（分析化学专业论文）扫描电化学显微镜细胞双信息成像研究.pdf

山东人学顾t 学位论文 中文摘要 前言首先对扫描电化学显微镜( s e c m ) 的实验装置和工作模式进行了简要的 介绍。然后就s e c m 的下述两个方面进行了较详细的介绍。1 介绍了s e c m 探头 的发展。2 介绍了s e c m 在细胞和酶分析方面的应用。 第一章制作了双会微米电极，对其进行了表征，并与单根会微米电极的表 征结果进行了比较，结果显示两者无显著性差异。并将此电极用作s e c m 的探 头分别作了向导体基底和绝缘体基底的探头逼近曲线，与理论曲线拟合后基本 重合，说明我们做的双电极能用作s e c m 实验中。 第二章用扫描电化学显微镜同时成像单个活细胞内的过氧化物酶活性和细胞 形貌。首先，用s e c m 的收集模式确定了测定p o 的最佳条件。又利用毛地黄皂 苜( d i g ) 能溶解细胞膜i 二的胆固醇的性质，在细胞膜上产生微孔细胞内的大分 子( 如酶) 仍然破禁饲在细胞内部，而小分子物质( 如酶的底物和产物) 则可以 进出细胞。经过d i g 处理后的细胞仍能存活。当溶液中加入p o 的底物( h 2 q 和 h 2 0 2 ) 后，它们可以扩散到细胞内，并在细胞内p o 的催化下反应生成b q 和水。 将双电极探头的一支电极的电位恒定于b q 发生还原反应的电位，用s e c m 就可 以测得细胞周围b q 在探头上产生的电流，获得细胞表面b q 浓度分布的形貌图。 同时溶液巾加入k 4 f e ( c n ) 6 ，将另一根电极的电位恒定于k 4 f e ( c n ) 6 发生氧化反应 的电位，当探头扫过细胞时，由于细胞有一定的高度，所以k 4 f e ( c n ) 6 的氧化电流 会有所降低( 此时细胞相当于一个绝缘体基底) ，从而测得了细胞的形貌。 第三章j f ls e c m 同时测得了单个鼠肝细胞中的碱性磷酸酶( a l p ) 和细胞 的呼吸活性。首先用收集模式确定了检测a l p 的最佳条件。用毛地黄皂苷( d i g ) 对细胞进行穿孔。然后加入酶的底物( p a p p ) ，在a l p 的催化水解下生成p a p 。 将双电极探头的会电极电位恒定于p a p 发生氧化反应的电位，用s e c m 就可以测 得细胞周围p a p 在探头上产生的电流，从而测得细胞内a l p 的活性。同时固定另 一根电极( 铀屯极) 的也位为0 2 发生还原反应的电位，出于细胞呼吸要消耗氧， 所以细胞周围0 2 的浓度要比本体溶液的低，由此我们就可以通过测定细胞周围 0 2 浓度的变化而引起的探头电流的变化来获得细胞的呼吸活性信息。 关键词：扫描电化学显微镜，双电极，过氧化物酶，碱性磷酸酶 山东大学硕士学位论文 a b s t r a c t i nt h ep r e f a c e ，f i r s to fa l l ，t h eb a s i ca p p a r a t u s ，t h eo p e r a t i o nm o d e so fs c a n n i n g e l e c t r o c h e m i c a lm i c r o s c o p y ( s e c m ) w e l ei n t r o d u c e db f i e f l y t h e n , t h et i p si ns e c m i n c l u d i n gu l t r a m i c r o e l e c t r o d e ( m 旺) ，d u a le l e c t r o d e ，c h e m i c a lm o d i f i e de l e c t r e d e s , i o n i cs e l e c t e dm i c r o e l e c t r o d e ( i s m e ) e t c 。a n dt h ea p p l i c a t i o n so fs e c mi nt h e i n v e s t i g a t i o nf o rc e l l sa n da l z t m ew e r er e v i e w e d i nt h ef i r s tp a r t , d u a l - a ue l e c t r o d e sw 啪f a b r i c a t e da n de h a r a c t e l j z e d ，c o m p a r e d w i t hs i n g l ee l e c t r o d e t h e r ei sn om a r k e dd i f f e r e n c ebe | nt h e m t h e na p p m a c h c u r v e sf o rt h ed u a l - a ue l e c t r o d e so v e rb o t hi n s u l a t i n ga n dc o n d u c t i v es u b s l x a t e sw e r e o b t a i n e dn u