（农业生物环境与能源工程专业论文）失水胁迫对月季切花花瓣内肽酶种类及其活性的影响.pdf

中文摘要 本试验以探讨“失水胁迫对花瓣内肽酶活性和种类的诱导及其对月季切花失水胁迫耐性的影 响”为目的。首先选用耐失水品种s a m a n t h a 和中度耐失水品种b e l a m i ，并且以刨造不同的 胁迫程度为目的，分别进行了带枝花和离枝花两种方式下的失水胁迫处理，采用分光光度法测定 了内肽酶的活性与种类，在此基础上以s a m a n t h a 为试材，进行反复失水胁迫处理，通过底 物胶电泳法进一步探讨了失水胁迫对内肽酶活性和种类的诱导。 1 、两品种之间的比较研究表明 1 ) 在o 6 0h 失水胁迫过程中，带枝花花枝复水率出现由缓慢f 降到快速下降的拐点， s a m a n t h a ( 3 0h ) 晚于b e l a m i ( 2 4h ) ；两品种花朵水势对应于复水率拐点呈现高度吻合的 由快速下降转向缓慢下降的转折点。 2 ) 两品种花瓣内肽酶活性诱导上升的转折点与其相应的复水率迅速降低的拐点相一致。胁迫 诱导引起的花瓣中金属蛋白酶和丝氨酸蛋白酶活性的变化均是s a m a n t h a 显著低于b e l a m i 。 离枝花获得了与带枝花的一致的结果。 由此说明，切花月季品种间失水胁迫耐性差异可能与胁迫对花瓣中金属蛋白酶和丝氨酸蛋白 酶活性诱导的差异有关。对s a m a n t h a 的诱导显著低于b e l a m i ，这可能是s a m a n t h a 较 b e l a m i 耐失水的原因之一。 2 、 s a m a n t h a 反复失水胁迫处理结果表明： 1 ) 失水胁迫2 4h 后，经6h 复水花颈弯曲状况能够恢复到正常状态，同时花朵水势能够 恢复到胁迫前的水平，但是花枝鲜重和花瓣内肽酶活性却在复水1 2 h 才基本上恢复到胁迫前水平； 再次失水胁迫，花枝形态和花朵水分状况都表现出与第一次胁迫相近的变化，但是花瓣内肽酶活 性较第一次胁迫过程中的变化更剧烈，上升幅度更大。 2 ) 花瓣中丝氨酸蛋白酶活性的迅速增加与切花的衰老紧密联系：失水胁迫强烈诱导了丝氨 酸蛋白酶活性，失水胁迫1 8h ，其活性就和自然衰老过程中萎蔫期( 6 级) 时的相同，复水6h 仍不能明显下降，再次失水胁迫6h 其活性就已经达到萎蔫期( 6 级) 时的水平；a b a 预处理减 轻了失水胁迫的征状，水势的降低、鲜重的损失及内肽酶活性的水平都显著被抑制。 3 ) 试验中对月季切花花瓣内肽酶底物胶电泳测定方法进行了优化，结果表明，花瓣蛋白粗 提液通过s e p h a d e xg - 2 5 柱子去盐去色素等杂质后，在4 0 下前处理1 0m i n ，然后用1 2 分离 胶( 含有0 1 5 明胶) 进行分离，复性完成后温育1 6h ，内肽酶的酶解条带在蓝黑色的凝胶背景 上清晰出现。 4 ) 底物胶电泳法结果显示，失水胁迫诱导的内肽酶与衰老相关的内肽酶谱带相同，共有3 条，分子量从大到小依次大约为2 0 0k d a 、1 2 3 5k d a 、9 7 4k d a ，分别命名为e p l 、e p 2 、e p 3 ， 其中e p 2 、e p 3 与衰老关系更为密切。e p i 、e p 2 、e p 3 的最适反应温度是4 2 ；e p l 的适宜p h 在酸性到中性范围内，e p 2 和e p 3 在中性到碱性范围内，p h7 时三者活性都能明显表现；e p 2 和 e p 3 是丝氨酸蛋白酶，e p l 可能是金属蛋白酶。 5 ) 失水胁迫显著增强了e p l 、e p 2 、e p 3 的活性，尤其是e p 2 、e p 3 的活性，复水到6h 时， e p 2 仍保持较高活性；a b a 预处理后明显降低了三者，尤其是e p 2 、e p 3 的活性，并且使e p 3 的 活性推迟到胁迫2 4h 才开始出现。 由此推测，失水胁迫过程中对两个分子量不同的丝氨酸蛋白酶活性的强烈诱导与复水后瓶插 开花进程缩短之间存在一定的关联。 关键词：月季切花；失水胁迫；内肽酶；丝氨酸蛋白酶：分光光度法；底物胶电泳法 i i a b s t r a c t t h i sw o r kw a sa i m e dt oi n v e s t i g a t ei n d u c t i o no ft h ea c t i v i t ya n dt y p e so fe n d o p r n t e a s e s ( e p ) r e l a t e dt o t o l e r a n c et ow a t e rd e f i c i ts t r e s s ( w d s ) i nc u tr o s e ( r o s ah y b r i d a ) d u r i n gw d st w oc u l t i v a r s ， s a m a n t h a w i t ht h es t r o n gt o l e r a n c et ow d s ，a n d b e l a m i ，w i t ht h em e d i u mo n e ，w e r eu s e da s m a t e r i a l s t om a k ed i