（生物化学与分子生物学专业论文）蔗糖诱导马铃薯块茎形成的信号分子功能研究.pdf

独创性声明 y 9 7 4 5 1 8 本人声明所呈交的学位论文是我个人在导师指导下进行的 研究工作及取得的研究成果。尽我所知，除文中已经标明引用 的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写 过的研究成果。对本文的研究做出贡献的个人和集体，均已在 文中以明确方式标明。本人完全意识到本声明的法律结果由本 人承担。 学位论文作者签名：粥角 加形年月f 。日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的 规定，即：学校有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的 复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。本人授权云南师范 大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行 检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学 位论文。 学位论文作者签名：物钐萄 z 口护g 年莎月加日 指导教师签名：多诅身撂 年月b 4 云南师范大学硕士研究生学位论文 云南师范大学硕士研究生学位论文 摘要 本文以同步结薯的马铃薯离体单节茎段为实验材料，探讨了蔗糖在诱导马铃 薯块茎形成过程中的信号分子功能。主要研究结果包括以下几个方面： 1 、不同可溶性糖诱导处理对马铃薯单节茎段块茎形成的影响 用不同的单、双糖及糖类似物在相同浓度或相同渗透势条件下模拟高浓度蔗 糖( 8 0 ) 诱导块茎形成。结果表明，无论是在相同浓度还是在相同渗透势条件 下，蔗糖诱导结薯能力最强，并具有高效性；而且，蔗糖的这种高效诱导作用与 其产生的渗透胁迫及诱导过程中培养基的p n 变化无关，也不完全是通过其已知的 碳源和能源生理功能来实现。 2 、蔗糖，葡萄糖吸收抑制处理对蔗糖葡萄糖诱导马铃薯单节茎段块茎形成及基因 表达的影响 利用文献报道的蔗糖特异性吸收抑制剂( p c m b s 、n e m ) 或葡萄糖竞争性吸 收抑制剂( p t a o r i d z h a ) 干扰蔗糖或葡萄糖的吸收过程，发现外源蔗糖主要以跨膜 运输形式进入胞内，少部分被胞壁转化酶分解后通过己糖载体输入胞内，并且这 两种运输形式对蔗糖的高效诱导作用是必需的；但蔗糖诱导结薯的主要作用是通 过蔗糖本身实现，与蔗糖的跨膜转运有直接关系。此外，该部分的研究结果还表 明，在诱导结薯过程中，蔗糖可在转录水平上诱导s t s u t l 和s u s y 4 基因的表达， 且这种诱导作用可被p c m b s 处理所抑制，并被p h l o r i d z i n 处理部分抑制，而s t s u t l 和s u s y 4 基因表达均与块茎形成相关，这说明蔗糖可能通过调节与块茎形成相关 基因的表达而诱导块茎发生与形成。 3 、操纵钙信使系统对蔗糖诱导马铃薯单节茎段块茎形成及基因表达的影响 利用质膜钙离子吸收抑制剂l a c l 3 、钙调素活性抑制剂t f p 、及钙离子载体 a 2 3 1 8 7 与胞外钙离子螯合剂e g t a 协同处理干扰钙信使系统，发现抑制胞外钙离子 吸收、或抑制胞内钙调素活性、或调节胞内外钙离子浓度均可阻断高浓度蔗糖的 诱导结薯作用，并抑制蔗糖对s t s u t l 和s u s y 4 基因的诱导表达作用，说明钙信使 系统直接参与了蔗糖诱导马铃薯块茎形成及相关基因表达的信号转导。 4 、马铃薯s t s u t 2 的系统发生及其结构与功能的研究 云南师范大学硕士研究生学位论文 通过系统发生分析、马铃薯s t s u t 2 基因的部分e d n a 片段结构预测及表达分 析，发现s t s u t 2 在分类上属于s u t 2 亚族，在蛋白质水平上具有特殊的胞质环结 构域，且可被蔗糖诱导表达，据此，初步推测s t s u t 2 可能就是质膜蔗糖信号感应 器。 综合分析上述结果表明，蔗糖诱导马铃薯块茎形成的作用主要通过其独特的 信号转导途径实现，也就是说蔗糖本身可能具有信号分子功能，且s t s u t 2 可能就 是其在胞内的信号感应器。 关键词：蔗糖；马铃薯；块茎形成；信号分子 云南师范大学硕士研究生学位论文 a b s t r a c t u s i n gt h es y n c h r o n i z e dt u b e r i z a t i o ns y s t e mo fs i n g l e n o d es t e mc u t t i n g so f n v i t r op o t a t op l a n t l e t s ，w eh a v ea t t e m p tt op r o b et h es i g n a lf u n c t i o no fs u c r o s ei nt h e i n d u c t i o no ft u b e r i z a t i o no fp o t a t op l a n t l e t s t h