（生物学专业论文）圆弧青霉pg37碱性脂肪酶的发酵生产、分离纯化及基因克隆和表达.pdf

缩写词表 一一 缩写词表 a b b r e v i a t i o n sw i t hc h i n e s ea n de n g l i s hi n t e r p r e t a t i o n - 缉呈墓室鲤猛 a b a 2 6 0 a c n a g a m p a t p b i s b p b s a c a m p c d n a d a d t t d n a s e d n a d e a e d e p c o n s c l d s e d t a a n t i b o d y a b s o r b a n c ea t2 6 0n m a c e t o n i t r i l e a n t i g e n a m p i c u l i u a d e n o s i n e 5 - t r i p h o p h a t e n n m e t h y l e n e b i s a c r y l a m i d e b a s e p a i r b o v i n es e r u ma l b u m i n a d e n o s i n e 3 ，5 一c y c l i c - m o n o p h o s p h a t e c o m p l e m e n t a r yd e o x y r b o n u c l e i ca c i d d a l t o n d i t h i o t h r e i t o l d e o x y r i b o n u c l e a s e d e o x y r i b o n u c l e i c a c i d d i e t h y l a m i n o e t h y l d i e t h y l p y r o c a r b o n a t e d a n s y ic h l o r i d e d o u b l es t r a n d e d e t h y l e n e d i a m i n e t e t r a a c e t i c a c i d 1 主塞鲤猛 抗体 2 6 0n m 处吸光度 乙膪 抗原 氨苄青霉素 腺苷三磷酸 n n 亚甲双丙烯酰胺 碱基对 牛血清白蛋白 环腺背酸 互补d n a 道尔i 顷 二硫苏糖醇 脱氧核糖核酸酶 脱氧核糖核酸 二乙基氨基乙基 焦碳酸二乙酯 丹磺酰氯 双链 乙二胺四乙酸 一 竺竺望查 一 e c e s i m s g s t h r p o h p l c i p t g c f 1 9g k m l a s l i p i l i p i i l i p h i m r n a m d g l m d l c m m l v m o p s n t g 0 r f o l i g o ( d t ) p i p e g p g 3 7 p b 2 2 7 e n z y m e c o m m i s i o n e l e c t r o s p r a yi o n i z a t i o nm a s ss p e c t r o m e t r y g l u t a t h i o n es - t r a n s f e r a s e h o r s e r a d i s hp e r o x i d a s e h i g h p e r f o r m a n c el i q u i dc h r o m a t o g r a p h y i s o p r o p y l 一1 一t h i o b d g a l a c t o s i d e i s o e l e c t r i cf o c u s i n g i m m u n o g l o b u l i n g m i c h a e l i sc o n s t a n t l i n e a ra l k y lb e n z e n es u l f o n a t e a l k a l i n el i p a s ei a l k a l i n el i p a s ei i a l k a l i n el i p a s ei i i m e s s e n g e r r i b o n u c l e i ca c i d m o n o a n d d i a c y l g l y c e r o ll i p a s e g e n e e n c o d i n gm d g l f r o mp g 3 7 m o l o n e y m u r i n el e u k e m i av i r u s 3 一( n m o r p h o l i n o ) p r o p a n es u l p h o n i e a c i d n m e t h y l e n n i t r o n - n i t r o s o g u a n i d i l l e o p e nr e a d i n gf r a m e o l