（微生物学专业论文）球孢白僵菌分生孢子油剂的生物学特性研究.pdf

本研究承蒙 国家自然科学基金项目( 30 270 8 97 ) 国家“9 73 计划”课题( 20 0 3 c b l l 4 20 3 ) 资 助 致谢 首先我要感谢我的导师冯明光教授三年对我悉，t l , 关怀和指导。他为我的 成长倾注了无数的心血，为我的发展指明了前进方向。从论文的选题、设计、 撰写、修改直至顺利完成，都凝聚着他的辛劳和汗水。冯老师渊博的知识、 严谨的科学态度和忘我的敬业精神令我钦佩，并将使我日后受益匪浅。 在团结奋进的实验室中，我度过了繁忙而充实的工作与学习时光，这在 的记忆中将永远是难忘的。在这里我受惠于所有老师和同学的无私帮助。 均焕副教授、袁康培副教授在实验的设计和实施中提供宝贵的建议和意 。应盛华老师和师兄陈春在实验的具体操作和数据分析处理中给予了详尽 耐心的指导。与我互勉互助的师姐师兄叶素丹、华丽、田丽、张丽靖、李 、濮小英、顿玉慧、吴惠仙、梁勇、盛亮，学友施卫兵、张国忠、陈龙然、 娇以及师弟师妹黄宝福、邹根、姜渝、尚素微、俞佳、杨旭芬、鲍佳生、 均、郑武、秦毅、单乐天在实验的完成中也提供了许多启发和帮助。在此 他们表示诚挚的谢意。 三年来，同窗好友不仅给予精神上的鼓励，而且在需要的时候给予慷慨 的帮助。与好友朱洁、汤少红、蒋彩英、方丽、杨旭、刘静、杨丽、金洁、 谢丹超、周学来、朱亚韦、张小斌、蒋跃平等的交流与友情将是记忆中永远 闪亮的一页。 谨向所有为我营造良好工作氛围和提供热情帮助的人们致以诚挚的谢 意! 最后，我怀着歉疚的心情向深爱着我的父母、家人表示衷心感 身t ，是他 们的理解与支持使我顺利完成学业。 黄芳芳 2 0 0 5 年5 月 于杭卅1 华家池 我徐见而娟陈李向 摘要 作为重要的杀虫真菌之一，球孢白僵菌( b e a u v e r i ab a s s i a n a ) 已被开发成多种商 品制剂用于农林害虫防治。本研究探讨不同含水量和温度对白僵菌高孢粉贮存寿命 的影响，比较了1 4 种植物源和矿物源油品作为孢子滴剂载体的生物相容性及雾化分 散性，在此基础上组成了基于单品油和配方油的2 0 种孢子油剂，试验观察了它们在 不同温度下贮存期间活孢率变化情况。主要结果总结于后： 含水量与温度对球孢白僵菌分生孢子粉贮存寿命的影响将含水量为1 1 2 、 4 7 3 、7 2 3 、9 8 4 及1 4 1 1 的球孢自僵菌b e a u v e r i ab a s s i a n as g 8 7 0 2 分生孢子 粉分别在4 v 和2 5 。c 下黑暗贮存1 8 个月，定期检测活孢率，以确定孢子粉的贮存寿 命。结果显示，各温度处理中含水量显著( p 0 0 5 ) 影响孢子贮存期间的活孢率。在4 c 下，含水量为1 1 2 9 8 4 处理的活孢率在头1 6 个月均稳定在9 1 以上的水平上波 动，且相互间差异不显著：次高含水量处理( 9 8 4 ) 的活孢率在第1 8 个月才显著低 于其它较低含水量处理，但也达9 0 ：高含水量处理( 1 4 1 l ) 的活孢率则从第6 个 月起显著低于其余较低含水量处理，第1 2 个月时降至2 4 _ 2 。而在2 5 。c 下，第3 和第6 个月的活孢率在不同含水量处理间均呈极显著差异( p o 0 1 ) ，即随含水量升 高而显著下降，次高含水量处理在第6 个月的活孢率仅剩1 7 6 。贮存期间活孢率 ( 圪) 对贮存时间( 瓦；月数) 和孢子粉含水量( c ，) 的依赖关系符合改进的存活衰变模 型，4 下拟合为= i 1 + 0 0 1 5 5 e x p ( 一0 0 5 2 0 + o 0 0 2 3 c g ) l ) ( r 2 = n 8 5 9 , f 4 ，1 3 5 = 4 0 9 5 p o 0 0 0 1 ) ，2 5 下拟合为砭= 1 1 + 0 0 6 4 2 e x p ( o ，2 7 1 8 + 0 0 0 5 2 c j ) l 1 ( r 2 = o ，8 6 5 ，f 4 8 = 2 5 8 3 ，p 0 0 0 0 1 ) 。根据拟合的模型预测，在4 下贮存，若保证活孢率9 0 ，1 4 含水量的孢子粉可贮存5 0 个月，1 2 为7 3 个月，1 0 为1 1 2 个月，9 为1 4 9 个 月，8 为2 1 0 个月，7 为3 3 0 个月，6 j 2 l6 5 5 个月，故孢子粉冷贮的含水量控 制在8 以下将非常安全。