em a i nr e s u l t sw e r es u m m a r i z e da s f o u o w s ： 1 t h ee f f e c t so fd i f f e r e n ts o l u b l es u g a r so ni nv i t r ot u b e r i z a t i o no fs i n g l e n o d es t e m s o f p o t a t op l a n t l e t s w eh a v es i m u l a t e dt h ei n d u c t i o no fe x o g e n o u ss u c r o s ew i t hd i f f e r e n ts u g a r sa n d s u g a ra n a l o g sa ts a m ec o n c e n t r a t i o no rs a m eo s m o t i cp o t e n t i a l ，t h er e s u h ss h o w nt h a t s u c r o s ew a sa ne f f i c i e n tf a c t o rf o rt u b e r i z a t i o ni n d u c t i o nc o m p a r i n gw i t ht h eo t h e r s o l u b l es u g a r s ，i t sr o l e si nt h ei n d u c t i o no ft a b e r i z a t i o nw e r en o tr e l a t e dt ot h ec h a n g e s o fo s m o t i cp o t e n t i a la n d o rp hv a l u eo fc u l t u r em e d i u mp r o d u c e db ys u c r o s ei t s e l f , a n d n o td e p e n d e n to ni t sk n o w nb i o l o g i c a lf u n c t i o n s ，e g s u p p l i e dc a r b o h y d r a t e sa n de n e r g y f o rt h eg r o w t ha n dd e v e l o p m e n to f p l a n t l e t s 2 t h ee f f e c t so fs u c r o s e g l u c o s ea b s o r p t i o ni n h i b i t o r so ns u c r o s e g l u c o s ei n d u c i n g p o t a t ot u b e r i z a f i o na n dg e n ee x p r e s s i o n u s i n gs u c r o s e g l u c o s ea b s o r p t i o ni n h i b i t o r s ( p c m b s ，n e m ，p b a o r i d z i n ) t od i s t u r b t h ea b s o r p t i o no fs u c r o s e g l u c o s e ，w ef o u n dt h a te x o g e n o u ss u c r o s ew a st r a n s p o r t e d i n t ot h ec e l l sm a i n l ya si n t a c tm o l e c u l eb ys u c r o s et r a n s p o r t e r s ，a l b e i tp a r to ft h e mw a s c a t a b o l i z e di n t oh e x o s e sb yc e l lw a l li n v e r t a s e ，a n dt h e nt r a n s p o r t e di n t ot h ec e l lw i t h h e x o s et r a n s p o r t e r s ，b o t ho ft h et r a n s p o r t i n gp a t h w a y sa r en e c e s s a r yf o rs u c r o s e i n d u c i n gt u b e r i z a t i o no fp o t a t op l a n t l e t se f f i c i e n t l y , b u tt h em a i nf u n c t i o no fs u c r o s ei n t h ei n d u c t i o no ft u b e r i z a f i o nw a sc h a r g e dw i t hs u c r o s ei t s e l f , a n dd i r e c t l yr e l a t e