i g o d e o x y t h y m i d y l i c a c i d l s o e l e c t r i cp o i n t p o l y e t h y l e n eg l y c o l p e n i c i l l i u mc y c l o p i n mp g 3 7 p e n i c i l l i u m c y c l o p i u m p b 2 2 7 2 酶学委员会 电喷雾质谱 谷胱苷肤s 转移酶 辣根过氧化物酶 高效液相色谱 异丙基硫代一d d 一 半乳糖苷 等电聚焦 免疫球蛋白g 米氏常数 直链烷基苯磺酸按 碱性脂肪酶i 碱性脂肪酶 碱性脂肪酶1 1 i 信使核糖核酸 单双脂酰廿油脂肪酶 p g 3 7m d g l 基因 鼠白血病病毒 3 一( n 一吗啉代) 丙磺酸 亚硝基胍 开放阅读框架 寡聚脱氧胸苷酸 等电点 聚乙二醇 圆弧青霉p g 3 7 菌株 圆弧青霉p b 2 2 7 菌株 缩写词表 p o l y ( a ) p a g e p b s p v a r r n a r t p c r p c r r e r p h p l c r n a s e s d s s s t a e t s p t e m e d p o l y a d e n y l i ca c i d p o l y a c r y l a m i d eg e le l e c t r o p h o r e s i s p h o s p h a t e b u f f e r e ds a l i n e p o l y v i n y la l c o h o l r i b o s o m er i b o n u c l e i ea c i d r e v e r s e t r a n s c i i p t i o np c r p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n r e s t r i c t i o ne n d o n u c l e a s e r e v e r s e dp h a s eh p l c r i b o n u c l e a s e s o d i u m d o d e c y ls u l f a t e s i n g l es t r a n d e d t r i s a c e t a t eb u f r e r t r a n s c r i p t i o ns t a r tp o i n t n ，n ，n ，n 一t e t r a m e t h y l e t h y l e n e d i a m i n e 1 r m u o r o a c e t i ca c i d t r i a c y l g l y c e r o ll i p a s e t e t r a c y c l i n e t h e r m u s a q u a t i c u sd n ap o l y m e r a s e t r i s e d t ab u 【t i e r t r i s ( h y d r o x y m e t h y l ) a m i n o m e t h a n e u i t r a v i o l e t t r a l l $ f e rr i b o n u c l e i ea c i d 5 - b r o m o 一4 一c h l o r o - 3 一i n d o l y l b d g a l a c t o s i d e 3 多聚腺苷酸 聚丙烯酰胺凝胶电泳 磷酸缓冲盐水 聚乙烯醇 核糖体核糖核酸 逆转录p c r 聚合酶链式反应 限制性内切酶 反相h p l c 核糖核酸酶 十二烷基硫酸钠 单链 t r i s 一乙酸电泳缓冲液 转录起始点 n ，n ，n ，n 一四甲基乙二胺 三氟乙酸 三脂酰甘油脂肪酶 四环素 栖热水生菌d n a 聚合酶 t r i s e d t a 缓冲液 三( 羟甲基) 氨基甲烷 紫外线 转移核糖核酸 5 一溴一4 一氯一3 一吲哚一d d 一 半乳糖苷 帆 r 啪他 ；| 耋 w 中文摘要 圆弧青霉碱性脂肪酶的发酵生产、分离 纯化及基因克隆和表达 博士研究生：邬敏辰 导师：孙崇荣黄伟达 摘要 木博士论文对圆弧青霉碱性脂肪酶进行了较系统深入：t l 啪r 究，实验内容包括： 侧弧青霉突变株p g 3 7 的诱变选育、p g 3 7 碱性脂肪酶发酵工艺条件的优化、2 5l 实验室小罐发酵条件探索、2 0m 3 发酵罐大生产试验以及脂肪酶提取和颗粒酶制备 等的研究；碱性脂肪酶分离纯化和酶学特性的研究、制备型聚丙烯酰胺凝胶电泳的 吲工酶分离和酶动力学常数等的测定、利用高效反桐色谱和电喷雾质潜法分别构建 和测定了同工酶l i pi 的胰蛋白酶酶解肽谱和准确分子量；p g 3 7l i pi 基因的p c r 扩增、克隆和表达；对真菌脂肪酶一级结构进行了分类和分析，并构建了真菌脂肪 酶的系统进化树。 一、碱性脂肪酶菌利t 选育和发酵生产 1 圆弧青霉碱性脂肪酶的菌种选育 有关碱性脂肪酶生产菌株选育的文献大多只谈及土壤等的筛选，菌种改良的方 法和结果则很少见报道。