（光学工程专业论文）激光诱导血浆自体荧光光谱识别胃癌的研究.pdf

激光诱导血浆自体荧光光谱识别胃癌的研究 激光诱导血浆自体荧光光谱识别胃癌的研究 摘要 近年来，荧光法癌症诊断，以其实时、客观、无毒副作用和灵敏度高等优势，引 起了国内外相关领域学者的广泛关注。癌细胞与正常细胞的代谢不同，其代谢物存在 于血浆中，导致癌症病人与健康人血浆的自体荧光光谱出现差异。因此，通过对他们 的光谱进行信息提取和分析，即可实现癌症的鉴别、筛查和诊断。 目前，有不少研究者利用癌症病人血浆的自体荧光特征峰来进行癌诊断研究。但 是由于血浆中多种荧光团的存在，各荧光峰相互交叠，形成的荧光光谱谱带较宽。仅 从光谱中选择特征峰进行分析，不仅十分困难，而且不能全面反映光谱的有效信息， 难以提高准确率。本文创新地对血浆的自体荧光光谱进行二阶导数光谱法处理，使其 相互交叠的光谱分离，然后采用偏最小二乘法结合人工神经网络( p l s - a n n ) 法对整 个光谱进行多因素信息提取，提高了癌诊断的准确率。 本文首先采用荧光分光光度计对4 5 例胃癌病人和健康人的血浆进行了自体荧光 光谱检测；同时，设计了激光诱导荧光( l i f ) 系统，使用l i f 系统对4 5 例血浆进行 激光诱导自体荧光光谱探测。对获取的光谱数据，采用国际癌诊断领域先进的信息提 取技术p l $ - a n n 法，用m a t l a b 语言编程分别对两种系统得到的自体荧光光谱进行数 据处理，其灵敏度、特异度和准确率分别是：8 6 、9 6 、9 3 ；9 5 ，1 0 0 ，9 8 。结 果表明，用p l sa n n 并结合二阶导数光谱法对用l i f 系统得到的自体荧光光谱进行分 析，胃癌诊断的准确率最高。另一方面，本论文采用高效液相色谱法定量分析了9 例 胃癌病人和4 例健康人血浆，发现胃癌病人和健康人血浆中原卟啉i x 含量的差异： 胃癌病人血浆原卟啉i x 的浓度范围为4 6 5 3 4 x 1 0 一一1 8x l o 一1 1g ul ，健康人血浆原卟 啉i x 的浓度为1 0 4 8 5x l o 一一1 9 3 5 2 x 1 0 。5ug ul 。为以血浆的荧光光谱特征进行癌诊 断研究提供了依据。 关键词：激光诱导荧光光谱；最小二乘法结合人工神经网络法：二阶导数光谱；胃癌 血浆：高效液相色谱法 激光诱导血浆自体荧光光谱识别胃癌的研究 s t u d yo nl a s e rin d u c e da u t o f iu o r e s c e n c eo fp la s mf o r s t o m a c hc a n c e rdia g n o sis a b s t r a c t m o r ea n dm o r ep e o p l ep a ya t t e n t i o nt ot h ee f f e c t i v ec a n c e ri d e n t i f i c a t i o nm e t h o d w h i c hi s s i g n i f i c a n tt os a v ec a n c e rp a t i e n t s l i v e s f l u o r e s c e n c es p e c t r o s c o p yw a sp a i d a t t e n t i o nt o ，f o ri t sa d v a n t a g e so fr e a lt i m ed e t e c t i o n ，i m p e r s o n a l i t yi n n o c u i t ya n ds oo n a l t h o u g ht h ec a n c e ri d e n t i f i c a t i o nu s i n gs p e c t r o s c o p yh a sb e e ns t u d i e de x t e n s i v e l y , i ti s s t i l la ti t sp r i m a r ys t a g e e s p e c i a l l yt h es l o ws p e c t r u ma n a l y s i st e c h n o l o g yh a sk e p tb a c k t h ed e v e l o p m e n to ff l u o r e s c e n c es p e c t r u mf o rs t o m a c hc a n c e rd i a g n o s i s l a s e ri n d u c e dn u o r e s c e n c e ( l i f ) s y s t e mw a ss e t u p i nt h e t h e s i s 4 5p i e c e so f a u t o l u o r e s c e n c eo fp l a s mw e r em e a s u r e db ym e a n so ff l u o r e s c e n c es p e c t r o p h o t o m e t e ra n d l i fs y s