m e r i c a l l y b yf i t t i n ga ne x p e r i m e n t a lc u r r e n t d i s t a n c ec u r v et ot h e o r e t i c a l c u r v e s ，i t i sf o u n d e dt h a tt h et w oc u r v e s c o i n c i d e ，w h i c hd e m o n s t r a t e so u r d u a l - e l c e t r o d e sc a nu s e di ns e c m e x p e r i m e n t s i nt h es e c o n dp a r t , p e r o x i d a s o 口o ) i nas i n g l en e u t r o p h i lc e l la n dt o p o g r a p h ya r c h ：n a g e d 砒t h ef l a m et i m e f i r s to f a u t h eo p t i m u mc o n d i t i o no f d e t e c t i o nw a s1 0 0 x 1 0 。 m o l lh 2 q ，1 0 0 x 1 0 - 3m o l lh 2 0 2f o rs u b s t r a t ea n dp b sf o rb u f f e r d i g i t i o u l np i g ) i n p b sc o u l dd i s s o l v ec h o l e s t e r o lo nt h ec e l lm e m b r a n ea n df o r mm i c r o h o l eo ni t s u c h l o wm a s sm o l e c u l e sc o u l dp a s st h r o u g ht h em e m b r a n ew h i l em a c r o m o l e c u l e ss u c ha s f f f l z y m e w e r es t i l lw i t h i nt h ec e l l ( t h ec e l li ss t i l ll i v ea f t e rt r e a t e dw i t h d i g ) c o n s e q u e n t l y , h 2 qa n dh 2 0 2c o u l de n t e rt h ec e l la n dr e a c tu n d e rt h ec a t a l y s i so f p ot op r o d u c eb qa n dh 2 0 w h e nt h e 卸m o v e da b o v et h es u r f a c eo fs u b s t r a t e , w h i c h i m m o b i l i z e dc e l l sw i t hc o l l a g e n , i tc o u l dd e t e r m i n et h ec h a n g e so f t h ec o n c e n t r a t i o no f b q ，f i n dc e l l sa n dd e t e c tt h ea c t i v i t yo fi n t r a c c l l u l a rp ob ys e c m a tt h es a m et i m e ， 1 o o x l 0 - 3 m o l lk 4 f e ( c n ) 6w e r ea d d e di nt h es o l u t i o n i m m o b i l e dt h ep o t e n t i a lo f t h e o t h e re l e c t r o d eo f d u a l - a ue l e c t r o d e st ot h ep o t e n t i a lt h a tk 4 f e ( c n ) 6i so x i d a t e d w h e n t h e 缸pm o v e da b o v et h es u r f a c eo f c e l l ，t h eo x i d a t i o nc u r r e n tw i l lr e d u c eb e c a u s eo f t h e h e i g h to f c e u t h e nt h et o p o g r a p h yi sd e t e r m i n e d i nt h et h i r dp a r t , a l k a l i n ep h o s p h a t a s e ( a l p ) i nas i n g l er a tl i v e rc e l la n da c t i v i t yo f r e s p i r a t i o na