（应用化学专业论文）萘酰亚胺类一氧化氮荧光探针的设计、合成及光谱研究.pdf

独创性说明 作者郑重声明：本硕士学位论文是我个人在导师指导下进行的研究工 作及取得研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外， 论文中不包含其他人已经发表或撰写的研究成果，也不包含为获得大连理 工大学或者其他单位的学位或证书所使用过的材料。与我同工作的同志 对本研究所做的贡献均已在论文中做了明确的说明并表示了谢意。 作者签名：骛d 计日期：? 型! 大连理工大学硕士研究生学位论文 大连理工大学学位论文版权使用授权书 本学位论文作者及指导教师完全了解“大连理工大学硕士、博士学位论文版权使用 规定”，同意大连理工大学保留并向国家有关部门或机构送交学位论文的复印件和电子 版，允许沦文被查阅和借阅。本人授权大连理工大学可以将本学位论文的全部或部分内 容编入有关数据库进行检索，也可采用影印、缩印或扫描等复肯i 手段保存和汇编学位论 文。 作者签名：鍪! 墨坐 导师签名 学玄 2 6 年月f 。h 大连理工大学硕士研究生学位论文 摘要 本文介绍了几种荧光团性能和几种常用的荧光探针的受体，并对一氧化氮荧光探针 的研究进展作了一个简单的回顾。借鉴了对一氧化氮敏感的邻苯二胺受体，并在此基础 上设计合成了二个系列萘酰亚胺类荧光分子探针。 l 、在系列一中设计并合成了基于p e t 机理的、一( 3 4 一二胺基一苯基) 4 一氨基一l ，8 一 荼酰亚胺及n ( 3 ，4 苯并三畔) 一4 氨基一l ，8 一萘酰亚胺，并对其进行了光谱研究，检测 了其对一氧化氮的识别。 该系列分子是荧光增强型荧光探针，受体采用邻苯二胺，荧光团采用萘酰亚胺。由 于分子内的光致电子转移作用，化合物本身荧光很微弱，当与一氧化氮结合后，氮上的 孤对电子被束缚住，隔断了化合物的光致电子转移作用，从而释放出黄绿色的荧光，荧 光量子效率可增加9 ( ) 一1 0 7 多倍。该化合物选择性好，灵敏度高，具有很好的实用性。 2 、在系列一的基础上，我们突破以往受体的局限，首次采用萘酰亚胺四、五位追 位姣做一氧化氮受体，利用分子内推拉电子体系的变化即i c t 机理来检测一氧化氮。 系列二分子的荧光团采用萘酰亚胺，受体采用萘酰亚胺四、五位的迫位胺。利用其 四、五位的迫位胺来对氧化氮进行识别，当与一氧化氮结合后，其荧光强烈猝灭，颜 色变化明显。它是个可对氧化氮识别的双通道探针。而且其最大吸收从4 5 0 n m 兰移 至4 2 0 nr t l ，掘我们所知，是第一个基于i c t 基理的双波长探针。 关键词：萘酰亚胺；荧光探针；一氧化氮 竖堕鲞! 茎坠垩壁鲞二墨些塾蒸堂堡丛塑堡盐：鱼堕垄堂堂堕至 t h ed e s i g n ，s y n t h e s i z ea n dt h es t u d yo fs p e c t r u mo ft h en e wn a p h t h a l e n e d e r i v a t i v e sa sn i t r i co x i d ep r o b e a b s t r a c t t h ep a p e rh a si n t r o d u c e ds e v e r a lf l u o r o p h o r e sa n ds o m ew e l l - i n f o r m e dr e c e p t o r sa n d r e v i e w e dt h e p r o g r e s s o ff l u o r e s c e n tp r o b ef o rn i t r i co x i d es i m p l y t w os e r i e so f n a p h t h a l i m i d ed e r i v a t i v e sa sn i t r i co x i d ep r o b ew a sd e s i g n e da n ds y n t h e s i z e d a tt h eb a s eo f v i c i n a ld i a m i n e s 1 n 。f 3 4 d i a m i n e p h e n , r 1 1 4 a m i n o 1 ，8 n a p h t h a l i m i d e a n d n 一( 3 ，4 一t r i a z o l e - p h e n y l ) 一4 一a m i n o 1 8 - n a p h t h a l i m i d ew e r ed e s i g n e da n ds y n t h e s i z e d a tt h es a m et i m e t h e i r s p e c t r u ms t u d i e sa n dd e t e c t 岛【，n i t r i co x i d ew e r ei n v e s t i g a t e d r h e s ef l u o r e s c e n tp r o b e s 小o m e dt h ev m n a ld i a m i n