（化学工程专业论文）树脂deaeeh固定化氨基酰化酶的研究与乙酰dl蛋氨酸酶拆分液分离.pdf

中文摘要 本文系统地测定了树脂d e a e e h 的各种物理与化学参数对酶固定化 可能产生的影响；最终选定树脂8 1 4 1 1 2 作为氨基酰化酶的固定化载体并作 吸附研究和固定化酶评价：改进了乙酰一d l 蛋氨酸的酶拆分液分离工艺， 从而提高了分离效率和产品纯度。 固定化载体决定固定化酶的酶活和性质，因此本文从载体筛选入手， 在已有实验研究的基础上，选择树脂d e a e e h 系列的三个产品：1 2 4 1 2 、 8 1 4 1 1 2 、4 4 6 为研究对象，从功能基含量，比表面，孔径分布，交联度， 固定化酶活等多方面比较，最终选定树脂8 1 4 1 1 2 作为氨基酰化酶的固定化 载体，实验发现固定化酶活最高可达9 5 6 u g 。通过对比实验分析确定，自 由酶溶液浓度为2 0 m g m l 时，能使固定化酶活和酶活力收率同时达到峰 值；振荡吸附达到最佳效果的时间确定为8 小时。在测定吸附等温线过程 中发现酶蛋白吸附属非单分子层吸附，并且上柱循环固定化的效果要好于 振荡固定化。考察了固定化酶的最适反应温度、p h 值、热稳定性等反应条 件，确定固定化氨基酰化酶对乙酰d l 一蛋氨酸的拆分没有明显的底物抑制 现象。采用阳离子交换树脂柱对乙酰d l 蛋氨酸的酶拆分液进行分离，实 验结果证实这一工艺不仅可以有效地分离纯化l 一蛋氨酸，还可以兼得乙酰 一d 一蛋氨酸，且二者的收率分别达到了8 5 以上和7 5 左右。最后提出了 双柱耦联模型，以期获得更高的拆分效率。 总之，通过对树腊载体物理和化学性能的研究，不仅可以在一定程度 上预测它作为载体的效果，也为拆分氨基酸工艺的改进提供了理论依据。 固定化酶的反应条件及分离工艺中各个参数的优化组合可以很大程度提 高产品的纯度和分离效果，为工业化的实现奠定基础。 关键词：树脂氨基酰化酶固定化蛋氨酸离子交换分离 a b s t r a c t t h ep e r f o r m a n c ea n dp h y s i c a lp r o p e r t i e so fd e a e e hr e s i ni ss y s t e m a t i c a l l y s t u d i e di nt h ep a p e r ，b yw h i c ht h ep o s s i b l ei n f l u e n c eo nt h ei m m o b i l i z a t i o no f a m i n o a c y l a s ei sa l s oa n a l y z e d t h r o n g ht h ec o m p a r i s o nb e t w e e nt h e r e s i n s8 4 12 ， 1 2 4 1 2a n d4 4 6 ，t h ef o r m e ri sc h o s e na st h ec a r r i e ro fi m m o b i l i z a t i o n t h e a d s o r p t i o no fa m i n o a c y l a s ei si n v e s t i g a t e da n dt h ei m m o b i l i z e de n z y m ei sa s s e s s e d b e s i d e s t h es e p a r a t i o nt e c h n i q u eo fe n z y m a t i cd e a c y l a t i o no f n a c e t y l - d l m e t h i o n i n i sa l s oi m p r o v e ds ot h a tt h ee f f i c i e n c yo fs e p a r a t i o na n dt h ep u r i t yo ft h ep r o d u c ta r e i n c r e a s e d t h ep a p e rb e g i n sw i t ht h es e l e c t i o no fc a r r i e r sd u et ot h eg r e a te f f e c to nt h e e n z y m ea c t i v i t y o nc a r r i e r b a s e do nt h eu n d e r s t a n d i n go fo t h e r s s t u d ya n d i n v e s t i g a t i o n s as e r i e so fr e s i n so fd e a e - e ，hw e r eu s e dt oa d s o r bt h ea m i n o a c y l a s e i nw h i c ht h er e s i n8 4 1 2i sm o r ee x c e l l e n ti nm a n ya s p e c t s ，i n c l u d i n gs u r f a c e ，c o