t e m 4 0 5 n mw a sc h o s e na se x c i t a t i o nw a v e l e n g t h t h ep a r t i a ll e a s t s q u a r e sb a s e d o nt h ea r t i f i c i a ln e u r a ln e t w o r k ( p l s - a n n ) w a su s e dt oa n a l y z et h es e c o n dd e r i v a t i v e s p e c t r a t h es e n s i t i v i t y , t h es p e c i f i c i t ya n dt h es u c c e s sr a t eo ft w os y s t e m sa r es e p a r a t e l y 8 6 、9 6 、9 3 ：9 5 ，1 0 0 ，9 8 s oi t sc o n c l u d e dt i l a tt h es e c o n dm e t h o dw h i c hw a s m e a s u r e db yl i fu s i n gt h ep l s a n nt oa n a l y z i n gs p e c t r aw a sm o r ee f f e c t i v ef o r i d e n t i f i c a t i o no fs t o m a c hc a n c e r o nt h eo t h e rh a n d ，ar a p i d ，s e n s i t i v ea n dr e p r o d u c i b l eh i g h p e r f o r m a n c el i q u i dc h r o m a t o g r a p h y ( h p l c ) m e t h o dw a su s e dt oa n a l y z ep o r p h y r i ni xi n h u m a np l a s m w i t l lf l u o r e s c e n c ed e t e c t i o na t6 2 8 n m ( e x c i t e da t4 0 4 n m ) i tw a sf o u n dt h a t t h ec o n c e n t r a t i o no fp o r p h y r i ni xi nc a n c e rw a s4 6 5 3 4 x 1 0 s - 1 8 x 1 0 p 肛1w h i l ei tw a s 1 0 4 8 5x 1 0 4 - 1 9 3 5 2 x 1 0 一g g p 1i nn o r m a lp l a s m k e y w o r d s ：i a s e ri n d u c e df i u o r e s c e n c e ：p a r t i a ii e a s t s q u a r e sa n da r t i f i c i a i n e u r a in e t w o r k ：s e c o n dd e r i v a t i v e s p e c t r a ：g a s t r i cp i a s m ；h i g h p e r f o r m a n c e i iq uidc h r o m a t o g r a p h y 独创声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究 成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经 发表或撰写过的研究成果，也不包含未获得 l 注! 地塑直基 丝盂要壁别童明的! 奎拦亘窒! 或其他教育机构的学位或证书使用过的材料。与我一 同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。 学位论文作者签名：4 c s , 互 签字日期：励锌，月如日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，有权保留并向国 家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。本人授权学校 可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或 扫描等复制手段保存、汇编学位论文。( 保密的学位论文在解密后适用本授权书) 学位论文作者签名：泵至、寻 导师签字： 另磊 签字目期：加6 年罗月九日签字日期：扣。z 年j - 月；。日 学位论文作者毕业后去向 工作单位： 通讯地址： 电话 邮编 0 1 课题的意义及来源 刖吾 随着人类社会的进步和科学的发展，人们生活水平和医疗水平不断提高，不少疑 难杂症被攻克，使得人类的平均寿命有所增加。但是作为人类生命的主要杀手之一的 癌症却未得到彻底的解决。在我国每年就约有2 0 0 万人发病，1 5 0 万人死于癌症。