ea sr e c e p t o re n dn a p h t h a l i m i d ea s f l u o r e p h o i e h ec o m p o u n d sh a et h ew e a kf l u o r e s c e n c et h e m s e l v e s 、b u tt h e yc o u l dy i e l dt h e h m f l vg r e e nf l u o r e s c e n c ed u et ot h ep e ta f t e rt h e yb i n d e dw i t hn i t r i co x i d e b e c a u s et h e e l e c t r o no fn i t r o g e nw e r eb i n d e d ，t h ep e tw a sb l o c k e dt h ef l u o r e s c e n c eq u a n t u m e f f i c i e n c i e sa r ei n c r e a s e dm o r et h a n9 0t i m e s t h e yh a v et h ea d v a n t a g eo fs p e c i f i c i t y s e n s i t i v i t ya n dp r a c t i c a b i l i t y ! a tt h eb a s eo fp a s tw 0 1 k 、w ea d o m e dp e r i a m h i ea sr e c e p t o rt h e yr a k e da d v a n t a g eo f i c lm e c h a n i s mt od e t e c tn i t r i co x i d e t h e s ec o m p o u n da d o p e dn a p h t h a l i m i d ed sf l u o r e p h o r ea n dp e r i - a m i n ea sr e c e p t o rt h e f l u o r e s c e n c eq u e n c e dq u i c k l ya f t e l t h e yb i n d e dw i t hn i t r i co x i d e t h ec o l o rc h a n g e d o b v i o u s r ，+ | 1 h e y c o u l db e c o m et h et w o c h a n n e lp r o b ef o rn i t r i co x i d ef u r t h e r m o r e t h e m a x i u ma b s o r p t i o nw a sc h a n g e df r o m4 5 0 ! l mt o4 2 0 n ma sf a ra sw ek n o w t h ec o m p o u n d c o u l db et h ef i r s tr m i o m e t r i cp r o b e k e yw o r d s ：n a p h t h a l i m i d e ；f l u o r e s c e n tp r o b e ；n i t r i co x i d e 大连理工大学硕士研究生学位论文 引言 近年来，荧光染料作为功能性色素在科学技术的各个领域得到广泛应用。尤其作为 分子探钊在生命科学【l “、超分子光化学1 5 - 1 0 1 方面的研究在全世界范围内备受瞩目，是目 前热门的研究课题之一。经过特殊设计的荧光分予探针具有高灵敏度，高特异选择性等 特点，可将微环境的变化信息转变为光信号，从而使人分子的对话成为可能，架起宏 观世界与微观世界的桥梁。毫无疑问，研究和开发高效识别的荧光探针对整个生命科学 及社会的进步都是至关重要的。 一氧化氮本身具有神奇的的生理调节功能1 4 2 1 。它不仅具有免疫调节、神经传递、 血压生理调控和血小板凝聚的抑制等生理功能，而且在许多组织中尽管其真正的释放 量目前尚难于检测，但已确知会释放出不同浓度的一氧比氮且浓度的变化与机体的生 理机能紧密相连。但由于一氧化氮半衰期短为它的检测带来了很大的困难如何现场定 性和定量检测一氧化氮，向化学家们提出了艰巨而开拓性的任务，人们采取了电化学、 化学荧光法、质谱、紫外一可见分光法等一系列方法来对一氧化氮进行测量。这其中荧 光法由于其灵敏性高，具有实时性，且测量简单易行而得到了广泛青眯【】”j 。 个荧光探针由荧光团和受体两部分组成，近年来，对一氧化氮进行识别的荧光团 主要有荧光素、罗丹明、b o d i p y 、菁类染料等，但它们各有其优缺点。本文主要采用 的是1 ，8 萘酰噩胺类荧光团，1 ，8 - 萘酰亚胺是一类优秀的荧光发射圜1 1 6 - l 8 ，斯托克位 移大于5 0 r i m 以上，并且极易进行改造。当它的4 位有供电基团，如氨基的衍生物都能 够发射很强的荧光。