本研究以圆弧青霉白色变株p b 2 2 7 为出发菌株，采用紫 p l - 年r l 亚硝基胍等多次物理化学涛变，筛选抗真菌抗生素的抗性株和抗底物、底物结 构类似物或底物分解产物的抗性株，获得一株己酸抗性突变株p g 3 7 ，其产酶水平 比发株p b 2 2 7 提高了15 倍，达到5 5 7 u m l 。 2圆弧青霉p g 3 7 碱性脂肪酶的发酵工艺条件优化 在选育出碱性脂肪酶高产菌株p g 3 7 的基础上，研究了p g 3 7 碱性脂肪酶的发 酵工艺条件，优化了p g 3 7 的摇瓶最适产酶条件。发酵产酶培养基的组成为( g d l ) ： 豆饼粉40 ，玉米浆30 ，磷酸氢二钾10 ，硫酸镁01 ，大豆磷脂10 ，柠檬酸o0 5 ， 豇汕02 ，起始d h75 ；发酵工艺条件为：装液量5 0 m l 5 0 0 m l 三角瓶，摇瓶转速2 5 0 r m i n ，培养温度和叫问分别为2 8 _ + 1 和9 6h ，发酵期问第3 6 、5 4 和7 2h 各流加0 4 4 中文摘要 e j d l 花, l i a i l 。在上述条件下，p g 3 7 的脂肪酶活性为2 0 6 0u m l ，是条件优化前的37 倍允彳l 。吲弧青霉p g 3 7 在2 5l 实验室小罐的产酶平均水平为2 9 0 0 u m l 。 3 圆弧青霹p g 3 7 碱性脂肪酶的工业化生产试验 在摇瓶和2 5l 实验室小罐试验成功的基础上，进行了大生产试验。实验结果 表l ! j | ，2 0m 3 发酵罐在通风量为0 3 08w v m i n 、搅拌转速为1 8 0r m i n 、发酵温度 2 8 + _ 1 、发酵过程中流加豆汕以补充碳源以及控制发酵醪p t i 值7 为2 - 7 、6 的条件 卜，发酵7 2h 左右，成熟发酵液酶活性达4 5 2 0u m l ，为摇瓶发酵i 佝22 倍。 4 圆弧青霉p g 3 7 碱f _ u j p , 肪酶的提取 刚p g 3 7 碱e - m t 肪酶的提取和颗粒酶的制备进行了研究。发酵液经过滤、超滤 浓缩、硫酸铵沉淀、造粒等过程制得颗粒碱性脂肪酶成品，酶的提取总收率在7 0 以卜，颗粒酶活性单位为50 x 1 0 4u g 。 二、p g 3 7 碱性脂肪酶的分离纯化和特性 1 p g 3 7 l i p1 的分离纯化、特性和n 末端氨基酸序列测定 网弧青霉p g 3 7 成熟发酵液经离心、硫酸铵盐析、疏水层析、阴离子交换层析 和凝胶过滤层析等分离纯化步骤，获得了比活性为每毫克5 2 0 0u 的l i pi ，纯化倍 数】65 ，得率3 32 ，在聚丙烯凝胶电泳( p a g e ) 5 f i is d s 一聚丙烯凝胶电泳( s d s p a g e ) 上均呈现单一蛋白质条带。s d s p a g e 和凝胶过滤( s e p h a d e xg 1 5 0 ) 分别测得l i p i 的分子量为2 75k d a 和2 9k d a ，表明该酶蛋白以滩体形式存在。n 末端2 0 个氨基 酸残基的序列测定结果为a t a d a a a f p d l h r a a k l s s a ，与已知的脂肪酶的n 末 端序列没有同源性。l i pi 的酶学性质研究结果表明，该酶的最适作月j 温度为2 5 ， 在3 0 c 以下稳定，4 0 处理2 0r a i n 仅残留3 0 酶活性；p h 稳定范围在6 5 1 05 之 间，最适作用p h 为1 0 0 。 研究了洗涤剂中阴离予和非离子表面活性剂对碱性脂肪酶稳定性的影响，阴离 于表而活性剂l a s 对脂肪酶活性的影响较大，而非离子活, k i - 齐0a e 0 9 列酶活t l ：无 影响，且具有抵消阴离子l a s 对酶活性的影响。在洗涤荆中蛋白酶规定的添加量 范围内，对p g 3 7 碱性脂肪酶活性的影响较小，两者可同时添加在洗涤剂中。上述 所有酶学特性的研究结果表明，该碱性脂肪酶可以用作洗涤剂的添加成分。 2 p g 3 7 碱性脂肪酶同工酶的分离纯化和物理常数测定 刘经疏水层析和阴离子交换层析等部分纯化的样品，采用制备型聚丙烯酰胺凝 胶电泳进一步将其分离纯化，获得了p g 3 7 碱性脂肪酶的3 个蛋白质组分，其一1 pl i p 1 为扛成分，它们在s d s p a g e 图谱上呈现同一水平位置的单一蛋白条带，而在 s 中文摘要 p a g e = 却呈现3 个不同位置的条带。采用酶蛋门活性条带印迹技术证明了这3 个 条带都具有碱性脂肪酶的活性，从而推断p g 3 7 所产脂肪酶中同时存在3 种碱性同 ， 一酶，它们的分子量几乎相同，分别称其为l i pi 、l i pl i 和l i p 1 1r 。测定了l i pi 和l i pl i 的等电点分别为p i5 4 和50 ，同州它们的动力学常数k 。和v 分别为 45 4 、6 4 1 ( v v ) 干 1 55 6 、47 6i t m o l m i n i - t g 。 3 p g 3 7 l i pi 的高效反相色谱和质谱研究 以常压层析系统纯化的碱性脂肪酶( l i pi ) 为 发蛋白，采月| 高压反相色谱对其 进步分离纯化，以满足肽谱分析所需纯度的需要。