r ed e t e r m i n e da tt h e 鼠蚰et i m e f i r s to fa 1 1 t h eo p t i m u mc o n d i t i o no f d e t e c t i o nw a s7 5 x 1 0 - 4 m o l l p - a m i n o p h e n y l p h o s p h a t e ( p a p p ) f o rs u b s t r a t ea n dp b sf o r b u f f e r a f t e rt r e a t e dw i t hd i g p a p pc o u l de n t e rt h ec e l la n dr e a c tu n d e rt h ec a t a l y s i so f 山东大学硕士学位论文 a l pt op r o d u c ep - a m i n o p h e n o l ( p a p ) w h e nt h et i pm o v e da b o v et h es i i r f h c eo f s u b s t r a t e ，w h i c hi m m o b i l i z e dc e l l sw i t hc o l l a g e n , i tc o u l dd e t e r m i n et h ec h a n g e so f t h e c o n c e n t r a t i o no fp a p , f m dc e l l sa n dd e t e c tt h ea c t i v i t yo fi n t r a c e l l u l a ra l p b ys e c m a tt h es a m et i m e t h eo x y g e na r o u n dt h ec e l lw i l ld e c r e a s eb e c a u s eo ft h er e s p i r a t i o no f c e l l w h e nt h et i pm o v ea b o v et h ec e l l ，t h er e d u c t i o nc u r r e n to f o x y g e nw i l ld e c r e a s e s ot h a tw ec a nd e t e c tt h ea c t i v i t yo f r e s p i r a t i o no f c e l l k e y w o r d s ：s c a n n i n ge l e c 仃o c h e m i c a lm i c r o s c o p y , d u a l - e l e c t r o d e ，p e r o x i d a s e ，a l k a l i n e p h o s p h a t a s c 山东人学碗f 。学位论文 a f m a l p b q b s a d d i g e f g d g o x h r p h 2 q b l t i t i s m e ，r 疗 o p 0 1 ) a p p a p p p b s r s e c m s p m s t m u m e 符号与缩写 原子力显微镜 碱性磷酸酶 l ，4 苯醌 牛j 6 l 清白蛋白 扩散系数 毛地黄皂苷 探头电位 法拉第常数 戊二醛 葡萄糖氧化酶 辣根过氧化物酶 对苯二酚，氢醌 基底的电流 探头上的i 乜流 探头上的稳态扩散电流 离子选择性微电极 探头的校i f 电流( = 州札。) 校币距离( = d a ，吐探头与基底的距离；口，探头的半径) 氧化还原反应的电予转移数 氧化态介质 髓过氰化物酶 对氨基苯酚 对氨基苯磷酸擎酯 细胞等渗液 还原念介质 扫描电化学显微镜 扫描探针显微镜 扫描隧道显微镜 超微电极 原创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独 立进行研究所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不 包含仃何j 他个人或馔体已经发表或撰写过的科研成果。对本文的研 究f 1 ；出重要员献的个人和集体，均已在文叫j 以明确方式标明：本人完 全意识到本声明的法律责任由本人承担。 论文作者签名：鳌銎堑 日期：型：! ： 关于学位论文使用授权的声明 本人完伞，解l l i 东大学有关保留、使j 1 j 学位论文的规定，同意学 校保留或向国家有关部f j 或机构送交论文的复印件和电子版，允许殓 文破查阅和借阅；木人授权l j i 东大学可以将本学位论文的全部或部分 内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或其他复制手段 保存论文昶l 亍| j 编本学位论文。 ( 保密论文在解密后戍遵守此规定) 论文作者签名：! 