在 几种常见的恶性肿瘤中，胃癌的死亡率居首位。据统计，每2 3 m i n 就有一名中国人 死于胃癌。因此癌症的诊断和治疗成了全人类关心的话题。 所有癌症的发生发展都要经历诱导期、原位癌、浸润癌、癌症扩散四个阶段。在 癌或瘤的发生、发展过程中，其病变仅局限于粘膜与粘膜下层，并未侵及周围器官组 织，也无局部淋巴结或远处转移的原位癌和浅表浸润癌时的诊断临床上称为恶性肿瘤 的早期诊断。依靠现有的治疗手段，大部分早期癌症能得到医治，而到晚期只能得到 症状改善的姑息治疗效果。资料表明，如能早期发现，并且立即进行适当的治疗，5 以上的病人可以治愈，8 0 一9 0 以上的病人能生存五年以上，而且也大大降低了治疗 费用，减少痛苦及致残后果。因此，实现癌症的有效诊断，尤其是早期诊断，是延长 甚至挽救癌症患者生命的关键。 现有的癌症诊断方法有很多。“，如采用肿瘤标志物、x 射线、c t 、磁共振、放射 性核素、超声等多种技术，它们多数都是利用组织的形态特性进行诊断，但是检查过 程中接受的辐射和检查所需服用的药剂常常对身体有害，有些诊断费用还很高。而且 对怀疑对象最终仍然需要取样活检通过最权威的病理学证实。活检是对取样活组织标 本进行病理组织切片检查分析，具有较高的准确率。但活检存在许多不可克服的缺点， 如：微小病变和较深层病变易被漏检；活检取样时主观随意性较大，往往因随机取位 不准而误诊；需花费较长的时间和代价在体外进行，存在一定风险，不能“实时诊断”， 易延误治疗。因此，人们一直在致力于寻找一种能正确指导或替代活检的诊断方法， 但到目前为止，还没有一种非损伤型的、诊断率较高的癌症检测手段应用于临床，因 此找到一种方便、快捷、有效的诊断方法无疑意义重大。 光谱学和光谱检测技术是通过物质”5 。6 1 ( 原子、分子、团簇等) 对光的吸收与发 激光诱导血浆自体荧光光谱识别胃癌的研究 射，研究光与物质的相互作用，研究物质结构、物化特性和物理化学定律等。荧光光 谱技术属于光谱技术中的一种，是分析物质成分和分子结构的有力工具，通过研究组 织和体液的荧光光谱就能够获得细胞的组成和代谢信息，而且具有极高的光谱和时间 分辨率、灵敏度以及无损、安全、实时等优点而成为光生物医学的主要研究领域，也 为癌症的诊断开辟了一条新的途径。 目前，在胃癌筛查及诊断方面虽已建立了些新的方法，但仍有必要在此基础上 寻找更为有效而快速，易于被接受的检测方法。由于癌细胞和正常细胞代谢不同，其 代谢物存在于血浆中，导致胃癌病人血浆与健康人血浆的自体荧光光谱出现差异，从 而能间接反映血液组成成分和含量的变化，并能够由此发现识别胃癌病人血浆的特征 光谱或数学判据。根据这些差异，就可能实现胃癌的鉴别、筛查和诊断。因此具有广 阔的临床应用前景和很高的研究价值。 本文分别采用氙灯和低强度激光光源的4 0 5 n m 波长诱导血浆荧光光谱，对4 5 例 血浆进行了荧光光谱检测：在数据处理方面，摒弃了传统的以峰值强度、峰值强度比 值等单因素作为判据，采用国际癌诊断领域先进的信息提取技术偏最小二乘法结合人 工神经网络法( p a r t i a ll e a s t s q u a r e sa n da r t i f i e i a ln e u r a ln e t w o r k ，简称 p l s a n n ) 并结合二阶导数光谱法对实验数据进行分析，提高了诊断的准确率。并用 高效液相色谱法测量胃癌病人和健康人血浆中原卟啉i x 的浓度，从分子水平上来确 定胃癌病人和健康人血浆中原卟啉含量的差异。使用m a t l a b 语言编程完成各种数据 处理。 本论文的研究来源于国家自然科学基金项目“无创智能激光光谱癌诊断研究”和 青岛市自然科学基金项目“自体荧光光谱确定组织中胃癌含量及机制分析”。 o 2 国内外的研究现状 近年来，国内外荧光法肿瘤诊断的研究非常活跃。许多学者致力于利用光与血浆 相互作用后血浆所表现出来的特性，用自体荧光光谱法对各种癌症进行检测，以获得 精确的诊断信息，进而研制出简单可行的诊断仪器。 早在上世纪5 0 年代，人们就已经开始利用物质的发光特性及其吸收光谱来判定 它们的特定的物理、化学性质。6 0 年代初，生物学家开始研究蛋白质、核酸、游离核 激光诱导血浆自体荧光光谱识别胃癌的研究 苷酸等细胞大分子物质的荧光，发现一定的荧光光谱与某些特定的分子结构相关。其 后的研究进一步发现可采取各种方法诱导物质的固有荧光，即自体荧光或内源荧光， 并可以根据它们荧光光谱特征判定物质结构。近年来，很多学者已经或正在进行内源 荧光法鉴别肿瘤组织和筛查癌症的研究。 国外在这方面的研究起步较早，1 9 2 4 年，p o l i c a r d 首次在实验室中观察到肿瘤 组织的自体荧光，认为是受细菌感染在肿瘤中形成的内源性卟啉所致，并在特定光激 发下产生荧光。而k o r b l e r 等否定了他的看法，认为是由卟啉前驱物在肿瘤组织中优 先积聚造成的。日本的福富久之、佐佐木功典、西坂刚等将激光导入癌病灶，观测到 了胃癌、结肠癌组织的红色荧光。日本的熊谷博采等人自1 9 7 0 年以来就对胃癌粘膜 的自体荧光进行了观察和记录。他们用汞灯、激光作光源，观察到5 8 0 n m 附近的黄色 荧光，提出了用这种黄色荧光作为癌症检查手段的可能性”1 。 