（应用化学专业论文）在植物体锌、硒对铅、镉的拮抗作用研究.pdf

中国科学技术大学颂士毕业论文 摘要 本课题主要研究微量元素锌、硒与有毒的重金属元素镉、铅在植物中的的拮 抗作用。 笳栽实验研究了当微量元素锌、硒与重金属元素铅、镉在土壤中共存时，这 四种元素在植物中的吸收关系。实验表明：在西红柿、蒜苗中锌、硒对铅、镉均 表现出拮抗效应。 水培实验研究了铅、镉、锌、硒从培养液中被吸收进入蒜苗时的相互作用， 特点是避免了土壤中其它因素的干扰。铅、镉在蒜苗中的含量，随着锌、硒浓度 的增加而减少，锌、硒对铅、镉表现出明显的拮抗效应。铅、镉的存在对锌、硒 的富集也产生了轻微的影响。 叶面喷施实验是通过叶面喷施含锌、硒的营养液对蒜苗进行富锌、富硒，并 用连续浸取法对蒜苗中的铅、镉进行了化学形态分析。在镉污染的条件下，喷硒 蒜苗吸收的硒比不喷硒的增加了1 2 1 3 ，喷锌蒜苗吸收的锌比不喷锌的增加了 1 1 7 。在铅污染的条件下，喷硒蒜苗吸收的硒比不喷硒的增加了6 4 3 ，喷锌 蒜苗吸收的锌比不喷锌的增加了1 4 7 。喷硒使镉的吸收降低了珥斗蟛，喷锌使 镉的吸收降低了3 7 0 1 。镉化学形态分析表明：锌与镉在蒜苗中存在着全面的 竞争关系，当锌大量存在时，蛋白质态的镉、无机盐态的镉均明显降低：硒在蒜 苗中的富集，也明显抑制了镉蛋白的形成。铅化学形态分析表明：各种形态的铅 的含量均无明显变化，喷施硒与锌对铅在蒜苗中的吸收无明显影响。 ! 旦型兰垫查查堂堡兰些堡兰 a b s t r a c t t h ea n t a g o n i s mb e t w e e nt w ob i o e l e m e n t s ( z na n ds e ) a n dt w ot o x i cm e t a l s ( p b a n dc d ) i np l a n tw a si n v e s t i g a t e d ， i np o te x p e r i m e n t ，s e ( s e 4 + ) a n dz n ( z n 2 + ) w e r ea p p l i e d ，r e s p e c t i v e l y ，t ot h es o i l c o n t a m i n a t e db yp bo rc d ，i nw h i c ht h et o m a t oa n dg a r l i cw e r ep l a n t e d a sar e s u l t ， s ea n dz nw e r ee n r i c h e de v i d e n t l yi nt h et w ov e g e t a b l e s t h ec o n t e n t so fp ba n dc d i nt h et w ov e g e t a b l e sw e r ed e c r e a s e dm a r k e d l y t h ea n t a g o n i s mo fs ea n dz na g a i n s t p ba n dc di np l a n t sw a ss u g g e s t e d h y d r o p o n i c se x p e r i m e n t sw e r ea d o p t e dt oi n v e s t i g a t et h ei n t e r a c t i o n sb e t w e e n t h eb i o e l e m e n t sa n dt o x i cm e t a l sb e f o r et h e s eh e a v ym e t a l se n t e r e dt h ei n t e r i o ro f g a r l i c h y d r o p o n i c se x p e r i m e n t ss h o w e dt h a tt h ec o n t e n t s o fc di n g a r l i cw e r e r e d u c e db yt h ee n r i c h m e n to fs eo rz n ，s u g g e s t i n gt h a tt h e r ew e r ea n t a g o n i s t i c i n t e r a c t i o n sb e t w e e nc da n ds e z ns i g n i f i c a n t l y t h ea b s o r p t i o no fp bw a sa l s o d