而近年来，研究者利用其4 位和5 位取代的化合物也陆续报道，它 们的供电子能力的改变对整个化合物的波长也有明显的影响。 对一氧化氮识别的受体有很多，其中较好的一类是邻苯二胺，它是依靠邻苯二胺与 一氧化氮的结合来对其进行识别，因此，这类受体的选择性好，且灵敏度极高。我们正 是利用其这个优势将其与萘酰亚胺相结合，设计并合成了以p e t 为基理的一氧化氨荧 光探针，同时，我们又采用了一个不同以往的新的迫位胺作为一氧化氮受体，设计并合 成了一系列新的基于i c t 基理的氧化氮探针。 系列一是将邻苯二胺与萘酰亚胺组装来对一氧化氮进行识别，它的灵敏度极高，荧 光量子产率在结合一氧化氮后提高了9 0 多倍。 系列二是利用萘酰亚胺4 、5 位的迫位胺来对一氧化氮进行识别，它突破以往受体 的局限，生成了有别于以往五元环结构的六元环而这种六元环结构比五元环拥有更稳 定的结构。与此同时，由于4 、5 位上氮原予的推拉作用的改变，使其在结合一氧化氮 前后波长发生移动，这将对我们今后对一氧化氮的定量检测有很大的帮助。因为这种检 张晓琳：萘酰亚胺类一氧化氮荧光探针的设计、合成及光谱研究 删能够避免受外界因素的影响，如化合物浓度、 结合一氧化氮后颜色改变明显且引起荧光猝灭， 溶剂极性、p h 等。另外，该化合物在 使其对氧化氮的检测简单易行。 大连理工大学硕士研究生学位论文 文黻综述 1 1 概述 荧竞分子搽钟( f l u o r e s c e n tm o t e c u l 8 rp r o b e ) ，荧光分子开关( f l u o r e s c e n t m o l e c u l a rs w i t c h ) 和荧光分子传感器( f 】u o f e s c e n tm o c u la rs e n s o r ) 是在荧光分予 识别( f l u o r e s c e n tm o l e c u l a rr e c o g n jt i o n ) 中经常使用的概念。荧光分子探针是其 中内涵鼹广鹊一个概念，一般凡是在定体系内，当某种物质战 本系的菜物理性质发 生交倦时该分予翁焚毙信号可懿发生稻应载改变的小分子就哥称为菜一物质或莱一镪 理性质的荧光物理探针；荧光分予开关是指在识别过程中分子荧光信号有明显强弱变化 的荧光分子探针：荧光分子传感器是指在识别过程中分予荧光信号能够快速，可逆响应 戆荧光分子掭镑。所专霉分子识爱楚疆分子之闽( 毫体与骞体或称之为受体与藏物) 蠹 共价键力的选择性结台并产生某种特定功能的过程。单纯的结合不是识鳓，识剐是有露 标的结合，它是通过系列结构确定的分子闻相互作用而组成的模式识别过程。结合形 成的越分子体系是由它的稳定性筹翻选择性，即形成过程中的能蓬和信息量来袭征的“”。 荧光分子擦钳麓踅分子科掌中最为 l 久久胜的领域之，它戆主要功笺包括势予识 别和将识剐信息转换成荧光信号两部分。识别怒超分子化学自勺核心内容，是分子存贮和 超分子渎取分子信息的过程。这种分子间识别炼分子在更高的结构层次上实现功能的基 础，魁分子间鸯组靛的蕊提。但由于这静结合是出非共价键完成的。遗器形成的结构稳 定瞧较 氛，绘磺究豢寒一定静霞瀑。荧竞分予探钟畿将这耱分子缝合转换戏翕检测韵荧 光信号，而且可在单分子水平上实现原位，实时检测。因此，在化学走向超分子科学并 于生命科学，材料科学等学科高度交叉的今天，荧光分子探针得到各研究领域的广泛关 注是蒋鬻是然豹。 两箭报道的荧光分子探针的被识剐客体飙皴简单的质予副手性分子、藿色、寡累梭 营酸序列等千差万别。那么荧光分子探针的识别功能部分就要举由于被识别分子互补的 结构以便读取被识别分子完整的结构信息，提简识别的选择性和敏感性。也就是说，探 针分子粒识翔蘩分遴常应其有与被识别分予嗣等豹复杂性，嚣对于耍杂客体分子实舔设 计探针分子的识别罄团时，通常只针对客体分子易于识别的特征部分设计互补的识别罄 团。另外，探针分子还要完成识别信息向荧光信号的转变，在这方面利用的光物理和光 化学帆理是多神多媾的。匿此，为实现这些转换枫理所设诗、合成的探针分子的化学缩 誊毒瑟惫纷繁复杂。些探针努予尽管取褥了整好鲸识羽效暴，但人们荠不蹩专分清楚鼋袋 别及信号转换的详细机理。还有些关于荧光嫌针分予报道的结果是错误的，例如在有 机溶剂中将探针识别基与氢离子的结合误认为是与目标物种赍勺结合。同样是由于荧光分 张晓琳：荼酰亚胺类一氧化氮荧光探针的设计、合成及光谱研究 子探针的高度敏感性，识别研究中要特别小心，否则就容易出现错误结果。总之，荧光 分子探针是一个 分活泼、精彩纷呈，但又充满着未知和挑战的新领域研究。 荧光分子探针的主要应用领域是生物、医学和环境监测，所以在水溶液中的识别爿 具有潜在的广泛应用价值。另外，许多探针分子的荧光性质会受质子的影响，在水溶液 中可以通过缓冲溶液控制稳定的p h 值，使识别研究的结果更可靠。由于水分子对金属 离子较强的水合作用以及水分子对荧光探针分子识别基团较强的结合，使水溶液中的金 属离子识别比有机溶剂中有更大的难度。 根据以上论述，通常评价荧光分子探针的性能应主要考虑灵敏性、选择性、实时性 和原侮监测性能四方面因素。