dt oi t s t r a i l s - m e m b r a n et r a n s p o r t i o n t h er e s u l t sa l s os h o w e dt h a ts t s u t la n ds u s y 4g e n e s ， w h i c hs p e c i f i c a l l ye x p r e s s e dd u r i n gt h et u b e r i z a t i o no f p o t a t op l a n t l e s ，c o u l db ei n d u c e d b ys u c r o s ea tt r a n s c d p f i o n a ll e v e l ，b u tw a sa l m o s tc o m p l e t e l yi n h i b i t e db yp c m b sa n d p a r t i a l l yi n h i b i t e db yp h l o r i d z i nt r e a t m e n t t h ea b o v ep r e l i m i n a r yr e s u l t si m p l i e dt h a t 4 云南师范大学硕士研究生学位论文 t h ei n d u c i n gf u n c t i o no fs u c r o s eo nt u b e r i z a t i o no fp o t a t om i g h t m o d u l a t i n gg e n ee x p r e s s i o nr e l a t e dt ot h ep r o c e s so f t u b e d z a t i o n 3 t h ee f f e c t so fm a n i p u l a t i n gt h ec a + + _ c a ms y s t e mo ns u c r o s e t u b e r i z a t i o na n dg e n ee x p r e s s i o n b ea c h i e v e db y i n d u c i n gp o t a t o b ym a n i p u l a t i n gt h ec a ，c a ms y s t e mw i t hp l a s m am e m b r a n ec a 2 + c h a n n e l i n h i b i t o rl a ：+ ，c a ma c t i v i t yi n h i b i t o rt f p , c a ：+ i o n o p h o r ea 2 3 1 8 7a n dc a 2 + c h e l a t i n g r e a g e n te g t a ，w ef o u n dt h a ti n h i b i t i n gc a ：+ a b s o r p t i o n ，o rc a ma c t i v i t yo rm o d u l a t i n g c y t o p l a s m i cc a 2 + c o n c e n t r a t i o nc o u l di n h i b i tt h es u c r o s ei n d u c i n gt u b e r i z a t i o n ，a n d i n h i b i t e ds t s u t ia n ds u s y 4g e n ee x p r e s s i o na tt r a n s c r i p t i o n a ll e v e lt h er e s u l t ss h o w n t h a tt h ec a 2 + - c a ms i g n a l i n gs y s t e mw a sd i r e c t l yi n v o l v e di nt h et r a n s d u c f i o no fs u c r o s e s p e c i f i cs i g n a l i n gp a t h w a y s 4 t h es t u d yo f t h ep b y l o g e n e s i s ，s t r u c t u r ea n df u n c t i o no f s t s u t 2 c o m b i n i n gw i t ht h ep h y l o g e n e t i ca n a l y s i s ，t h e s t r u c t u r e p r e d i c t i o no fc d n a p a r t i a ls e q u e n c ea n dt h ea n a l y s i so f s t s u t 2g e n ee x p r e s s i o n ，w ef o u n dt h a ts t s u t 2h a d au n i q u ec y t o p l a s m i cl o o pw h i c hi ss i m i