用电喷雾质谱测得l i p1 的准 确分予量为2 7 ，2 1 7 1d a 。对该脂肪酶的胰蛋白酶水解条件，紫外吸光系数( a 。1 ) 、 部分肽段的分子量和氨基酸残基序列等进行了研究和测定，结果显示水解液中添加 尿素对水解有明显的影响，l i pi 的紫外吸光系数a ，。为80 3 ，纯化的2 个胰蛋白 酶肫解肤段的部分氨基酸序列分别为i y d l v t d 和y p d y t l e a v 。 三、l i pi 碱性脂肪酶的基因克隆不i 表达 本研究在测定了p g 3 7l i pin 末端和2 个胰蛋白酶酶解j j 太段部分氨基酸序列的 錾础上，采用分段p c r 扩增和克隆的方法，获得了l i pi 基凶，并分别测定了完整 的c d n a 和d n a 基因序列，并依据c d n a 推导出了包括信号肽在内的完糕的l i p i 氰l l ；酸j 乒列。将去除n 末端信号肚序列的l i plc d n a 兜隆至表达载休p g e x 。5 x 一3 和p t y b l l 中，分别在大肠杆菌b l 2 1 和e r 2 5 6 6 中得到了融合表达。整个实验内 容包括以下步骤： i p g 3 7 l i p ic d n a 的克隆、序列分析和表达，以及免疫印迹鉴定 采用t r i z o l 试剂一步法抽提p g 3 7 总r n a ，所提取总r n a 的a 。：a 2 。值为 1 8 2 ，甲醛变性琼脂糖凝胶电泳呈现真核微生物所特有的2 8 sr r n a 和1 8 sr r n a 条惟 ，说明r n a 样品的纯度较高，m r n a 未发生分解。根据l i pi n 末端2 0 个氨 基陵残基序列和真核生物m r n a 在3 端具有p o l y ( a ) 等所提供的信息，设汁并合成 了简m e p c r 引物，利用r t p c r 技术扩增了p g 3 7l i pi 成熟肽编码区和3 非编 码区的c d n a ，并将p c r 产物直接克隆至p u c m t 载体中。序列分析表明，该l i p i 成熟蛋白含有2 5 8 个氨基骏，其中保守的五肽序列为g l y h i s s e r l e u g l y 。进一步 采用c | o n t e c h 公司的s m a r t t mp c re d n a 文库构建试剂盒，扩增、克隆和测定 了自m r n a 转录起始点至编码区的e d n a 片段，从而完成了l i pi 完烂e d n a 的 分析测定。将编码完整l i p1 成熟肷的c d n a 克隆到p g e x 表达载体中，在大肠杆 菌b l 2 1 中进行i p t g 诱导表达，s d s p a g e 检测结果表明，所表达的g s t l i pi 6 中文摘要 蛋l 】分予量约为5 3k d a 。利用免疫印迹( w e s t e r nb l o t t i n g ) 技术，发现该融合蛋自能 与抗碱性脂肪酶( l i pi ) 的小鼠j 衄清起特异的抗原抗体反应，从而从一个方丽证实所 克隆的c d n a 即为编码p g 3 7 成熟l i pi 的基因。p g 3 7l i pic d n a 基因的确定，为 深入地研究该碱性脂肪酶的结构与功能、优化酶学特性和构建高表达的重组工程菌 打下了基甜；。 2 p g 3 7 l i p id n a 的扩增、克隆和序列分析 对于真核微生物基因组来说，d j 于大多数结构基因是不连续的，所以在已知了 c d n a 序列的基础上，有必要进一步确定l i pi 的d n a 序列，以确定该脂肪酶基因 足否含有内含子以及内含予数目和长度。分别在c d n a 转录起始位点和终止密码 予附近设计合成一对引物，以p g 3 7 基因组d n a 为模板，采用p c r 技术扩增并克 隆了l i pi 的d n a 片段，最后采用单测p c r 技术，克隆了l i pi 基因的肩动子序 列，从而完成了整个l i p id n a 的序列分析测定。 3 p g 3 7m d l c 和p e n i c i l l i m ne x p t t n s u mw m c 2 0 7l8 脂肪酶丛凶的克隆 同州，我们又在同一菌株p g 3 7 中克隆了一个酶学性质和序列jl i p1 完全不 同的脂肪酶的基因，核苷酸序列测定结果表明与已知酶学性质和氨基酸序列的 1 ) e t # c i l l i t t mc a m e m b e r t i iu 一1 5 0 完全一致，属于m o n o a n dd i a c y l g l y c e r o ll i p a s e 。另外， 我们采用扩增l i pid n a 的同一列引物，在p e n i c i l l i t m te x l ) a n s i i i l lw m c 2 0 7 1 8 基因 组d n a 中扩增和克隆了一个脂肪酶基因，测序结果表明与l i pi1 # 因序列完全一 致。 