若在2 5 c 下贮存并保证活孢率8 0 ，含水量1 0 的孢子 粉仅可贮存1 7 个月，8 为2 3 个月，6 为3 0 个月，4 为3 8 个月，2 为4 6 个 月。显然，孢子粉在此温度下贮存必须将含水量控制在5 以下，才能贮存3 个月 以上并使活孢率预期达到8 0 。 孢子油剂的载体油筛选载体油的选择应考虑其粘度、雾化分散性和生物相容 性。将孢子粉分别加入1 4 种植物或矿物油( 玉米油、大豆油、葵花油、东茶油、粟 米油、花生油、色拉油、橄榄油、石蜡重油、石蜡轻油、溶剂油2 0 0 # 、甲基硅油、 自油1 0 # 及白油2 6 # ) 中，使其终浓度达到1 0 9 个孢子m 1 。然后，测定了1 4 种油 剂的粘度、相同喷雾条件下形成的雾滴大小及分布、雾滴平均含孢总数和单孢率以 及5 1 天期间的相容性，旨在从中筛选出适合白僵菌的载体油。结果表明，不同油 品的粘度差异极其显著旷极大，p o 0 1 ) ，供试油剂分别以甲基硅油和溶剂油2 0 0 # 的粘度为最高( 5 3 3c s t ) 和最低( 1 4 1c s t ) ，其余油剂的粘度在1 2 0 - - - t 5 0c s t ( c e n t i s t o k e s ) 之间。甲基硅油粘度最大，流动性很差，难以喷雾。在自动喷塔的相同喷雾压力下 不同油剂所形成的雾滴大小范围及分布比例很不相同，直径曼8 0l l m 的雾滴一般占很 大比例，达7 0 8 0 ，而8 0 1 2 0g m 的雾滴只占1 0 1 5 。其中，直径4 0 1 2 0 “m 的雾滴以石蜡重油最多，占6 2 1 ；石蜡轻油次之，占5 4 6 。直径- 4 0g m 的雾滴 以石蜡重油最少，仅占1 7 2 ：葵花籽油最多，达4 4 8 。直径范 虱n 4 0g m 、4 0 1 2 0 “m 和1 2 0 4 0 0p - m 的雾滴百分比在不同油剂间差异极显著( 尸 00 1 ) 。不同油剂雾滴 的这三个直径范围的平均含孢量差异都不显著。在4 0 - 1 2 0l l m 的雾滴中，花生油雾 滴含孢量最高达2 8 6 个雾滴，玉米油最少仅1 2 ，9 个雾滴。供试油剂中，直径4 0g m 的雾滴一般仅含1 2 个孢子雾滴，4 0 1 2 0p m 的雾滴含1 3 2 9 个孢子雾滴，而 1 2 0 4 0 0g m 的雾滴含孢量高达2 0 0 3 0 0 个，雾滴。此外，1 4 种载体油以溶剂油2 0 0 # 、橄榄油和色拉油与自僵菌孢子的相容性较差，贮存1 4 天或2 1 天后即未再检测 到孢子萌发；而甲基硅油、自油2 6 # 、石蜡重油、石蜡轻油、自油1 0 # 则与白僵 菌孢子的相容性较好。综合油剂粘度、雾滴大小及分布、雾滴含孢量及单孢率、生 物相容性以及油品价格等因素，石蜡重油、石蜡轻油、白油1 0 # 、白油2 6 # 被认 为是作为载体油较佳的品种，它们都是矿物油。 基于不同油品的孢子油剂的贮存寿命以石蜡重油、石蜡轻油、白油1 0 # 、白 油2 6 # 的单品油及其与甲基硅油或花生油3 ：1 和1 ：1 组成的不同配方油配制成1 0 9 个孢子m l 的2 0 种油剂，分别在4 c 和2 5 下黑暗贮存，每隔半月抽检活孢率。结 果显示，4 c 下贮存6 个月，所有供试油剂的活孢率大多在5 的误差范围内波动， 活孢率稳定维持在9 4 以上，仅个别油剂略有下降，但最低也达8 8 。在2 5 下， 不同油剂间的活孢率下降幅度差异较大，贮存满6 个月时大多维持在4 0 5 0 ，仅 油剂h ( 白油2 6 # 甲基硅油= 3 i ) 军dj ( 石蜡轻油甲基硅油= 1 ，1 ) 的活孢率分别达到 7 5 3 芹1 38 0 7 ，而油剂1 ( 白油2 6 # 甲基硅油= 1 1 ) 、t ( 白油2 6 # 花生油= 1 1 1 ) 、c ( 白 油1 0 # ) 和f ( 石蜡轻油甲基硅油= 3 1 ) 的活孢率仅剩2 0 3 0 ；油剂k ( 白油l o # 甲 基硅油= 1 1 ) 在5 5 个月时就未检测到萌发的孢子。然而，恒温2 54 c 的贮存试验受到 2 0 0 4 年夏季杭州因电荒经常被拉闸限电的严重影响，原计划进行一年的贮存观察不 得不中断，因而其观察结果只能作为相同条件下的参考，不宜作为结论。 