l a rt ot h es p e c i f i cs t r u c t u r eo fg l u c o s es e n s o r r e p o r t e di ny e a s t ，a n dw a ss u b j e c t e dt os u t 2s u b f a m i l y , a n ds u c r o s ec o u l di n d u c e s t s u t 2g e n ee x p r e s s i o n w et h u sp r e l i m i n a r i l ys p e c u l a t e dt h a ts t s u t 2m i g h ta c ta sa c y t o p l a s m i cm e m b r a n e - b i n d i n gs e n s o ro f s u c r o s e b a s e do na b o v er e s u l t s ，w es u g g e s t e dt h a tt h e r ew a sas u c r o s e - s p e c i f i cs i g n a l i n g p a t h w a yr e s p o n s i b l ef o rt h es u c r o s ei n d u c i n gt u b e r i z a t i o no np o t a t op l a n t l e t s i no t h e r w o r d s ，s u c r o s ec o u l db es e n s e da n da c ta sas i g n a lm o l e c u l ei nw h i c hs t s u t 2m i g h tb e t h es e n s o ro fs u c r o s ei nt h ec e l l s k e y w o r d s ：s u c r o s e ；s o l a r i u mt u b e r o s u ml ；t u b e r i z a t i o n ；s i g n a lm o l e c u l e 云南师范大学硕士研究生学位论文 i 引言 蔗糖( s u c r o s e ，s u c ) 是绿色植物光合作用碳同化的主要末端产物，也是大多 数高等植物体内光合产物运输与分配的主要形式。即便在以糖醇( 如甘露醇和山 梨醇) 和棉子糖系列( 如棉子糖、水苏四糖和v b r b a s c o s e ) 作为同化物运输形式的 植物中，蔗糖仍然是运输流的主要成分( b e e b e 和t u r g e o n1 9 9 2 ) 。植株源器官中 合成的蔗糖，除了少量被用于满足自身生长发育的需求外，大部分被装载到韧皮 部的筛管伴胞复合体( s i e v ee l e m e n t - c o m p a n i o nc e l lc o m p l e x ，s e c c c ) 中，进而经 长距离运输，再从筛管分子进入到根、茎、嫩叶、花、果实或种子等库器官中。 蔗糖在植株体中定向运输和分配的方式不仅直接沟通了“源”与“库”之间的联 系，还对植物体的整个生长和发育进程( 如植物的光合作用、呼吸作用、同化物 的合成分配、抗逆性、开花、淀粉和主要贮藏蛋白的特异性积累及贮藏器官的形 成等) ，及相关的生理现象、生化代谢途径和基因表达等起非常关键的调节作用 ( m a d o r e 和l u c a s1 9 9 5 ；h e l l m a n 等2 0 0 0 ) 。然而与植物的激素信号相比，蔗糖需 要更高的浓度即在m m 浓度范围内才能表现出效应( k e n d e 和z e e v a a r t1 9 9 7 ) 。因 此，过去通常认为，蔗糖的上述调节功能是通过其作为植物生长和发育所必需的 碳源、能源或渗透调剂的生理功能来实现的( k o c h1 9 9 6 ；s m e e k e n s1 9 9 7 ) 。但是，最 近的研究结果却表明，蔗糖本身可能还具有信号分子的功能( c h i o u 和b u s h1 9 9 8 ； r o o k 等1 9 9 8 ；s h e e n 等1 9 9 9 ) ，即蔗糖在植物相邻细胞间和不同组织器官间的转运 和分配、或其在胞内外的浓度变化可能引发相应的蔗糖特异性信号，此信号不仅 调节蔗糖本身的转运、分配和代谢，还协调植物的整个生长发育进程( l a l o n d e 等 1 9 9 9 ；s m e e k e n s2 0 0 0 ；r o l l a n d 等2 0 0 2 ；k o c h2 0 0 4 ) 。而且，蔗糖有可能主要通过此 类尚不清楚的蔗糖特异性信号传导途径( s u c r o s e s p e c i f i cs i g n a l i n gp a t h w a y s ) 来实 现其众多的生理调节功能。所以，证实植物体内蔗糖具有信号分子的功能，并阐 明植物蔗糖信号的发生及传递途径，不仅可以揭示蔗糖对植物生长和发育的关键 性调节作用的本质；还将为作物的产量和品质的遗传改良提供新的理论指导。