（化学工艺专业论文）酶解马氏珠母贝肉制备降血压肽的研究.pdf

酶解马氏珠母贝肉制备降血压肽的研究 摘要 高血压是引发心血管疾病如心力衰竭、中风、冠心病和心肌梗塞等的 重要危险因子。血管紧张素转化酶抑n n ( a c e i ) 是目前用于预防治疗高血 压的重要药物之一，但化学合成的a c e i 易引起恶心、呕吐、腹泻等副作 用。因此，安全性高、副作用小、易吸收等优点的食源性a c e i 尤其引入 注目，已成为生物活性肽研究领域的热点之一。 本文以马氏珠母贝肉为原料，选用6 种蛋白酶在各自适宜的条件下进 行酶解，采用h p l c 法分析酶解产物对血管紧张素转换酶( a c e ) 的抑制活 性，筛选出碱性蛋白酶为其制备的最佳酶种类，并确定了水解度为2 1 时， 产物具有较好的抑制活性。在此基础上，分别考察了加酶量，底物浓度， 酶解温度及p h 等对水解度的影响，结果表明：加酶量为0 1 7 5g l 、底物 浓度为3 5g l 、温度为4 5 * ( 2 、p h 为9 5 及水解时间2 4 0m i n 为最适酶解工 艺条件。通过s d s 聚丙烯酰胺凝胶电泳测定相对分子质量分布，发现酶解 产物中主要为1 4 4k d 以下的多肽分子。 根据实验数据和经验公式推导出碱性蛋白酶酶解马氏珠母贝 肉的动力学模型分别为d h = 5 7 5 7 l n 1 + ( 4 4 0 2 3 e o s o - 0 0 4 4 8 ) t 和 r = ( 2 5 3 4 4 岛一0 2 5 7 6 s o ) e x p l - 0 1 7 3 8 ( d h ) i ，并求得酶失活常数k d 为5 1 7 3 7 m i n ，水解活化能厶为5 7 0 5k j m o l ，酶失活活化能岛为6 3 3 0k j m o l 。 理论值与实际值进行对比，动力学模型与实验结果非常吻合，说明它具有 很好的实际应用价值。 利用1 0k d 超滤膜对a c e i 进行初步分离，确定了最适工艺参数：压 力0 4m p a ，初始料液浓度2 5m g m l ，p h7 0 ，操作温度3 5 。c 。通过对超 滤前后溶液各部分抑制活性的检测发现，超滤能使较高a c e i 组分获得有 效富集。 关键字：酶解马氏珠母贝降血压肽 p r e p a r a t i o n o fa n g i o t e n s i ni c o n v e r t i n g e n z y m ei n h i b i t o r yp e p t i d e sf r o mp i n c t a d a m a i u 、e n s i im e a tb yp r o t e a s eh y d r o l y s i s a b s t a r c t h y p e r t e n s i o ni sam a j o rr i s kf a c t o ro fc a r d i o v a s c u l a rd i s e a s e s ，s u c ha sh e a r tf a i l u r e ， a p o p l e x y , c o r o n a r yd i s e a s ea n dm y o c a r d i a li n f a r c t i o n a n g i o t e n s i ni - c o n v e r t i n ge n z y m e i n h i b i t o r y ( a c e i ) i so n ek i n d o fi m p o r t a n td r u g sf o rp r e v e n t i o na n dt r e a t m e n to f h y p e r t e n s i o n , b u tc h e m i c a ls y n t h e s i so fa c e ii se x t r e m e l ye a s yt oc a u s eq u e a s i n e s s ，v o m i t , d i a r r h e aa n do t h e rs i d ee f f e c t s t h e r e f o r e ，a n g i o t e n s i ni - c o n v e r t i n ge n z y m ei n h i b i t o rp e p t i d e s f r o mf o o dp r o t e i nh a st ob ee s p e c i a l l yn o t i c e a b l eb e c a u s eo fi t sa d v a n t a g e sw h i c hi n c l u d e s s a f t yl i t t l es i d ee f f e c t s ，e a s i l ya b s o r b e d ，a n ds oo n , a n db e c o m eo n eo ft h ef o c u s e si nt h e b i o a c t i v ep e p t i d e sr