孟继武教授等经过对胃组织匀浆和胃液的光散射和荧光实验，综合分析后认为特 征荧光所标志的物质，可能是一种与癌组织的代谢、免疫相关的物质。而且由于一般 情况下，癌细胞的代谢、免疫产物均存在于患者的静脉血中。因此，这种特征荧光的 标志物也应存在于患者的静脉血中，推断这种物质是卟啉化合物，来源于卟啉代谢， 于是开展了血清、血浆荧光光谱的研究”，将荧光法癌症诊断的研究向前推进了一 步，从肿瘤的定位迈向了真正意义上癌症的早期发现和早期诊断。 1 9 8 8 年，孟继武教授等人在研究血清光谱时发现：在4 0 5 n m 光源激发下，癌症患 者血清光谱分别在6 3 0 n m 和6 9 0 n m 出现两个明显的发射峰，而健康人的没有或者不明 显，认为这是由于癌症患者血清中具有特异性的卟啉类化合物引起的“。1 9 9 1 年又 发明了血清荧光法恶性肿瘤诊断技术并应用于i 临床。先后在1 2 个大城市均有临床应 用，对一些具体数据的做了统计学分析。并于1 9 9 2 年将该项技术介绍到日本，进行 了早期胃癌的临床诊断，而且受到了日本学者的高度评价：“该方法不仅适用于恶性肿 瘤的l 临床诊断也能跟踪疗效。”之后进一步的研究确定这种特异性的卟啉类化合物就 是原卟啉i x ，并据此提出了肿瘤诊断的判据“，认为可用于癌症的普查“。 1 9 9 7 年，彭燕等用2 0 0 n m 、2 5 0 n m 、2 9 0 n m 的紫外光激发消化道癌症患者的血清样品， 发现在3 5 0 n m 一8 0 0 n m 的波长范围内，光谱呈现四个发射峰，分别在3 2 0 n m 一3 4 0 n m 、 4 0 0 n m4 6 0 h m 、6 3 0 n m 和6 9 0 n m ”。北京医科大学的林三仁“，福建医科大学的林孟戈等 激光诱导血浆自体荧光光谱识别胃癌的研究 人“”也对癌症患者血清光谱的特异性做过相关的报道。1 9 9 4 年赵晓杰等开始了激光诱 导血清荧光诊断肝癌的研究。2 0 0 0 年陈雨强。”等用低强度激光诱导血浆自体荧光光 谱，认为激光诱导血浆荧光光谱可作为临床诊断。 多种荧光团的存在及内部局部微环境的多变性导致血浆的荧光光谱的复杂多变。 血浆的成分、其成分之间的相互作用、光谱仪的影响( 检测器，环境对基线的影响等) 和血浆的前期处理等许多因素对光谱都有影响。这些都给荧光光谱分析带来一定的困 难，而荧光光谱分析技术对于提高利用荧光光谱诊断肿瘤的准确性至关重要。因此， 运用先进的光谱信息提取技术对荧光光谱进行数据处理受到越来越多的致力于利用 荧光光谱进行肿瘤诊断的研究者的重视。 在早期研究中，研究者对荧光光谱的分析是比较简单的，大多研究者以峰的位置 或强度作为判据对肿瘤荧光光谱进行分析的。如孟继武“”1 等研究得到血浆中用特征 峰6 3 0 n m 并用峰和谷的强度比值得到诊断胃癌的经验公式i = i 。i 。一1 。由于血浆荧光光 谱的复杂多变，无论是以峰的位置为判据，还是以荧光强度为判据，其诊断的准确性 都不尽如人意。也有人引用二阶导数光谱法和高斯拟合法，减少成分之间的交叠引起 的误差，并用多个峰值来判断癌变和健康人血浆的差异，如，丁建华等采用二阶导数 光谱法“”和高斯拟合法分析白鼠血清荧光光谱。 到了9 0 年代后期，研究者们开始认识到选择研究整个光谱比仅仅研究光谱中的 几个点能够获得更多的信息。r a m a n u j a m 等人应用主成分法( p r i n c i p a lc o m p o n e n t a n a l y s i s ，简称p c a ) 区分正常和发炎的鳞状上皮细胞“，取得了理想的区分结果。 l i s b o ap j 等用人工神经网络( a r t i f i c i a ln e u r a ln e t w o r k s ，简称a n n ) 分析癌o “。 n a y a kg s 用p c a 和a n n 结合分析了口腔癌的组织提高了癌的诊断率。”。w a n g 等人对 口腔癌的荧光光谱进行了研究，并先后应用偏最小二乘法( p a r t i a ll e a s t s q u a r e s ， 简称p l $ ) 及偏最小二乘法结合人工神经网络法( p l s a n n ) 对口腔癌进行了分类”7 2 ”。 马君等用p l s a n n 法应用到胃癌组织中进行判别分析汹，其准确率高达9 3 。多因素 信息提取技术以整个光谱作为研究对象，充分考虑各因素的变化在光谱中引起的差 异，通过对光谱信息中主成分的提取和分析，充分考虑各因素的变化在光谱中引起的 差异，同时去除噪音的影响。其中以偏最小二乘法结合人工神经网络法( p l s a n n ) 最具优势，它结合了人工神经网络技术，解决了光谱中存在的非线性现象的影响，提 激光诱导血浆自体荧光光谱识别胃癌的研究 高了癌识别的准确率。 除了对血浆的自体荧光光谱进行了光谱峰值、峰位等研究以外，不少研究者还对 血浆中的荧光物质进行了定量测定。高效液相色谱法。”以其快速、灵敏、准确、微量 和重复性好的特点，广泛地被用在生物化学、药理学、免疫学等学科，也被用在临床 医学的研究中，极大地促进了临床医学的发展。早在7 0 年代，d a v i s 、u z i e l 等人就以 高效液相方法分析了肿瘤患者与正常人尿液之间甲基化核糖核酸和碱基的差异。