f f e r e n tp r o c e s so fw d s ，t h et w oc u l t i v a r sw e r et r e a l e ds e p a r a t e l yw i t ht w o m a n n e r s ，n a m e l yf l o w e r sw i t ho rw i t h o u tb r a n c h e s ，a n dt h ea c t i v i t ya n dt y p e so fe pw e r ed e t e r m i n e d b a s e do nt h es p e c t r o p h o t o m e t e rm e t h o d s a m a n t h a w a sf u r t h e r m o r eu s e dt op r o b ei n t ot h ei n d u c t i o no f t h ea c t i v i t ya n dt y p e so fe pb yr e p e a t e dw d st r e a t m e n tt h r o u g hg e l a t i n - s d s p a g em e t h o d 1 b a s e do nc o m p a r i s o no f t h et w oc u l t i v a r su n d e r w d s ： 1 ) at u r n i n gp o i n li nw h i c hr e c o v e r yr a t eo f f l o w e r sw a sg o i n gt ob ed e c r e a s i n gr a p i d l y , w a so b s e r v e di n f l o w e r sw i t hb r a n c h e s ，a n dt h eo c c u r l e n c eo ft h et u r n i n gp o i n tw a sl a t e ri n s a m a n t h a ( 3 0h ) t h a ni n b e l a m i ( 2 4h ) t h et u r n i n gp o i n to f q u i c kf a i l i n go f w a t e rp o t e n t i a l ( w o ) o f f l o w e rt os l o wf a i l i n gw a s a l s oo b s e r v e di nt h ef l o w e r so fb o t hc u l t i v a r , t h e s ep o i n t sw e r eh i 曲i d e n t i c a lw i t ht h et u r n i n gp o i n t so f t h e i rr e c o v e r yr a t e 2 、w d s i n d u c e d i n c r e a s eo f e pa c t i v i t y w a s l a t e r i n s a m a n t h a t h a n i n b e l a m i a n d t h e t u r n i n gp o i n t s o fq u i c ki n c r e a s eo fe pa c t i v i t yi n d u c e db yw d si nb o t hc u l t i v a r sw e r ec o n s i s t e n tw i t ht h et u r n i n g p o i n t so ft h e i rr e c o v e r yr a t e s c h a n g e so fb o t hm e m l l o - p r o t e i n a s ea n ds e r i n ep r o t e i n a s ea c t i v i t i e so f p e t a l si n d u c e db yw d sw e r es i g n i f i c a n t l ys m a l l e ri n s a m a n t h a t h a ni n b e l a r n i t h ee x p e r i m e n t sw i t ht h ef l o w e r sw i t h o u tb r a n c h e ss h o w e ds u b s t a n t i a l l yt h es a m er e s u l t sa st h o s e d e s c r i b e da b o v ew i t ht h ef l o w e r sw i t hb r a n c h e s t h e s er e s u l t sa b o v es u g g e s t e dt h a tt h ed i f f e r e n c eo f t o l e r a n c et ow d sb e t w e e nd i f f e r e n