e s e a r c hf i e l d s i nt h i sa r t i c l e ，s i xd i f f e r e n tp r o t e o l y t i ce n z y m e sw e r ee m p l o y e dt oh y d r o l y z ep i n c t a d a m a r t e n s i im e a tt op r o d u c et h eh y d r o l y s a t e su n d e rt h e i rs u i t a b l ec o n d i t i o n , a n dt h eh i 曲 p e r f o r m a n c e li q u i dc h r o m a t o g r a p h ym e t h o dw a sd e v e l o p e df o rd e t e r m i n a t i o no ft h e i n h i b i t o r ya c t i v i t yo fa n g i o t e n s i ni - c o n v e r t i n ge n z y m e ( a c e ) i nh y d r o l y s a t e s t h er e s u l t i n d i c a t e dt h a th y d r o l y s i so fp i n c t a d am a r t e n s i im e a tw i t ha l k a l i n ep r o t e i n a s ep r o d u c e dt h e h i g h e s ta c ei n h i b i t o r ya c t i v i t y t h e r e f o r e ，a l k a l i n ep r o t e i n a s ew a se s t a b l i s h e df o rf u r t h e r s t u d y o no p t i m i z a t i o no fh y d r o l y s i sc o n d i t i o n s a n dt h ed e g r e eo fh y d r o l y s i sw a sd e t e r m i n e d o n21 w h e nh y d r o l y s a t eh a st h eh i g h e s ta c e i n h i b i t o r ya c t i v i t y o nt h i sb a s i s ，t h ef a c t o r s ， i n c l u d i n gt h ee n z y m a t i cq u a n t i t y , c o n c e n t r a t i o no fs u b s t r a t e ，t e m p e r a t u r e ，p ha n dr e a c t i o n t i m e ，w e r ei n s p e c t e dr e s p e c t i v e l yo nd h t h er e s u l ts h o w e dt h a tt h eo p t i m u mc o n d i t i o n so f a l k a l i n ep r o t e i n a s et oh y d r o l y z ep i n c t a d am a r t e n s i im e a tw a s ：e n z y m a t i cc o n c e n t r a t i o na t 0 17 5g l ，c o n c e n t r a t i o no fs u b s t r a t ea t3 5g l 一，t e m p e r a t u r ea t4 5 c ，p ho n9 5a n d i i i h y d r o l y s i st i m ea t2 4 0m i n d e t e c t e db ys d s - p o l y a c r y l a m i d eg e le l e c t r o p h o r e s i s ，t h er e s u l t a b o u tw e i g h to fm o l e c u l a ri n d i c a t e dt h a tl o t so fp e p t i d e sf r o mh y d r o l y s a t ew a sl e s st h a n14 4 k d b a s e do nt h ee x p e r i m e n t a ld a t aa n de m p i r i c a lf o r m u l a , t h ed y n a m i c sm o d e la b o u t h y d r o l y z i n go fp i n c t a d am a r t e n s i im e a tb ya l k a l i