随后 r i c h a r da ”由以高效液相方法分析了正常人与肿瘤患者血清中小分子物质的成分，发 现两者的光谱存在差异。d e n i sjm 等以高效液相方法分析了肿瘤患者血清中肿瘤的标 志物的含量变化。国内，2 0 0 0 年王亮等用高效液相色谱法测胃癌病人血浆中的氨基 酸浓度。林三仁等用高效液相色谱法分析方法测定胃癌病人的胃液的特异物质。“3 。 黎远东用高效液相色谱法分析方法对肝癌病人和正常人血清同时进行了锌卟啉和原卟 啉的测定o ”。 总之，人们用不同的激发波长，通过光谱或成像等方法，对人体肿瘤组织和血浆 受激产生的自体荧光进行了大量的研究和观察，发现了肿瘤患者与健康人荧光的不同 特征，并对光谱差别的来源做了一些探索。在对肿瘤组织的研究中已经采用多因素信 息提取技术，提高了诊断的准确率。然而，在对于血浆的自体荧光光谱的分析中只用 峰值比法、二阶导数光谱法等，还未引入多因素信息提取技术。 0 3 本论文的结构安排 由于荧光法癌症诊断所具有的实时、客观、无毒副作用和灵敏度高等优势，引起 了国内外学者的广泛关注。原卟啉i x 是人体内一种能发射荧光的微量代谢产物，癌 症会导致卟啉代谢的异常，因而成为我们在荧光法癌症诊断的研究中所关注的对象。 本文首先采用荧光分光光度计对4 5 例胃癌病人和健康人的血浆进行了自体荧光光谱 检测：同时，设计了激光诱导荧光( l a s e ri n d u c e df l u o r e s c e n c e ，简称l i f ) 系统， 使用l i f 系统对4 5 例血浆进行激光诱导自体荧光光谱探测。然后，对获取的光谱数 据，采用国际癌诊断领域先进的信息提取技术p l s a n n 并结合二阶导数光谱法进行分 析。最后，用m a t l a b 语言编程完成智能癌诊断软件。另一方面，利用高效液相色谱 技术定量测量胃癌病人和健康人血浆中原卟啉i x 的含量。 5 激光诱导血浆自体荧光光谱识别胃癌的研究 本文共分六章。第一章和第二章为理论依据，第三、第四和第五章为实验数据及 分析。第六章为总结。论文的主要内容概括如下： 第一章生物分子荧光光谱及探测技术。详细而全面地概括了荧光光谱的相关理 论，包括了光致发光的原理、生物体内的发光源、血浆的组成成分和光谱特性、原卟 啉i x 的结构和光谱特性以及影响荧光的因素。 第二章信息提取理论。介绍了平滑、面积归一、二阶导数光谱等光谱数据预处 理方法和单个峰值比、p l s a n n 等分析判别法，其中详细地阐述了本论文的信息提取 方法( p l s a n n 法) 的原理。 第三章荧光分光光度计测血浆的自体荧光。采用4 0 5 n m 波长的x e 氙灯激发胃癌 病人和健康人血浆得到自体荧光光谱并对其进行二阶导数光谱法处理将重叠的谱带 分离。用p l s a n n 法分别分析血浆的自体荧光光谱和它的二阶导数光谱。并使用 m a t l a b 语言编程进行光谱数据处理。 第四章激光诱导血浆自体荧光。4 0 5 n m 波长激光激发胃癌病人和健康人血浆的自 体荧光光谱并对其进行二阶导数光谱法处理将重叠的谱带分离。用p l s a n n 法分别分 析血浆的自体荧光光谱和其二阶导数光谱。并使用m a t l a b 语言编程进行光谱数据处 理。 第五章高效液相色谱法定量分析血浆中的原卟啉。简单介绍了高效液相色谱法 的基本原理、实验系统。采用4 0 4 n m 波长激发，6 3 8 n m 波长荧光探测，得到胃癌病人 和健康人血浆的色谱图。利用标准原卟啉溶液色谱图的面积和质量关系得到线性回归 方程。根据线性回归方程和胃癌病人和健康人血浆的色谱图的原卟啉i x 的面积，计 算胃癌病人和健康人血浆中原卟啉i x 的含量。 第六章总结和展望。对本论文的工作进行了总结，通过对荧光光谱法用于癌症 诊断的优势和存在的问题进行分析，提出了下一步努力的方向。 第一章生物分子荧光光谱及探测技术 生物体内含有多种生物大分子，受到光照射时，会发射出荧光。不同的分子其能 级结构不同，吸收光和发射的荧光也就不同，同一种物质当其含量不同时，发射荧光 的强度就会产生相应的差异。当人体发生病变时，体内的生物分子代谢以及微环境就 会发生相应的变化，进而导致其荧光光谱的变化，因此可以利用光谱仪器探测生物分 子的荧光光谱，通过对其光谱特征的分析实现对疾病的探测。本章对分子荧光涉及的 基本概念、原理、方法、影响因素进行了简单的介绍。 1 1 光致发光的基本原理 1 1 1 从能级结构解释荧光产生的过程 探究荧光的产生要从分析分子的能级结构开始。生物组织是由有机分子构成的， 用光谱技术分析生物分子的本质是检测分子的能级。分子总能量可以表示为电子能、 振动能和转动能三部分之和，其中振动能级和转动能级是迭加在电子能级之上的，荧 光的产生在于分子能级之间的辐射跃迁。对大多数有机分子，其电子能级的基态是单 重态s 。倘若分子吸收能量后电子的总自旋仍为0 ，这时分子处于激发的单重态，用 s 。( n = l ，2 ) 表示，如跃迁过程中总自旋变为l ，分子便处于激发的三重态，用t 。 ( n = l ，2 ) 表示。对应于每一个激发单重态都有一个三重态，它们处于较低的能级， 也就是说最低的电子激发态是一个三重态。