四、真菌脂肪酶一级结构的分类和分析 1真菌脂肪酶一级结构分类 作者首先研究和分析了几乎所有已报道的真菌脂肪酶基因和氨基酸序列，包括 本人最近发表的p e nc y c l o p i u mp g 3 7 和p e n e x p a n 朋mw m c 2 0 7 1 8 脂肪酶氨基酸序 列。在此基础上，采用p c g e n e68 软件系统刘各种真菌脂肪酶的氨基酸序列进行 了同源性比较，根据序列的同源性高低，将真菌脂肪酶归纳为5 类，其l | f 每类脂肪 酶的氨基酸序列同源性大于6 0 ，而各类之间的同源, t d - r a q q , 于3 0 。用c l u s t a l 方 法构建了真菌脂肪酶的系统进化树，将各种真菌脂肪酶的基因或氨l ，酸序列进行分 类，有利于对脂肪酶进行系统的硼：究和分析。 2 真菌脂肪酶基因和氨基酸序列分析 在上述分类的基础上对真菌脂肪酶的氨基酸和基因结构进行了分析。分析结果 表明：真菌脂肪酶d n a 基因中有些不含内含子，对于有内含子的脂肪酶基因，其 7 中文摘要 内含f 的结构和剪接位置与已确定的丝状真阿非：o 浮类似，仍内岔了的数川以拜小 弄n 同：已报道的真菌脂肪酶基因在转录起始点l 游含育l l 核生物4 导仃的c k f l 、州 t a t a a a 保守序列，以及住终止密码予1 ：游禽有肌1 尾识圳信号a a t a a a ；讹i i v 类炎茼脂肪酶的保j ) ：序列为g l y h i s s e , 一l e t , 一g l y ，而第v 炎的为g l y l g l u s e , 一a l a g l y ；真莳脂肪酶一。级结构中的s e t 、a s p 和l l i s 组成了脓的活协f f j 吖t ，f 心：f “i 儿 黼腑胁酶一级结构r f 吖f 种：祧基化识别序列a s h 。x s e r t h r ，i 亥胁l 啪! ：种锄贷j 7 ： 晰另一些却不存企该l , , q z i 位点。 、。| 关键词：碱性脂肪酶；圆弧青霉；菌种选育；发酵；工艺条件优化；超滤 f 颗粒酶；纯化与特。陛；n 末端氮基酸序列；碱性蛋白酶；表面活性剂 同工酶；酶动力学；制备型凝胶电泳；高压液相色谱；电喷雾质谱 、。j；、 肽谱；紫外吸收系数；p o r 扩增：克隆；基因序列；大肠杆菌 融合表达；免疫印迹；同源| 生；系统进化树； 分类；序列分析 一一 苎查塑苎 一 f e r m e n t a t i o np r o d u c t i o na n dp u r i f i c a t i o no f a l k a l i n e l i p a s e ，a n dc l o n i n g a n d e x p r e s s i o n o fal i p a s cg e n e f r o mp e n i c i l l i u mc y c l o p i u mp g 3 7 p h d c a n d i d a t e ：w um i n c h e n s u p e r v i s o r ：s u nc h o n g - r o n g a n d h u a n g w e i d a a b s t r a c t t h es t u d i e so na l k a l i n el i p a s eb yp e n i c i l l i u mc y c l o p i u mw e r ec a r r i e do u td e e p l ya n d s y s t e m a t i c a l l y i n m y p hdd i s s e r t a t i o nt h e s t u d y i n g c o n t e n t sa r ea s f o l l o w i n g ： m u t a g e n i z i n ga n db r e e d i n gm u t a n t s t r a i n p e n i c i 1 i t t mc y c l o p i u mp g 3 7 ，o p t i m i z i n g t e c h n o l o g i c a l c o n d i t i o n so f l i p a s e f e r m e n t a t i o n b yp g 3 7 ，e x p l o r i n g f e r m e n t a t i o n c o n d i t i o n sw i t ha2 5l i t e rb i o r e a c t o r ，c a r r y i n go u ti n d u s t r i a lp r o d u c t i o no rt e s ti nf l2 0m 3 f e r m e n t o r ，a n dt h es t u d i e so nl i p a s er e c o v e r ya n dg r a n u l a t e dl i p a s ep r e p a r a t i o n ；s t u d i e s o n p u r i f i c a t i o n a n dc h a r a c