n t e n t o f r e a c t i o ng r o u p d i s t r i b u t i o no f p o r ea n ds oo n n ea c t i v i t yo f i m m o b i l i z e de n z y m e r e a c h e s9 5 6 u 幢a ti t sb e s t t h ey i e l do fe n z y m ea c t i v i t ya n dt h ea c t i v i t yo f i m m o b i l i z e de n z y m er e a c ht h e i rp e a k sw h e nt h ec o n c e n t r a t i o no fe n z y m es o l u t i o ni s 2 o m g m la n dt h eo p t i m a lt i m e o fv i b r a t i o n i s8h o u r s ac o n c l u s i o nt h a tt h e a d s o r p t i o no fa m i n o a c y l a s eo nt h er e s i n8 4 1 2i ns i n g l em o l e c u l ec a n tb ed r a w n f i o mt h ea d s o r p t i o ni s o t h e r m ，f u r t h e r m o r e ，t h ec y c l ea d s o r p t i o ni nc o l u m ni s b e t t e rt h a no s c i l l a t i o na d s o r p t i o n b e s i d e s ，t h eo p t i m u mt e m p e r a t u r e ，p ha n d o t h e rf a c t o r so nt h er e a c t i o no fi m m o b i l i z e de n z y m ea r ei n v e s t i g a t e da n d d e c i d e d i t ss u r et h a tt h ei n h i b i t i o no fs u b s t r a t ei sn o to b v i o u s a sf a ra st h e s e p a r a t i o no fe n z y m a t i cd e a c y l a t i o no fn a c e t y i d l m e t h i o r f i n i s c o n c e r n e d ，a n e wt e c h n i q u ei sd e v e l o p e dt h a ta ne x c h a n g ec o l u m no fc a t i o nr e s i ni sa d o p t e d r e s u l t i n g t ot w op r o d u c t s ，i el m e ta n da c d m e t ，a n dt h e s ep r o d u c t s a c q u i r e dh i g hy i e l do f8 5 a n d7 5 r e s p e c t i v e l y f i n a l l y ，c o u p l i n gm o d e lo f t w oc o l u m n si sp u tf o r w a r di no r d e rt og e th i g he f f i c i e n c yo fr e s o l u t i o n i nac o n c l u s i o n ，s t u d i e so nt h ep h y s i c a la n dc h e m i c a lc h a r a c t e r so ft h e r e s i n s h e l pt oi n s t r u c tt h es y n t h e s i so f b e t t e rc a r r i e ra n dp r o v i d et h e o r yf o rt h ei m p r o v e m e n t o ft h er e s o l u t i o no fa m i n oa c i d s t h eo p t i m u mr e a c t i v ec o n d i t i o n so fi m m o b i l i z e d e n z y m ea n ds e p a r a t i o no fe n z y m a t i cd e a c y l a t i o no fn a c e t y l - d l m e t h i o n i na r e h e l p f u lt oi n c r e a s et h ep u r i t ya n ds e p a r a t i o ne f