e c r e a s e dw i t ht h ei n c r e a s e o ft h ec o n c e n t r a t i o n so fz no rs ei nh y d r o p o n i c s e x p e r i m e n t s i nf o l i a re x p e r i m e n t ，s eo rz nw a se n r i c h e db yf o l i a ra p p l i c a t i o no f s eo rz nt o t h eg a r l i ct h a tw a sp l a n t e di ns o i lc o n t a m i n a t e db yp bo rc d t h e nas e q u e n t i a l e x t r a c t i o nm e t h o dw a sa p p l i e dt oa n a l y z et h eg a r l i cl e a v e si no r d e rt os t u d yt h e c h e m i c a lf o r mo f p ba n dc di ng a r l i ct h er e s u l ts h o w e dt h a tf o l i a ra p p l i c a t i o no fs e o rz nh a da no b v i o u se f f e c to nt h ee n r i c h m e n to fs eo rz ni ng a r l i c t h ec o n t e n t so f c dc o m b i n e dw i t hp r o t e i n ，c o m b i n e di np h o s p h a t ea n dc o m b i n e di no x a l a t ew e r ea l l r e d u c e di nt h eg a r l i ce n r i c h e ds eo rz n t h ea b s o r p t i o no fc dw a sr e s t r a i n e dw h e nt h e l e v e lo fz nw a sh i 曲i ng a r l i c z nc o m p e t e dw i t hc db o t hi no r g a n i cf o r ma n d i n o r g a n i cf o r mi ng a r l i c t h ec o n t e n to fc dw a sa l s od e c r e a s e da st h ec o n t e n to fs e i n c r e a s e d t h ec o n t e n to fp bd e c r e a s e ds l i g h t l yi nt h eg a r l i ce n r i c h e ds eo rz ns ea n d z nh a dn oo b v i o u se f f e c to np bi ng a r l i c ， 2 中国科学拉术大学硕士毕业论文 1l 硒的生物学作用 第一章综述 1 _ l1 硒在动物和人体的作用 硒在动物中的作用主要是参与蛋白质和g s h p x 等的合成，刺激免疫球蛋白 及抗体的产生，拮抗及降低某些有毒元素及物质的毒性，保护细胞膜的结构功能， 参与三援酸循环等。 1 1 2 硒在植物体的作用 硒在植物中具有抗氧化作用，硒是g s h - p x 的组分，硒具有提高g s h p x 活 性，防止膜脂质过氧化，保护生物膜不受损伤的功能。在大豆、油菜、小麦和玉 米等高等植物的叶片或萌发种子中检测到了g s h p x 的活性，且与植物体内硒的 水平有着极其密切的关系，证明硒对高等植物具有抗氧化作用 1 。 硒在植物中的存在形式比较复杂，主要以禽硒氨基酸衍生物的形式存在 2 。 硒多糖也是硒在植物中的一种重要存在方式。硒多糖在自然界，尤其是在植物中 的存在已经得到证实，大蒜硒多糖的生物活性明显优于多糖和亚硒酸钠，它不仅 能抑制s i o ：对细胞的损坏，还能抑制人胚肺巨细胞病毒，抑制率达3 8 6 3 。 适量硒还能促进植物的光合作用。适量施硒可以减少气孔阻力、提高气孔 c o ：通量而促进了植物的净光合速率，说明一定量硒能促进气孔开放而减少了光 合作用过程气体交换的阻力 4 。 