灵敏性中包括许多因素：首先，探针与被检测物的结合强 度是识别灵敏性的前提；其次，识别信息的荧光信号转换效率同样影响识别灵敏性，荧 光增强的探针一般会比荧光淬灭的相应探针灵敏性高；另外，荧光团的荧光波长、量子 产率、靳托克斯位移、荧光背景干扰等会影晌探针的监测灵敏性；灵敏性还与其性能璃 关。选择性主要取决于探钊与被检测物的结合选择性：有时某些被结合客体可直接影嚷 荧光团的荧光发射i 生i t - ，这种情况下识别选择性还与被结合的客体性质有关；专一选择 性是最好的。实时性主要包括识别响应的速度和可逆性两方面，如果可逆响应的速度快 十或与被检测客体的变化速度相匹配，则可称之为实时响应探针f 传感器) 。原位检测 性能主要取决于探针分子与被检测体系的相溶性，探针能以独立的分子状态分散于检测 体系并发出识别信号；从目前的实际情况来看，水溶性比非水溶性探针好；其实在一定 限度内，荧光探针检测的空间分辨率取决于仪器。上述评价探针性l l t t 主要因素并不是 评价研究一l 作水平的指标，对于研究工作来说创新性是最重要的。 1 2 荧光分子探针识别原理 1 21 光诱导电子转移p e t ” p h o t on d u c e dee c tr o ntr a n s f e r 在各种阳离子荧光分子探针中，利用p e t 原理设计的荧光分子探针最为常见，这类 探针设计原理明确，特别是对于碱金属、碱金属和氢离子通常都可获得荧光增强的探 针。典型的p e t 荧光探针体系是由具有电子给予能力的识别基团r ，通过连接基团s 和 荧光基团f 相连，三部分构成的功能分子。其中荧光团的功能是光吸收和荧光信号的发 射并且它的发射强度与识别基团的结合状态相关：识别基团的功能是结合客体并将结台 信息传递给荧光团；这两部分被连接基团相连成一个分子并且使识别信息有转化为荧光 强度的变化。 在p e r 荧光分子探针中，识别基团与荧光团之间的识别信息与荧光信号之间的转化 是靠光诱导电子转移完成的。p e t 荧光分子探针的具体工作过程如下：具有电子给与能 力的 别基团能够将处于最高能级的电子转入激发态荧光团因电子激发而空出的电子 大连理工大学硕士研究生学位论文 轨道，使被光激发的电子无法直接跃迂回原基态轨道发射荧光，导致荧光团的荧光淬灭： 然而，当识别基团与客体结合后，降低识别基团的给电子能力，p e t 过程被减弱或不再 发生，使荧光团的荧光发射增强。因此在未结合客体之前，探针分子不发射荧光，或荧 光很弱。一旦受体与客体结合，荧光团就会发射出荧光。p e t 荧光探针的作用机制可由 前线轨道理论来进一步晓明r 图l 一1 ) 。由于与客体结合前后，荧光强度差别很大，呈 明显的“关”，“开”状态，这类探针又被称为荧光分子开关。 e h o 荧光团 el u 上 i 、 h o “ 自由受体荧光团结合受体 圈11p e t 机制的前线轨道理论示意图 f i g 1 1f r o n t i e ro r b i t a le n e r g yd i a g r a me l a b o r a t i n gt h em e c h a n i s mo fp e ts w i t c h e s 已报道的p e t 荧光开关分子中，多数都是以脂肪胺及其衍生物或芳胺及其衍生物作 为识别基团，同时作为p e t 的电子给体( 荧光淬灭基团) ：荧光团和识别基之间的连接 基一般是亚甲基、乙撑基或内撑基等短链烷烃，过长的连接基将使p e t 效果变差。 d es i i r a 的研究组”“利用多种荧光团，设计了大量的p e t 荧光分子探针，用于氢离 子，碱金属或碱土金属等的识别，并将荧光开关作为分子逻辑们器件。钱旭红教授 等合成的以4 一氨基一l ，8 一萘酰亚胺衍生物为荧光圈的p e t 荧光探针是有效的氢离子探 针，以被m o l e c u l a rp r o b e 公司推广为细胞酸性内脂质探针。 大多数p e t 荧光分子探针的设计是基于受体与客体的结合，使p e t 过程受到抑制， 使荧光团发劓出强荧光的原理设计的。但是当探针与过渡金属或重金属原子结合时，由 于其外层d 电子的氧化还原行为。另外，也可能发生能量转移淬灭。总之，氢离子、碱 金属以及碱土金属离子通常都可以根据p e t 原理设计出荧光增强的探针；过渡金属或重 金属离子识别时情况复杂的多。 另外p e t 探针不仅可以用于阳离子的识别，也可以用于中性分子识别。n a g a n o 等“。 曾设计了荧光素为荧光团的p e t 探针用于单线态氧的检测( 如图l - 2 ) 。 | f 斗 张晓琳：萘酰亚胺娄一氧化氮荧光探针的设计、台成及光谱研究 到1 2 单线态氧氓别p e t 荧光探针 f i g1 2p e t f l u o r e s c e n tp r o b ef o rs i n g l eo x y g e n 12 + 2 分子内共轭电荷转移i cr in tr a m o ie o u ia rc h ar g etr a n s f e r c t 荧光探钊的荧光团舁自强的推_ 于立电子体系，电子供给体与电子的接受体共轭相 连，在光的激发下会产生电j 7 由电子的供给体向接受体转移。i c t 荧光探针由的客体受 体单元往往是推一拉电予体系整体中的部分，多数情况是电子的供给体，但角可能是 电子的接受体。