墅墨圣：导师签名：纽蚯日期：銎竺主：篮 山东大学碗i ：学位论文 前言 l 扫描电化学显微镜简介 扫描电化学显微镜( s c a n n i n ge l e c t r o c h e m i c a lm i c r o s c o p e ，s e c m ) 是8 0 年 代未由b a r d 小组【1 】在超微电极( u m e ) 和扫描隧道显微镜( s t m ) 【2 】的基 础上提出和发展起来的一种新型扫描探针显微镜技术( s p m ) ，它是一种分辨率 介于普通光学显微镜与扫描隧道显微镜之白j 的电化学现场检测技术。与s t m 和 原子力显微镜( a f m ) 不同，s e c m 基于电化学原理工作，可测量微区内物质 氧化或还原所给出的电化学电流。它把一支能够进行三维移动的超微电极作为 探头插入电解质溶液中，在离固相基底表面非常近的位置进行扫描，来研究基 底的形貌和固液界面的电化学性质。由于其具有化学灵敏性，不但可以用来研究 探头与基底上的异相反应动力学及探头和基底之白j 溶液层中的均相反应动力学， 分辩电极表面微区的电化学不均匀性，给出导体和绝缘体表面的形貌，而且还可 以对材料进行微米级加工及研究许多重要生物过程等，从而弥补了s t m 和原子力 显微镜( a f m ) 不能直接提供电化学活性信息的不足 2 实验装置 常规的s e c m 装胃如图l 所示，主要由电化学部分( 电解池、探头、基底、 参比电极、辅助电极和双恒电位仪) 和用来精确控制探头位置的压电驱动器以 及用来控制操作、获取和分析数据的计算机( 包括接口) 三部分组成。探头固 定在由三维马达控制的爬行器上，使探头在基底上方沿x 、y 、z 轴方向精确移 动基底固定在电解池的底部，爬行器及固定电解池的载物台都放置于一个稳 固的平台上，以减小震动所引起的噪音通过双恒电位仪可控制探头电极和基 底的电位。应用计算机通过位置控制器来控制x y z 三维爬行器在基底上方移动。 与此同时，由电化学分析仪测定探头上的信号变化而得到基底的三维图像 3 工作模式 s e c m 可以多种工作模式进行实验，如反馈模式、产生收集模式、穿透模 式、离子转移反馈模式、平衡扰动模式、电位测定等。本论文实验过程中用到 的工作模式有反馈模式和产生收集模式，在此简单介绍一下。 a b 幽ls e c m 仪器装筐示意图 a ，装置方框示意l 鳘i ；b ，爬行器示意l 茔| 。 反馈模式是s e c m 实验中最常用，也是可以用于定量分析的一种工作模式 ( 见图2 ) 。在反馈模式中，u m e 作为三i 乜极t 奉系 一的_ - l ：f l - i c 三极，相当t - j r 它扫 描探针显微镜中的探头。所要研究的样品通常称之为基底，基底也可以作为第 二工作电极。在这种情况下，用一个双恒电位仪来控制探头和基底电极的电位。 所有电极都插入含有氧化还原介质的电解质溶液一i ，。 以还原型介质( r ) 为例，当探头上所加的电位足够正时，r 在探头上发生 氧化反应。当探头离基底很远时( 见图2 a ) ，探头上的稳念扩散电流f l 。符合 公式( 1 ) 。 i t = 4 n f d r c r a ( 1 ) 式中n 是电子转移数，足法拉第常数，d r 是r 的扩散系数，c r 是r 的浓 度，a 是探头的半径。 当探头向导体基底逼近至探头与基底的距离( d ) 大约为几个探头半径( 口) 时，在探头上所产生的被氧化的物质( 0 ) 就可以扩散到些底上并能在基底上重 新还原成r 。这种使探头上的电流( 打) 增加的过程被称为萨反馈，即卉 。( 见图 2 b ) 。d 越小，f t 越大。反之，当基底足绝缘体时，探头产生的物质( o ) 则不 能在其表面上发生反应。绝缘体在此仅起到一个阻碍r 从本体溶液扩散到探头 上的作用，此时f t 随d 的减少而降低，即打 口，d 为探头距基底的距离) ，探头的稳态电流打。可用公式( 1 ) 表示。 固定探头电位为k 3 f e ( c n ) 6 的还原电位( 0 v ) ，此时，k 3 f e ( c n ) 6 就会在探头上 还原，产，j ik 4 f e ( c n ) 6 。探头逐渐靠近举底时，探头上的电流打随着d 的变化 和基底性质的变化发生相应的变化。当基底是导体时( 基底电位恒定于o 5v ) ， 探头上所产生的k 4 f e c c n ) 6 就可以扩散到基底上并能在基底上重新氧化成 k 3 f e c c n ) 6 ，从而使探头上的电流增加，如图i - 9 a 和1 - i o a 所示。当基底是绝 缘体时，探头上产生的k 4 f e ( c n ) 6 不能在基底表面上发生反应。绝缘体只起到 一个阻碍k 3 f e ( c n ) 6 从本体溶液扩散到探头的作用。此时打随d 的减少而降低， 如图1 9 b 和1 1 0 b 所示 a b 3 8 3 6 2 3 4 兽 3 2 3 0 3 0 2 8 2 6 著2 4 = ： 2 2 2 0 1 8 0 5 0 l o ol5 02 0 0 2 5 0 z ( m ) 01 02 03 04 0s o6 07 0 z ( p m ) 1 7 山东人学硕i 。学位论文 图i - 9 双金微米电极向铂导体基底( a ) 和聚四氟乙烯绝缘体墓底( b ) 逼近的s e c m 探头渐进曲线 含1 0 0 x1 0 。