f i c i e n c yo fp r o d u c t sa n db u i l ds o l i d f o u n d a t i o nf o ri n d u s t i l i z a t i o n k e y w o r d s ：r e s i n ，a n a i n o a c y l a s e ，i m m o b i l i z a t i o n ，m e t h i o n i n e ，i o n e x c h a n g e ， s e p a r a t m n 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作和取得的 研究成果，除了文中特别加以标注和致谢之处外，论文中不包含其他人已经发表 或撰写过的研究成果，也不包含为获得鲞洼盘堂或其他教育机构的学位或证 书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中 作了明确的说明并表示了谢意。 学位论文作者签名：碉珑藏签字日期：砂岁年f 月玎日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解墨鲞盘茎有关保留、使用学位论文的规定。 特授权苤盗盘望可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检 索，并采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编以供查阅和借阅。同意学校 向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权说明) 学位论文作者签名： 硇或萄艾 导师签名 捌 签字日期： 纠年月才日签字日期：诉f 月，日 天津大学硕士学位论文 第一章文献综述 第一章文献综述 1 1 手性药物的发展现状及前景 手性( c h i r a l i t y ) 是用来表示化合物分子由于组成原子的三维排列引 起的结构不对称性的术语，它是自然界存在的一种普遍现象，作为人类生 命活动基本物质的糖、氨基酸、蛋白质等几乎全部具有手性。手性异构体 ( 对映体) 在药物中占有很大的比例，据统计，己知药物中有3 0 4 0 左右是手性的 卜3 1 ，其余的多为外消旋体药物【4 1 ，与药物分子所作用的受 体或靶位是氨基酸、核苷、膜等组成的手性蛋白质和核酸大分子，他们对 与其结合的药物分予的空间立体构型具有选择性，因此，对映体药物在体 内往往呈现很大的药效差异。消旋药物的两个对映体进入生命体内厢，往 往只有一种对映体具有疗效作用，而另一种对映体因不能很好的契合而效 力甚微或者与其他大分子契合产生不同的药理作用，甚至产生毒性1 5j 。特 别是医药史上造成严重影响的“反应停”事件，使人们充分地认识到药物 的手性问题，用光学纯副作用小，使用剂量小、疗效高等优点，手性药物 迅速成为医药研究的热点并在市场中占有的份额逐渐增大【6 j 。 有关资料显示，2 0 0 2 年所开发的1 2 0 0 种药物中，有8 2 0 种属于手性 药物，其中6 1 2 种药物以单一对映体在开发，占世界开发药物总数的5 1 ，非手性药物3 8 4 种，占3 2 。可见开发药物中的三分之二是手性药物。 匣鲴 9 9 3 1 9 9 皓1 9 1 9 9 7 1 9 9 8 1 0 9 1 2 0 0 02 0 0 12 0 0 2 2 0 0 32 0 0 4 2 0 0 5 y e a r 图1 1 手性药物市场的增长趋势 f i g u r e1 1i n c r e a s eo fc h i r a lm e d i c i n em a r k e t i - 沥励翊场阴呖呖沥沥组 一 饧饧溯助功阴豳翻组助翰阴呖纫沥组 沥缓功沥翻沥国囫溯溯呖疆 沥励沥饧组汤纫沥豳呖巨沥团圉 啪 言 哪 删 m 枷 一t 霉3 c g 善8 2 一月协 天律大学硕士学位论文第一章文献综述 据专家预测，到2 0 0 5 年，全球上市的化学合成新药中约有6 0 的为单一 异构体药物。手性药物的不断增加改变着化学药物的构成，成为制药工业 的主要发展方向。图1 1 为近2 0 年手性药物的市场销售额的增长趋势，充 分说明了手性药物本身所具有的魅力【7 1 。 随着人们对手性药物的认识的加深和对光学纯药物需求的增长，手性 药物的科学研究价值与广阔的市场前景引起了医学界的重视。但目前我国 的手性科技发展还仅限于实验室的研究阶段，可以肯定的是，随着实验室 技术的臼臻成熟，一些新工艺、新技术将为中国的制药行业提供手性药物 合成的最佳途径，从而极大的促进中国手性药物的发展。 1 2 手性氨基酸的药用及制备方法 1 2 1 手性氨基酸的药用 在天然氨基酸中，有2 0 种氨基酸参与蛋白质合成。氨基酸作为葡萄糖 的基质、氮的载体、神经递质，并与蛋白质转变、酶活性和离子通量调节 有关。在2 0 种氨基酸中，有8 种人体内不能合成，需外源供给；而有些 氨基酸体内虽能合成，但数量不足；与脂类和糖类相比，非必需氨基酸在 体内的储存量也较低，因此，氨基酸的损耗偏多或供应不足均极易引起临 床症状，需及时补充1 8 1 。 