t c u l t i v a r sm i g h t b er e l a t e dt ot h ed i f f e r e n tc h a n g e so fm e t a l l o - p r o t e i n a s ea n ds e r i n ep r o t e i n a s ea c t i v i t i e si np e t a l si n d u c e d b y w d s 2b a s e do nt h er e s u l t so f s a m a n t h a u n d e rr e p e a t e dw d st r e a t m e n t ： i ) w rf o r6ha f l e fw d sf o r2 4h ，t h eb e n ds t a t e so ff l o w e rn e c kc o u l dr e c o v e rt ot h en o r m a l ，a tt h e s a m et i m e ，t h ew po f f l o w e rc o u l dc o m eb a c kt ot h el e v e lo f n os t r e s sb u t ，t h ef r e s hw e i 。鲥o f b r a n c h a n dt h ee pa c t i v i t yo fp e t a l sc o u l dn o tg e tb a c kt oab a s a ll o wl e v e la st h a to fb e f o r ew d st r e a t m e n t u n t i lw rf o r1 2h w h e nw d sb e i n gg i v e na g a i n ，t h es i m i l a rc h a n g e st o o ko ni nf l o w e ra p p e a r a n c e ， f l o w e ra n db r a n c hw a t e rc o n d i t i o n s ，w h i l em o r ea c u t e l yc h a n g ep r e s e n t e di ne pa c t i v i t yo fp e t a l s 2 ) t h eq u i c ki n c r e a s eo f s e r i n ep r o t e i n a s ea c t i v i t yi np e t a l sw a sc o r r e l a t i v ew i t hs e n e s c e n c e t h ea c t i v i t y w a si n d u c e ds t r o n g l yb yw d s w d sf o r18h ，t h ea c t i v i t yw a st h es a m ea st h a to fs e n e s c e n c e ( s t a g e6 ) a n dd i dn o td e c r e a s e ds i g n i f i c a n t l yu n t i lw rf o r6h w d sf o r6hw a sg i v e na g a i n ，t h ea c t i v i t yc a m et o t h el e v e lo fs e n e s c e n c e t h ew d s - i n d u c i b l ea p p e a r a n c eo ff l o w e rw a sw e a k e nb ya b a ；t h ef a l l i n go f w a t e rp o t e n t i a l ，t h el o s so f f l e s hw e i g h ta n dt h eh o i s to f e pa c t i v i t yw e r ec o n t r o l l e d 3 ) t h ed e t e r m i n i n gm e t h o do f g e l a t i n - c o n t a i n i n gp o l y a c r y l a m i d eg e l si ne pf r o mp e t a l so f c u tr o s ew a s o p t i m i z e d t h er e s u l ts h o w e dt h a tr e m o v i n gs a l t sa n dp i g m e n t sf r o mc r u d ee x t r a c t st h r o u g hc o l u m no f s e p h a d e xg - 2 5w a s v i t a lt ot h ep r e p a r a t i o no fp r o t e i ns a m p l e t h ep r e p a r e ds a m p l e sw e r et r e a t e df o r1 0 i i l r a i na