m o l lk 3 f e ( c n ) 6 的0 5 0 0m o l l 。k c i 溶液；烈探头电 i ) = 均为0v ； 参比也极：a g a g c l i u 极；轴助l u 极：t ( i f u 拔；步进进j 叟，5p m s 。 a b 3 8 3 6 3 4 3 2 3 0 01 0 0i s 02 0 0 z ( $ t m ) 02 04 06 08 0 1 0 0 1 2 0 舀t i m ) 图1 1 0 金微米【乜极向导体基底( a ) 乖i 绝缘体丛底( b ) 逼近的s e c m 探头渐进曲线 实验条f ，j 硎幽i - 9 根据s e c m 理论，如果s e c m 工作模式采用反馈模式，且符合如下假设：氧 化还原介质的更新是扩散控制的：介质的氧化型和还原型扩散系数相等；基底无 限大【7 】。对于导体基底校正电流( 胪) 符合公式( 2 ) 【8 】。l 值在0 0 5 到2 0 2 f 自j 时，带与曲线的偏差小于o 7 。对丁绝缘体丛底， 7 舣控制的异棚反应 则符合公式( 3 ) 【8 】。l 值在o 0 5 到2 0 之间时，矿与曲线的偏差小于o 5 。 ” m 纠 体 ” 眨 9 6 v u v 山东大学硕卜学位论文 ，f ：- i t ：0 7 8 ，3 7 7 + o 3 3 1 5 e x p ( _ - 10 6 7 2 ) + o 6 8 ( 2 ) l r ll ，：”= ! i ，一( 3 ) 。 ( o 1 5 + 1 5 3 8 5 l + o 5 8 e x p ( - i 1 4 l ) + 0 0 9 0 8 e x p ( l - 6 3 ) 0 0 1 7 l ) ) 式中，巧代表基底是导体时的校正探头电流( = f t f t 。) ，代表基底是绝 缘体时的校j 下探头电流( = 州f t ，。) ，衍。为探头离基底很远时的稳态电流，f t 为 探头电流，为校j 下距离( = d a ，其中d 为探头的半径，d 为探头与基底的实际距 离) 。 通过实验数掘与理论曲线的拟合，可以测得探头与基底之间的距离。理论曲 线是以，t k ( 对于导体基底，代表咩；对于绝缘体基底，代表垆) 对作图得 到的，由于实验数据是以探头的电流( i - r ) 对探头沿z 轴所走的距离( z ) 作图得 到的，如图1 - 9 和图1 1 0 ，因此要把打和z 分别进行归一化计算成打。和三才能与 理论曲线进行比较。v 。= 州打。，这样用e x c e l 软件就可以求出不同f t 值对应的带 值。而l = d a ，这罩可以先假设z 0 为探头爬行到与基底距离为0 时探头总共走的 距离( z o 为一个估计值，见图1 9 ) ，这样d = z o z ，因此可以用e x c e l 求出不同z 值对应的( z 0 一z ) a 的值( 即值) 。在e x c e l 中，以，t k 对工作曲线即为校正探头电 流一距离曲线( 如图1 1 1 和图1 - 1 2 ) 。图1 1 l 和图1 1 2 分别是双金微米电极和 单根会微米电极作为探头逼近导体基底( a ) 和绝缘体基底( b ) 时的校正探头 电流一距离曲线。其中，图1 1 l a 和图1 - 1 2 a 中的实线是按理论公式( 2 ) 作出 的斤。上理论曲线。图1 1 l b 和图1 - 1 2 b 中的实线是按理论公式( 3 ) 作出的矗。也 理论曲线。图1 1 l 中的空心菱形和实心圆形分别是双微米电极的两根电极逼近 基底得到的实验数掘按照上述方法进行换算，得到的i t k - l 曲线图1 1 2 中的 空心菱形是单根微米电极逼近基底得到的实验数据按照上述方法进行换算，得 到的i t k - l 曲线。通过图1 9 和图1 1 0 的比较可以看出。双微米电极和单微米电 极逼近基底的逼近曲线没有什么差别，而通过图1 1 l 发现实验曲线和理论曲线 基本重合，说明我们制成的双微米电极可用于s e c m 实验。 1 9 ! ! 查叁兰堡! ：竺丝堡苎 3 2 5 a 2 七1 5 1 0 5 o b 024681 01 21 41 61 82 0 上( d a ) 024681 01 21 41 61 82 0 l ( d a ) 图1 - 1 i双金微米电极作为探头逼近导体基底( a ) 和绝缘体基底( b ) 时的 校正探头电流一距离曲线。 空心菱形和实心圆形分别是双电极的两支电极w i 和w 2 的投l e 探头电流一距离曲线；实 线是理论校正探头电流一距离曲线；含1 0 0 x 1 0 m o l l k 3 f e ( c n ) 6 的o 5 0 0 m o l l k c i 溶液； 双探头电位均为0v ；步进速度：5l a m s 2 0 a o2 4681 01 21 41 61 8 2 0 l ( d a ) h他眦吆。 由 ， ” 2 ” ， ” o 山东大学颈上学位论文 b 止 02468 1 01 2 1 4 1 61 3 2 0 l ( d a ) 幽1 1 2 金微米屯极作为探头逼近导体基底( a ) 和绝缘体基底( b ) 时的 校正探头电流一距离曲线。 