关键词：球孢自僵菌，孢子粉贮存，含水量，温度，货架寿命，存活衰变模型 油剂，粘度，雾滴分散性，生物相容性，活孢率 1 球孢白僵菌分生孢子制剂的生物学研究现状 1 1 球孢白僵菌概述 球孢白僵菌b e a u v e r i ab a s s i a n a ( b a l s a m o ) v u i l l e m i n 是最常见的昆虫病原真菌， 其菌落呈绒状、丛卷毛至粉状，有时呈绳索状，但很少形成孢梗索；菌落培养初期 多呈白色，稍后变成淡黄色，偶成淡红色；背面无色，或淡黄色至粉红色。分生孢 子梗多着生在营养菌丝上，粗1 2g m ，产孢细胞( 瓶梗) 浓密簇生于菌丝、分生孢子 梗或膨大的泡囊( 柄细胞) 上，球形至瓶形，颈部明显延长成粗1g m 、长达2 0i t m 的 产孢轴，轴上有小齿突，呈膝状弯曲( “之”字形弯曲) 。产孢细胞和泡囊常增生，在 分生孢子梗或菌丝上聚成球状至卵状的相当密实的孢子头。分生孢子球形或近球 状，透明，光滑，2 - 3 2 2 5g m ( 蒲蛰龙和李增智，1 9 9 6 ) 。 球孢白僵菌可通过穿透昆虫的体壁、呼吸道和消化道而感染寄主。其中，穿透 体壁是最主要的感染途径，此过程包括孢子在昆虫体壁上吸附、萌发产生芽管、借 助于胞外酶等因素的作用穿透昆虫体壁，然后菌丝在寄主血腔中快速繁殖，终因耗 尽营养而导致寄主死亡( f e n ge ta l ，1 9 9 4 ；翟锦彬等，1 9 9 5 ) 。球孢白僵菌的寄主范围 极广，可侵染1 5 个目中1 4 9 科的7 0 0 余种昆虫及6 科的1 0 余种蜱螨( 蒲蛰龙和李增 智1 9 9 6 ) 。 长期以来，球孢白僵菌受到广泛关注和深入研究。上世纪六十年代以后，人们 逐渐认识到化学杀虫剂对生态环境的破坏性以及化学杀虫剂的残留污染对人类自 身健康的影响( 冯明光，1 9 9 8 ) ，便开始努力发展有效的替代防治方法，以利植物保护 的可持续发展( g o e t t e le la 1 ，1 9 9 5 ) 。在这种背景下，球孢白僵菌因具有寄主范围广、 致病力强、无公害、不污染环境( 徐庆丰，1 9 9 1 ) 、易于培养生产等优点( 蒲蛰龙和李 增智，1 9 9 6 ) 以及在害虫防治中显示出的潜力而日益受到世人关注( f e n ge t a l ，1 9 9 4 ) 。 球孢白僵菌的侵染体有分生孢子、芽生孢子、菌丝体三种形式。其中，分生孢 子是最常见的侵染体，被加工成多种剂型。球孢自僵菌分生孢子制剂可依赖一定的 施用技术( 喷雾法、喷粉法、撒施法) ，将白僵菌引入靶标环境中去，通过不同应用 方式( 杀虫剂式放菌、引种定殖、接种式放菌) 防治多种农林和卫生害虫( 蒲蛰龙和李 增智，1 9 9 6 ) 。迄今，世界上相继注册了数十个球孢白僵菌分生孢子产品( 李增智， 1 9 9 9 ) 。然而，球孢白僵菌在应用中也暴露出杀虫速度较慢及受气候影响较大等弱点 ( i n g l i se ta l ，1 9 9 7 ) 。制剂生产国正在为选择合适的剂型，增强球孢白僵菌孢子的环 境抗性和对寄主的有效攻击能力作不懈的努力( g o e t t e le t a l ，1 9 9 5 ) 。我国的白僵菌生 产、使用虽然已有4 0 多年的历史，在剂型的研究和商业化过程方面也取得了显著 成果，但与世界上现有的水平有一定差距。 1 2 含水量与温度对生防真菌孢子贮存寿命的影响 害虫生防真菌侵染体( 孢子、菌丝等) 的有效贮存在很大程度上决定着生防菌剂 研发的成功与否，因为侵染体是生防真菌制剂的杀虫活性成份。一般认为孢子粉含 水量和贮存温度是影响球孢白僵菌孢子粉贮存寿命的重要因素( f e n g e ta l ，1 9 9 4 ；杨 敏芝等，1 9 9 4 ；殷凤鸣等，1 9 9 6 ) 。其含水量作为影响孢子活性的重要参数而倍受重 视，因为孢子粉含水量过高会导致孢子提前萌发和自溶( f e n ge ta i ，1 9 9 4 ；王成树， 1 9 9 6 ) ，含水量在l o 以下的自僵菌制剂有利于孢子活力的保持( 2 e 成树，1 9 9 6 ；李农 昌等，1 9 9 6 ) 。冯明光和应盛华( 2 0 0 2 b ) 研究发现，球孢白僵菌孢子粉含水量和贮存温 度通过交互影响内贮总糖和蛋白质的代谢水平而影响孢子活力，贮存中孢子粉的活 孢率与内贮营养物质的代谢水平显著或极其显著相关。