n ep r o t e i n a s ew a sd e d u c e dr e s p e c t i v e l y a n d t h er e s u l t so f g e n e r a l k i n e t i c e q u a t i o n f o rt h i s h y d r o l y s i s p r o c e s s w e r e s u g g e s t e d ：明= 5 7 5 砌 1 + 洋0 2 3 e o s o 一0 0 4 4 8 ) t a n dr = ( 2 5 3 4 4 e 0 0 2 5 7 ( x s o ) e x l ：( - o 1 7 3 8 ( z ) m e a n w h i l e ，s o m ek i n e t i cp a r a m e t e r sw e r eo b t a i n e dr e s p e c t i v e l y ：e n z y m i ci n a c t i v a t i o n c o n s t a n t 幻i s51 7 3 7m i n 1 ，t h eh y d r o l y s i sa c t i v a t i o ne n e r g y 厶i s5 7 0 5k j m o l 。1a n dt h e i n a c t i v a t i o ne n e r g y 岛i s6 3 3 0k j m o l c o m p a r e dt h e o r e t i c a lv a l u ew i t ha c t u a lv a l u e ，t h e d y n a m i cm o d e lw a sp r o v e dv e r yg o o da g r e e m e n tw i t he x p e r i m e n t a lr e s u l t , a n ds h o w e di t s g o o dp r a c t i c a lv a l u e t h e10k du l t r a f i l t r a t i o nm e m b r a n ew a su s e dt os e p a r a t ea c e ii n i t i a l l ya tt h i st i m e ， t h eo p t i m u mp r o c e s sp a r a m e t e r sw e r ed e t e r m i n e d ：t h ep r e s s u r e pa t0 4m p a , t h ei n i t i a l c o n c e n t r a t i o no fs u b s t r a t ei s2 5m g m l 一，p ho n7 0 ，o p e r a t i n g t e m p e r a t u r ef o r3 5 0 m e a n w h i l e ，c o m p a r e di n h i b i t o r ya c t i v i t yo fs o l u t i o n sw i t hb e f o r ea n da f t e ru l t r a f i l t r a t i o n , t h e r e s u l ts h o w e dt h a tu l t r a f i l t r a t i o nw a sa b l et oe n r i c h h i g h e ra c ei n h i b i t o r ya c t i v i t y c o m p o n e n t so fh y d r o l y s a t ee f f e c t i v e l y k e y w o r d s ：h y d r o l y z a t i o n ；p i n c t a d am a r t e n s i i ；a c ei n h i b i t o r yp e p t i d e s 一 符号说明 意义 每克蛋白质所含必需氨基酸的量 每克蛋白质所含氨基酸的总量 每克蛋白质所含非必需氨基酸的量 对照组中马尿酸的量 加入抑制剂后马尿酸的量 马尿酸浓度 马尿酸回收率 标准样中马尿酸的量 混合样中马尿酸的量 样品中马尿酸的量 a c e 抑制率 水解度 单位质量底物中已水解的肽键数目 单位质量底物中蛋白质肽键总数 碱液体积 碱液浓度 氨基的平均解离度 底物中蛋白质总量 酪氨酸含量 酶液的最终稀释倍数 酶的质量 反应时间 反应速率 初始底物浓度 具有活力的酶浓度 初始酶浓度 单位或量纲 m g g 。l m g g l m g g l “g 1 t g m m 0 1 l 。i p g p g p g m m o l g - i m m o l g - i l m 0 1 l l g 嵋 g m l n m 0 1 m i l g - l l g l l g l l 得删 舭 血 瓜 日 飓风凰俨 肼 办 风b g 口 鸠m f 矿 ， r 岛历岛 意义 被钝化的酶浓度 米氏常数 酶失活常数 水解活化能 水解活化能因子常数 酶失活活化能 酶失活活化能因子常数 膜通量 透过液体积 膜面积 超滤时间 蛋白质回收率 组分i 的体积 组分i 的浓度 超滤前溶液体积 超滤前溶液蛋白质浓度 当前膜的纯水通量 没有污染前膜的纯水通量 被污染后膜的纯水通量 单位或量纲 g l 。