菱形是金微米电极的校正探头电流一距离曲线；实线是理论校正探头电流一距离曲线 实验条什同图1 i l 。 1 3 4 双微米电极双电极之问的相互干扰性测定 1 3 4 1 测定一根电极收集另一根电极的反应产物的收集效率 由于双电极之间的距离比较小( 大约有6 0p m ) ，所以理论上一根电极上发 生氧化还原反应产生的物质也会扩散到另一根电极上，因此，我们必须测定一 根电极收集另一根电极的反应产物的效率到底如何。图1 1 3 是1 o o x1 0 矗m o t l k 3 f e ( c n ) 6 在双电极上的循环伏安曲线我们测定了双电极之间的收集效率。图 l 1 3 ( a ) 是固定第二工作电极w 2 上电压为o 5 v ( 也就是k 4 f e ( c n ) 6 的氧化电位) ， 在工作电极w 1 上于o 0 。5v 进行扫描，记录在i 0 0 1 0 矗m o l l 的k 3 f e ( c n ) 6 溶 液中w l 上的循环伏安曲线。随着w l 上反应的进行( k 3 f e ( c n ) 6 - - - + k 4 f e ( c n ) 6 ) ， w i 周围的k 4 f e ( c n ) 6 就会越来越多，这样w 2 就会收集w i 产生的f e ( c n ) 6 从图中记录的w 2 的氧化电流值我们可以算出，w 2 收集w i 产生的k 4 f e ( c n ) 6 的 效率约为1 o ，此处所说的收集效率也就是w 2 上的氧化电流与w l 上的还原电 流的比值( o 2 9 2 8 9 ) 【4 】。图1 1 3 ( b ) 是固定w i 电位为0 5v ，设定w 2 上电 压为0 - 0 5v 时扫的循环伏安曲线。同样从图中可以算出。w i 收集w 2 产生的 k 4 f e ( c n ) 6 的效率约为1 1 ( 即0 3 1 2 8 4 的比值) ，从这一方面可见，双电极之间 由于氧化还原反应而引起的相互干扰很小，在实验中，我们可以忽略。 2 l 垃 。 旺 o ! ! ! 垄叁兰竺! ! ：兰丝堡苎 - - - _ - _ _ - - _ _ _ _ _ _ _ _ _ - _ _ - _ - _ - _ - _ _ - - _ - _ _ _ 一一一一一 一 ( a ) e ( v ) e 图1 - 1 3 1 0 0 x1 0 。m o l lk 3 f e ( c n ) 6 在烈金微米电极上的循环伏安曲线。 探头电位：( a ) ：w 1 ov o 5v 。w 2 ，0 5vv sa g a g c | ；( b ) ；w 2 0v o 5v w l 。0 5v v s a g a g c i 。扫描速度0 0 2v s 1 , 3 4 2 改变一根电极上的电压，观测另一楸i 乜极的循环伏安i l f l 线的变化 图卜1 4 中曲线i 是w 2 上不加电压，扫描w 1 的循环伏安曲线( 相当于单 如 筋 加 h m ， 0 分己一 山东人学顾上学位论文 根电极的循环伏安曲线) 。曲线2 7 分别是固定双金电极中w 2 的电压为0 v ( 曲 线2 ) 、o 1v ( 曲线3 ) 、0 2v ( 曲线4 ) 、o 3v ( 曲线5 ) 、0 4v ( 曲线6 ) 和 o 5v ( 曲线7 ) 时，扫捣电极w l 的循环伏安曲线。由图1 1 4 可以看出，在 w 2 上加不同的电位时，7 条w l 的循环伏安曲线基本重合，这说明，不管w 2 上加不加电压或者加多少电压，对w l 基本没有影响。 另外，理论上说，我们得到的w l 和w 2 的扫描曲线的交叉点所对应的电压， 应该与w 2 上所肌的f 【l 压一致( 因为溶液相同) ，可是实际得到的两条曲线的交 叉点稍微偏离w 2 上所加的电压，这可能是由于两根电极的半径不同从而造成 电极在相同的溶液中扫描得到的电流稍微不同。 山上述讨论可以看出，我们所作的双电极之间基本没有干扰，可以用于双 电活性物质的测定。 w i1 一 w 2 2=曩彝，昌。 豸轳一 n | | 圹 w 24 夕 w 26 ，7 7 0 50 40 30 20 1o 00 1 e ( v ) 图i 1 4 改变双电极中一根电极( w 2 ) 的电压，扫描另一根电极( w 1 ) 的循环伏安所得 到的一系列曲线 含1 0 0 x 1 0 m o l l k 3 f e ( c n ) 6 的o 5 0 0 m o l l k c l 溶液；w l 的电压：0 v - 0 5 v w 2 的电 乐：0 v ( 曲线2 ) ，o 1v ( 曲线3 ) ，0 2 v ( 曲线4 ) 。0 3 v ( 曲线5 ) ，0 4 v ( 曲线6 ) ， 0 5v ( 曲线7 ) ；扫描速度o 0 2 v s 另注：曲线i 是在w 2 上不加电压的情况r ，扫w l 的循环伏安得到的。 如 筋 加 b 加 ， o v u 一 i ij 东人学倾i 学位论 1 4 结论 我们通过对双金微米电极和单根金微米电极表征结果的比较，发现双微米电 极和单微米电极之b j 没有太大差异，而双微米电极的逼近曲线与理论曲线能够基 本拟合，说明我们制作的双电极能用于s e c m 的实验。