该 方面的研究因此也逐渐成为国内外植物科学研究中的重要领域( h e l l m a n 等2 0 0 0 ) 。 6 云南师范大学硕士研究生学位论文 然而，由于植物体内蔗糖生理功能的多样性、以及蔗糖在植物体内容易被水 解成葡萄糖和果糖，而已知植物体内存在已糖信号感应系统。因此，从目前国内 外的研究现状分析，要将蔗糖的信号分子功能从其代谢物、代谢途径和其它生理 功能中剥离出来进行研究仍存在较大的难度。业已报道的相关研究工作主要是借 助于蔗糖类似物( f e r u l e 等2 0 0 1 ) 、代谢抑制剂( t a k e d a 等1 9 9 4 ) 、突变体筛选( p e g o 等2 0 0 0 ) 、蔗糖特异性诱导表达基因( 如r o l c 基因、拟南芥亮氨酸拉链基因等) 的克隆与表达分析( c h i o u 和b u s h1 9 9 8 ；k o c h1 9 9 6 ；r o o k 等1 9 9 8 ) 以及蔗糖信号 与其它已知信号系统( 如光信号、激素信号等) 之间的交流( c r o s s - t a l k i n g ) ( w i l l i a m s 等2 0 0 0 ) 等手段，来推测和间接证明蔗糖信号系统的存在。s m e e k e n s ( 2 0 0 0 ) 研究 发现蔗糖能特异地诱导p a t a t i n 基因的表达，另外f e r n i e ( 2 0 0 1 ) 用蔗糖的非代谢性类 似物p a l a f i n o s e 进行同样的处理，发现p a l a t i n o s e 也能刺激淀粉的合成。显然，这 些研究发现为证实蔗糖信号系统的存在提供了间接的证据，却难以为蔗糖信号的 发生机制及其传递途径提供直接的证据。所以，迄今关于植物对蔗糖信号的感应 ( s u c r o s es e n s i n g ) 及其传递途径等均不太清楚( h e l l m a n 等2 0 0 0 ；s m e e k e n s2 0 0 0 ； w i l l i a m s 等2 0 0 0 ) 。 参照酵母( sc e r e v i s o a e ) 体内已知的已糖感应信号系统，以及蔗糖转运蛋白 ( s u c r o s et r a n s p o r t e r s ，s u t s ) 介导了蔗糖在植物体内的运输和分配过程等报道， l a l o n d e 等( 19 9 9 ) 推测，植物体内的某些蔗糖转运蛋白也有可能直接起到蔗糖信号 感应和传递的作用。所以，s u t s 基因的克隆及其结构与功能的研究不仅有助于揭 示蔗糖在基因表达、新陈代谢及生长发育过程的调控作用的本质，而且将成为直 接证实蔗糖信号存在及其发生机制等的重要方法。 自r i e s m e i e r 等( 1 9 9 2 ) 首次在从菠菜中克隆到第一个编码蔗糖转运蛋白 ( s o s u t i ) 的c d n a 后，人们相继从马铃薯、拟南芥和水稻等植物中分离、鉴定 或克隆了一系列的蔗糖载体蛋白编码基因或c d n a ，并证实这些s u t s 来源于多基 因家族( k u h n 等1 9 9 9 ；w i l l i a m s 等2 0 0 0 ；a o k i 等2 0 0 3 ) ：在蛋白质水平上有类似于 己糖载体( h e x o s et r a n s p o r t e r , h x k ) 的1 2 个跨膜结构域，为典型的膜结合蛋白质 分子；其n 末端和c 末端均位于质膜的细胞质一侧，面向细胞质的中间部分有一 突出环将蔗糖载体蛋白分为分别含6 个跨膜结构域的两大部分( h e n d e r s o n1 9 9 0 ) ， 云南师范大学硕士研究生学位论文 且大多数都属于质子共运载体( p r o t o ns y m p o r t e r s ) 。根据氨基酸序列的同源性、对 蔗糖的亲和性及对蔗糖的转运能力，可将蔗糖载体蛋白分为三个亚族，即s u t l 、 s u t 4 和s u t 2 亚族。研究表明，s u t l 和s u t 4 亚族的蔗糖载体蛋白具有蔗糖转 运能力，且对蔗糖在韧皮部的装卸载及长距离运输是非常必要的。与s u t l 及s u t 4 亚族不同，s u t 2 亚族的蔗糖载体蛋白对蔗糖不具有转运能力( b a r k e r 等2 0 0 0 ) ；且 在结构上，s u t 2 亚族的蔗糖载体蛋白不仅具有其它s u t s 亚族的跨膜结构特征， 还拥有独特的类似于酵母质膜上葡萄糖信号感应器s n f 3 和r g t 2 的胞质环 ( c y t o p l a s m i cl o o p ) 结构域( 比s u t l 多5 0 个氨基酸残基) ，在胞质环结构域中 还包含有两个高度保守的盒子( b o x e s ) ，即c c b l 和c c b 2 盒子( j z e a n 等1 9 9 6 ； b a r k e r 等2 0 0 0 ) 。s n f 3 和r g t 2 蛋白的信号感应功能就是由其胞质环结构域介导 的；该胞质环结构域缺失则无信号感应功能，将s n f 3 的胞质环结构域添加到酵母 h x t l 和h x t 2 的c 末端，可使其具有葡萄糖信号感应功能；其中s n f 3 是低浓度 葡萄糖信号感应器，主要调节高亲和性葡萄糖转运蛋白的表达，r g t 2 是高浓度葡 萄糖信号感应器，主要调节低亲和性葡萄糖转运蛋白的表达。