人类对氨基酸的需求极为广泛，在医药领域的应用也日益发展。例如， d 一天冬氨酸用作制备阿扑西林( 一种青霉素注射药) 的中间体，还可以用 作合成d 天冬氨酸一羟胺( 可治疗病毒感染) 的前体1 9 1 ；d ( 一) 一苯 甘氨酸是合成一内酰胺类抗生索氨苄及其衍生物的重要侧链中间体【l o l ； d 色氨酸是抗瘗剂和免疫抑制剂的重要合成前体，如d 口。氨基一口一吲哚基 丙酮酸 ；l 一色氨酸可用作抗抑制剂和催眠剂等；l 一苯丙氨酸是制各抗癌 药物苯丙氨酸芥、对氧基苯丙氨酸甲酰肉瘤素等的合成原料f 1 2 1 ；l 一蛋氨酸 作为合成4 0 h s a l l m e t ( 抗癌药物) 、s 腺苷l 一蛋氨酸等手性药物的合成 原料1 3 1 ，d 蛋氨酸作为肽类药物的合成原料【l4 1 ，以及其它手性氨基酸都是 制备手性药物的重要中间体。2 0 世纪9 0 年代手性氨基酸通常被用作营养 性输液原料，其消耗占药用氨基酸的8 0 ，而近年来，随着各种新型含氨 基酸药物( 特别是肽类) 的问世，氨基酸及其衍生物作为手性药物的中间 体所占有的市场份额越来越大。目前，我国进口的近2 0 0 种生化药中，氨 基酸类约占1 4 ，这也说明我国氨基酸类药有着广阔的发展前途。 天津大学：颐士学位论文第章文献综述 据专家预测，到2 0 0 5 年，全球上市的化学合成新药中约有6 0 的为单 异构体药物。手性药物的不断增加改变着化学药物的构成，成为制药工业 的主要发展方向。图1 1 为近2 0 年手性药物的市场销售额的增长趋势，充 分说明了于性药物本身所具有的魅力j 。 随着人们对手性药物的认识的加深和对光学纯药物需求的增长，手性 药物的科学研究价值与广阔的市场前景引起了医学界的重视。但目前我国 的手性科技发展还仅限于实验室的研究阶段，可以肯定的是，随着实验室 技术的i i = = | 臻成熟，一些新工艺、新技术将为中国的制药行业提供手性药物 合成的最佳途径，从而极大的促进中国手性药物的发展。 1 , 2 手性氨基酸的药用及制备方法 1 2 1 手性氨基酸的药用 在天然氨基酸中，有2 0 种氨基酸参与蛋白质合成。氨基酸作为葡萄糖 的基质、氯的载体、神经递质，并与蛋白质转变、酶活性和离了通量调节 有关。在2 0 种氨基酸中，有8 种人体内不能合成，需外源供给；而有些 氢基酸体内虽能合成，但数量不足；与脂类和糖类相比，非必需氢基酸在 体内的储存量也较低，因此，氨基酸的损耗偏多或供应不足均极易引起临 床症状，需及时补充”j 。 人类对氨基酸的需求极为广泛，在医药领域的应用也日益发展。例如， d 天冬氧酸用作制各阿扑西林( 一种青霉素注射药) 的中间体，还可以用 作合成d 天冬氨酸羟胺( 可治疗病毒感染) 的前体 9 1 ；d ( 一) 苯 甘氨酸是合成筘一内酰胺类抗生素氨苄及其衍生物的重要侧链中间体 10 1 ； d 色氨酸是抗癌剂和免疫抑制剂的重要合成前体，如d d 氨基芦一吲哚基 丙酮酸j ；l 一色氨酸可用作抗抑制剂和催眠剂等；l 一苯丙氢酸是制备抗癌 药物苯丙氨酸芥、对氧基苯丙氨酸甲酰肉瘤素等的合成原料l l 列；l 蛋氨酸 作为合成4 0 h s a l l m e t ( 抗癌药物) 、s 腺苷l 蛋氢酸等手性药物的合成 原料【”】，d 一蛋氨酸作为肽类药物的合成原料”i ，以及其它于性氨基酸都是 制各手性药物的重要中间体。2 0 世纪9 0 年代手性氨基酸通常被用作营养 性输液原料，其消耗占药用氨基酸的8 0 ，而近年来，随着各种新型含氨 基酸药物( 特别是肽类) 的问世，氨基酸及其衍生物作为手性药物的中间 体所占有的市场份额越来越大。目前，我国进口的近2 0 0 种生化药中，氨 基酸类约占1 4 ，这也说明我国氨基酸类药有着广阔的发展前途。 基酸类约占1 4 ，这也说明我国氨基酸类药有着广阔的发展前途。 天津大学硕士学位论文第一章文献综述 1 2 2 手性氨基酸的制备方法 手性氨基酸的制备方法i l ”，主要有化学拆分法、不对称合成法、结晶 法、微生物法、酶法、配位萃取法、膜拆分法、色谱法等。目前，研究最 活跃的当属酶法。 化学拆分法，即将d l 一氨基酸或其衍生物与具有光学活性的酸或碱作 用生成非对映异构体的盐类，再根据非对映异构体不同的物理性质，用常 规的分离方法( 如分馏、结晶等) 把它们分开，最后再把分离得到的两种 衍生物分别变成单一的旋光化合物，即达到了拆分的目的【1 “。例如，用溴 化樟脑磺酸a ，苯基乙胺作为拆分剂对d l 对羟基苯甘氨酸进行拆分，d 对羟基苯甘氨酸的收率可达9 2 【】7 1 。 不对称合成法，主要是通过对有机反应过程的研究，寻找控制反应立 体选择性的对映体试剂或催化剂，将底物转化为单一的光学活性产物。例 如广泛应用于工业化生产的催化氢化就是一种很实用的不对称合成技术。 不对称合成一般有四种情况：( 1 ) 用旋光性的起始物，( 2 ) 用旋光性的试 剂，( 3 ) 用旋光性的催化剂或溶剂，( 4 ) 圆偏光存在下的反应【6 l 。 结晶法，一种可以称作诱导结晶法，即在外消旋体的过饱和溶液中， 加入一定量的一种旋光体的纯晶体作为晶种，在它的作用下溶液中该种旋 光体含量较多，且在品种的诱导下优先结晶析出。例如庞秀言等人【1 8 】在 d l 。瑾一丙氨酸的乙醇。