当受体单元与客体结合时，很显然会对荧光团推一拉体系产生影响，或 是减弱分子内电荷转移，或是强化电荷转移，从而导致荧光的变化。 ni：i：jij：埝。c一：c。wc一。c“：“r”e，。 ( i；： l o 23 图l3 三种i c t 荧光探针 3t h r e ef l u o r e s c e n tp r o b e sb a s e do ni c tm e c h a n i s m 典型的i c t 荧光化合物l ，氮杂噩醚作为受体，同时也是推一拉电子体系的电子共 给体。当冠醚与碱土金属离子如c a ”络合时，离子的拉电子效应降低了盂醚氮原子的供 电子能力，因此发生了荧光的兰移，且荧光增强。 受体单元为典型i c t 荧光探针化合物2 。2 “1 ，吡啶氮原子为荧光团的荧光受体，同时 也是氢质子的电子受体，当吡啶氮原子与氢质子结合后，拉电子能力增强，故荧光发生 ， 八 g 大连理工大学硕士研究生学位论文 红移。多数的i c t 荧光化台物在与客体结合后荧光都会发生一定的移动，但荧光强度往 往没有什么大的变化。但是化合物3 。i 确是一个特例，在其冠醚受体结合m g ”后荧光增 强了2 2 5 0 倍! 在i c t 中，有一种情况被称为扭曲的分子内电荷转移t i c t ”“1 t w i s t e d i n t r a m o l e c u f a rc h a r g et r a n s f e r ：。在具有推一拉电子体系的荧光分子中，如果推电子 ( 如二甲氨基) 是通过单键与荧光团相连的，当荧光团被分子激发时，由于强烈的分子 内光诱导电荷转移，导致原来与芳环共平面的电子给体绕单键旋转，而与芳环平面处于 正交状态，原来的共轭体系被破坏，部分电荷转移变为完全的电子转移，形成t i c t 激 发态。当形成t i c t 激发态时，原有的i c 7 荧光则被淬灭。t i c t 态常常不发射荧光或者 发射弱的长波荧光，少数情况下出现i c t 与t c t 双重荧光现象。但t i c t 激发态由于正 负电荷完全分离，具有非常高的极性，固此强极性溶剂有利有t i c t 激发态的形成，而 且由于在强极性溶剂中t i c t 态的能量低，波长，大幅度红移。并使其与处于低能级的三 线态或基态的能隙大大缩小，大大增加了起非辐射跃迁得的几率，所以，t i c t 态往往是 无荧光或者是发射非常弱的长波长荧光，少数情况下出现t i c t 与i c t 双重荧光状态。 由于t 】c t 荧光对环境效应非常敏感，因此常常被用于监测环境，比如胶束，囊泡，环 糊精，分子筛，细胞膜等等中的极性，粘度，温度等。最典型的t i c t 荧光化台物，是 4 一( n ，n 一二甲基) 氨基苯腈( 化合物4 ) ，在极性溶剂中发射双重荧光。一些带有二烷 基氨基的经典化合物如7 一二甲基香豆素。”1 ，n i l er e d 。”。，( 化合物5 ) r h o d a m i n e “。 等，都呈现出对环境效应的敏感性，都可以用作微环境荧光探针。 c n 审 n 豸斟孕 4 5 6 圈14 三种极性检测用t i c t 荧光探针 f i g1 4t h r e et i c tf l u o r e s c e n tp r o b e sf o rm e d i u mp o l a r i t y t i c t 荧光化合物也可以用于水溶液中小分子有机化合物的识别，通常需要与环糊精 共同使用。例如著名的t i c t 荧光化合物a n s 8 。( 苯氨基萘磺酸，如化合物6 ) ，在含有 环糊精的水溶液中，可以进入环糊精空腔的内部，由于环糊精空腔内部的微环境的极性 g 一 张晓琳：荣酰亚胺类一氧化氮荧光探针的设计、合成及光谱研究 远远小于外部的水相，因此a n t i 不能形成t z c t 激发态，当有尺寸合适的有机小分子存 在时，会与a f , s 竞争，将a n s 逐出环糊精内部空腔，进入水相，光激发是形成t i c t 态， 荧光减弱，并大幅度红移。 123 激基缔合物1 e x c i f l i e r 当两个相同的荧光团，如多环芳烃蔡、蒽和芘等连接到一个受体分子的合适位置时， 其中一个被激发的荧光团( 单体) 会和另一个处于基态的荧光团形成分子内激基缔台物。 它的发射光谱不同于单体，表现为一个新的、宽而强的、长波无精细结构的发射峰。由 于形成这种激基缔合物需要激发态分子与基态分子达到“碰撞”距离“3 ；a ，因此荧光 团阃的距离是激基缔合物形成和破坏的关键。所以利用各种分子间的作用力改变两个荧 光团间的距离，如用结台客体前后单体激基缔合物的荧光光谱变化表达客体被识别信 息。萘、蒽、芘等荧光团由于具有较长的激发单线态寿命，易形成激基缔合物，常常被 用于此类探针。 1 ，2 4 荧光共振能量转移f r e t 。5 。”1 fju o r e s c e n tr e s o n a n c ee n e r g yt r a n s f e r 当能量给体，荧光团d ，与能量受体a ，相隔的距离远大于d a 的碰撞直径时，只要 d 与a 的基态和第一激发态两者的振动能级间能量羞相当，或者说d 的发射光谱与a 吸 收光谱能有效的重叠，仍然能够发生从d 到a 的非辐射能量转移。