另外，s n f 3 和r g t 2 都表现为密码子偏倚性较低( 1 0 wc o n d o nb i a s ) ，且都不具有转运葡萄糖的功能 ( l i a n g 和g a b e r l 9 9 6 ；6 z e a n 等1 9 9 8 ；c h i a p e l l o 等1 9 9 8 ；k a q u i 等1 9 9 9 ) 。而且对番 茄组织中s u t s 基因的定位表达分析发现，番茄的l e s u t 2 与高亲和性的l e s u t l 和低亲和性的l e s u t 4 并列分布在韧皮部的筛管细胞质膜上( b a r k e r 等2 0 0 0 ； r e i n d e r s 等2 0 0 2 ；s c h u l z e 等2 0 0 3 ；b a r t h 等2 0 0 3 ) ，但它本身却没有蔗糖转运的功 能，而其编码基因则可以被蔗糖( 葡萄糖不能) 诱导表达，与此同时它同样表现 有密码子偏倚性。综上可知，s u t 2 无论是在结构上或功能上都表现出与酵母质膜 上的葡萄糖信号感应器s n f 3 和r g t 2 有较大的相似性，据此，推测s u t 2 可能起 到感应胞内蔗糖信号的作用( b a r k e r 等2 0 0 0 ；e c k a r d t 2 0 0 3 ) 。迄今，有关这种推测 仍缺乏相应的实验证据，但相关的研究工作和结果可为植物蔗糖的信号分子功能 研究提供突破口。 马铃薯( s o l a n u mt u b e r o s u ml ) 原产于南美洲的阿第斯山区，是目前世界第 四大农作物，也是当代人们的重要粮食和主要经济作物，因其具有较强的库器官 ( 块茎) 而成为植物光合产物转运与分配调控研究的模式植物之一。马铃薯块茎 是马铃薯植株在一定发育时期或一定诱导条件下，形成匍匐茎，经匍匐茎亚顶端 8 云南师范大学硕士研究生学位论文 辐射状膨大增生，并富积大量同化产物而形成的一种变态贮藏器官，也是该作物 的经济器官( 李灿辉和龙维彪1 9 9 7 ) 。块茎形成涉及马铃薯植株的生长、发育、代 谢改变、同化产物分配及新器官形态建成等一系列复杂过程的综合变化。因此深 入研究马铃薯块茎形成的作用机制，不仅为作物遗传品质的改良提供理论指导， 还将对指导马铃薯的生产实践等具有很大的实用价值。 离体培养诱导马铃薯块茎形成是研究块茎形成机理的主要方法之一。迄今， 众多相关报道主要集中在对已知植物生长调节物质( 如c c c 、b a 、a b a 、j a 或 s a 等) 诱导结薯作用机制的研究；普遍采用在含高浓度蔗糖( 6 o 。1 0 0 ，w v ) 的培养基中添加上述生长调节物质，在全黑暗或短日照条件下培养的标准诱导结 薯方法。然而，l i 等( 1 9 9 1 ) 和我们实验室前期的研究结果表明，在全黑暗或短 日照条件下，仅高浓度蔗糖即可诱导一系列不同基因型的马铃薯试管苗结薯；而 当培养基中不加蔗糖，或仅含低浓度的蔗糖( 小于4 ) 时，无论添加何种上述“诱 导结薯因子”均无法诱导块茎的发生和形成。由此说明，高浓度蔗糖在马铃薯块 茎发生和形成的过程中起到了非常关键的作用。 综上所述可知，在高等植物体内蔗糖本身还可能具有信号分子功能，且蔗糖 在诱导马铃薯块茎的发生及形成过程中起到非常关键的调节作用。那么，高浓度 蔗糖在诱导块茎形成过程中的关键作用是通过其生理功能实现，还是通过其可能 的信号分子功能实现的? 如果蔗糖诱导马铃薯块茎形成是通过其可能的信号分子 功能实现，那么，马铃薯s t s u t 2 是否就是其在胞内的信号感应器? 类似的问题还 未见详细的报道。因此，基于国内外的研究现状以及我们实验室前期的研究结果， 本文以马铃薯试管苗单节茎段为材料，采用全黑暗( t o t a ld a r k n e s s ，t d ) 条件下于 培养基( m s ) 中加入不同类型的可溶性糖、己糖类似物或衍生物、及糖吸收抑制 剂或钙、钙调素活性抑制剂等处理方法，探讨了蔗糖诱导马铃薯块茎形成、相关 基因表达、及其与钙信使系统之间的关系，并对马铃薯s t s u t 2 进行了系统发生和 结构与功能的研究，以期从形态、生理、分子的角度来阐明蔗糖诱导马铃薯块茎 形成的作用机制。 9 云南师范大学硕士研究生学位论文 材料和方法 一、实验材料 供试材料为马铃薯大西洋( s o l a n u mt u b e r o s u ml c v a t l a n t i e ) 品种的无病毒试 管苗。大西洋为中早熟品种，结薯对日照呈中性反应。 材料预培养准备：取云南师范大学薯类作物研究所保存的大西洋无病毒试管 苗，在无菌条件下剪切为单节茎段后，将其转接到m s + 3 蔗糖+ o 7 琼脂的固态 繁殖培养基中，每个果酱瓶接入1 0 节单节茎段；置于1 4h r d2 0 0 0 l x 光照，2 5 士2 。c 条件下培养2 8 天，长成的无菌试管苗直接用作实验材料。 二、处理方法 诱导单节茎段结薯的方法：取预培养2 8 天的无菌健壮试管苗，剪去顶端和基 部接触培养基的茎段后，将余下的中部茎段剪切为不带叶片的单节茎段，将单节 茎段转接至不同处理的培养基上，置于全黑暗( t d ) 2 0 。