l m 0 1 l 1 m l n k j m o l l k j m 0 1 1 l h - i m - 2 l m 2 h m l m g m l l m l m g m l 。l l 。h 1 m - 2 l h - i m - 2 l h - i m - 2 待最幻峨以幽都山g 彳 钆郦k g g 山厶珈 广西大学学位论文原创性声明和使用授权说明 原创性声明 本人声明：所呈交的学位论文是在导师指导下完成的，研究工作所取得 的成果和相关知识产权属广西大学所有，本人保证不以其它单位为第一署名 单位发表或使用本论文的研究内容。除已注明部分外，论文中不包含其他人 已经发表过的研究成果，也不包含本人为获得其它学位而使用过的内容。对 本文的研究工作提供过重要帮助的个人和集体，均己在论文中明确说明并致 谢。 论文作者签名：扭投参 朋年月3 日 学位论文使用授权说明 本人完全了解广西大学关于收集、保存、使用学位论文的规定，即： 按照学校要求提交学位论文的印刷本和电子版本： 学校有权保存学位论文的印刷本和电子版，并提供目录检索与阅览服务； 学校可以采用影印、缩印、数字化或其它复制手段保存论文； 在不以赢利为目的的前提下，学校可以公布论文的部分或全部内容。 请选择发布时间： 玉即时发布口解密后发布 ( 保密论文需注明，并在解密后遵守此规定) 做储签名隰放多导师签碥撼舻厂月矿日 首摹解马氏珠母贝肉制备降血匿肽的研究 第一章绪论 高血压是目前全球范围内重大的公共卫生问题之一，被认为是引发动脉硬化及心肌 梗塞等心血管疾病与肾衰竭的主要因素。目前，治疗高血压的方法主要以传统化学合成 的药物治疗为主，但由于其易引起低血压、心动过缓、呕吐等副作用【l 】，因此，近年来 研究人员把目光转向于更安全的降血压药物上来，其中来源于食物蛋白的具有降血压活 性的血管紧张素转换酶抑制肽( a n g i o t e n s i ni - c o n v e r t i n ge n z y m ei n h i b i t o r yp e p t i d e s ， a c e i ) 越来越引起重视，由于其安全性高且往往附带有如免疫促进、减肥及易消化吸 收等生理功能，所以备受人们亲睐，已成为生物活性肽研究领域的热点之一【2 】。 近年来，对其研究发展也非常迅速。目前，人们己先后从牦牛酪蛋白、鲨鱼鱼肉、 牛肉、猪血、酸奶、蓝贝、鲑鱼等【3 - 9 】动物蛋白和高梁、大豆、玉米、大米、绿豆、椰 菜、麦麸等【1 0 - 1 6 植物蛋白的酶解产物或发酵制品及红酒与白酒【1 7 1 中分离得到了各种不同 结构的血管紧张素转换酶抑制肽，并通过动物实验或体外活性实验证明了具有很好的降 血压作用。随着对其作用机制、生理效果及制备方法的研究进一步深入，来源于食物蛋 白质的降血压肽越来越显示出良好的应用前景。 1 1 高血压及其危害 高血压是一种以动脉血压升高为主要症状的慢性心脑血管疾病，不仅患病率高，而 且可引发心、脑、肾、视网膜等靶器官损伤及代谢的改变，并能导致冠心病、心肌梗塞、 脑卒中和肾功能衰竭等疾病【1 8 】。由于血压长期维持在较高的水平上，加重了心脏负荷， 早期发生代偿性左心室肥厚，随着病情发展心脏继续扩张，最后可能发生心力衰竭及严 重心律失常；长期血压升高可促进动脉粥样硬化的形成，尤其是冠状动脉硬化的发展， 也可使小动脉硬化易于破裂出血或痉挛而导致脑血栓的形成。肾脏入球和出球小动脉痉 挛、硬化、退变导致肾脏缺血、缺氧、肾实质纤维化，高血压晚期多伴有进行性肾功能 减退，同时血压长期升高使得视网膜动脉发生玻璃样变化等【1 9 删。值得注意的是，在高 血压病的早期和中期，症状往往不明显，容易被人们忽视，因而常被人们称为“无声的 杀手 。 每年全世界因高血压而死亡1 2 0 0 万人，在发达国家和比较发达国家，其患病率可高 达2 0 以上，就是在发展中国家，近年来高血压的患病率也在不断增长，因此，被称为 酶解马氏珠母贝肉制畚降血压肽的研究 “人类健康无形的杀手 。目前，我国高血压患病率已上升到1 1 8 8 ，患病人数估计已 近l 亿，每年死于心血管疾病( 主要是高血压、脑卒中和冠心病) 的人数达2 0 0 万，已成 为一个十分严重的社会公共卫生问题【2 1 1 。 1 2a c e 与高血压的关系 血管紧张素转化酶( a n g i o t e n s i ni - c o n v e r t i n ge n z y m e ，a c e ) 是一种含锌二肽羧基 肽酶，在人体组织及血浆中广泛存在，主要存在于血管内皮细胞内，在肺毛细血管细胞 含量最为丰富。它是人体肾素一血管紧张素系统( r e n i na n g i o t e n s i ns y s t e m ，r a s ) 和 激肽释放酶一激肽系统( k a l l i k r e i nk i n i ns y s t e m ，k _ k s ) 中起关键作用的酶，主要通过 两种途径来实现对血压的调节：( 1 ) 将血管紧张素l 转换为具有升压物质一血管紧张素 i i ；( 2 ) 降解降压物质一激肽，使之失活，具体步骤如图1 1 所示。 