水饱和溶剂中加入l 丙氨酸晶种，通过冷却恒温结 晶得到l 一丙氨酸晶体。另一种是利用廉价易得的试剂作为拆分剂，如 k e s s l e s i 伸】用硫酸作为拆分剂，用羧酸、醇、酮中的一种或几种按定的比 例混合作为溶剂，对d l 一对羟基苯甘氨酸进行拆分。 微生物法，利用微生物对混旋氨基酸的专一识别性能力的性质，消耗 掉一种对映体而得到另一种对映体，即得到手性氨基酸。例如y o k o z e k i 等人以醛为原料，经b u c h e r e r 反应合成d l 5 一对羟基苯乙内酰脲，然后用 恶臭假单胞菌的二氢嘧啶酶催化选择性水解为n 一氨甲酰一d 对羟基苯甘氨 酸，收率达9 2 1 2 0 1 。 酶法，类似于微生物法，即从生物体内提取酶直接拆分混旋氨基酸。 但由于底物、反应条件和所用的酶的不同，酶法合成的效率有较大的差别。 姜忠义等人【2 】用n 一乙酰苯丙氨酸酯类衍生物为底物，以氨基酰化酶为催 化剂进行l 一苯丙氨酸的制备，结果达到很高的纯度。 配位萃取法，是以手性试剂为配体与中心离子( 多数为过渡元素的离 子) 形成的配合物( 络离子) 作萃取拆分剂，与对映体形成螯合物，由于 对映体构型上的差异，所形成的螯合物稳定性不同，其物理性质表现出较 天津大学硕士学位论文第一章文献综述 大的差异，在两相间的分配行为表现亦不同，从而实现对映体的拆分1 2 ”。 膜拆分法，氨基酸的生物转移通常是依靠埋在生物膜中的载体蛋白来 传递的，这种转移的对映体选择性是非常高的。通过膜分离进行旋光异构 体的拆分正是这群生物过程的模拟。膜体系中的手性分子( 主体) 与外消 旋( 客体) 结合，通过氯仿或其它溶剂载体从一水溶液转移到另一水溶液 再释放出来，即完成了分离1 2 “。 色谱法1 2 “，又可细分为手性毛细管色谱法、高效液相色谱法手性固定 相、流动相法、手性配体交换色谱法，即在色谱系统中引入某种金属离子 和某种手性配位体，待测对映体与配位体可形成两个非对映体的三元络合 物，经色谱过程实现光学异构体的立体选择性分离；薄层色谱法，又包括 手性流动相在非手性固定相上进行拆分和利用手性固定相拆分。 1 3 大孔树脂的性质及用途 大孔离子交换树脂和大孔吸附树脂( 简称大孔树脂) 是2 0 世纪7 0 年 代末离子交换领域中发展起来一种有较好吸收性能的有机高聚物吸附剂 1 2 4 j 。自1 9 6 6 年美国r o h m 和h a a s 公司合成第一种大孔网状吸附剂以来， 各种性能不同、结构各异、品种繁多的合成吸附剂相继问世。大孔树脂是 一种不溶于酸、碱及各种有机溶剂( 如乙醇、丙酮及烃类等) 的高分子聚 合物。大孔树脂的孔径和表面积都比较大，它们在树脂内部具有三维空间 立体孔结构。大孔树脂本身结构所的优点，如表面积大、交换速度快、稳 定性好、流动性好、且可以发生功能基反应，使其在很多领域里得到应用。 国外最早用于废水处理，后来逐渐扩展到医药工业、化学工业、分析化学、 l 临床鉴定和治疗等领域，我国主要用于医药工业的药物及生物活性物质的 提纯和中草药化学成分的提取分离【2 。2 “。 1 - 3 1 大孔树脂的主要性质 1 3 1 - l 孔结构 大孔树脂颗粒多是无数小球集聚成的，其结构内部存在孔道，亦即 存在死空间及凝胶部分两种区域i 2 ”。大孔树脂优于凝胶树腊的另一个特 点是它的孔道在干湿状态下都存在，且孔径可以从数十到数十万埃。大 孔树脂基本特征主要是颗粒内部存在永久性微孔，其大小、数量及分布 很容易根据需要在制备过程中通过致孔剂的作用来调节。这就改善了凝 胶树脂仅仅通过改变交联度来控制性能的局限性 天津大学硕士学位论文第一章文献综述 1 3 1 2 表面积 由于大孔树脂内部是多孔海绵状，其表面积可以人为调节，最大可 以达到1 0 0 0 米2 克，这不仅为离子交换提供良好接触机会，缩短了扩散 路径，还增加了许多链节活性中心，发挥了与外来分子间的范德华引力 作用，使分子吸附容易发生，甚至吸附许多非离子性物质，扩大了应用 范围。 1 3 1 3 交换速度 大孔树脂内部微孔既多又大，表面积也大，活性中心增多，离子扩 散速度增大，交换速度就加快，在使用上可以缩短生产周期，提高效率、 降低成本。大孔型树脂的交换速度要比凝胶的快一个数量级。 1 3 1 4 稳定性1 2 8 耐溶胀收缩性能好，一般的凝胶树脂从干燥状态变为含水的溶胀状 态，由于功能基强烈地水合溶胀，使内部应力增大，往往发生破裂，经过 多次干湿变化逐渐破碎流失，缩短树脂使用寿命，但大孔树脂不存在这种 流失；耐氧化，大孔树脂交联度一般都较高，另外还易于再生，在树脂内 部不滞留易引起氧化的过氧酸，所以耐氧化性能较好；耐辐照，大孔树脂 的耐辐照性能优于凝胶型；耐磨损，大孔树脂表面没有裂纹，耐磨损，适 用于自动化连续交换装置。 1 3 1 5 流动性 大孔树脂表面无裂纹，对流体阻力小，离子不易漏过，离子形式及 溶液浓度改变时，体积变化不大，在柱操作使用中压降小，在连续法应用 中，流动性好，工艺参数稳定。 1 3 1 6 功能基反应 大孔树脂具有固定的孔道，在制备中易于与功能基反应的试剂进行扩 散，靠近反应的位置，可以减免凝胶树脂先通过溶胀过程带来的缺点。