t e r i z a t i o no fa na l k a l i n e l i p a s e ，f u r t h e rs e p a r a t i o n o f i s o e n z y m e s b yp r e p a r a t i v ep o l y a c r y l a m i d eg e le l e c t r o p h o r e s i s a n dd e t e r m i n a t i o no f e n z y m i ck i n e t i c sc o e f f i c i e n t s ，c o n s t r u c t i o na n dd e t e r m i n a t i o no fl i p1p e p t i d em a p p i n g a n dp r e c i s em o l e c u l a rw e i g h tr e s p e c t i v e l y ；p c ra m p l i f i c a t i o n ，c l o n i n ga n de x p r e s s i o no f a na l k a l i n e l i p if r o mp e n i c i l l i u m c y c l o p i u mp g 3 7 ；c l a s s i f i c a t i o n a n d a n a l y s i s o f d e d u c e da m i n oa c i ds e q u e n c e s ，a n dc o n s t r u c t i o no ft h ep a y l o g e n e t i cr e l a t i o n s h i po ft h e f u n g a ll i p a s e s p a r tl b r e e d i n g o fa l k a l i n el i p a s e p r o d u c i n g s t r a i na n d l i p a s ep r o d u c t i o n 1 b r e e d i n gs t r a i no f a l k a l i n el i p a s eb yp e n i c i l l i u mc y d o p i u m t h er e f e r e n c e s c o n c e r n i n gb r e e d i n gp r o d u c i n g s t r a i n so fa l k a l i n e l i p a s e so n l y l i m i t e dt h ei s o l a t i o na n ds e l e c t i o nf r o ms o i lm e t h o d sa n dr e s u l t so fi m p r o v i n gs t r a i n s w e r es e l d o mr e p o r t e da f t e rs e v e r a lp h y s i c a la n dc h e m i c a lm u t a g e n e s i sw i t hu va n d n t g ，am u t a n tp g 3 7o fr e s i s t i n gn c a p r o i ca c i dw a so b t a i n e d i nt h i s s t u d yf r o ma n a l k a l i n el i p a s ep r o d u c i n gs t r a i n ，p e n i c i l l i u mc y c l o p i u mv a i la l b u mp b 2 2 7 ，b ys c r e e n i n g m u t a n t so f r e s i s t i n ga n t i f u n g a la n t i b i o t i c s ，s u b s t r a t e s ，s u b s t r a t ea n a l o g u e so rh y d r o l y s a t e s o fs u b s t r a t e st h ea l k a l i n el i p a s ey i e l do fp g 3 7w a si n c r e a s e db y15 - f o l da sc o m p a r e d 9 英文摘要 w i t hs t r a i np b 2 2 7 ，a n dr e a c h e dt o5 5 7u m l 2 o p t i m i z i n gf e r m e n t a t i o nc o n d i t i o n s o fa l k a l i n el i p a s e sb yp g 3 7 b a s e do nt h ea l k a l i n el i p a s eo v e r p r o d u c t