肾素血管紧张素调节系统( r a s )激肽释放酶激肽系统( k k s ) 血管紧张素原激肽原 l 肾素i 激肽释放酶 血管紧张素i缓激肽 ( 无活性)( 活性) i a c e l 血管紧张素i i缓激肽1 7 洫锨缩一高呒涨 图1 - 1a c e 对血压的调节作用 f i g 1 - 1a n g i o t e n s i ni - c o n 、，e r t i i 培e n z y m er e g u l a t i o no nt h eb l o o dp r e s s u r e 在r a s 中，a c e 催化血管紧张素i 脱去c 末端两个氨基酸残基形成活性很强的血管 紧张素i i ，而血管紧张素i i 是肾素血管紧张素调节系统中己知活性最强的血管收缩剂， 它能作用于小动脉，使血管平滑肌收缩，迅速引起升压效应；同时还能刺激醛固酮分泌 和直接对肠胃作用( 减少肾血流量及促进n a + ，k + 的重吸收) ，引起钠贮量和血容量 的增加，也能使血压升高。在k k s 降血压系统中，缓激肽是降血压物质，a c e 也能作用 于缓激肽，催化其c 末端脱去2 个氨基酸残基而使其失活。因此，协调好a c e 的活性， 就能有效的预防和治疗高血压。 酶解马氏珠母贝肉制备降血妇呔的研究 1 3 降血压肽的作用原理 血管紧张素转换酶抑制肽，又称降血压肽，是一类可与a c e 活性功能区竞争性结合， 从而抑制其活性的小分子肽【2 2 1 。最早f l j f e r r e i r a 等【2 3 1 在南美洲蝮蛇( b o t h r o p s j a r a r a c a ) 毒液中分离得到。由于这些寡肽类物质能够增强缓激肽的作用，故将其称为缓激肽增强 因子。后来又发现这种肽类物质有抑制a c e 的作用，能使血管紧张素i 转变为血管紧张 素i i 的过程发生障碍。1 9 7 1 年，o n d e t t i 掣2 4 】合成t b p f s 成分之一的壬肽抗压素，这是第 一个用于临床的血管紧张素转化酶抑制剂( a c e i ) 。研究发现，a c e 是一种金属肽酶， 含有2 个结合z n 2 + 的位点，即所谓“必须结合位点( o b l i g a t o r yb i n d i n gs i t e ) 。z n 2 十 结合位点是a c e 催化反应的活性基团所在部位，包括降血压肽在内的各种a c e i 的共同 作用是与a c e 活性部位的z n 2 + 结合，使之失活。降血压肽是一类对a c e 活性区域亲和力 较强的竞争性抑制剂，它们与a c e 的亲和力比血管紧张素i 或舒缓激肽更强，而且也不 容易从a c e 结合区释放，从而阻碍a c e 催化水解血管紧张素i 成为血管紧张素i i 以及催化 水解舒缓激肽成为失活片段的两种生化反应过程，起到降血压的作用。 1 4 降血压肽的构效关系 1 9 6 5 年，f e r r e i r a 等【2 3 】首次从南美洲腹蛇的毒液中发现了血管紧张素转换酶抑制肽， 它能够抑制舒缓激肽酶从而增强血管舒激肽的活性，这引起了世界各国研究者们极大的 兴趣。而后，日本学者【2 5 1 从亚洲腹蛇的毒液分离出具有类似活性的a c e i 。我国学者【2 6 】 从浙江腹蛇、江西腹蛇的毒液中也分离出类似活性的a c e i 。通过对蛇毒a c e i 结构的分 析发现，它们有一个共同的特点：n 末端为焦谷氨酸，c 末端为脯氨酸，其降血压的功 能主要是通过与a c e 的竞争性抑制实现的，但通过饲喂动物发现，它对正常动物血压没 有任何影响。 1 9 7 1 年，o s h i m a 等【2 刀第一次报道了源于食品蛋白质的降血压肽。随后，m a r u y a m a 等【2 8 捌】从牛酪蛋白中成功酶解获得了4 种降血压肽，并研究了它们的构效关系，发现这4 种降血压肽分别位于1 酪蛋白中2 3 3 4 ，2 3 2 7 ，1 9 4 1 9 9 残基间与p 酪蛋白的1 7 3 1 8 3 残 基间，用含上述肽的饲料饲喂自发性高血压老鼠四周后，发现它们的血压下降了1 0 9 a ：4 3 m m h g ，从而证实了食品蛋白中确实存在降血压肽活性片断；k o h m u r a 等【3 2 3 3 】选择了人 - 孚l 1 3 酪蛋白作为原料，依据其氨基酸序列人工合成了6 9 条c 末端含脯氨酸的短肽，又以 人乳k 酪蛋白为原料，人工合成了2 3 条c 末端含脯氨酸或酪氨酸的短肽，并对这些肽的 酶解马氏珠母贝肉制备降血压昧的研究 活性进行检验，发现其活性区主要集中在p 酪蛋白的3 9 5 2 区域以及k 酪蛋白的6 3 6 5 区 域，这首次直观地告诉人们，食品蛋白质中确实存在某些降压活性序列，可以通过酶解 的方法获得，从而起到预防和治疗高血压的目的。 从9 0 年代以来，人们己成功从沙丁鱼、金枪鱼、鲣鱼、大豆豆豉与酱油及牡蛎、扇 贝、河蚌等贝类蛋白的水解或发酵产物中分离纯化到了各种结构、序列及大小不一的具 有抑匍j a c e 活性的小肽【3 “1 1 。