t4 0 ，l o a d e di n1 2 s e p a r a t i n gg e lc o n t a i n i n g0 1 5 g e l a t i n ，f o l l o w i n ge l e c t r o p h o r e s i s ， i n c u b a t e df o r1 6h ，c l e a rb a n d sw e r eo b s e r v e d0 nt h ed a r kb l u eb a c k g r o u n d 4 ) t h er e s u l t so f g e l a t i n s d s p a g es h o w e dt h a tt h en u m b e ro f b a n d si n d u c e db yw d sw a st h es a m ea s t h a to fs e n e s c e n c e r e l a t e de p s a c c o r d i n gt ot h em o l e c u l a rw e t g h tf r o ml a r g et os m a l l ，n a m e de p i ( 2 0 0 k d a ) ，e p 2 ( 1 2 3 5k d a ) ，e p 3 ( 9 7 4k d a ) r e s p e c t i v e l y a m o n gt h e m ，e p 2a n de p 3w e r em o s tc o r r e l a t i v e w i t hs e n e s c e n c e ，t h eo p t i m u ma c t i v a t i o nt e m p e r a t u r eo fe p l 、e p 2a n de p 3w a s4 2 ：a sf o rt h e o p t i m u ma c t i v a t i o np h ，e p ih a do b v i o u sa c t i v i t yf r o ma c i d i ct on e u t r a l ，e p 2a n de p 3h a dc l e a ra c t i v i t y f r o mn e u t r a lt oa l k a l i ，a n da l lt h et h r e eh a do b v i o u sa c t i v i t yw a sp h7 ；e p 2a n de p 3w e r es e r i n e p r o t e i n a s e s ，w h i l ee p lw a sm e t a l l o p r o t e i n a s e 5 ) t h ea c t i v i t i e so f e p i ，e p 2 ，a n de p 3 ，e s p e c i a l l ye p 2a n de p 3 ，w e r ei n d u c e ds i g n i f i c a n t l yb yw d s w rf o r6h ，a c t i v i t yo fe p 2w a sh i i g h e rs t i l l a c t i v i t i e so fe p i ，e p 2a n de p 3 ，e s p e c i a l l ye p 2 ，e p 3 ， d e d u c e dd u r i n gw d sa f t e ra b ap r e t r e a t m e n t ( p t ) ，a n de p 3w a sn o to b s e r v e do nt h eg e lu n t i lw d sf o r 2 4h t h e s er e s u l t sa b o v es u g g e s t e dt h a ta c t i v i t i e so ft h et w od i f f e r e n tm o l e c u l a rw e t g h ts e f i n ep r o t e i n a s e s w e r ei n d u c e ds t r o n 出yd u r i n gw d s ，t h i sc o u l dr e l a t e dt os h o r t e n i n go ff l o w e ro p e n i n gd u r i n gr a s i n gi n d i s t i l l e dw a t e r ( d w ) a f t e rw d s k e yw o r d s ：c u tr o s e ；w a t e rd e f i c i ts t r e s s ；e n d o p r o t e a s e ；s e r i n ep r o t e i n a s e ；s p e c t r o p h o t o m e t e rm e t h o d ； g e l a t i n s d s - f a g em e t h o d 缩略词表 英文缩写英文全称中文名称 a b a a b s c