如在4 。c 下含水量1 5 的自 僵菌孢子粉仅能贮存6 个月，而含水量降至8 贮存1 年，活孢率仍达8 1 3 ，故孢 子粉含水量不超过1 0 才有利于贮存( 殷风鸣，1 9 8 3 ) 。 国外学者对黄绿僵菌m e t a r h i z i u mf i a v o v i r i d e ( g a i n s & r o z s y p a l ) 贮存条件研究 较深入，发现未经干燥的新鲜孢子粉在1 7 c 年n8 下贮存，分别经历9 周和3 2 周后 活孢率均下降至4 0 以- r ：而经硅胶干燥保存的孢子粉在相同条件下贮存1 2 7 周后， 活孢率仍分别达6 0 年e i8 0 ，1 6 0 周后还分别有4 7 和6 8 ( m o o r ee ta 1 ，1 9 9 5 ) 。将 干燥的黄绿僵菌孢子粉及其油剂( 油中加入孢予粉) 分别在1 0 - 1 4 。c 和2 8 - 3 2 。c 的变温 条件下进行贮存，8 0 天后油剂中的活孢率在两种变温下分别为9 6 和8 5 ，同期孢 子粉的活孢率在较低变温下为9 5 ，而在较高变温下活孢率仅剩2 7 ( m o o r ee ，a i ， 1 9 9 6 ) 。通过对7 株球孢白僵菌不同含水量( 2 3 - 3 2 ) 的孢子粉在1 0 、2 0 、3 0 、4 0 及 5 0 c 的梯度恒温下贮存的活孢率观察及模拟分析，5 左右的含水量被认为有利于贮 存( h o n ge t a l ，2 0 0 1 ) 。 1 3 球孢白僵菌分生孢子油剂 剂型是指以特定工艺程序将原药( 有效成分) 及各种组分按一定比例加工制备而 成的产品形式。为了更好地利用白僵菌孢子防治特定环境中的靶标害虫，延长孢子 粉储存期并提高其环境稳定性，球孢白僵菌的分生孢子已被加工成多种剂型，或用 于田问小规模试验，或被广泛应用。到目前为止，剂型的种类有粉剂、可湿粉剂、 乳剂、油剂、颗粒剂及胶囊剂等。为了使制剂具备某些特性，有必要在制剂中添加 湿润剂、紫外保护剂、增效剂等添加剂。 目前，比较有发展前景的改进方法是将分生孢子制成油剂，这样真菌制剂比较 稳定、高效且易于投入使用，代表了一种生物防治方法的巨大改进。与传统的丝孢 类真菌( 球孢白僵菌等) 使用孢予悬浮液形式相比，这种制备方式具有明显的优势。 油剂是指用油将自僵菌孢子粉稀释成悬液的剂型。八十年代初，我国广东省在开展 白僵菌超低容量喷雾杀虫的研究时，应用二线油作为稀释剂防治马尾松毛虫取得显 著效果( 殷风鸣，1 9 8 1 ；潘务耀等，1 9 8 8 ) ，但因油剂中的二线油为石油精炼中煤油的前 体，来源不广，也没有定型的商品供应，大批量使用二线油生产白僵菌油莉有定 的困难( 王成树，1 9 9 6 ) 。李农昌等( 1 9 9 6 a ) 研究了球孢白僵菌高孢粉与菜籽油、米糠油、 五角枫油、蓖麻油、胡麻油、芝麻油、棕裥油、石蜡油和s 油九种油品的生物相容 性。结果表明分生孢子能与所试的油品良好相容，易形成单孢分散状态。但其中棕 榈油具有易凝固的缺点，不宜使用。国外曾使用椰子油作为稀释剂生产白僵菌分生 孢子油齐l j ( p r i o r & j o l l a n d s ，1 9 8 8 ) 。 油( 植物油和矿物油) 与亲脂性的孢子相容性良好，而且还是良好的喷洒助剂。 植物油( 如向日葵、花生等) 具有有机物产生系统的优点，但是它们易变质，也会残 留下粘性物质而堵塞喷洒装置( b u t te ta 1 ，2 0 0 1 ) 。矿物油中很多成分具有生物活性， 且粘度不大，因而矿物油作为超低容量油剂的溶剂便引入注目( 刘步林，1 9 9 8 ) 。相对 而言，石蜡油挥发快，也只留下少量残留物，它们常用于降低植物和矿物油的粘性， 使其更易流动( b u t te ta 1 ，2 0 0 1 ) 。油剂的缺点是重量过大( 因此运输费高) ，有些植物 油含有植物性毒素，所以在使用中要谨慎。 白僵菌油剂与粉剂相比杀虫效果显著，主要是油剂粘着力强，渗透性好，破坏 虫体表皮蜡质层和几丁质，有利于芽管侵入。真菌孢子油剂比传统的水质悬浮剂更 有传染力( b a t e m a n & a l v e s ，2 0 0 0 ) ，如油可充分提高真菌除草剂的效果( a m s e l l e me t a i ，1 9 9 0 ) 。