另 外凝胶树脂磺化后，必须通过逐渐降低硫酸浓度等方法缓和分解手续，以 减慢树脂内部应力由于功能基突然水合所引起的变化，避免或减少表面裂 纹，而大孔树脂则可以直接用水分解，同时试剂用量及反应时间都可略有 缩短，而效果并不减低。 1 3 2 大孔树脂的用途 工业上，树脂主要用于水的净化处理、贵重或有用物质的回收、离子 天津大学硕士学位论文 第一章文献综述 的分离等。自二十世纪6 0 年代末开始，随着许多新型树脂的发明，它的 应用扩大到非水溶液中物质的净化与分离，以及做催化剂使用等方面。随 着离子交换应用技术的改善与发展，树脂的应用将获得更大的发展。特别 是在制药工业中，离子交换法可使许多操作变得简单1 2 9 。如混合床离子交 换法在药物的纯化精制方面成就突出，如除去氨基酸、蛋白质、维生素b 中的盐十分有效；还可使一些本身带酸、碱性的药物的盐型转化，如链霉 素盐酸盐变成硫酸盐、磷酸盐、醋酸盐、吗啡碱等都是这方面的典型例子。 离子交换树脂在抗菌素及生化药物生产中的应用使树脂在制药工业中应 用的一个主要方面。特别是用弱酸性阳离子交换树脂提取分离链霉素的成 功具有划时代的意义，不仅对提高链霉素纯度和降低成本起重要作用，也 显示了离子交换树脂在抗生素分离提取方面的巨大潜力。 在本文的实验工作中，也尝试使用廉价而实用的树脂作为酶固定化的 载体，并详细测定比较了几种不同交联度和致孔度的大孔树脂d e a e e h 的各种物理性能指标，包括比表面，孔径分布，孔容，吸附等温线，静态 交换容量以及吸附动力学等，选择一种具有与酶分子物理性质最匹配的树 脂作为固定化载体，并进一步研究了固定化反应的各种条件，以期确定条 件的最佳结合点而获得理想的固定化效果，并能在将来得到推广应用。 1 4 氨基酰化酶的固定化 氨基酰化酶( n a c y l a m i n o a c i da r n i d o h y d r o l a s e 或a c y l a s ei ) 是一种高 分子量、双亚基的蛋白质酶，广泛存在于各种生物。由于它能专一水解n 一酰基化l 氨基酸的酰基弓，因此很早就被用来分离d l 一氨基酸， 特别是近年来随着l 一型氨基酸在食品、医药、工业和农业上有着越来越 广泛的应用，酶法拆分化学合成的d l 一氨基酸混合体具有产物成本低、 纯度高、同时得到d 一型和l 一型光学活性产物的优点，氨基酰化酶得到 越来越多的青睐，特别是在l 一蛋氨酸f 3 2 】和l 苯丙氨酸生产中氨基酰 化酶被广泛采用。到目前为止，已经有报导从猪肾脏和曲霉( a s p e r g i l l u s s p ) 中分离纯化得到这种酶，也有些学者尝试从高等植物中提取 3 4 3 “。 但酶的提取成本较高，价格昂贵，且酶是一种蛋白质，稳定性差，这些因 素给实际生产带来较大的压力，所以白6 0 年代起f 37 1 ，随着固定化酶研究 的迅速发展，固定化氨基酰化酶的成功制备使酶法连续拆分混旋氨基酸的 工业化得以实现。 固定化酶与酶溶液相比，具有以下优点： 天津大学硕士学位论文第一章文献综述 ( 1 ) 易于将固定化酶与底物、产物分开； ( 2 ) 可以在较长时间内进行反复分批反应和装柱连续反应； ( 3 ) 在大多数情况下，可以提高酶的稳定性； ( 4 ) 酶反应过程能够加以严格控制； ( 5 ) 产物溶液中没有酶的残留，简化了提纯工艺； ( 6 ) 较溶液酶更适合与多酶反应； ( 7 ) 可以增加产物的收率，提高产物的质量； ( 8 ) 酶的使用效率高，成本降低。 一般在实际应用过程中，着重发挥固定化酶在改革工艺和降低成本 方面的巨大潜力，收到良好效果【38 1 。 1 4 1 固定化载体 固定化酶相对于自由酶有许多突出的优点，因此，氨基酰化酶的固定 化研究在生物工程领域引起广泛兴趣。首先是不同的固定化技术的逐步发 展成熟，如物理吸附法，离子吸附法，包埋法，共价键结合法以及肽键结 合法，其次是不同固定化载体的筛选与评价。下面就不同载体的应用做 详细的介绍： 1 ) 氨基酰化酶以离子键形式与d e a e s e p h a d e x 相结合的固定化酶率 先实现了工业规模的应用，d e a e s e p h a d e x 也是公认的较好的固定化 氨基酰化酶载体，但在我国这种载体价格比较昂贵，且多是进口的， 而且d e a e s e p h a d e x 系列的载体粒径小、易变形，流体力学的性质不 是很好i ”j 。 2 )南开大学高分子研究所以李民勤、王道宾为代表的研究人员设计合 成了一系列以聚丙烯酰胺为骨架的高分子载体作为氨基酰化酶的固定 化载体，包括功能基化的丙烯酸甲酯一二乙烯基苯交联共聚物 4 叭、功 能基化聚丙烯酸甲酯【4 ”、功能基化丙烯酰胺一丙烯酸甲酯交联共聚物 【4 2 】等4 3 1 载体，对它们的固定化研究也颇有成效。 3 )苯乙烯为骨架的大孔树脂，如清华大学的徐东【4 4 】使用d 3 8 0 作为氨 基酰化酶的固定化载体，固定化酶活也可以达到7 0 0 u g ，但从理论上 比较，以苯乙烯作为惰性骨架，分子骨架的刚性比较强，相比较甲基 丙烯酸脂类更好一些，因此，开发以甲基丙烯酸脂类为惰性骨架，而 又能比d e a e s e p h a d e x 成本低的树脂作固定化载体是一个新颖且 有前景的思路。 