i s i ca c i d 脱落酸 a p s a m i n o p e p t i d a s e s 氮肚酶 b s ab o v i n es e i m i t ia l b u m i n 牛血精白蛋白 c b bc o o m a s s i eb r i l l i a n tb l u e 考马斯亮蓝 c h i c y c l o h e x i m i d e 环己酰讵胺 c p s e a r b o x y p c p t i d a s e s 羧肽酶 d 7 r td i t h i o t h r e i t o 二二硫苏糖醇 d wd i s t i l l e dw a t e r 去离子水 e 一6 4 l t r a n s - e p o x y s u c c i n y l l e u c y l a m i d o - l 0 匾环氧琥珀型亮氨- ( 4 - g n a n i d i n o ) 一b m a n e ( 4 - 胍基) 一丁烷 e d t a e t h v l e n ed i a m i n et e t r a a c e t i ca c i d乙二胺四乙酸 e p e n d o p r o t e a s e 内肤酶 h p l c h i g hp r o d u c tl i q u i dc h r o m a t o g r a m 高效液相色谱 i ai o d o a e t i ea c i d碘乙酸 p c d p r o g r a m m e d c e l ld e a t h 程序化细胞死己 p e g p o l y e t h y l e n eg l y c o l 聚乙二醇 p m s f p h e n s u i f o n f l u o r t e 苯甲基磺酰氟化物 p t p r e t r e a t m e n t 预处理 p v p p o l y v i n y l p y r r o l i d o n e 聚乙烯毗咯烷酮 r u b p c 1 , 5 - d i p h o s p h a t er i b u l o s ee a r b o x y l a s e 磷酸核酮糖羧化酶 s d s - p a g es o d i u md o d e c y ls u l p h a t e p o l y a c r y l a m i d es d s 聚丙烯酰胺凝胶 g e le l e c t r o p h o r e s i s 电泳 1 a耐c h l o r o a c e t i ea c i d 三氯乙酸 t n s t r i s m y d r o x y m e t h y l ) a m i n o m e t h a n e 三羟甲基氪基甲烷 w d sw a t e rd e f t e i ts t r e s s失水胁迫 w pw a t e rp o t e n t i a l水势 w r w a t c 丁r e c o v e r y 复水 v 独创性声明 扩7 7 3 4 0 2 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导f 进行的研究工作及取得的研 究成果。尽我所知，除r 文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他 人已经发表或撰写过的研究成果，也小包含为获得中国农业大学或其它教育机构 的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均 已存论文中作了明确的蜕叫并表_ i r 谢意。 研究生签名： 匙嘉考 啪叽步年磊肜口 关于论文使用授权的说明 本人完全了解中罔农业大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权 保留送交论文的复印件和磁盘，允诈论立被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或 扫描等复制手段保存、汇编学伉沦文。同意中国农业大学可以用不同方式在不同 媒体上发表、传播学位论立的全部或部分内容。 ( 保密的学位论文在解密后应遵守此协议) 硎究生繇耙专青 时| _ 。j ：渺年缸磊 导师签名：毒，苏军 叫问：胪j 年月心日 中国农业大学博士学位论文 第一章文献综述 月季切花是世界四大切花之一，在国内外市场上占有非常重要的地位。 在大宗切花中，月季切花极易失水，一旦失水便难以恢复( 唐雪梅等，1 9 9 9 ) 。 失水胁迫是植物因失水量大于吸水量而影响植物体正常生理代谢的过程，是月季切花贮运过 程中所经受的最常见的逆境。在我国，月季切花从采收到销售经历环节多，运输时问长，h 多采 用干式运输( 高俊平等，1 9 9 5 ) ，切花在采收、预冷、包装、运输以及贮藏等各个采后环节中，都 有可能遭到不同程度的失水胁迫( m a y a k 鲥可，1 9 8 7 ) ，往往因胁迫而导致僵蕾、僵花、萎蔫、 弯颈等，花朵不能正常开放，以致缩短瓶插寿命。失水胁迫往往是导致月季切花远途运输损耗的 主要原因。