c 培养箱内进行诱导培养， 并于第十四天记录诱导结薯强度及块茎形成百分率。 1 、不同糖、糖类似物处理方法 相同浓度( 8 ，w v ) 不同可溶性糖的诱导处理：将预培养好的试管苗材料 单节茎段分别接于1 2 m s + 8 蔗糖、麦芽糖、葡萄糖、果糖、甘露糖、甘露醇、 或( 4 葡萄糖+ 4 果糖) + o 7 琼脂的培养基中，置于全黑暗( t d ) 2 0 。c 培养 箱内进行诱导培养，并于第十四天记录诱导结薯强度及块茎形成百分率。每种处 理重复三次，每个重复4 0 个茎段培养皿。 相同渗透势( 2 3 3 7m m o l 1 ) 不同可溶性糖的诱导处理：将预培养好的试管苗 材料单节茎段分别接于1 2 m s + ( 与8 蔗糖相同摩尔数的) 麦芽糖、葡萄糖、果 糖、甘露糖、甘露醇+ o 7 琼脂的培养基中，及1 2 m s + 2 、4 或6 蔗糖+ 不 1 0 云南师范大学硕士研究生学位论文 同量的甘露醇】( 最终培养基的渗透势与8 蔗糖相同) + o 7 琼脂的培养基中。 每种处理重复三次，每个重复4 0 个茎段培养皿，培养条件同上。 糖衍生物的诱导处理：将预培养好的试管苗材料单节茎段分别接于 1 2 m s + 8 p - 1 - g 或p - 6 g + o 7 琼脂的培养基中。每种处理1 0 支小指管，每管2 个茎段，不设重复，培养条件同上。 2 、蔗糖葡萄糖吸收抑制剂处理方法 蔗糖吸收抑制剂p c m b s ( 对氯高汞苯磺酸) 和n e m 处理：配制1 2 m s + 8 蔗糖，葡萄糖+ o 7 琼脂诱导结薯的基本培养基，在其中分别加入p c m b s ：0 0 、 1 0 0 、2 0 0 、和5 0 0i x m 0 1 l ；n e m ：0 0 、1 0 、5 0 、1 0 0 、5 0 0 和1 0 0 0i n n 0 1 l ，将预 培养好的试管苗材料单节茎段接入其中。每种处理重复三次，p c m b s 处理每个重 复4 0 个茎段培养皿，n e m 处理每个重复3 0 个茎段培养皿，培养条件同上。 葡萄糖吸收竞争性抑制剂p h l o r i d z i n ( 根皮苷) 处理：配制1 2 m s + 8 蔗糖 葡萄糖+ 0 7 琼脂诱导结薯的基本培养基，在其中分别加入p h l o r i d z i n ：0 0 、1 0 、 5 0 、1 0 0 、5 0 0 、1 0 0 0i m a o l l ，将预培养好的试管苗材料单节茎段接入其中。每种 处理重复三次，每个重复3 0 个茎段培养皿，培养条件同上。 3 、操纵钙信使系统实验处理方法 质膜钙离子吸收抑制l a 3 + 处理：配制1 2 m s + 8 蔗糖+ 0 7 琼脂诱导结薯的基 本培养基，在其中分别加入l a 3 + ：0 0 、2 0 0 、5 0 0 、2 0 0 0 和3 0 0 0 “m o l l ；将预培 养好的试管苗材料单节茎段接入其中。每种处理重复三次，每个重复3 0 个茎段 培养皿，培养条件同上。 钙调素活性抑制t r i f l u o p e r a z i n e ( t f p ) 处理：配制1 2 m s + 8 蔗糖+ o 7 琼脂诱 导结薯的基本培养基，在其中分别加入t f p ：0 0 、1 0 、2 0 、5 0 和1 0 0i x m o l l 将 预培养好的试管苗材料单节茎段接入其中。每种处理重复三次，每个重复3 0 个茎 段培养皿，培养条件同上。 钙离子载体a 2 3 1 8 7 与胞外钙离子螯合剂e g t a 的协同处理：配制1 2 m s + 8 “ 云南师范大学硕士研究生学位论文 蔗糖+ 0 7 琼脂诱导结薯的基本培养基，在其中分别加入a 2 3 1 8 7 和e g t a ：0 0 、5 0 m m o l l e g t a + 1 0 0t t m o l l a 2 3 1 8 7 ；将预培养好的试管苗材料单节茎段接入其中。每 种处理重复三次，每个重复2 0 个茎段培养皿，培养条件同上。 三、测定方法 l 、p h 测定方法 对己灭菌的蔗糖葡萄糖诱导处理培养基进行p h 测定作为对照，取1 4 l o * l o c m 培养皿的1 1 4 天接有茎段的蔗糖葡萄糖诱导处理培养基，加热融化后， 于4 5 。c 左右测定p h 。每种处理设三次重复。 2 、蔗糖诱导基因表达的实验方法 2 1 、取材：以分别加有各种抑制剂的诱导马铃薯结薯茎段为材料，于诱导的第一、 二和七天定时取材。 2 2 、总r n a 的提取 按照q i a g e n 公司r n e a s y m i n ik i t s 的使用说明进行总r n a 的提取，取2 0 肛g 总r n a 用于e d n a 合成。 2 3 、e d n a 第一条链的合成 按照p r o m e g a 公司r e v e r s et r a n s c r i p t i o ns y s t e m 的实验说明进行c d n a 的制 各。 