4 )以包埋法将氨基酰化酶固定在聚丙烯酰胺凝胶中，也可以获得较高 天律大学硕士学位论文 第一章文献综述 的酶活力收率，且处理的底物浓度高达o 6 m o l l ，但使用效率较低， 重复使用时拆分效率很低，使得其工业化的价值大大降低。除以上介 绍的固定化载体外，也有以碘乙酰纤维素共价吸附固定氨基酰化酶 1 4 5 1 ；以及以醋酸纤维素为载体制备固定化氨基酰化酶膜的研究4 6 1 ；还 有对载体进行转型，制备磁性微球，对氨基酰化酶进行固定化研究等 1 4 7 。 1 4 2 固定化酶的理化性质评价 固定化技术解决了一些问题，但由于酶分子从游离态变成牢固地结合 于载体的状态，酶分子的微环境发生了改变，如酶固定化过程中发生的物 理化学变化会使酶的活性中心受损，致使酶活性有所降低；酶联接于固相 载体上后，酶蛋白的构型和活性中心都会发生改变，而且载体骨架和侧链 可能造成空间位阻等，类似的原因必然使酶学性质发生改变 4 8 。因此研究 固定化酶在酶催化反应中的最适条件对实际应用有着十分重要的意义，所 以许多相关的因素受到关注和研究 4 9 , 5 0 】，并以此作为固定化酶的评价依 据。 1 4 2 1p h 对酶作用的影响 大部分的酶反应在某一个p h 下会达到最大反应速度，固定化酶反应 也一样，但由于酶分子与载体分子的交联，微环境等条件的变化引起固定 化酶反应的最适p h 也发生变化，一般固定化酶的最适p h 会比自由酶偏高 o 5 1 个单位，从而使固定化酶反应的p h 范围变宽，且稳定性增强。 1 4 2 2 温度对酶作用的影响及热稳定性 温度对酶反应的速度有很大的影响，多数存在一个最适温度，在最适 温度的两测，反应速度比较低。一般固定化酶的最适温度会比自由酶的高 出1 0 。c 左右，提高了酶的耐热性和稳定性。同样，在各自最适温度下温 浴一定的时问，再比较其酶活保留率。许多实验表明，固定化酶的热稳定 性要明显高于自由酶。 1 4 2 3 对底物浓度要求的变化 是否存在底物抑制现象是评价酶的另一个指标。能够拆分较大的底物 浓度是工业化的一个有利条件。事实上，氨基酰化酶的自由酶存在明显的 底物抑制现象，而报导中的固定化氨基酰化酶却与之相反 4 2 1 ，可能存在底 物激活作用。这也说明，氨基酰化酶在固定化前后，反应机理有很大的变 化。 天津大学硕士学位论文第一章文献综述 1 4 2 4 固定化酶的操作稳定性 将自由酶固定化的一个主要目的就是为了实现工业化生产，但是否适 合工业化应用的一个重要指标就是连续生产的能力。工业上有一个规定的 参数，固定化酶的半衰期要达到2 0 天，只有满足这样的条件，才能体现 密固定化酶的优越性。 2 0 0 2 年，徐亚妮尝试了一种新树脂、由南开大学化工厂提供的试用品 d e a e - - e h 做载体，是以甲基丙烯酸脂类为惰性骨架，以d e a e 进行功能 基化。从其结构上分析，惰性骨架较为理想，而功能基也与已实现工业化 的d e a e s e p h a d e x 相同，具备了较好的结构基础，从实际工作的结果比 较中也可以看出，这种新的载体展现出其突出的效果，因此，本论文就是 在前人工作的基础上，在d e a e e h 的合成中，调整致孔剂和交联剂的比 例，获得不同孔径、孔容、比表面和功能基含量的树脂，分析比较他们的 结构和物理性质，并对其进行固定化研究和效果比较，最后筛选出理想的 固定化载体。 1 5 拆分液的分离研究 拆分反应后，溶液中含有目标氨基酸和未被选择拆分的酰化氨基酸， 将目的产品与杂质产物分离并获得较高纯度的产品是制备手性氨基酸的 个重要环节，在生产投资费用中占很大的比例，因此，研究分离与纯化 技术也是至关重要的 s u 。 氨基酸是一种具有两性官能团的物质。当介质的p h 达到一定值时， 氨基酸分子呈电中性，此时的p h 称为氨基酸的等电点( p i ) 。当介质p h 低于等电点，氨基酸以阳离子状态存在；当p h 高于等电点，氨基酸以阴 离子状态存在。氨基酸的溶解度随p h 的变化很大，在等电点时，溶解度 最小1 5 2 1 。氨基酸在水溶液中存在如下平衡： r 淼二r 器些二r 5 5 都是采取沉淀法获得产物的。 等电点沉淀法是根据氨基酸的等电点不同，调节p h ，最后能使目的氮 基酸尽可能多的沉淀出来。目前国内味精厂都采用等电点沉淀法提取谷氨 酸。 1 5 2 离子交换法 离子交换法是利用离子交换剂对不同氨基酸吸附能力差异对氨基酸 混合物进行分组或实现单一成分的分离。如味精厂采用强酸性阳离子交换 树脂对谷氨酸阳离子进行选择性吸附，以使其它杂质得以分离；s o l d a t o v 等人1 56 】研究了液体磺酸基离子交换剂对脂肪族氨基酸阳离予的提取平衡。 对于拆分液采用离子交换法进行分离的也有很多例子，如韩际宏i ”】等用离 子交换法分离蛋氨酸的拆分液，且采用两次上柱，即先将l m e t 和n a + 交 换到树脂上，经盐酸洗脱后，将洗脱液再次上柱吸附l m e t ，再经洗脱、 结晶而得产品，不但洗脱剂、再生剂成本较高，且第二次上柱时l m e t 的 交换量只有树脂理论交换量的4 】8 ，吸附效率较低，l m e t 的产率为7 4 3 。但总的来说离子交换树脂法提取氨基酸处理量大，工艺较成熟。 