这些小肽对a c e 的抑制活性主要由2 个因素决定：寡肽的 分子质量以及寡肽的氨基酸组成和结构。实验结果表明，大部分具有抑制活性的降血压 肽相对分子质量都在1 5 0 0d 以下【4 2 】。至于降血压肽的氨基酸组成与降血压活性之间的关 系，目前还不能确定，但是综合分析目前已知的由天然蛋白质水解所得到的a c e i 的结 构发现，n 末端一般为长链或具有支链的疏水性氨基酸( 如l e u 、l l e 、v a l ) ，c 末端一 般为具有环状结构的芳香族氨基酸( 如p h e 、t y r 、t r p ) 或p r o 。 1 5a c e 抑制活性评价方法的研究 a c e 抑制活性的评价有多种方法，早期的a c e 活性分析以该酶的天然底物血管紧张 素i 或缓激肽为底物，应用放射色谱法、比色法或放射免疫法的方法分析，操作复杂， 干扰多且底物昂到4 3 1 。现在主要是以人工合成的三肽作为酶解底物进行分析。报道中最 常用的方法是以马尿酰组氨酰亮氨酸( h i p h i s l e u ，h h l ) 为底物的分光光度计法畔】， a c e 抑制剂的活性以i c 5 0 ( 即抑制5 0 a c e 活性的a c e 抑制剂浓度) 来表示。 1 9 7 1 年，c u s h m a n 等m 】建立了紫外分光光度法，最p a c e 在催化分解血管紧张素i 的模 拟物h h l 产生马尿酸，该物质在2 2 8n m 处具有特征吸收峰。当加入a c e 抑制剂时，a c e 对h h l 的催化分解作用受到抑制，马尿酸的生成量减少。通过测定加入抑制剂前后马尿 酸紫外吸收的差别可算出抑制活性的大小。在该方法中，a c e 和底物反应需要一定的时 间，生成的马尿酸需经乙酸乙酯抽提，且在2 2 8r i m 处干扰较多，对实验操作要求高，易 产生实验误差。许多学者对这一方法进行改进，将h p l c 直接用于反应液中马尿酸的定 性定量分析，不需经过乙酸乙酯抽提马尿酸的繁琐过程，准确性高【4 5 1 。如w a t a n a b e 等【4 6 】 对该方法进行改进，采用微胶束毛细管电泳的方法定量分析马尿酸，缩短了分析时间， 并提高了精确度。 动物实验是评价降血压肽效应的有效方式，降血压肽生物学效应评价的实验动物一 般是原发性高血压大白鼠( s h r ) 。降血压肽的动物试验一般采用口服或静脉注射的方 式，以不同剂量喂食或注射，同时做a c e i 药物对照组，比较不同剂量对s m 洫压的影响， 酶解马氏珠母贝肉制备l u t - 血压肽的研究 并与a c e i 药物的降压效果进行比较。例如，j e 等【8 】从蓝色贻贝m ”i i u se d u l i s 的发酵物中 提取出序列为e v m a g n l y p g 的降血压肽，i c 5 0 值为1 9 3 4 烬m l 一，通过直接口服可以 有效地降低原发性高血压大白鼠( s h r ) 的血压。z h a o 等h 7 】用菠萝蛋白酶和a l c a l a s e 蛋 白酶对海产明胶进行水解，并使用其中抑制活性最高的g h 一组分饲喂s h r 一个月，结 果发现s h r 的血压有显著的下降。值得注意是，许多肽段在体外实验中对a c e 具有抑制 活性，但在体内实验中降压降低或并无效果。c h e n 等【4 s 】认为，由于酶解降血压肽的降压 活性与其肽链上特定的基团及氨基酸序列有关，而其经口服后，由于胃肠消化系统中所 含酶的分解作用，其结构会有所改变，从而影响其降血压活性。m a s t s u i 等【4 研研究了胃肠 消化酶对口服酶解降血压肽的降压活性的影响，认为部分原本不具降压活性的肽段在各 种酶的作用下，释放出具有生理活性的基团，而同时部分原本具有生物活性的肽段则失 去生理功能，认为需从两个方面综合考虑消化系统对酶解降血压肽的作用影响。也有报 道认为，这些抑制肽只是a c e 的底物，不是真的抑制剂，所以它们在体外实验测得的活 性较高，而在体内无效【5 。 1 6 酶法制备降血压肽 1 6 1 原料来源 虽然降血压肽没有固定的氨基酸组成，但原料蛋白质的选择十分重要。降血压肽制 备原料的选择首先应考虑原料蛋白质的氨基酸组成，疏水性氨基酸和芳香族氨基酸以及 脯氨酸含量高的蛋白质适合作为酶法生产降血压肽的原料。我国拥有十分丰富的蛋白质 资源，很多未能得到有效的利用，特别是一些低值蛋白质始终处于被浪费的状态，大豆 蛋白、鱼贝类蛋白、玉米蛋白、乳酩蛋白、鸡蛋等的年产量很高，并且价格低廉，是生 产降血压肽的良好原料。 1 6 2a c e i 的制备方法 生产a c e i 的方法大体有三种：一是提取存在于生物体中的各类天然a c e 抑制肽； 二是通过化学法或酶法降解蛋白质，化学法常采用加热和酸处理的方法，体外蛋白酶水 解包括直接酶解和利用微生物间接酶解两类；三是用重组d n a 技术、酶法、化学法合成 活性肽。通过酸碱水解生产a c e i 虽然工艺简单、成本低廉，但是在生产过程中酸水解 会生成有毒物质，碱水解产物有异味，并且水解程度难于控制，所以在食品工业中应用 很少。