“”。 生物分子受激发射荧光历经的时间很短( 1 0 。5 - 1 0 。s ) ，但却经历了极其复杂的能 量转移和驰豫过程。辐射跃迁的过程中，发生光子发射，伴随着荧光或磷光现象；无 辐射跃迁的过程中，电子激发能转化为振动能或转动能；无辐射跃迁包括内转换和交 叉驰豫。内转换指的是相同态系体系间的跃迁，交叉驰豫指的是不同态系体系之间的 跃迁，同时，在相同电子态的不同振动能级之间还存在振动驰豫作用。 激发单重态间的内转换速率很快( 1 0 ”一1 0 ”s 1 ) ，由于内转换和交叉驰豫过程的 速率，与该过程所涉及的两个电子态的最低振动能级间的能量差有关，能量差越大， 速率越小，而s 和s 。两个电子态的最低振动能级问的能量差，在绝大多数情况下远比 其他相邻的两个激发单重态之间的能量差大，因而s 一s 。的内转换速率常数相对的要 激光诱导血浆自体荧光光谱识别胃癌的研究 小得多。因而更高激发单重态的寿命通常很短，处于这种电子态的激发分子，除少数 外，在可能发生辐射跃迁之前，便发生了到达s 电子态的非辐射驰豫。发生于单重态、 三重态之间的交叉驰豫，由于该过程是自旋禁戒的，因而其速率常数远小于内转换过 程的速率。因此，所观察到的荧光现象，通常情况下是发自s 。态的最低振动能级的辐 射跃迁。 分子荧光的产生可以由图1 1 来加以说明。 单重态 振动驰豫 内转换 孓喜茬圣邕 图ll 荧光和磷光体系能级图 当分子受到波长为与其吸收带相吻合的照射光激励时，它将吸收能量并被由基态 激发到单重态的第一电子激发态( s ；) 或更高电子激发态的振动能级上，并保持电子 的自旋态。处于激发态的生物分子是不稳定的，它们会很快( 约1 0 1 2 - i 0 1 4 s ) 发生振 动驰豫，将多余的能量传递给介质而降落到该电子态的最低振动能级( v = o ) 。对高于 s 的电子态，此后又经由内转换及振动驰豫而降落到s ，电子态的最低振动能级。处于 s 最低振动能级的分子，其驰豫过程有如下几种途径：( 1 ) 发生s 。一s 。的辐射跃迁而 伴随荧光现象：( 2 ) 发生s ：一s 。的内转换过程；( 3 ) 发生s 一t 的交叉驰豫。而处于 t i 态的最低振动能级的分子，则可能发生t 一s 。的辐射跃迁而伴随磷光现象，也可能 发生t 。一s i 的交叉驰豫，降落到基态的各个能级。最后，电子以无辐射驰豫到达基态 中的最低振动能级。 激光诱导血浆自体荧光光谱识别胃癌的研究 1 1 2 激发光谱和发射光谱 由荧光的发光原理可知：分子产生的荧光由第一电子激发态与基态的能级差决 定，和分子被激发到哪一能级无关，也与激发光的波长无关，只与荧光物质本身的能 级结构有关。所以可以根据光谱曲线，对荧光物质进行分析鉴别，因此实验中探测待 测样品的激发光谱和发射光谱，通过分析其特征和差异，确定生物分子中物质成分。 激发光谱：就是通过测量某一波长的荧光强度随激发波长变化而获得的光谱，它 反映了不同波长激发光引起荧光的相对效率。通常激发光谱的形状与吸收光谱的形状 很相像，但由于仪器因素( 如检测器的响应特性) 的影响，往往又有所差异。 荧光发射光谱：又称荧光光谱，指的是荧光强度随波长的变化关系，它反映了分 子在不同波长上发射荧光的相对强度。 荧光光谱具有以下特点： a 斯托克斯位移，即相对吸收光谱和激发光谱，荧光光谱总是出现在更长的波 长处； “ b 荧光发射光谱与激发波长无关，吸收谱可以有几个吸收带，荧光发射仅对应 从s 的最低振动能级到s 。各振动能级的跃迁； c 吸收光谱与发射光谱呈镜像对称关系。 因受激分子在上升和下降的过程中损失了一部分能量，所以荧光的波长总比激发 光的波长稍长。由于回落至基态的不同振动能级时，光子携带的能量不同，所以光子 的频率也不同，因而每种物质都会发出多个波长的特征荧光，不同物质也会因此发出 不同的特征荧光。不同波长的激光激励同一组织，其自体荧光也是有差别的；不同组 织所含荧光物质的种类和数量不同，用同种波长激光激励，产生自体荧光也不同。 尽管几乎所有的物质都有吸收光谱，但不是所有的物质都发荧光。产生荧光必须 具备一定的条件：该物质分子必须与照射光有相同的本征频率，即能吸收激发光的光 子并从基态跃迁到激发态；该物质必须具有较高的荧光效率。照射光越强，被激发到 激发态的光子越多，产生的荧光越强，检测的灵敏度越高。 激光诱导血浆自体荧光光谱识别胃癌的研究 1 1 3 有机分子的荧光光谱 分析光谱的最终目的还是要研究发光物质，物质分子结构与荧光的发生及其强度 紧密相关，因此可以根据荧光光谱推测有机分子的结构特征，反过来也可以根据有机 分子结构判断该物质的荧光光谱特性。 能 量 术+ 。 术。 n 术。 个 n n 反键轨道 反键轨道 未反键轨道 成键轨道 成键轨道 图1 2 有机化合物分子中价电子的能级与电子跃迁 通常有机物只有。轨道、n 轨道、未成键的n 轨道以及与0 、n 两种反键轨道 问的电子跃迁，如图1 2 所示。能够发射荧光的物质应同时具备两个条件，即物质分 子必须有强的紫外一可见吸收和一定的荧光效率。分子结构中n n 跃迁、n o 跃迁和n n 跃迁都有紫外一可见吸收。未成键n 电子能量比n 电子能量要高，更容 易被激发，但由于n n $ 电子跃迁概率小，相对于n 一” ，荧光微弱，所以实际上 只有分子结构中存在共轭的n n 跃迁，才可能有荧光发生m 4 “。