因而，月季切花失水胁迫耐性机理及其减轻措施的研究始终是其采后研究的热点。大 量研究认为植物衰老和经逆境胁迫后，能引起组织中蛋白质的变化( b r a d y ，1 9 8 8 ；n a v a r i l z z o e tn ，2 0 0 0 ) 。关于植物内肽酶的研究，已经明确是水解蛋白的一类酶，失水胁迫能引起其活性 及种类的变化。目前有关的研究主要集中在小麦( 吴小平等，1 9 9 4 ；s r i v a l l ie ta 1 ，1 9 9 8 ) 、蚕豆 ( j o n e se t a l ，1 9 9 5 ) 、豇豆( k h a n n a - c h o p r ae l a l ，1 9 9 9 ) 等大田作物和模式植物拟南芥上( k o i z u m i e ta 1 ，1 9 9 3 ) 。切花，特别是月季切花采后失水胁追与内肽酶关系的研究报道还不多见。本研究 从蛋白大分子入手研究失水胁迫对月季切花花瓣内肽酶活性和种类的影响，揭示月季切花失水胁 迫过程中的分子机理，以期为制订有利于延长采后贮运寿命的策略提供理论依据。 1 失水胁迫与切花衰老 1 1 切花的失水胁迫特征 切花的开放和衰老与花枝水分的吸收、运输以及蒸腾丧失之间的平衡密切相关，花枝水分平 衡是影响切花质量的重要因素。 在影响切花水分平衡的因素中，切花的植物体结构、发育状况以及生理代谢机能等是重要的 内在因子；湿度、温度、光照等环境因子则通过对植物机体的影响而发生作用。 失水胁迫是水分平衡丧失的一种重要形式，是切花在采后处理的各个环节中最常见且难以避 免的现象，也是造成切花流通损耗的重要因素。 切花失水胁迫不同于在体植物，在体植物在经受失水胁迫或干旱时，是在根系与地上部各器 官或组织之间的联系未发生断离的情况下进行的，根系对胁迫或干旱的适应或调节能力，影响着 地上部的失水程度或系列的生理和生化反应。另外，根系台成的物质( 如激素) 和运输到地上 部的矿质元素，都有可能对地上部器官及整个植物体的抗旱反应起到调节作用。对于切花来讲， 一方面，失去了根系吸水的固有方式，使吸水能力变得更加脆弱并易受外界因素的影响( 细菌和 空气进入造成的导管空腔化) ；另一方面，采后切花彻底断绝了根系对地上部的养分供应，使切花 采后瓶插过程中所有生命活动是在“饥饿”状态下进行的( 不包含插在保鲜液中的切花) ，这决定 第一章文献综述 了采后切花的生命进程中，大分子物质的降解是晟主要的生理生化特征。 迄今为止的月季切花失水胁迫方面的研究主要包括耐失水胁迫品种的筛选，包括耐性类型 的划分、忍耐极限的确定等( 唐雪梅等，1 9 9 9 ) ；水分吸收和输导能力的改善，包括表面活性 荆的应用等( v a n d o o me t a l ，2 0 0 2 ) ；抗氧化酶系统和非酶系统的调节机理( 李永红等，2 0 0 1 ： 张常青等，2 0 0 2 ；李永红等，2 0 0 3 ；单宁伟，2 0 0 5 ) ：蛋白质等大分子的降解和合成机理，如 内肽酶的合成和作用机理等( 丛日晨等，2 0 0 1 ；丛日晨等，2 0 0 3a ；丛日晨等，2 0 0 3b ) 。其中有 关的研究还不多。 1 2 切花失水胁迫后的衰老与蛋白质变化 切花开花与衰老是指切花采后瓶插至萎蔫的整个过程，切花的失水胁迫可发生在这个过程里， 也可发生在采后干藏的切花中。研究失水胁迫后的切花蛋白质代谢问题，包含着两个密不可分的 内容，一方面需阐明在整个开花进程中的蛋白质代谢途径或规律，另一方面也需阐明失水胁迫对 这一途径产生了怎样的干预作用，对于前者已有不少报道。姜微波( 1 9 9 7 ，1 9 9 9 ) 研究发现香石 竹采后花中蛋白质合成能力随衰老而降低，加速衰老的乙烯处理，诱导了6 0k d 蛋白合成。高勇 ( 1 9 9 0 ) 、丛日晨( 2 0 0 3a ) 研究发现月季切花瓶插期间花瓣中可溶性蛋白的含量在瓶插初期增加， 后期下降。王然( 1 9 9 8 ) 报道月季切花在瓶插衰老过程中，在可溶性蛋白的s d s p a g e 图谱上 出现了特异蛋白，虽然未对这个特异蛋白作进一步的鉴定，但是这个发现表明，在切花的衰老过 程中，不仅存在蛋白质的降解，而且还会发生蛋白质的合成。 有关切花采后失水胁迫对切花蛋白质代谢影响的报道还不多，丛日晨等( 2 0 0 3b ) 对切花月 季b e l a m i 进行3 0 h 的失水胁迫而后复水瓶插，发现，夫水胁迫提高了可溶性蛋白质和游离氨基 酸含量，复水后处理花瓣仍高于对照但火水胁迫如何干预蛋白的代谢，还没确定的说法。 已有研究表明，蛋白大分子的降解是植物器官衰老最明显的特征，蛋白酶是水解蛋白质的酶， 所以关于内肽酶与特定植物器官衰老的关系逐渐被“大学者所关注。失水胁迫能加速月季切花的 衰老，有关失水胁迫与月季切花花瓣内肽酶之间的关联问题的研究也就显得更为重要。 2 内肽酶与切花衰老 2 1 植物蛋白水解酶概述 所有水解肽键的酶称为蛋白水解酶，其中分解内部肽键的酶为内肽酶或称蛋白酶( e p s ) ，水 解外部( n 端或c 端) 肽键的酶称为外肽酶，如氨肷酶( a p s ) 和羧肽酶( c p s ) 。 