相比之下酶水解条件温和，对蛋白质的营养价值破坏小，最重要的是此法生产安 广西大掌硕士学位论文酶解马氏珠母贝肉制备降血压肽的研究 全性高、能在温和的条件下进行定位水解分裂生产大量的短肽，生产时间短，且水解过 程易控制，价廉易于推广。因此，酶解是目前获取生物活性肽最有效的途径。 a c e i 作为生物活性肽的一种，可以通过酶解某些食物蛋白质获得。由于酶具有特 异性，不同种类的酶获取的产物存在较大差异，因此，酶的选择是a c e i 生产的关键。 由于一般不知道原料蛋白质的一级结构，并且a c e i 也没有一个固定的结构，所以酶法 生产降血压肽存在一定的盲目性，应根据酶的专一性从众多的蛋白酶中进行筛选。目前 已经应用在降血压肽生产的蛋白酶主要有碱性蛋白酶、嗜热菌蛋白酶、胰蛋白酶、 砧c 2 l l a s e 、胶原蛋白酶、酸性蛋白酶、胃蛋白酶等5 1 巧7 1 ，可根据不同原料及工艺要求选 择不同种类的酶。例如，s e k i 等【5 8 】用地衣型芽饱杆菌碱性蛋白酶酶解包括沙丁鱼、带鱼、 牡砺、虾、蟹在内的1 2 种食物蛋白，获得了不同抑制活性的a c e i 。 此外，在选择酶时最好根据其水解的特异性进行选择，如胰凝乳蛋白酶水解由芳香 族氨基酸的羧基所形成的肽键；胃蛋白酶能迅速水解由芳香族氨基酸和其他氨基酸形成 的肽键，也能较缓慢地水解其他一些氨基酸( 如l e u ) 和酸性氨基酸参与形成的肽键； 碱性蛋白酶也有对终端疏水性氨基酸的专一性，主要裂解疏水性氨基酸( 如：l e u 、i l e 、 v a l 等) 的终端；嗜热茵蛋白酶水解由v a l 、l e u 、i l e 、p h e 、t y p 、m e l 等疏水性氨基酸的 氨基端形成的肽键。 除了用单一蛋白酶进行水解以外，也可以用两种或以上的酶同时加入或按一定顺序 加入进行水解。例如b y u i l 等【”】人依次用灿c a l a s e 、p r o n a s ee 、胶原蛋白酶3 步水解阿拉斯 加青鳕皮，得到了2 种活性较高的降血压肽，其中序列为g l y p r o l e u 肽段的i c s o 值为 2 6p , m o l l - l 。k i l n 等【5 9 】利用五种不同的蛋白酶对牛皮胶质进行水解，比较各产物的活 性，发现蛋白酶e ，a l c a l a s e 和胰凝乳蛋白酶的水解产物活性比其它二种蛋白酶产物的活 性要高，然后他们将这几种蛋白酶进行组合，在不同的时间按不同的顺序加入，发现蛋 白酶加入的顺序不同，产生的活性也各不相同，a l c a l a s e 与蛋白酶e 组合产物的降血压活 性最高。但吴建平等【删的研究发现，双酶法的作用效果与单酶法相比，并没有明显优势。 1 7 降血压肽的分离提取 建立一套适宜的分离提取技术工艺是将降血压肽推向商业化生产的必要条件。分离 提取的效率将直接影响至u a c e i 的应用前景。在酶法生产降血压肽的研究中，不同种类 的酶、不同的水解条件都会使目标产物有所差异，包括分子质量分布、氨基酸组成、带 电量、p h 值、极性等方面，因此对降血压肽的分离纯化相当复杂。目前，肽类常用的 - 6 酶解马氏珠母贝肉制畚降血且洲的研究 分离方法包括：凝胶过滤层析、离子交换层析、凝胶电泳、高效液相色谱、毛细管电泳 等。在进行分离纯化时，最好是将分离原理不同的2 种或多种手段结合使用，从而使得 到的目标产物更纯。如倪莉等【6 l 】采用凝胶色谱过滤s e p h a d e xg 2 5 、离子交换层析和反 相高效液相色谱法对水解度为2 0 的动物蛋白酶解产物进行分离纯化，利用质谱测定其 中种a c e i 的组成为g l y t r y 。k u n i o 掣6 2 】用阳离子交换树脂d o w e x5 0 w ( 旷) 、s e p h a d e x g 2 5 凝胶和s ps e p h a d e xg 2 5 从裙带菜的酶解产物中分离出降血压肽并分析其结构。 b y u n 等【5 5 】在s e p h a d e xg 2 5 凝胶层析和s ps e p h a d e xg 2 5 离子交换层析的基础上，进一步 用o d s 柱进行反相高效液相色谱分离，从阿拉斯加绿鳕鱼皮的酶解产物中分离得到了纯 度较高的降血压肽；a s t a w a n 等【6 3 l 用s e p h a d e xg 2 5 凝胶层析和s ps e p h a d e xg 2 5 离子交 换层析分离纯化金枪鱼的酶解产物得到至少4 种降血压肽。 1 8 降血压肽的研究开发 自1 9 7 7 年c u s h m a n 等即】根据血管紧张素转换酶( a c e ) 底物的化学结构推测其活 性部位的模型，并据此开发设计了第一个化学合成的血管紧张素转换酶抑制剂( a c e i ) 卡托普利( c a p t o p r i l ) 以来，a c e i 药物在高血压治疗中的作用得到了医学界的普遍 认可。但由于化学合成的a c e i 会使血压过低或血压下降过快，引起低血压、心动过缓、 眩晕、恶心、呕吐、腹泻、便秘、性功能障碍等一系列人体不良反应，所以研究者开始 寻找安全性更高的a c e i t 。 