一般来说，有机 分子结构的差异会对吸收和荧光的波长和强度产生影响，强荧光物质通常具有以下特 征： a 绝大多数能够产生荧光的物质都含有芳香环或杂环，具有大的共轭n 键结构， 共轭度越大，激发和发射波长越长，荧光强度也会增大； b 在同样的长共轭分子中，刚性和平面性越大，荧光效率也越大，而且荧光波 长红移： c 最低单重电子激发态为n 、 型； d 荧光分子上的各种取代基对分子的荧光光谱和荧光强度都产生很大的影响。 激光诱导血浆自体荧光光谱识别胃癌的研究 给电子取代基，能增加分子的共轭程度，使荧光效率提高，波长红移，如- - o h ，一 o c h 3 ，- - n h 2 ，- - c n 等。吸电子取代基会起到相反的作用。 1 1 4 荧光强度与荧光物质浓度的关系 荧光强度i ，正比于吸收的光量( 光强) i 。及荧光量子产率o ，： l = i 。中f 吸收的光量( 光强) i 。应为入射光的光强的光强i 。与透射光的光强i 。之差，即： i 。= i o i 。 根据吸收定律( 朗伯一比耳定律) ： i _ i o1 0 础。 所以： i f = i a 驴f = 砂f ( i o - i 洲f i o ( 1 一1 0 越。) 。批( 1 _ e - 2 3 0 3 8 b c ) 式中，e 为摩尔吸光系数，b 为样品溶液的光程( 即液池的厚度) ，c 为样品的摩尔浓 度。而e - 2 3 曲的展开式为： 。_ 2 3 曲。：卜23 0 3 b 。一! 二! ：! ! ! 生蔓。( - 2 3 0 3 b c ) 3 当浓度c 很稀，吸收光量不超过总光量的2 时， g b c 00 5 ( 约为0 0 2 ) ，则展开式 的高次项可忽略，即： e - 2 3 击。= 1 23 0 3 s b c 所以： i f223 0 3 十f i o s b c 当i 。及b 一定时： ir = k c 上式表明，荧光强度与荧光物质的浓度成正比，这是荧光分析法是量分析的依据。 但是，应该注意的是，此式只适合于荧光物质的稀溶液。当c 较大， g b c o02 时， 线性关系将受到破坏。其原因是受激后的激发态分子与体系中的其他分子所碰撞，使 其以非辐射击跃迁的形式激化，产生荧光猝灭，或者激发态分子所发射的荧光被没受 激发的分子所吸收，而又因中，一般少于i 所以发生所谓的“自吸收”现象而使荧光 减弱。为了减少碰撞去激发的机会，可以用降低温度，增大溶液粘度或把荧光( 磷光) 激光诱导血浆自体荧光光谱识别胃癌的研究 物质附着在固体，支撑物测定的方法，以减少猝灭效应。 1 2 生物体内的发光源 荧光物质广泛存在于人体的组织和体液中。在生物大分子中存在着大量不同能量 量子态的分裂现象。结合在一起的原子中的电子可以相互作用，同时和一个以上的原 子核发生作用，如果使原来的能级劈裂成大量的亚能级，原子间的相对运动、振动和 转动能使亚能级进一步劈裂而形成能带，能带反映了生物组织内部相互作用的详尽而 复杂的信息。 生物医学中比较重要的天然荧光分子( 荧光团) 常常是分子庞大而机构复杂的有 机化合物“，多数具有共轭双键的系统，如维生素、核酸、氨基酸、蛋白质、胺类、 酶、辅酶和卟啉等生物大分子以及许多有机芳香族化合物，在一定波长激发下，生荧 团能发射特定波段范围内的荧光。表1 i 列举了常见生荧团以及它们的最佳激发波长 和发射峰波长“。 a 蛋白质的内源荧光 蛋白质的荧光来源于色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸。它们的相对荧光强度为 1 0 0 ：9 ：5 。当蛋白溶液为中性时，采用波长为2 8 0 n m 的光激发，发射波长范围位于 3 2 0 n m 一3 5 0 n m 波段。如果蛋白质中不含色氨酸，只含酪氨酸和苯丙氨酸，则荧光光谱 主要表现酪氨酸的特征，最大发射波长约为3 4 0 n m 。对于含有色氨酸的蛋白质，荧光 光谱则主要表现色氨酸的特征，最大荧光发射波长位于3 2 0 n m 一3 5 0 n m 之间。 b 天然色素的内源荧光 维生素大多含有芳香环结构，本身具有较强的荧光。植物、藻类或光和细菌中含 有各种色素和辅助色素分子，它们都含有荧光团。根据它们的荧光激发谱和荧光发射 谱可用来鉴定色素的存在及含量，也可以用来分析光合作用过程中能量的吸收与传 递。 c 生物组织的内源其他( 白体) 荧光 生物组织中的胆红素、核黄素、卟啉、v b 。等均为内源性荧光物质。其中卟啉是 激光诱导血浆自体荧光光谱识别胃癌的研究 一类广泛存在于自然界的天然色素，广泛存在于血红蛋白、细胞色素、植物叶绿素等 生物组织中。 自体荧光光谱能反映分子的化学结构和所处的微观环境的状态信息，可以直接通 过测量其荧光来确定其存在、分布及数量，从而在生物分子、医药和临床分析中具有 广泛的应用”3 “。 不同生物组织由于分子结构不同，相对于正常组织而言，肿瘤组织在发展过程中 由于代谢等生理活动的特殊性，会导致某些荧光物质相对量的变化。而癌细胞的代谢、 免疫产物均存在于胃癌病人的静脉血中，血浆包括了血液中除去红细胞以外的大部分 物质。因此，血浆中相应的荧光物质含量相对发生变化，进而引发其荧光光谱的变化， 可表现为荧光强度和谱线形状的改变。