2 4 、p c r 扩增 2 4 1 、引物 引物 序列( 5 - 3 ) 长度参考文献 & s u t l - fa g c t t c c a t a g c t g c t g g t g t t2 2r i e s m e i e r 等 踯u t l rc g g a c t a a g g l l a a g g c t a t g g 2 21 9 9 3 s u s y 4 一f c a a g c t g a c c t g g a c c a c c a c a g t2 4f u 等1 9 9 5 s u s y 4 - r a c c a c a ：丌g a a a a c c a t a g g a 芦江t c t2 6 2 4 2 、p c r 反应体系( 2 5 1 d ) 无菌水1 4 3 “l ，1 0 xp c r b u f f e r2 5 9 l ，m g c l 2 2 0 山，d n t p1 0m ，上下游弓 云南师范大学硕士研究生学位论文 物各1 0i x l ，e d n a 模板3 0 $ t l ，t a p 酶0 2 山( 5 0u p i ) 。 2 4 3 、p c r 扩增条件 9 4 c 预变性4 m i n ， 9 4 。c 2 m i n ，5 5 c ( s t s u t l ) 5 4 c ( s u s y 4 ) l m i n x 3 5 个 循环，7 2 总延伸1 0 m i n 。 3 、马铃薯s t s u t 2 部分e d n a 片段的制备方法 3 1 、取材：以8 蔗糖诱导马铃薯结薯茎段为材料，于诱导的第一、二和七天定 时取材。 3 2 、总r n a 的提取 按照q i a g e n 公司r n e a s ym i n ik i t s 使用说明进行总r n a 的提取，取2 0 烬 总r n a 用于e d n a 合成。 3 3 、e d n a 第一条链的合成 按照p r o m e g a 公司r e v e r s et r a n s e r i p t i o ns y s t e m 使用说明进行e d n a 的制备。 3 4 、p c r 扩增 3 4 1 、引物 先利用d n a s s i s tv e r s i o n1 0 对s t s u t 2 与其它蔗糖载体进行同源性分析，然 后再利用p r i m e rp r e m i e r5 0 软件设计s t s u t 2 的特异性引物，并委托上海生物工程 公司合成引物。 & s u t 2 一f ：5 - t c t t c c t c c t c c g c c t g t a 3 s u t 2 - r ：5 - t g g a c t c c c t c c g t a t g t g 3 3 4 2 、p c r 反应体系( 2 5 山) 无菌水1 4 3 山，1 0 x p c r b u f f e r 2 5 山，m g c l 2 2 0 山，d n t p l 0 山，上下游引物各 1 0 山，e d n a 模板3 0 p 1 ，t a p 酶0 2 i _ d ( 5 u p 1 ) 。 3 4 3 、p c r 扩增条件 9 4 * ( 2 预变性4 m i n ，( 9 4 。c 2 m i n ，5 3 9 c l m i n ，7 2 。c 2 m i n ) x 3 5 个循环，7 2 。c 总延伸1 0 m i n 。 3 5 、电泳检测 3 6 、测序：委托上海生物工程公司测定 云南师范大学硕士研究生学位论文 四、数据收集与统计分析 诱导结薯强度主要参照h u s s e y 和s t a c c y ( 1 9 8 1 ，1 9 8 3 ) 的5 级( a e ) 分级标准 观察记录；结薯指数( t u b e r i z a t i o n i n d e x ) = ( a i + 5 + b i + 4 + c i + 3 + d i + 2 + e i + 1 ) 单个重复的样品量( 单节茎段数量) 。 a i ：表示第i 次重复中诱导产生无匍匐茎的气生块茎的节段数； b i ：表示第i 次重复中诱导产生匍匐茎、且其顶端膨大形成块茎的节段数， 膨大的块茎直径至少为匍匐茎粗的2 倍以上； c i ：表示第i 次重复中诱导只产生匍匐茎的节段数； d i ：表示第i 次重复中诱导产生带叶的枝条的节段数； e i ：表示第i 次重复中诱导未产生任何反应，腋芽无任何发育变化的节段数。 所有实验数据的平均值、标准误、差异显著性、方差分析通过s p s s1 1 5 处 理，图表则由s i g m a p l o t3 0 1 绘制。 五、试剂与仪器 p c m b s 、p h l o r i d z i n 、n e m 、a 2 3 1 s 7 、l a c l 3 、t f p 和葡糖胺均购自s i g m a 公司， 其它试剂均采用国产分析纯。 r n a 提取试剂盒购于德国q i a g e n 公司，r e v e r s et r a n s c r i p f i o ns y s t e m 购于 p r o m e g a 公司，引物购于上海生物工程公司，其它p c r 相关试剂均购于s a b c 华 美生物工程公司。 仪器包括上海梅特勒一托利多仪器有限公司d e l t a3 2 0 型p h 计，p h a