而且油有良好的分散性和附着性，其可提高对寄主的效果：( p r i o re ta 1 1 9 8 8 ； i b r a h i me t a l ，1 9 9 9 ) 。针对蝗虫的研究表明，在不同的温湿度条件下，相对于气生孢 子水剂，油剂的效n ：更好( p r i o re ta l ，1 9 8 8 ；b a t e m a ne ta 1 ，1 9 9 3 ；f a r g u e se ta l ，。1 9 9 7 ； i b r a h i me t a l ，1 9 9 9 ) 。最普遍的原理是由于昆虫表皮的亲脂性，油滴比水滴的粘附性 更好。而且，接触表皮后，油分散的很快，可携带那些孢子进入一些因不适应孢子 生长而被保护的虫体部分( b u t te ta 1 ，2 0 0 1 ) 。此外，油剂比起水剂更有利于雾滴与蜡 质叶片表面的接触，提高了雾滴的持效性和附着力。 普遍使用当地易获得的植物油，并用种石蜡轻油来稀释，降低其粘度，而提 高液体使用的特性。油剂降低了孢子脱水的可能，与水剂相比，具有提高杀虫效果 和速度，特别是在低湿条件下，并形成适宜于u l v ( u l t r a l o wv o l u m e ) 超低容量技 术和c d a ( c o n t r o l l e dd r o p l e ta p p l i c a t i o n ) 雾滴控制应用技术的理想混合物，挥发性 降低( r h i n d ，2 0 0 0 ) ，且大面积的应用剂量一般只需要3 5 l h a ( m u k u n de ta 1 ，2 0 0 1 ) 。 超低容量喷雾，具有浓度高，喷量少，工效高、省药、药效高等特点。浓度一般为 百分之几十，雾滴小，直径一般为7 0 “m ( 地面超低容量喷雾防治害虫的最佳粒径) ， 而常规喷雾的雾滴直径多在2 0 0 3 0 0 肛m 以上( 刘步林，1 9 9 8 ) 。p r i o re ta 1 ( 1 9 8 8 ) 发现 球孢白僵菌油剂在超低容量喷雾应用中成活率更高，比水剂更易侵染p a n t o r h y 阳s p l u t u s ，其原因可能是油刹更易于附着于亲脂性的昆虫表皮。含孢量高的油质雾清比 含孢量低的水质雾滴更能耐光、耐温、抗雨，因而残效期也要长些，防治适期也可 以宽些，特别是作物附着的药剂接近原药，其挥发熏蒸作用大害物接触到药剂时， 药剂能很快向有害物体内浸入或渗透，提高了防治效果( 刘步林，1 9 9 8 ) 。 试验证明以零号柴油( 市售) 作为9 5 1 油剂的稀释剂，需随配随用，混合后立即 使用对孢子的萌发无显著影响，但放置7 2h 后孢子萌发率为0 ；且柴油稀释后的孢 子粉具有良好的悬浮性，此特性为喷雾的匀质性奠定了基础( 李农昌，1 9 9 6 e ) 。 1 3 。1 粘度 粘度是液体分子间的内摩擦力。常用分类有动力粘度( 1 ) 和运动粘度( 1 ) ) 。动力粘 度“) 定义为面积各为lc m 2 且相距1c n 的两层液体以le m s 的速度相对运动时产 生的内摩擦力。动力粘度的单位是厘泊c p s ( c e n t i p o i s e ) ，1c p s = 1 1 0 0 0 p a s 。我国 常用的粘度单位为厘斯或称厘沱，即运动粘度( u ) 等于液体的动力粘度与同温度下液 体密度( p ) 之比= q p ) ，显然它与温度有关。运动粘度1 ) 的单位是m m 2 s 或者是c s t ( c e n t i s t o k e s ) 。 油剂的粘度主要取决于溶剂的牯度。其粘度受气温的影响愈小愈好，以避免因 气温有变化而影响药液通过药械调量孔的流速( 刘步林，1 9 9 8 ) 。粘度直接影响萌发 和分散的流动性，事实上，粘度、萌发、分散性是相互作用的，如果其中任意一个 因子发生变化，其它也会改变( s o p e r w a r d ，1 9 8 1 ) 。药液粘度高就难于雾化，雾滴 大小随着药液粘度的增高而增大。同样是每公顷喷洒4l 药液，粘度从1 0 p a s ( 1 c p s ) 增加到4 5 x 1 0 p a s ( 4 5c p s ) ，雾滴中径由1 2 0l a m 增大到2 0 0p m ，小雾滴减少， 大雾滴增多，雾滴总数随之减小，单位面积上雾滴覆盖密度大大减小。