内肽酶作用于肽链内部特定肽键的酶，有些也能在肽链端部发生反应，即行使脂酶的作用， 按照其催化机制和催化活性位点可分为以下几大类：丝氨酸蛋白酶( e c3 4 2 1 ) 、半胱氨酸蛋白酶 ( e c3 4 2 2 ) 、天冬氨酸蛋白酶( e c3 4 2 3 ) 、金属蛋白酶( e c3 4 2 4 ) 、苏氨酸蛋白酶( e c3 4 2 5 ) 。 2 中国农业大学博士学位论文 蛋自质降解是一个连锁反应，先被肽链内肽酶降解，再根据底物特异性( 肽链末断：n 断，c 断) 被肽链外切酶，如氨肽酶和羧肽酶水解。尽管内肽酶裂解的内部肽键远离链端，但些内肽酶也 能与肽链的终端和模式底物反应，这时可能显示的是酯酶的活性。 蛋白水解酶的功能是多方面的，主要包括：参与植物生长发育过程中功能蛋白的降解和周转； 清除逆境胁迫下非保护蛋白；参与降解丧失功能和不正常组装或聚积的蛋白质；加工剪接信号肽 等方面( b e e r se t a l ，2 0 0 0 ；v i e r s t r a e t a l ，1 9 9 6 ；d a i l i n ga n d n e t t l e t o n ，1 9 8 6 ；s o l o m o n me t a l ， 1 9 9 9 ) 。 2 2 内肽酶的生化特征与研究方法 2 2 1 内肽酶的生化特征 催化机制 v a l l e e 等1 9 8 3 年发现胰凝乳蛋白酶水解4 。硝基苯乙酸的反应是由两个连续的步骤组成的，示 意图如下。这是内肽酶催化机制研究的重要里程碑。 k sk 2 k 3 e + s 呻 e 8叫e s 4 - p i叫e + p 2 在第一步中，底物与酶结合形成一个非共价的e s 联合体，这一步是可逆的；第二步，酶催 化位点被激活的化学基团攻击位于底物上的裂解的肽键，释放肽键裂解的第一个产物( p 1 ) ，这时， 底物的其他部分仍和酶结合在一起，然后随着第二个产物( p ：) 的释放利酶的再生，反应完成。 保证反应顺利进行的条件是底物结台位点能正确引导底物和酶结台，酶分子中天然存在能在e s 短暂形成e - p 2 键和催化这个中间体裂解的基团。正是这一重大发现才使得内肽酶催化机制的研究 有了进步发展，各类内肽酶的活性位点和结合位点的特征、催化反应所需的条件逐渐弄清，进 而，用来研究各类内肽酶的人造底物被合成，专一性和非专一性抑制剂被找到，天然底物、天然 抑制剂也被纯化。实现了人为调控内肽酶活性。 定位 早期研究认为，植物的内肽酶主要分布在液泡中( s t o r e ye t a l 。，1 9 8 6 ；m i k o l a e ta 1 ，1 9 8 6 ) ， 以防其随意水解胞内蛋白质，故自溶诱导的水解酶也存在于液泡。小麦叶片衰老中的蛋白水解酶 活性一直存在于液泡中( w i t t e n b a c he ta 1 ，1 9 8 2 ) ，几乎包括全部水解酶( b o i l e ra n dk e n d e ，1 9 7 9 ) 。 然而后来证实，在叶绿体( h u f f a k e r e t a l ，1 9 9 0 ；d a l l i n g a n d n e t t l e t o n 。1 9 8 6 ：v i e r s t r a 甜口f ，1 9 8 6 ) 、 细胞壁( v a nd e r w i l d e ne t a l ，1 9 8 3 ；v a n d e r v a l ke t a l ，1 9 8 8 ) 、微体( o s t e r y o u n ge l a l ，1 9 9 2 ) 、 线粒体( c o r p a s e t a l ，1 9 9 3 ) 、匏液( v i e r s t r ae t a l ，1 9 8 6 ) 及高尔基体( m a r t t i l a e t a l ，1 9 9 5 ) 3 中也发现其活性。1 9 9 3 年首次在豌豆叶片的过氧化物体中发现蛋白水解酶活性( c o r p a se la 1 ， 1 9 9 3 ) 内、外肽酶均有活性 2 2 2 内肽酶的研究方法 植物内肽酶的研究方法经历了简单的酸碱滴定法、分光光度法、蛋白的肽谱分析法、分子生 物技术分析法、蛋白组学分析法等的演变。总起来，可分成两个研究层次：定量分析和定性分析。 内肽酶的定量分析 内肽酶研究常用的分析方法是定量分析，研究者的目的主要是获得植物生理过程与内肽酶的 关系，在内肽酶量的变化上捕捉可能的信息，用的研究方法主要是酸碱滴定法、分光光度法。酸 碱滴定法用的底物是脂类底物，直到1 9 5 4 年，肽水解产物灵敏而又便利的检测方法的发明，才使 得内肽酶的定量分析有了很大的进展，这时候，分光光度计普遍使用，紫外分光光度法已成功运 用到试验中。 分光光度法检测内肽酶的原理是在a n s o n 分析方法的基础上发展起来的。通过检测内肽酶水 解作用释放出来的溶于t c a 的肽而间接获得内肽酶的定量信息。让内肽酶与底物( 一般为合成 蛋白类底物) 在限定条件下温育反应，反应后的混合物用t c a 沉淀，沉淀后的上清用于肽分析。 肽分析一般包括以下几种手段( 据底物性质不同) ： 检测水解后溶于t c a 的酪氨酸残基在2 8 0n m 下的吸光度变化。 检测水解后与茚三酮结台的溶于t c a 的化合物在5 7 0n m 下的吸光度变化。 