来源于食物蛋白质的降血压肽的降压效果虽然不及化学合成的a c e i ，但其有以下 优点【删：( 1 ) 安全性高：由于以食品为原料制备，或者加入食品级酶制剂，不会对人 体造成伤害。( 2 ) 降压效果温和专一持久：研究表明a c e l 只对高血压患者有降压作用， 而对正常人血压没有影响，作用时间也较长，因此无须担心因过度降压而带来的副作用。 ( 3 ) 其他的一些生理功能：除降压功能，往往具有免疫促进，抗凝血，易消化吸收和 抗肿瘤等功能，已吸引了不少研究者的目光。 事实上还有许多食物蛋白来源的降血压肽经体外实验和动物实验以及临床实验研 究证明具有较强的a c e 抑制活性和显著的降压效果，这为研究开发新型安全高效的 a c e i 提供了一条新的思路。日本【6 5 】早在2 0 世纪8 0 年代就对降血压肽进行了广泛深入 的研究。他们从玉米蛋白、大豆蛋白、鱼贝类蛋白、清酒糟等廉价的蛋白质资源中研究 开发了众多的a c e i ，制成药片、口服液或作为功能因子添加到各种食品中去，取得了 良好的经济效益和社会效益。 酶解马氏珠母贝肉制备降血月洲。的研究 我国对降血压肽的研究虽起步较晚，但也取得了可喜的成绩，如吴建平等【删从大豆 蛋白的酶解液中提取得到了序列为a s p l e u - p r o 和a s p g l y l 拘两种降血压肽。2 0 0 3 年，辛 志宏等用8 种蛋白酶分别进行单一酶和复合酶水解麦胚蛋白生产降血压肽。近年来， 人们又相继从蛋黄、苦荞麦等酶解产物中获得了降血压肽，使得对降血压肽的研究逐渐 成为一种趋势。 1 9 研究目的、意义及主要内容 1 9 1 研究目的及意义 随着陆地资源的相对匾乏，环境污染以及人们对于营养保健新的要求，人类逐渐把 目光投向更广阔的海洋。我国海洋生物资源蕴藏量十分丰富，其中海洋蛋白资源种类尤 其繁多。由于海洋环境不同于陆地环境，为适应某些极端环境，海洋生物往往含有与陆 地生物不同的、化学结构特异的活性物质。这些活性物质对心脑血管疾病、肿瘤、艾滋 病、糖尿病、老年性痴呆症等疑难疾病有着治疗或预防的作用。因此，应用海洋生物技 术向海洋索取食物、功能蛋白和特殊活性物质，研究开发新药已成为药物研究一个新的 发展方向，也成为世界各国海洋开发的一项重要内容。 马氏珠母贝( p i n c t a d am a r t e n s i i ) 属软体动物门双壳纲珍珠贝目珍珠贝科，又称合 浦珠母贝，是一种高蛋白、低脂肪，营养价值丰富的海产珍珠贝类。在我国主要分布在 广西、广东和台湾海峡南部沿海一带。近年来，由于珍珠养殖业的快速发展，其数量已 相当可观，仅广西、广东、海南三省的年产量就有数干吨之多。但目前主要被用于罐 头、饲料加工及晒成干品出售，加工利用程度低下，经济附加值不高。因此，以马氏珠 母贝肉为原料，开发降血压肽，不仅为高血压的防治提供一种新产品，同时也为马氏珠 母贝肉的深加工提供一条有效途径，这势必将产生良好的经济效益和社会效益。 本课题利用现代食品生物技术与现代分离技术相结合，探讨以a c e 体外抑制活性为 主要评价指标，采用酶解技术结合超滤的分离方法，从马氏珠母贝肉中制备a c e i ，为 工业化生产高纯度a c e i 摸索试验条件，奠定理论基础。 1 9 2 本课题研究内容 本课题主要研究内容包括以下几个方面： ( 1 ) 分析马氏珠母贝肉的主要营养成分及其氨基酸组成情况。 ( 2 ) 建立简便、快捷而行之有效的血管紧张素转换酶抑制活性的检测方法。 8 酶解马氏珠母9 肉制畚降血压肽的研究 ( 3 ) 以马氏珠母贝肉为原料，筛选出最适蛋白酶，并对酶解条件进行优化，分别考 察各因素对水解度的影响，确定酶解的适宜条件。 ( 4 ) 根据蛋白质酶酶促反应机理，研究其动力学模型，确定其动力学参数。 ( 5 ) 对酶解产物进行超滤分离，确定最佳超滤条件，考察超滤前后抑制活性变化情 况，为后续分离纯化工作进行初步探索。 广西大学硕士掌位论文酶解马氏珠母贝肉制备降血匿肽的研究 2 1 前言 第二章马氏珠母贝肉营养分析及评价 马氏珠母贝作为世界上三大海产珍珠贝类之一，由于其肉质味道鲜美、营养丰富等 优点，正逐步进入人们视野，其独特的保健功效也引起重视。其中富含的牛磺酸是一种 带有磺酸基( - s 0 3 h ) 的特殊氨基酸，具有抑制血小板凝集，降血脂、血压，降低胆固 醇，保护视力，促进大脑发育，防治胆结石等多种生理功能惭】，是海洋生物中的一种重 要的天然生理活性物质。此外，马氏珠母贝肉中e p a 和d h a 等不饱和脂肪酸也占脂肪 酸总量的1 2 6 和2 2 1 t 6 7 】。研究表明e p a 和d h a 具有降低血液胆固醇，促进平滑肌 收缩，扩张血管，抑制血小板凝集，降低血糖粘度，起到防治动脉硬化和血栓症等疾病 的作用【6 8 】，d h a 可以改善大脑机能，提高记忆力，对大脑的发育起重要作用，被誉为“脑 黄金”1 6 9 1 。近年研究表明，不饱和脂肪酸还具有一定的抗癌活性7 0 1 。此外，章超桦等f 7 l 】 采用枯草杆菌中性蛋白酶和木瓜蛋白酶酶解马氏珠母贝肉，发现其酶解液具有明显的抗 疲劳作用。凌霄等【7 2 】的研究结果表明，马氏珠母贝肉中含有的糖胺聚糖对h l 6 0