因此利用血浆自体荧光光谱的改变在相当程度 上可表现胃癌病人血浆与健康人血浆的某些物质含量的差异。又由于光谱分析法具有 高灵敏度，能够灵敏的反映一般组织学不能反映的特点，达到诊断的目的。 但是在人体与动物体内能发射荧光的物质有很多。每一种荧光物质存在一定的浓 度和特定的吸收光谱及荧光发射光谱，血浆荧光光谱来源于血浆中多种荧光物质的组 合。对于某一波长的激光，能被直接激发的生物分子是很多的，由于生物系统的复杂 性，激发能的转移方式也是多种多样的，每一荧光物质的发射光谱都具有一定的宽度， 多种荧光物质的光谱组合后，彼此会有重叠，因此生物荧光光谱也相当复杂，难以独 立的反应血浆中某一类物质组分的特征，目前还没有研究出能够将各种成分的含量对 荧光光谱的分量贡献建立直接的数学关系，这也是荧光技术在血浆诊断应用中的局限 性。 1 3 血浆的组成和光谱特性 血液由血浆和血细胞组成。其化学成分复杂，其7 5 8 5 是水分，其余为溶解在 水中的固体物质，它们在血液中存在是血液循环和细胞中物质代谢的结果。从血管中 抽取少量血液，并加入适量抗凝剂( 如肝素) ，血液的有形成分经自然沉降或离心沉 淀后，可分出三层：上层为淡黄色的血浆，下层为红细胞，中间的薄层为白细胞和血 小板，如图1 3 所示。 血浆中含有9 0 一9 2 的水分，其余为溶质。在溶质中以血浆蛋白含量最大，约占 激光诱导血浆自体荧光光谱识别胃癌的研究 血浆的6 2 一7 9 ，无机盐约占0 9 ，其余为非蛋白质的有机物，包括含氮的和不 含氮的两类，如图1 4 。 圈1 3 血液分层成分示意图 图14 血浆组成成分 等约3 血浆中的这些成分，有的是从消化道和肺吸收进来的如葡萄糖和氧气等，有的是 从组织细胞排出的，如二氧化碳和尿素等。这些成分的量经常在一定范围内变动，在 疾病的情况下，血浆某些成分的量可偏离正常范围。因此，通过测定血浆的化学成分 能在一定程度上反映体内物质代谢的情况，有助于评定疾病的诊断。 当光照射到血浆，会发生吸收、发射和散射等现象。通过检测和分析血浆的吸收 光谱、发射光谱和散射光谱，能够获得一些反映血浆内部物质构成情况的信息，以及 光量子与血浆相互作用过程的有关信息。 血浆对可见光可能存在瑞利散射和拉曼散射等，瑞利散射是弹性散射，即散射光 与入射光的光谱相同，这些散射可视为激发光。而拉曼散射是一种非弹性散射，但是 拉曼散射光的强度通常比激发光弱1 0 一一1 0 。倍“。所以研究谱线中基本看不到这种散 射谱线，几乎可以忽略。 因为血浆中含有大量具有n 共轭双键体系的大分子“”，形成了荧光生色团( 简称 荧光团) ，在波长为6 0 0 n m 附近会发射比较强的荧光。国内也有几个科研小组致力于 血浆荧光光谱的研究“”1 。 激光诱导血浆自体荧光光谱识别胃癌的研究 1 4 原卟啉的结构与光谱特性 原卧啉是生命活动中非常重要的分子，是一种杂环化合物，其结构特点是由4 个 吡咯环连接组成的大环，如图1 5 所示“。卟啉代谢是人体正常的生理活动之一。m g o u t e r m a n 等曾进行过理论研究，并提出四轨道理论模型，根据这一模型，原卟啉化合 物分子在可见光谱区的跃迁谱带强度应由原卟啉环n 电子大共轭体系的最高充满轨 道b a ( a 2 u ) 和最低空轨道b 2 ( a l u ) 的能量差所决定。随着能量差的增加也相应地减小 电子跃迁的强度“。 原卟啉是合成血色素的中间代谢物之一。机体中产生了癌症必然要引起种种生理 反应，对机体的原卟啉代谢产生影响，造成其代谢异常，使原卟啉这一中间代谢物发 生积累，使得胃癌病人出现了原卟啉代谢水平升高，因此可以把它作为标识物，通过 该物质的检测进行癌诊断“。 卟啉类光敏物质通常具有在6 0 0 - - 7 0 0 m n 波长范围内发射荧光的特征。原卟啉的 激发光谱在4 0 4 r i m 处有最大的吸收峰，如图1 6 实线所示。它的发射光谱在6 2 8 r u n 处有一最大荧光发射峰，其次为6 9 0 m n ，如图1 6 虚线所示。因此原卟啉的最佳激发 波长为4 0 4 n m ，最佳检测的波长为6 2 8 n m 。 p p 图l5 原卜啉i x 的化学结构式 1 5 影响荧光的因素 w a v e l e n g t h ( n m ) 图1 6 原卟啉i x 的激发光谱和发射 因为荧光检测的灵敏度很高，所以在对血浆进行荧光检测和分析的过程中也容易 激光诱导血浆自体荧光光谱识别胃癌的研究 受一些外界因素影响。 首先必须考虑待测物质所处的环境，这里的环境因素包括：样品放置于水中、生 理盐水中、还是空气中以及外界光的强度；如果放在某种溶剂中，那么是什么溶剂、 其纯度、浓度是多少，是否采用避光检测等所有这些因素都能对待测样品的荧光光谱 产生影响。比如：有些物质在水中几乎不产生荧光，而在乙醇中就会产生。溶剂的纯 度和浓度也会影响到物质荧光光谱的强度和峰值的位置。有些物质有光解特性如卟啉 类物质，不采用避光措施检测，会迅速光解，其荧光光谱强度降低。 血浆中并存着许许多多不同种类的有机生物成分。如果某种成分对激发光能或生 物荧光有明显的吸收，我4 f j n 称之为“内滤光现象”。这种情况肯定会影响到血浆的 荧光光谱。 温度对血浆荧光强度的