检测水解后与l o w r y 试剂结合的溶于t c a 的化合物在6 5 0n mf 的吸光度变化( 不能用 于植物粗提液，因为可能有酚类物质干扰) 。 检测水解后从底物上释放的显色基团与肽的结合物的吸光度变化( 如a z o c a s e i n 作底物时 可检测3 4 0n m 下的吸光度) 。 根据定量分析的原理，对蛋白底物进行化学修饰，如放射性标记得到放射性底物( 常用的标 记元素为3 h 、”c 、i ) ，而使分析的灵敏度大大增加。 内肽酶的定性分析 内肽酶的定性分析包括内肽酶分子量的确定、种类的确定、基因组成及功能的确定等等。内 肽酶的定性研究方法最先由c l e v e l a n d ( 1 9 7 7 ) 等提出的，即通过s d s p a g e 分离的蛋白的肽谱 分析，这一程序涉及蛋白或大肽的部分水解和s d s p a g e 对其水解产物的分离。m i l l e r 和h u f f a k e r ( 1 9 8 5 ) 用这种方法确定了大麦叶片蛋白酶水解r u b p c a s e 大亚基而产生的肽在1 3 ，0 0 0 m r 一 1 5 0 0 0 m r 之间。r a g s t e r 和c h r i s p e e l s ( 1 9 7 9 ) 用s d s p a g e 检测了大豆内肽酶水解自身蛋白的产 物。h a r a 和m a s t u b a r a ( 1 9 8 0 ) 用s d s p a g e 对降解西葫芦种子球蛋白的两个内肽酶进行了定性 分析。 p e t e r s e n 和v a ne t t e n ( 1 9 8 3 ) 将s d s p a g e 进行了改进，首先在非变性的凝胶上对内肽酶进 行分离，接着将含有待分辨内肽酶的凝胶板与其蛋白底物一起温育反应然后再进行第二次电泳 4 中国农业大学博士学位论文 f s d s - p a g e ) 。这样，第一次电泳蛋白酶是以蛋白的减少被检测的，第二次电泳看到的是该蛋白酶 水解蛋白底物的肽产物的情况。综上所述，无论怎么改进，s d s p a g e 方法都存在不能克服的缺 点：检测结果不直观，灵敏度不高，分离时蛋白酶可能自身降解。 底物胶电泳法是一种快速而灵敏的内肽酶定性分析方法，该法是将蛋白底物直接聚合在分离 胶里面，对内肽酶进行s d s p a g e 分离后，在适宜温度下进行一定时间的温育反应，然后通过染 色就可以看到蛋白底物被染色，没有被染色的地方就是所检测的内肽酶发挥作用的地方，利用蛋 白m a r k e r 就可以知道其分子量大小。这种方法在1 9 8 0 年被h e u s s e n 和d o w d l e 发展井成功的用于 动物纤溶酶原激活子的研究。之后，在动物内肽酶的研究上也成功运用，并被h a y 等( 1 9 9 1 ) 发 现在植物内肽酶的研究上颇具潜力。底物胶电泳法在植物光系统l l 蛋白酶检测中的应用，克服了 s d s p a g e 的缺点，检测到了多种蛋白酶( 周吴等，2 0 0 2 ) 。 现在利用这种方法已研究了多种植物的内肽酶。该方法要求在微弱的变性条件下，在含有明 胶的p a g e 上分离蛋白，接着用t r i t o nx 1 0 0 原位复性，适宜条件下反应，染色后活性内肽酶清 晰的亮带就在胶片上出现。 m i e h a n d ，f a y e 和y e l l e ( 1 9 9 3 ) 在h e u s s e n 和d o w d l l e 方法基础上，将内肽酶专一性抑制剂 引入试验，实现了不同种类内肽酶的直接分离。 r u i ( 2 0 0 2 ) 对底物胶电溶法进行改进，把梯度胶引进其中，用于小麦旗时衰老过程中内肽酶 同工酶的研究，发现用底物胶电泳法几乎检测不到新的内肽酶同工酶而用梯度凝胶电泳法则能检 测到6 种新的同工酶。 随着分子生物学的渗透，植物内肽酶的定性分析进入到基因水平，不仅可以了解其分子量种 类，甚至可以了解其基因组成。 近年来利用e d n a 技术己克隆到多种植物的内肽酶基因，同时内肽酶的蛋白组研究也取得了 很大进展。凝胶过滤、柱层析、亲和层析、h p l c 等蛋白质分离技术的成功应用，使得植物内肽 酶的纯化分离成为可能，w e s t e r n b l o t t i n g 分析及氨基酸分析与d n a 分析技术相结合，使人们对 植物内肽酶的功能也有了清晰的认识。 2 3 内肽酶的种类和作用 迄今为止，已知内肽酶有五人类别，分别为丝氨酸蛋白酶( e c3 , 4 2 1 ) 、半胱氨酸蛋白酶( e c 3 4 2 2 ) 、天门冬氨酸蛋白酶( e c3 4 2 3 ) 金属蛋白酶( e c3 4 2 4 ) 、苏氨酸蛋白酶( e c3 , 4 2 5 ) 。 植物中主要是前三种。各种内肽酶在植物界的作用哪一种更重要尚不能明确。 2 31 丝氨酸蛋白酶 丝氨酸蛋白酶的活性位点有一个丝氨酸残基，其上的羟基攻击底物上的羰基碳原子从而引发 反应。其活性在偏碱性的环境下发挥较好，对激活子没有绝对的要求，但c a 2 + 的存在有利于一些 酶原的激活反应和一些酶分子的稳定。研究发现，丝氨酸蛋白酶广泛参与植物衰老( d i s t e f a n oe t a 1 ，1 9 9 7 ，1 9 9 9 ；h u f f a k e r ，1 9 9 0 ) 、