这是一种偶基一偶基 耦合作用的能量转移过程。f r e t 的效率反比于d a 距离的六次方。实际上d - a 发射能量 转移的条件是很苛刻的，两者除了光谱重叠外，还必须以适当的方式排列，距离足够近。 a 可以是荧光团，也可以是荧光淬灭团。对于前一种形式，激发d 时，由于能量转移， 将观察到a 的荧光发射。f 面后种情况，只能观察到1 9 的荧光被a 淬灭。 1 3 荧光分子探针常用荧光园 131 稠环芳烃 以蒽、芘为主要代表的稠环芳烃类- - 般都是具有强而稳定的荧光在荧光探针领域 里它们作为结构最简单的荧光团，经常用于基础理论的研究，荧光探针领域的权威 i 。f a b b r i z zj 曾就蒽做信息系统的荧光探针发表综述”。特别重要的是，他们的产生激 基缔台物荧光这一特征，这是其他种类荧光团不具备的。到目前为止，给予激基缔合物 原理设汁的探针绝大多数都是以葸和芘作为荧光团的。但是这类荧光团一般不能人工合 成，而且往往具有致癌性，吸收波在紫外区，大大限制了其使用。 1 32 占吨类荧光团”1 ( x a n t h e n e ) 大连理工大学硕士研究生学位论文 图15 荧光素和罗丹明荧光团的结构式 f i g 1 5s t r u c t u r e so f f t u o r e s c e i na n dr h o d a m i n ef l u o r o p h o r e s 占吨类荧光团的代表是荧光素( 化合物7 ) 和罗丹明f 化合物8 ) ，它们都是非常 有名的荧光染料。其特点是荧光量子效率高，因此在生物医学用荧光探针领域应用非常 广泛。但是，它们的缺点也很明显，其s ：o c k s 位移小，对环境因素如p h 值，温度等， 很敏感，特别是p h 值，它们不适合在中性和酸性条件下使用。而旦当它们与生物大分子 结合后，荧光淬灭非常严重，达6 0 9 0 。尽管如此，由于目前还没有合适的替代品，它 们在生物医学上的应用仍然是应用最广泛的荧光团。 13 3 善类荧光团”“ 菁染料是近年来很受青睐的生物大分子标记荧光染料。由于在其结构中有较大的共 轭平面和季铵盐阳离子，因此与d n a 有很高的亲和力，易于与d n a 结合，而且结合后荧 光大大增强! 这正是荧光素和罗丹明不具备的特点。作为d n a 嵌入荧光探针的代表是 t o ，y ( ) 系列( 化合物9 ) 。 凡酵降物麓 r ， r 2 c y 5 c y 7 1 0 图l6 几种典型的蕾染料 f i g1 6s o m et y p i c a lc yf l u o r e s c e n td y e s 菁染料的另外一个特点是波长可调范围大，可以进入近红外区，有效避开了生物体 系的自发荧光，提高探针的灵敏度。如化合物1 0 。但是，菁染料的最大缺点是光稳定性 差，很容易分解，荧光量子产率低，这大大制约了其应用。 张晓琳：蔡酰亚胺类一氧化氢荧光探针的设计、合成及光谱研究 1 34b o d l p y 类荧光团“1 1 “ b o d i p y 类荧光团于二十世纪六十年代首次合成“。1 ，在九十年代中期才有m o i e c u a ! p r o b ei n e 推出的新型荧光剂”“，b o d l p y 类荧光化台物的特点是荧光量子效率高，隧 取代基变化荧光可调范围大不易受环境口h 的影响，这是一类非常有前途的荧光团， 尽管进入实际应用的时间较短，但其性能已得到普遍公认，在荧光探针领域有很大影响。 它的不同衍生物跨越整个可见区。并进入近红外区可以对四种碱基进行标记，瓦不发 生光谱重叠这是任何荧光团都无法比拟的。其主要弱点是s ! o c k s 位移小，合成成本 相对高 13 5 萘酰亚胺荧光团”“ l ，8 一萘酰亚胺是由1 ，8 一萘酸酐和伯胺缩台后生成的。1 ，8 萘酸酐本身是 个荧光发射团，但荧光微弱。如果萘环t 。有给电子基团，就形成了荧光团，但若是吸电子 基团，则不显示荧光。本类荧光团的分j l 结构具有取样几个特点。烈平面性：具有较大的 共轭体系；分子结构中一端具有强的给审子基团另一端具有强的吸电子基闭，因此其分 子结构中存在着一大的“吸一一供电子共轭体系”。处于这样体系中的电子很易受到光的 照射而发生跃迁，从而产生荧光特别是4 位有强烈供电f 基如氨基的衍生物都能够发 射很强的荧光。其光化学与光物理特点是光稳定性好、荧光发射波长适中且s t o c k s 毫 移大。曰前国内外有关1 ，8 一萘酰亚胺类化合物的研究主要集中在亚胺的变化和萘环上 的修饰。 ) ：v j 、 ； 强 舌寒 1 2 1 3 墨1 7 儿种萘酰亚胺荧光探针 f i g i7s o m en a p h t h a m i d ef l u o r e s c e n tp r o b e ? 。? t j 。 霪 v 、。 a 、 、。7 工、。，“ 1 4 我们研究组在这方面也做了许多贡献，如上图1 ，“、1 2 “是对铜离子识别的双波 长荧光探针，它在四、五位追位上引入的氨基对整个荧光分子的波长影响很大，对设计 双波长的荧光探针是一个非常好的取代位置，图1 3 “! 