另外，我们通过对双电极 两支电极问相互干扰性的测定，发现这两支电极斗u 互干扰比较小，在实验误差允 许的范围内，这就为我们以后要获得双电活性信息的实验打下了良好的基础。 1 5 参考文献 【1 】 w e i ，c ，b a r d ，a j ，k a p u i ，i ，n a g y , g ，t o t h ，k s c a n n i n ge l e c t r o c h e m i c a lm i c r o s c o p y 3 2 g a l l i u mu l t r a m i c r o e l e c t r o d e sa n dt h e i ra p p l i c a t i o ni ni o n - s e l e c t i v ep r o b e s a n a lc h e m 1 9 9 6 。6 8 ，2 6 5 1 - 2 6 6 3 ( 2 l l s i k 。s ，e t i e n n e ，m ，o n i ，j ，b l o c h l ，a ，r e i t e r , s ，s c h u h m a n n ，w d u a lm i c r o e l e c t m d e sf o r 【3 】 【4 】 【5 1 f 6 】 【7 】 【8 】 d i s t a n c ec o n t r o la n dd e t e c t i o no f n i t r i co x i d ef r o me n d o t h e l i a lc e l l sb ym e a n so f s c a n n i n g e l e c t r o c h e m i c a lm i c r o s c o p e a n a lc h e m 2 0 0 4 ，7 6 ，6 3 8 9 - 6 3 9 4 y a s u k a w a , t 。k a y a ，t ，m a t s u e ，t d u a li m a g i n go f t o p o g r a p h ya n dp h o t o s y n t h e t i ca c t i v i t y o fas i n g l ep r o t o p l n s tb ys c a n n i n ge l e c t r o c h e m i c a lm i c r o s c o p y a n a lc h e m 1 9 9 9 ，7 1 ， 4 6 3 7 - 4 6 4 i s t r a i n 。t g 。e w i n g ，a qc h a r a c t e r i z a t i o no fs u b m i c r o n s i z e dc a r b o ne l e c t r o d e si n s u l a t e d w i t hap h e n o l - a l l y l p h e n o lc o p o l y m e r a n a lc h e m 1 9 9 2 ，6 4 ，1 3 6 8 1 3 7 3 w e i 。c ，b a r d 。a j ，m i r k i n ，m v s c a n n i n ge l e c t r o c h e m i c a lm i c r o s c o p y 31 a p p l i c a t i o no f s e c mt ot h es t u d yo fc h a r g et r a n s f e rp r o c e s s e sa tt h el i q u i d l i q u i di n t e r f a c e ，p h y s c h e m 1 9 9 5 ，9 9 ，1 6 0 3 3 - 1 6 0 4 2 c h e n ，s ，k u c e r n a k ，a f a b r i c a t i o no f c a r b o nm i c r o e l e c t r o d e sw i t ha ue f f e c t i v er a d i u so fi n m e k c t r o c h e mc o m m u n 2 0 0 2 。4 8 0 - 8 5 k w a k jb a r d ，a j s c a n n i n ge l e c t r o c h e m i c a lm i c r o s c o p y t h e o r yo ft h ef e e d b a c km o d e t a n a l c h e m 1 9 8 9 ，6 i ，1 2 2 i 1 2 2 7 m i r k i n ，m v ，f a n ，e r e ，b a r d ，a j s c a n n i n ge l e c t r o c h e m i c a lm i c r o s c o p yp a r t1 3 e v a l u a t i o no ft h et i ps h a p e so fn a n o m e t e rs i z em i c r o e l e c t r o d e s j = e l e c t r o a n a l t h e m 1 9 9 2 ， 3 2 8 。