1 5 3 膜分离法 膜过滤法可以实现混合溶液的分离是因为在膜和溶液的界面处存在 以下机理：由于亲水性等原因所引起的选择性透过：筛分效应一待分离物 质分子的直径大于膜孔的直径，将被截留，反之则透过；电荷效应一若膜 表面带与待分离物质同种电荷，则会产生静电排斥作用，反之则会产生吸 引作用【5 ”。在人体的新陈代谢过程中存在大量的生物膜渗透现象，研究氨 基酸的膜分离不仅可以找出有效的生物分离技术，而且有助予加深对这些 新陈代谢过程的理解。因为氨基酸为两性物质，不同p h 下的解离状态不 同，所带的电荷数不同。此外溶液p h 还会影响到膜上离子基团带负电荷， 它能吸引和通过带正电荷的阳离子，而排斥带负电荷的阴离子；而带正电 荷的膜则允许带负电荷的离子通过。在特定的分离要求下，选择适当类型 的膜以及最佳的p h 条件就成了决定分离效果好坏的关键。国外膜分离工 艺已应用于乳制品工业。 1 5 4 萃取法 1 541 反应萃取 天津大学硕士学位论文 第一章文献综述 氨基酸不溶于普通有机溶剂，因此采用通常的溶剂萃取法不能奏效， 必须采用反应萃取法，即选择适当的反应萃取剂，其解离出来的离子于氨 基酸解离出来的离子发生反应，生成可以溶于有机相的萃取配合物，从而 使氨基酸从水相进入有机相。近年来，还未见到此种方法的工业报道，要 实现工业化，至少要先解决两个问题：其一是萃取过程中乳化的问题，其 二是低毒萃取剂的选择和萃取剂残留物对于产品质量的影响1 5 “。 1 5 4 2 液膜萃取 液膜萃取兼有溶剂萃取和膜渗透两项技术的特点，按其结构可分为乳 化液膜和支撑液膜两大类。乳化液膜为液体表面活性剂形成的球面，将溶 液分为内相和外相，液膜只有几个分子厚，单位体积设备的表面积很大， 具有萃取速度快、分离与浓缩一步完成、能从低浓度的溶液中有效地回收 溶质等优点。支撑液膜是起分离作用的液相借助毛细作用固定在多孔高分 子膜中，它可以使萃取与反萃取在液膜的两侧同时进行，从而避免载体负 荷的限制、减少了有机相的使用量，解决了乳化液膜的乳化液稳定条件及 破乳等问题。将液膜法用于氨基酸的分离提纯已有2 0 多年的历史，多采 用在液膜中加入载体使之与氨基酸离子结合透过膜进入接受相，也有的提 前将氨基酸丹磺酚化，使之在一点的p h 范围内维持电中性，以便于其穿 过有机膜进入接受相 5 9 1 。 l 543 反向微胶团萃取 反向微胶团是在非极性溶剂中，双亲物质的亲水基相互靠拢，以亲油 基朝向溶剂而形成的聚集体。用于形成反向微胶团的表面活性剂有两类： 以琥珀酸二酯磺酸钠为代表的阴离子表面活性剂；以三辛基甲基氯化铵为 代表的阳离子表面活性剂。但是两类反胶团萃取氨基酸时都要求氨基酸水 溶液中的无机盐浓度较低时才具有应用价值的萃取能力。翁连进等人开发 了一种新的、萃取能力更强的反胶团一二异辛基磷酸铵表面活性剂，并以 此开发了从胱氨酸母液中提取精氨酸工艺拍。 1 5 5 结晶 结晶是纯化物质的有效手段。要想得到具有一点粒度分布和晶体形状 的成品还必须对其进行浓缩结晶和重结晶。医药用输液氨基酸必须具有较 高的纯度，这就要求结晶产品具有较大的粒度，以便于与母液分离；较小 的晶体也易于形成聚结体，夹杂母液，降低产品的纯度。采用结晶法从拆 分液中获得拆分产品也有很多成功的例子，如八峰药化公司先将拆分液浓 天津大学硕士学位论文 第一章文献综述 缩结晶，再溶解于乙醇等有机溶剂中进行结晶分离获得左旋蛋氨酸p “。 从拆分液中获得拆分产品最常用的方法是根据溶质在拆分液中的溶 解度不同，采用直接浓缩结晶法进行分离，如这种分离方法来活动左旋蛋 氨酸：也有根据拆分液中的溶质在有机溶剂中的不同溶解度。但是，结晶 分离法得到的产品纯度往往不高，因此，离子交换法逐步兴起，根据被拆 分得到的物质本身的物理性质，采用某种树脂或其它吸附剂，调节溶液的 酸碱度，使目标产品或者杂质被吸附，从而达到分离的目的，这种分离方 法的效率较高。 本论文所得的拆分液中含有以下物质：l m e t ，h a c ，还有用于调节 拆分底物的p h 所需的n a + ，以及少量未反应的n a c l m e t 。由于拆分液 中存在n a + 等杂质，产品分离效率的提高一直是难以克服的问题。在文献 中对分离制备l m e t 的报导较多，而对同时提取n a c d m e t 的报导则较 少。对l m e t 的提取采用直接浓缩结晶法或者离子交换法的，但要想获得 较高纯度的l m e t ，且能回收n a c d m e t ，仅仅利用直接结晶法或者已报 导的离子交换吸附法都很难两全其美。本实验工作总结出一种新工艺，调 节拆分液到适宜的p h 值，将拆分液通过h 型阳离子交换柱，对流出液进 行分段收集，且流出液循环套用，将最后的收集液分别浓缩结晶。此工艺 不但能有效的将l m e t 和n a c d m e t 分离，还可以分别获得较高纯度 l m e t 和n a c d m e t 。 1 6 本文的研究工作及创新点 综上可以看出手性药物是世界医药市场发展的总趋势，而各种d 型 和l 型的氨基酸是手性药物的重要原料。然而天然的手性氨基酸非常有 限，所以人工获得手性氨基酸是一个重要途径。目前，酶法拆分获得手性 氨基酸凭借其简便的装置和快捷的反应倍受青睐，但其昂贵的成本成为阻 碍发展的障碍。本文工作的一个重要目的就是寻找一种成本低、效果好的 固定氨基酰化酶的载体。另外，拆分液的分离是获得