是对汞离子识别的荧光增强型探 一 。， 大连理工大学硕士研究生学位论文 针，在萘酰亚胺上容易引入各种类型的胺基，这对它设计对不同分子及离子的受体极其 有利，图1 4 “。是对质子识别的质子海棉探针，在萘酰亚胺的上面用质子海棉取代，利用 分子内的p e t 作用来实现对分子的识别。 由于萘酰亚胺荧光团作分子探针时表现出的优异的性能，今后它仍将是人们设计分 子探针的一个首要选择。 1 4 荧光分子探针常用识别基团 受体设计是超分子化学的最重要环节，识别是荧光分子探针的基本目的，识别基团 是为实现对目标物种的识别而合成的探针的结构单元。对于阳离子识别，除少数荧光化 合物本身所带的基团对离子具有识别能力外，绝大多数荧光分子探针需要一个主要为结 合受体而合成的识别基团。有时识别任务是识别基团与荧光基团上的取代基共同完成 的：识别基团与荧光基团共用部分结构( 识别基团与荧光基团之间刁i 是完全独立的) 是 i c t 探针的基本结构方式：典型p e t 探针的识别基团与荧光基团之间是相互独立的。荧 光分子探针中常用的识别基团有冠醚、开链聚醚、多乙烯多胺、多羧甲基胺、环糊精、 杯芳烃、多肽等。 1 41 冠醚类阳离子受体 冠醚( 包括单环冠醚，穴醚，开链冠醚) 类受体对阳离子客体有较好的亲和性，主 要用于碱金属，碱土金属及铵根离子的识别。冠醚对阳离子的选择性主要由冠醚中的杂 原子( 氧，硫，氮) 与金属离子的配位作用，和冠醚孔穴的尺寸决定。冠醚与荧光化合 物分子以不同方式结合，当冠醚络合了阳离子后，对整个体系引起扰动，进而影响其光 物理性能，提供出相关的信息。 全氧杂冠醚一般的含氧数为4 1 0 个，可与l i + 、n a + 、n h 。+ 、r b 一、c s 、a g + 、a u 、c a 2 + 、 s r ”、b a ”、c 矿、h g 一、h g ”、p b ”等形成络合物。冠醚荧光分子探针的合成，大多是利用 苯并冠醚的苯环的反应活性、芳环上取代基的反应活性，或通过冠醚环外侧链上的脂肪 族反应性基团将荧光团引入。 氮杂冠醚按环中氮原子的数量可分为单氮杂冠醚、双氮杂冠醚、多氮杂冠醚和全氮 杂冠醚( 大环多胺) 。氮杂冠醚由于空腔及杂原子的不同，表现出对不同的金属离子显 著的选择性。不仅因为它的配位选择性，同时氮杂冠醚与荧光团连接方便，并且识别信 息容易通过p e 3 1 、i c t 等方式影响荧光信号。所以这类冠醚在荧光分子探针中应用最为 广泛，前边列举的许多都是氮杂冠醚。 冠醚中的氧原子为硬碱，对碱金属和碱土金属离子有较强的络合作用；硫原子为软 碱，当冠醚中部分氧原子被硫原子所替代后对重金属或过渡金属离予有特异的络合能 力，能形成稳定的络合物，因此硫杂冠醚引起了人们的关注。 张晓琳：萘酰亚胺类氧化氮荧光探针的设计、合成及光谱研究 过渡金属和重金属的荧光识别以前几乎没有被提及过，因为他们都是很强的荧光淬 灭剂，但在近年来，已经出现了硫杂冠醚用于过渡金属及重金属离子的荧光识别的报道， 如化合物l 】、1 24 、”，在其硫杂冠醚结合重金属离子后，荧光强度大大增强。良好的识 别作用在于硫原子是一种“软”酸，而过渡金属离子是“软”碱，二者的配位能力比冠 醚与过渡金属离子的配位能力强。 15 1 6 匿l8 两种硫冠醚为受体的金属离子探针 f i g i8t w op r o b e sf o rt r a n s i t i o nc a t i o n s w i t ht r o w nt h i o e t h e ra sr e c e p t o r s 142 环糊精“9 环糊精是继冠醚后的第二代受体。环糊精是由葡萄糖通过【，4 糖营键相连形成的 类筒状化合物，其内腔疏水而外部亲水。一般是将荧光团连接在环糊精上，在水溶液 中，荧光团进入环糊精的疏水空腔：在- 5 受体结合删，客体将荧光团从空腔中逐出，导 致荧光变化。这类探针多用来识别中性分子。进入环糊境内脏的有机体分子往往处于某 种强制取向或受制约的构想状态。列丁“处j 二! f ； = 期精内腔的荧势团化信物的光物理，光化 学性质会受到环糊境内腔尺寸和极性的影响 = 【能会不同于处于自由状态的分子、， 对环糊精极其敏感的荧光化合物，i ：l t ：f t 磺酰胺fd n s ) 常常与环糊精联用，或者 直接将荧光化合物键连在环糊精上，可识别不同种类的外来客体物种。在水溶液中，d n s 进入c d 内腔，发射强荧光，当加入外来客体嗣，酬s 不断离， ：c d 内腔，进入强极性的水 溶液中，使其荧光强度不断的减弱。这体系可用于检测某些甾旗化合物是否进入环糊 精c 基于激基缔合物原理的c d 荧光探针也很常见，例如将芘连在c d 上的荧光探针存水 溶液中，芘在c d 内腔中，由于两个c d 内腔的靠近，合并，使两个芘发射团得以靠近并 在激发时形成激基缔合物，发射强烈的激基缔合物荧光。当溶液中加入新的客体分子时， 能进入c d 内腔，将芘取而代之，使激基缔合物荧光大大降低，而出现芘单体荧光。 大连理工大学硕士研究生学伉论文 14 3 吡啶衍生物 近年来吡啶衍生物作为荧光分子探针的识别基团得到了广泛的应用，特别是双一( 2 - 吡啶甲基) 氨被经常用于各种z n2 + 的荧光分子探针中。