4 7 6 2 山东人学硕卜学位论文 第二章扫描电化学显微镜同时成像单个活细胞内的 过氧化物酶活性和细胞形貌 2 1 引言 s e c m 从丌发的仞期，人们就在不断尝试将其应用拓展到生物领域。继b a r d 小组【l ，2 】首次用反馈模式做出了草和l i g u s t r u ms i n e n s i s 叶子表面的形貌图以 及用收集模式测定了e l o d c a 叶片上尤合作用产生的氧气和气孔释放氧气分布图 之后，细胞的形念和性质逐渐成为s e c m 研究的热门课题之一。近十年，m a t s u e 小组和m i r k i n 小组用绕单细胞做了一系列的工作。m a t s u e 小组【3 - 7 】利用探头 测定细胞产生或消耗的氧气研究了多种药物对细胞活性的影响。m i r k i n 小组【8 - l l 】 用s e c m 探测了单个哺乳动物细胞和紫色光合作用细菌r h o d o b a c t e rs p h a e o i d e 的 氧化还原活性、研究了哺乳动物细胞中电荷转移反应的机理。 但是以上的研究仅仅局限于研究细胞表面的信息，而没有检测到细胞内部物 质，而且获得的是单信息，从丽无法研究两种信息之间的关系。迄今为止关于s e c m 研究细胞的文献中，只有1 9 9 9 年m a t s u e 等【1 2 】发表的一篇文献是同时获得了两 种信息，但也只是获得了细胞形貌信息和细胞光合作用产生0 2 的浓度分布信息， 而没有检测胞内物质。而生命活动都是在细胞内实现的，有关单个细胞内的化学 组分的信息研究将使人们更好地了解某些特殊的细胞功能，更深入地认识细胞差 异、细胞问通讯、神经递质、细胞内大分子及药物或毒物刺激对生理的影响。本 实验室的王晓蕾【1 3 】利用毛地黄皂苷( d i g ) 来溶解细胞膜上的胆固醇，在细胞 膜上形成微孔，小分子物质( 如酶的底物) 可以通过这些微i l 进出细胞，而大分 子物质( 如酶) 则不能穿过细胞膜的性质，建立了一种s e c m 测定单个活细胞中 的过氧化物酶的方法。这样既保汪细胞形态上的完整性，又能用s e c m 来测定细 胞内的酶活性水平。此方法成功的应用于测定单个活的中性粒细胞中过氧化物酶 的活性水平 过氧化物酶( p o ) 在细胞中参与杀菌、解毒等机体防御机制，在哺乳动物体 内t 要存在于白细胞、肝细胞和乳腺细胞中。在白细胞中，中性粒细胞、单核细 胞和嗜酸性粒细胞中含有过氧化物酶。过氧化物酶的水平鉴定常是疾病诊断分类 中的一个重要依据。如白血病细胞浆中存在较多的过氧化物酶，就认为此类白血 病属于急性髓系细胞白血病，反之为急性淋巴细胞白血病急性粒细胞白血病以 山东人学甸i j f 学忙论史 强阳性为主，急性单核细胞白血病则为弱阳性【1 4 】。过氧化物酶的测定也可用于 诊断遗传性过氧化物酶缺乏症【1 4 】。因此，细胞内过氧化物酶的检测在医学上具 有重要的意义。 本实验中用双电极探头的s e c m 同时测定了两种信息一单个活的中性粒细胞 中的过氧化物酶活性和细胞形貌。为了确定检测翁l j j 魁内过氧化物酶活性条件，我 们首先研究了用戊二醛( g d ) 交联法来固定辣根过氧化物酶( h r p ) 并用s e c m 确定了收集模式测定h r p 的最佳条件。虽然h r p 是来自于辣根一植物细胞，但它 也是过氧化物酶，在催化过氧化物的性能以及活竹的表征和测量方面与动物细胞 内的过氧化物酶足相同的。在相同的检测条件下，用h r p 得列的实验的最佳条件。 也适用于动物细胞内的p o 检测，因为它们都足转化相同的过氧化物( 底物) 。最 后用s e c m 的双电极探头同时成像细胞内的过氧化物酶活性和细胞形貌。图2 1 示出了用s e c m 来测定细胞内的p o 和细胞形貌的原理。f i l lj l 乜被胶原固定在培养 皿上，然后将细胞用d i g 处理- 1 3 】，细胞膜上的胆同醇被d i g 溶解，产生微孔。细 胞内的大分子( 如酶) 仍然被禁锢在细胞内部，而小分子物质( 如酶的底物和产 物) 则可以进出细胞。当溶液中加入p o 的底物一氢醌( h 2 q ) 和h 2 0 2 后，它们 可以扩散到细胞内，并在细胞内p o 的催化下发生反应生成苯醌( b q ) 和水( 见 式( 2 1 ) ) 。 h z q o+2 h 2 0 ( 2 1 ) p 0 的催化反应速度非常快，生成b q 的速度受h 2 q 和i 2 0 2 的扩散速度控 制【1 5 1 。细胞内的b q 浓度比细胞外的大，b q 就会i 句e l l l 胞外扩散。当探头的电位 恒定于b q 发生还原反应的电位处，b q 按式( 2 - 2 ) 在探爻上反应a b qh z q ( 2 2 ) 当s e c m 探头的电位恒定于b q 发生还原反应的电位时，用s e c m 就可以测 得细胞周围b q 在探头上产生的电流，从