通常，超低 容量油剂一般控制粘度( 2 0 ) 在2 5 8 01 2 1 1 t 1 2 s 范围内( 刘步林，1 9 9 8 ) 。提高液体粘度 将延迟其沉淀，许多粘度缓和物是生物多糖( s o p e r & w a r d ，1 9 8 1 ) 。 1 3 2 雾滴密度 在单位面积上沉积的雾滴数量，就叫做雾滴覆盖密度，常以作物表面上每平方 厘米覆盖多少个雾滴来表示。雾滴覆盖密度与药效密切相关，一般说，在一定数值 范围内，覆盖密度愈高则药效愈好。覆盖虽不要求完全，但必须均匀。雾滴采集方 法，通常采用油敏纸和氧化镁薄板采集雾滴。此法多数用于测定雾滴覆盖密度，很 少用于测定雾滴直径，因为纸卡上的雾滴斑点比原雾滴要大得多，不同大小的雾滴 和不同质量的纸卡，雾滴扩系数差异很大，必须通过测定求得( 刘步林，1 9 9 8 ) 。 一般化学农药以喷油剂雾滴密度l o 个c m 2 和水刺2 0 个c m 2 为合格。但是，防 治病虫有效的雾滴覆盖密度还受农药品种、浓度、雾滴大小、防治对象等而有所不 同，例如采用体积中径7 0u m 的2 5 乐果油剂雾滴，防治小麦蚜虫有效雾滴覆盖密 度为3 4 个c m 2 ，防治稻飞虱为1 0 个c m 2 ，采用体积中径7 0u m 的2 5 敌百虫油剂 雾滴，防治低龄粘虫( 3 龄以下) 有效雾滴覆盖密度为8 1 0 个c m 2 ，防治4 龄以上粘 虫为1 5 个c m 2 ：而采用2 5 马拉硫磷油剂防治低龄粘虫则要2 0 个c m 2 以上；同为 2 5 辛硫磷油剂的雾滴，防治麦株上的低龄粘虫的有效雾滴覆盖密度为8 。1 0 个c m 2 ， 防治棉花上的棉铃虫为2 0 3 0 叶 c m 2 ( 刘步林，1 9 9 8 ) 。 9 1 3 3 雾滴大小和含孢量 理论上认为大油滴可显著降低生物防治在环境方面的积极作用( b a t e m a n & a l v e s ，2 0 0 0 ) 。s m i t he ta 1 ( 1 9 7 7 a ) 发现9 0l a m 的雾滴比1 8 0 或2 7 0g m 的雾滴有更好 的效果。喷洒直径 0 o s ) ；次高含水量处理在第1 8 个月的活孢率才显著低于其 它较低含水量处理，但也维持9 0 的水平；最高含水量处理0 4 】) 的活孢率则从第6 个月起显著低于其余较低含水量处理，至第1 2 个月时降至2 4 2 ( 3 8 ) ，此后活孢率检 测为零。而在2 5 下，第3 和第6 个月的活孢率观察值在不同含水量处理间均呈极显 著差异，即随含水量升高而显著下降。 表2 1 含水量对球孢白僵菌孢子粉在4 c ； 1 12 5 下贮存期间活孢率的影响 t a b l e2 1t h ee f f e c to f w a t e rc o n t e n to nt h ev i a b i l i t yo f bb a s s i a n ae o n i d i as t o r e da t4a n d2 5 。c 1 1 2 9 8 3 o 5 a9 3 7 + 29 a9 3 5 1 5 a9 5 8 i 5 a 9 2 5 - + 1 2 a9 4 5 + 0 6 a 9 08 i 4 a 5 6 7 7 5 a 4 7 39 63 + 0 6 a9 1 3 0 6 a9 2 3 1 7 a9 4 ，0 + - l _ 0 a 9 4 5 - + 0 6 a9 4 8 - + 1 3 a8 9 6 o5 a b5 1 3 - + 4 1 a 7 2 3 9 7 2 o 4 a9 0 4 + l ，4 a9 3 2 + 2 5 a9 28 05 a9 2 8 - + 0 6 a9 1 9 - + 1 ，5 a b8 0 0 - + 6 5 b e2 40 25 b 98 49 7 3 0 6 a 9 2 2 - + 2 1 a9 1 2 o 9 a9 2 7 0 6 a9 24 2 5 a9 0 0 - + 1 4 b 7 4 9 i l 2 c 1 7 6 - + 1 5 b 1 4 1 1 9 7 1 o 9 a8 61 0 4 b7 7 9 1 7 b2 42 - + 3 8 b f - t e s t f 4 8 2 3 , 5f 4 ，8 2 1 4 8f 4 8 2 6 0 7f j 8 2 9 6 i 凡，6 2 18 f 3 ，6 2 8 , 9凡，6 = 1 3 0f 3 ，6 = 5 93 尸= 00 6p o ，0 1j d o 0 1p o 0 1p = o 2 5p = 0 0 lp 0 0 l_ p 0 0 l 。