z n ”具有重要的生理功能，而它本 身不易对荧光团产生淬灭作用，近几年这类探针研究得非常活跃。 1 44 环状多铵盐类及胍类阴离子受体 识别阴离子的荧光探钏在生物学领域中有重大的意义，但是相对于阳离子荧光探针 来讲，其研究的历史较短，近年来才开始受到关注。阴离子识别的受体部分一般都含有 阳离子，或缺电子位点，通过静电作用与阴离子结合；而且田于多数阴离子容易形成氢 键，受体中往往引入氢键的给体基团以提高结合强度和选择性。 1 4 5 多点受体 i ， 图19 两例复杂客体识别的多点受体 f i g 19t w oe x a m p l e so fm u l t s i t er e c e p t o rf o rc o m p l i c a t e dg u e s t s 在荧光探针的实际应用中靠单一的某种受体结构，往往都不能做到高选择性，高灵 敏度的识别，这是由于客体分子的多样性，复杂性决定的。特别是在生物分子中，一般 都有多个功能性基团，例如最简单的氨基酸，有铵根和羧基，因此荧光探针也应该有多 点受体，其余客体分子的结合是多种作用力的综合结果。如化合物1 3 。 146 其他识别基团 除了上述比较常见的几类重要的识别基团外，还有很多其他类型的识别基团被用于 荧光分子探针中，如多肽等。 需要补充的是：作为超分子化学的重要组成部分，荧光分子探针受到科学家们的广 泛关注。受体在荧光分子探针中具有重要作用它决定分子探针与被识别客体的结合灵 敏性( 强度) 和选择性。这种结合性能是荧光分子探针对被识别客体具有选择性和灵敏 张晓琳：禁酰亚胺类一氧化氮荧光探针的设计、合成及光谱研究 性的前提。但是，只有分子的结合事件能有效地驱动荧光信号变化时，荧光分子探针：虿 完成了它的任务。 尽管我们前面分别讲述了荧光基团和识别基团，荧光分子探针是包含这两个部分的 整体，识别过程中还要涉及被t 别物种的结合，构成一个超分子体系。体系的复杂性大 于组成体系的个体复杂性之和，简单地拼合识别基和荧光团常常不能达到预期的目的。 1 5 本研究工作的背景及意义 氧化氮( n i t r i co x i d e ，n o ) 是h u m p h r e y 于1 9 3 5 年在研究“笑气”( n ! o ) 时发现的 白n o 被发现以来，它一直被看作是对生物有毒的简单无机分子。但是，自80 年代末 科学家发现，一氧化氮的作用远超乎于人们的想象。一氧化氮本身具有神奇的的生理调 节功能。它不仅具有免疫调节、神经传递、| ：缸压生理调控和血小板凝聚的抑制等生理功 能，而蜀在许多组织中，尽管其真正的释放量目前尚难于检测，但已确知会释放出不l 刊 浓度的一氧比氮，且浓度的变化与机体的生理机能紧密相关。许多疾病，包括基阂突变 。癌变动脉硬化等) 和生物机体中毒等，可能都是一氧化氮的释放或调节的彳：正博引 起的。因此，1 9 9 2 年n o 成为( ( s c i e r _ i c e ) ) 杂恚年度分予。 如何现场定性和定量检测一氧化氮，向化学家们提出了艰巨而开拓性的任务，人们 采取了电化学、化学荧光法、质谱、紫外一可见分光法等一系列方法来对氧化氮进行 测量。这其中荧光法由于其灵敏性高，具有实时性，且测量简单易行而得至6 了广泛青瞟。 臼6 日，研究者们已开发出了很多列一氧化氮检测的荧：悲探针。主要分为以下“，大类。 1 51 用邻苯二胺与n 0 缩台反应方法 1 、d a n m ! s 等发现d a n 可与n 0 7 反应生成n a t 声物”1 如图所示。当在3 7 5 r1 1 1 1 激发，在 4 1 5 n m 下观察发射，n a t 的荧光强度要比等摩尔的d a n 高出至少9 0 至1 0 0 倍。它可检沈 到1 0 一m o l l 。这种检测方法具有专一性、灵敏性和通用性。 眩麓兰 大连理工大学硕七研究生学位论文 但d a n 作为一氧化氮的检测探针仍存在许多缺陷，例如由于在紫外激发而致使对细 胞的毒性，强烈的自发荧光，摩尔消光系数小，以及在中性缓冲液中溶解性低。因此， 有更长的激发波长，高的摩尔消光系数，在水中有高的荧光量子效率的一氧化氮荧光探 针开始成为人们研究的目标。n a g a n o 研究组在这方面作出了卓越的贡献。 2 、d a f s 由于d a n 的启发，科学家开始把荧光团荧光素与其结合起来，合成了新的荧光探针 来检测n o 。d a f s 本身荧光弱，当与n o 结合后生成的d a y t s 。最大吸收波长并没有明显 的改变但却大大提高了量子产率。d a f s 的荧光的变化是基于它的具有反应性的邻苯二 胺部分，它能在氧气存在的条件下与一氧化氮进行反应生成相应的三唑类化合物( 如图 1 1 0 ) 。在反应前由于邻苯二胺部分富含电予，由于分子的光致电子转移作用( p e t ) 使电子转移到荧光团上导致荧光淬灭，但当邻苯二胺与一氧化氮反应后，氮上的电子对 被束缚使荧光释放出来。 0 h 2 n 吱l 2 n h 一 n n 3 0 0 ：1 hn m r ( d m s o 比t m s ) ，占：7 1 2 3 71 4 5 ( 1 h d ，j = 8 8 h z a r i - i ) ： 74 1 0 74