空体系与外界大气隔绝，通电发热，使样品蒸发，对热稳定的有机化合物一般可加热到20030000C而不分解，通常可分析非极性分子的分子量可达1000u，中等极性分子量达300u,09.12.2019,89,09.12.2019,90,第二节蛋白质组学研究的技术体系,优点：1)引入样品量小，样品蒸汽压可以很低2)可以分析复杂有机物3)应用更广泛,09.12.2019,91,第二节蛋白质组学研究的技术体系,（3）色谱进样：利用气相和液相色谱的分离能力，进行多组份复杂混合物分析,09.12.2019,92,第二节蛋白质组学研究的技术体系,3电离源(室)将引入的样品转化为正离子，并使之加速，聚焦为离子束的装置。由于离子化所需要的能量随分子不同差异很大，因此，对于不同的分子应选择不同的离解方法,09.12.2019,93,第二节蛋白质组学研究的技术体系,根据样品离子化方式和电离源能量高低，通常可将电离源分为：气相源：先蒸发再激发，适于沸点低于500oC、对热稳定的样品的离子化，包括电子轰击源、化学电离源、场电离源、火花源解吸源：固态或液态样品不需要挥发而直接被转化为气相，适用于分子量高达105的非挥发性或热不稳定性样品的离子化。包括场解吸源、快原子轰击源、激光解吸源、离子喷雾源和大气压化学（热喷雾）电离源等,09.12.2019,94,第二节蛋白质组学研究的技术体系,硬源：离子化能量高，伴有化学键的断裂，谱图复杂，可得到分子官能团的信息，如电子轰击，快原子轰击软源：离子化能量低，产生的碎片少，谱图简单，可得到分子量信息，如化学电离源，场电离源，场解吸电离源，激光解吸电离源，电喷雾电离源，大气压化学（热喷雾）电离源,09.12.2019,95,第二节蛋白质组学研究的技术体系,（1）电子轰击源（EI）电子轰击法是通用的电离法，是使用高能电子束从试样分子中撞出一个电子而产生正离子，即M+eM+2e式中M为待测分子，M+为分子离子或母体离子,09.12.2019,96,第二节蛋白质组学研究的技术体系,水平方向：加热灯丝与阳极间(加直流电压70V)高能电子束冲击样品正离子垂直方向：G3-G4加速电极(低电压)-较小动能-狭缝准直G4-G5加速电极(高电压)-较高动能-狭缝进一步准直-离子进入质量分析器,09.12.2019,97,09.12.2019,98,第二节蛋白质组学研究的技术体系,EI特点1使用最广泛，谱库最完整2电离效率高3结构简单，操作方便4分子离子峰很弱或不出现：因为电子能量高达70eV，而大多数有机化合物的电离电位约为7-10eV，因此除生成分子离子外，还要进一步断裂成碎片离子，约有10-20%的有机化合物（相对质量较大，极性大，难气化，热稳定性差的化合物）电离时缺少分子离子峰,09.12.2019,99,第二节蛋白质组学研究的技术体系,（2）化学电离源(CI)原理：高能量的电子轰击反应气体使之电离，电离后的反应分子再与试样分子碰撞发生分子离子反应形成准分子离子和少数碎片离子作用过程：样品分子在承受电子轰击前，被一种反应气(通常是甲烷)稀释，稀释比例约为103:1，因此样品分子与电子的碰撞几率极小，所生成的分子离子主要由反应气分子组成,47,41,09.12.2019,100,第二节蛋白质组学研究的技术体系,进入电离源的样品分子R-CH3大部分与CH5+碰撞产生(M+1)+离子；小部分与C2H5+反应，生成(M-1)+离子；极微小部分发生复合反应：,09.12.2019,101,这样就形成了一系列准分子离子QM+而出现(M+1)+，(M-1)+，(M+17)+，(M+29)+等质谱峰,产生M+1峰,质子化反应,复合反应,09.12.2019,102,第二节蛋白质组学研究的技术体系,CI特点：1准分子离子峰即(M+1)+峰很强，可提供相对分子质量这一重要信息，从而可以推断出相对分子质量2碎片峰较少，谱图简单，因为电离样品分子的不是高能电子流，而是能量较低的二次离子，键断裂的可能性较小，峰的数目随之减少3使用CI时需要将试样气化后进入离子源，因此不适用于难挥发，热不稳定或极性较大的有机物分析,09.12.2019,103,（3）场电离源(FI),应用强电场(电压梯度107-108V/cm)诱导样品电离,过程：强电场分子电子的量子隧道效应*分子热分解或碰撞带正电荷的碎片离子阳极排斥出并加速进入质量分析器,r2.5m,CCCH,09.12.2019,159,第二节蛋白质组学研究的技术体系,分子离子峰,分子电离一个电子后所形成的离子所产生的峰。分子离子的质量与化合物的分子量相等。,09.12.2019,160,第二节蛋白质组学研究的技术体系,分子离子峰的特点,1、一般质谱图上质荷比最大的峰为分子离子峰；有例外。,2、形成分子离子需要的能量最低，一般约电子伏特。,09.12.2019,161,第二节蛋白质组学研究的技术体系,M+1峰：某些化合物（如醚、酯、胺、酰胺等）形成的分子离子不稳定，分子离子峰很小，甚至不出现；但M+1峰却相当大。这是由于分子离子在离子源中捕获一个H而形成的，例如：,09.12.2019,162,第二节蛋白质组学研究的技术体系,M-1峰：有些化合物没有分子离子峰，但M-1峰却较大，醛就是一个典型的例子，这是由于发生如下的裂解而形成的：,09.12.2019,163,同位素离子峰（M+1峰）,由于同位素的存在，可以看到比分子离子峰大一个质量单位的峰；有时还可以观察到M+2，M+3。,例如：CH4M=1612C+1H4=16M分子离子峰13C+1H4=17M+112C+2H+1H3=17M+113C+2H+1H3=18M+2,同位素峰,09.12.2019,164,第二节蛋白质组学研究的技术体系,碎片离子峰,一般有机化合物的电离能为713电子伏特，质谱中常用的电离电压为70电子伏特，使结构裂解，产生各种“碎片”离子。半异裂：已电离的键开裂:X+-YX+Y,异裂：键异裂：X-YX+Y-,09.12.2019,165,开裂方式：均裂：键均裂：X-YX+Y,09.12.2019,166,正已烷裂解后产生的离子碎片,09.12.2019,167,同位素离子峰（M+1峰）,由于同位素的存在，可以看到比分子离子峰大一个质量单位的峰；有时还可以观察到M+2，M+3。,例如：CH4M=1612C+1H4=16M分子离子峰13C+1H4=17M+112C+2H+1H3=17M+113C+2H+1H3=18M+2,同位素峰,09.12.2019,168,亚稳离子：从离子源出口到达检测器之前产生并记录下来的离子称亚稳离子。离子从离子源到达检测器所需时间约10-5秒(随仪器及实验条件而变)，寿命大于10-5秒的稳定离子足以到达检测器，而寿命小于10-5秒的离子可能裂解(M1+M2+中性碎片)。在质量分析器之前裂解产生的M2+因其动能小于离子源生成的M2+，在磁分析器中的偏转不同，以低强度、于表观质量m*(跨23个质量单位)处被记录下来，其mz一般不为整数。m*与m1、m2(分别为M1，M2离子的质量)之间的关系为：m*=m22/m1,09.12.2019,169,质荷比一般不是整数(