m e a n sf o l l o w e db yd i f f e r e n tl o w e r c a s el e t t e r si ne a c hc o l u m nd i f f e r e ds i g n i f i c a n t l yf 尸 oo s ) b a s e do nt u k e y s h s d sa f t e ro n e w a ya n o v a 为了更清楚地分析贮存温度的影响，对各含水量孢予粉在44 c 和2 5 。c 下贮存期f 刚历 次抽样检测的活孢率进行双向分组方差分析，结果列于表2 2 。显然，在给定含水量下， 贮存温度r 、时间l 及其互作( a 功都对活孢率产生极显著影响；4 下冷贮历次检测 的活孢率总平均值总是显著高于2 5 * ( 2 下同期贮存的活孢率。由于2 5 。c 下不同含水量孢 子粉的贮存结束于不同时n ( n2 1 ) ，故分析中4 下的数据也按前者结束时间截止，以 便比较。 2 3 2 活孢率与含水量及贮存时间的关系 将各贮存温度下历次抽样检测获得的活孢率( k ) 对贮存时间( l ；月数) 和孢予粉含 水量( 巳) 进行模型拟合分析，发现具有y = i 1 + a e x p ( b x ) 形式的存活衰变模型稍加变 形，即可很好地拟合上述变量之间的关系。由此，获得球孢白僵菌孢子粉在4 * u 下冷贮 表2 2 贮存温度( 乃、贮存时间( 功及其互作( a 疋) 对球孢白僵菌不同含水量孢子粉活孢率的影响 t a b l e2 2t h ee f f e c t so fs t o r a g et e m p e r a t u r e ( 乃a n dt i m e ( 五) a n dt h e i ri n t e r a c t i v ee f f e c t ( a 功o nt h e v i a b i l i t yo f bb a s s i a n ac o n i d i aw i t hag i v e nw a t e rc o n t e n t 。p a i r e do v e r a l lm e a n sf o l l o w e db yd i f f e r e n tu p p e r c a s el e u e r sd i f f e r e ds i g n i f i c a n t l y ( p 00i ) b a s e do i l t u k e y s h s d sa f t e rt w o w a ya n o v a 的活孢率模拟模型 k = l ( 1 + o 0 1 5 5 e x p ( 一0 0 5 2 0 + o 0 0 2 3 c ：) t 该模型两个自变量对因变量变异的确定率达8 5 8 5 ( r z = o 8 5 8 5 ，f 41 3 5 = 4 0 95 ， p 0 o 0 0 1 ) ，各参数模拟值的r 检验均达到极显著水平。类似地，在2 5 下贮存的孢子 粉活孢率的模拟模型为 = 1 1 + 0 , 0 6 4 2 e x p ( 0 ，2 7 1 8 + o0 0 5 2 c 。a ) l 】 其自变量对因变量变异的确定率达8 6 4 5 ( r 2 = 0 8 6 4 5 ，f 4 8 i = 2 5 83 ，p 11 0 0 亿儋，含水量 5 ) 。 3 2 1 2 油助剂 供试食用油和矿物油种类及来源见表3 1 所列。 3 2 1 3 油剂制备 将孢子粉加入各种载体油中，使其终浓度为1 0 9 个孢子m l 左右。然后将上述油剂在室温下，用8 5 2 型恒温磁力搅拌器( 上海志威电器有限公司) 搅拌5h ( 2 0 0r m i n ) ，使其油剂混匀。 