i o ns t r a i np g 3 7h a v i n gb e e nb r e d ，t h e f e r m e n t a t i o nt e c h n o l o g i c a lc o n d i t i o n so fa na l k a l i n el i p a s e p r o d u c e d b y p e l l i c i i i l l m c y c l o p i u m p g 3 7w e r es t u d i e dt h e o p t i m a l c u l t u r a lc o n d i t i o n sf o ra l k a l i n e l i p a s e p r o d u c t i o ni ns h a k i n gf l a s kw e r e a sf o l l o w s ：f e r m e n t a t i o nm e d i u m ( g d l ) c o n s i s t e do f40 s o y b e a nm e a l ，3 0c o r ns t e e pl i q u o r , lok 2 h p 0 4 ，0lm g s 0 4 ，10s o y b e a nl e c i t h i n ，00 5 s o d i u mc i t r a t ea n d02s o y b e a no i lt h ec u l t i v a t i o nw a sc a r r i e do u ta t2 8 1 f o r9 6 h o u r so nar o t a r ys h a k e ra t2 5 0r m i n w i t h5 0m 1o fc u l t u r em e d i u mp u ti na5 0 0 一m 1 e r l e n m e y e rf l a s ka n d i n i t i a lp h75 d u r i n gw h i c ho4g d lp e a n u to i lw a sf e da t3 6 、5 4 a n d7 2h o u r sr e s p e c t i v e l yw i t ht h e s ec o n d i t i o n s ，t h ea l k a l i n el i p a s ey i e l d e db yp g 3 7w a s a b o u t2 0 6 0u m l ，b e i n g37 f o l da sc o m p a r e dw i t hc o n t r o lt h ey i e l do fa l k a l i n el i p a s ei n 2 5l i t e rl a b o r a t o r 7b i o r e a c t o rr e a c h e d2 9 0 0u m l 3 c a j t y i n go u ti n d u s t r i a lp r o d u c t i o no r 1 、e s to fa i k a l i n el i p a s e sb yp g 3 7 b a s e do ns u c c e s s f u lr e s u l t so fe r l e n m e y e rf l a s ka n d2 5l i t e rl a b o r a t o r yb i o r e a c t o r , l i p a s ei n d u s t r i a lp r o d u c t i o no rt e s tb yp g 3 7i na2 0m 3f e r m e n t o rw a sc a r r i e do u t t h e r e s u l t ss h o w e dt h a tw i t ht h ec o n d i t i o n so ft h ea i rf l o w03 - 08v r a i np e rm e d i u mv o l u m e ， a g i t a t i o ns p e e d1 8 0r m i n f e r m e n t a t i o nt e m p e r a t u r e2 8 士l a n df e r m e n t a t i o nt i m ea b o u t 7 2h o u r s ，d u r i n gw h i c ht h ep e a n u to i lw a sf e dt os u p p l yc a r b o ns o u r c ea n dt oc o n t r o lp h v a l u eo fc u l t u r eb r o t hw i t h i n72 - 76t h ea l k a l i n el i p a s e y i e l do fp g 3 7r e a c h e d4 5 2 0 u m l ，b e i n g2 2 一f o l da sc o m p a r e d w i t