3 2 2 油剂筛选方法 3 2 2 1 油剂粘度的测定 用旋转粘度计( v i s c os t a rp l u s ，f u n g l a bs a ，s a n t 表3 1 载体油的种类及来源 t a b l e3 1t h es o u r c e sa n dt y p e so fo i p r o d u c t su s e di nt h es t u d y a n t o n i ，s p a i n ) 预, l j 定各待测油品的粘度，单位为厘斯( c s t ) 。 3 2 2 2 油剂雾滴的物理特性测定 将五片1 8 1 8m l n 的盖玻片置于培养i t ( o = 9c m ) ，盖玻片底面用少量的双面胶固 定，把培养皿放于喷塔( p o t t e rs p r a yt o w e r , b u r k a r ds c i e n t i f i cl t d ，m i d d x ，u k ) 底部，各 取1 0 0 l 的油剂于喷塔上的容器中，在0 7k g ，c m 2 的空气压力下喷雾。将喷雾好的盖玻 片正面朝上的至于载玻片上，在2 0 0 倍显微镜( l e i c ad m r ，l e i c am i c r o s y s t e m sw e t z l a r g m b h ，g e r m a n y ) 下( o 8 6 5 9m m 2 视野) 观察摄影( l e i c ad cc a m e r a s ) ，启动软件( l e i c ad c t w a i ns o f t w a r e ) 统计油滴数，测量直径大小，并计数油滴中的孢子总数及其单孢分散数。 3 2 2 _ 3 载体油与孢子的相容性 将孢子粉加入a 一0 各载体油中，使其终浓度为1 0 8 个孢子m l 左右。然后将上述浊 剂在室温下，用8 5 2 型恒温磁力搅拌器搅拌5h ( 2 0 0r m i n ) ，使其混匀。再将各孢子油 悬液置于试管中，在室温下头3 周每1 周取样测定其萌发率，此后隔一个月再抽样测定， 比较各组分的差异性。每次取样前先将试管在振荡器上振荡数分钟，分散均匀后各取一 滴油液样品于含0 5 o p ( 乳化剂) 的1 0m l 营养液( 由蔗糖2 和蛋白胨0 ，5 组成) 中， i _ g 温( 2 5 + 1 ) 振荡( 1 0 0r m i n ) 培养2 4h ，用血球计数器计数发芽和未发芽的孢子数，重 复取样测定3 次，计算营养液中孢子萌发率。可见芽管长度等于或大于孢子直径的所有 孢子视为萌发( h o n ge t a l ，2 0 0 1 ) ，萌发率视为活孢率。 3 2 3 数据处理 所获观察测定数据采用完全随机单因素试验统计分析，软件为d p s 数据处理系统 ( 唐启义和冯明光，2 0 0 2 ) 。 3 3 结果与分析 3 3 i 油剂粘度 孢子油剂的粘度因油的种类不同 而异，详见表3 2 所列。方差分析表明， 粘度在不同油剂间的差异极其显著 ( f 41 3 = 5 6 4 1 6 4 4 ，p 0 0 1 ) ，l 和k 的粘 度分别最高和最低，而多数油剂的粘 度范围为1 2 0 1 5 0c s t 之间。l 的粘度 高达5 3 3c s t ，流动性较差，不易喷出。 3 3 2 油剂雾滴的物理特性 油滴直径大小分布a o 各孢子 油剂在自动喷塔相同工作压力下喷雾 条件形成的雾滴直径大小及比例分布 见表3 3 所列。其中l 因粘度过大， 喷雾极不连贯和均匀，喷出物多粘连 表3 2 球孢白僵菌分生孢子不同油悬液在2 3 6 下 的粘度 t a b l e3 , 2t h ev i s c o s i t i e so fd i f f e r e n to i ls u s p e n s i o n so f 曼b a s s i a n ac o n i d i aa t2 3 6 。c 成团。相反，k 因粘度过低，形成的雾滴过小过密而相互连接成片。其它孢子油剂喷雾 后 4 0 0 油剂雾滴含孢总数和单孢数在不同孢子油剂形成的茎4 0g m 、4 0 1 2 0u m 和 1 2 0 - - 4 0 0l - t m 雾滴中，每雾滴含孢量的差异都不显著( j p o 0 5 ) 。在4 0 1 2 0g m 的雾滴范 围内，油剂f 的含孢量最多，平均达到2 8 6 个孢子雾滴：a 含孢量最少，仅1 29 个孢 子雾滴。在4 0g m 的雾滴中，含孢量一般仅1 2 个