he r l e n m e y e rf l a s kc u l t u r e 4 r e c o v e r i n ga l k a l i n el i p a s e sf r o mf e r m e n t a t i o n b r o t hb yp g 3 7 s t u d i e so nt h er e c o v e r yo fa l k a l i n el i p a s ea n dt h ep r e p a r a t i o no f g r a n u l a t e de n z y m e b yp g 3 7w e r ec a r r i e do u t t h eg r a n u l a t e da l k a l i n e l i p a s ep r o d u c tw a sp r e p a r e df r o m f e r m e n t a t i o nb r o t h b yf i l t r a t i o n ，s u p e r n a t a n tu l t r a f i l t r a t i o n ，a m m o n i u m s u l f a t e p r e c i p i t a t i o na n dg r a n u l a t i o n t h eo v e r a l lr e c o v e r yo f l i p a s ea n dt h eg r a n u l a t e de n z y m e a c t i v i t yw e r eo v e r7 0 a n d5 x 10 4u g ，r e s p e c t i v e l y p a r ti ip u r i f i c a t i o na n dc h a r a c t e r i z a t i o no fa l k a l i n e l i p a s e sf r o mp g 3 7 1 p u r i f i c a t i o n c h a r a c t e r i z a t i o na n dd e t e r m i n a t i o no fn t e r m i n a la m i n oa c i d s e q u e n c e so fl i pif r o ma l k a l i n el i p a s e sb yp g 3 7 a n e x t r a e e l l u l a r , n o v e la l k a l i n el i p a s ep r o d u c e db yp e n i c i l l i l l mc y c l o p i u mp g 3 7w a s p u r i f i e db yc e n t r i f u g a t i o n ，a m m o n i u ms u l f a t ep r e c i p i t a t i o n ，a n dp h e n y l s e p h a r o s ec l 一4 b d e a es e p h a r o s ef a s tf l o wa n ds e p h a d e xg 7 5c o l u m nc h r o m a t o g r a p h i e sa165 - f o i d p u r i f i c a t i o no f t h el i p1w a sa c h i e v e dw h i c hh a das p e c i f i ca c t i v i t yo f 5 2 0 0u r a gp r o t e i n ， 英文摘要 a n dt h er e c o v e r yo ft h ea c t i v i t yw a s3 32 t h ep u r i f i e dl i pie x h i b i t e das i n g l ep r o t e i n b a n do ns d s p o l y a c r y l a m i d eg e le l e c t r o p h o r e s i s ( s d s p a g e ) a n dp o l y a c r y l a m i d eg e l e l e c t r o p h o r e s i s ( p a g e ) t h em o l e c u l a rw e i g h to f t h en a t i v el i p a s ew a se s t i m a t e dt ob e a b o u t2 9k d ab yg e lf i l t r a t i o nu s i n gs e p h a d e xg 一15 0 ，a n dt h a to ft h ed e n a t u r e dl i p a s e w a sd e t e r m i n e dt ob ea b o u t2 75k d ab yi t s m o b i l i t yo ns d s