1 2 锌的生物学作用 1 2 1 锌在动物和人体的作用 锌在人体中是仅次子铁的生命必需微量元素，人们早已知道锌在动物和人体 中主要以生物大分子的方式存在，它在生物体中具有重要的生理、生化功能及营 养作用。锌参与生物体内各种机体的生命活动过程，维持机体的正常代谢和发育。 养作用。锌参与生物体内各种机体的生命活动过程，维持机体的正常代谢和发育。 中国科学技术大学硕士毕业论文 1 - l 硒的生物学作用 第一章综述 i 1 _ 1 硒在动物和人体的作用 硒在动物中的作用主要是参与蛋白质和g s h p x 等的合成，刺激免疫球蛋白 及抗体的产生，拮抗及降低某些有毒元素及物质的毒性，保护细胞膜的结构功能， 参与三羧酸循环等。 i 1 2 硒在植物体的作用 硒在植物中具有抗氧化作用，硒是g s h p x 的组分，硒具有提高g s h p x 活 性，防止膜脂质过氧化，保护生物膜不受损伤的功能。在大豆、油菜、小麦和玉 米等高等植物的叶片或萌发种子中检测到了g s h - p x 的活性，且与植物体内硒的 水平有着极其密切的关系，证明硒对高等植物具有抗氧化作用 1 。 硒在植物中的存在形式比较复杂，主要以含硒氨基酸衍生物的形式存在 2 。 硒多糖也是硒在植物中的种熏要存在方式。硒多糖在自然界，尤其是在植物中 的存在已经得到证实，大蒜硒多糖的生物活性明显优于多糖和亚硒酸钠，它不仅 能抑制s i o ：对细胞的损坏，还能抑制人胚肺巨细胞病毒，抑制率达3 8 6 3 。 适量硒还能促进植物的光合作用。适量施硒可以减少气孔阻力、提高气孔 c o ：通量而促进了植物的净光合速率，说明一定量硒能促进气孔开放而减少了光 合作用过程气体交换的阻力 4 。 1 2 锌的生物学作用 i 2 1 锌在动物和人体的作用 锌在人体中是仅次于铁的生命必需微量元素，人们早己知道锌在动物和人体 中主要以生物大分子的方式存在，它在生物体中具有重要的生理、生化功能及营 养作用。锌参与生物体内各种机体的生命活动过程，维持机体的正常代谢和发育。 中国科学技术大学硕士毕业论义 在人体内存在着的各种酶类中均含有锌，作为酶的重要辅助因子，参与酶的合成 及其活性的发挥，促进生长发育；参与脂肪、蛋白质和碳水化合物的代谢，参与 生物体小分子的利用和贮运、肽链的解合，参与核酸的分解与合成；锌影响维生 素a 的转移并保持其在血浆中的正常水平，维持味觉和嗅觉，对维护中枢神经 系统功能起重要作用；锌能增强肝脏的合成能力，并参与解毒，从而改善机体的 防御能力，提高免疫功能：人和动物病伤治愈、骨骼和动脉修复都与锌的生物功 能关系密切，它是维持皮肤、骨骼和男性生殖器官正常生长发育所必需的；锌可 防止自由基对细胞的攻击，保护细胞膜及细胞的正常分裂。 1 2 2 锌在植物体的作用 1 9 3 6 年就证实锌是作物正常生长发育所必需的微量元素，1 9 4 0 年s k o o g 证 明植物缺锌体内生长素减慢；1 9 4 8 年我国学者崔徵提出锌是色氨酸合成时所必 需的，在缺锌的植物体内不能合成色氨酸；锌又是影响植物氮素代谢的重要元素； 1 9 7 6 年c h k i 等研究证明，锌与光合作用有密切关系，它会直接影响叶绿素的深 度，他测得成熟的叶子中，每克干重叶最低不能低于1 3 1 4 垤的锌。锌是高等 植物生长不可缺少的元素，植物缺锌后生长停滞。植物中正常含锌量( 占干物重) 为2 5 1 5 0 u g g ，含锌量小于2 0 9 9 g 时有可能缺锌 5 。各种植物含锌量有很大 差异，在同一植物的不同部位含锌量也不一样。据崔徵以西红柿为材料分析的结 果证明，正常植株中锌的分布是顶芽含锌量最高，叶中次之，茎中最少，整个作 物的含锌量则是由下而上逐渐递增 6 。 锌在植物中的生物学功能是：是一些酶与辅酶的组分和活化剂，是维生素的 活化剂，参与植物细胞的呼吸，促进光合作用，加强叶绿素的合成，催化植物体 内氧化还原过程，促进蛋白质的氧化，参与植物体内生长素吲哚乙酸的合成，促 进植物茁壮成长，增强抗病、抗寒能力。 1 3 铅的生物学作用 1 3 1 铅在动物和人体的作用 脑是对铅反应最敏感的器官，也是受损的主要器官。铅使得促甲状腺素( t s h ) 中国科学技术大学硕士毕业论文 释放激素( t r h ) 的反应降低。研究 7 报道铅能直接抑制人类生长激素和胰岛素样 生长因子i 的释放，这些内分泌的变化可能与铅毒性引起的身材矮小有关。铅还 对酶系统发生作用，影响珠蛋白的合成，影响血红素的合成。很高浓度的铅对试 验动物可显示某些致癌活性，用1 0 0 m g k g 或1 0 0 0 m g k g 碱性醋酸铅的饲料喂养 小鼠和大鼠，可诱发良性和恶性肾脏肿瘤【8 。慢性铅中毒时，肾脏的排泄机制 多半受到影响。出现肾组织进行性变性，伴随肾功能不全。 1 3 2 铅在植物体的作用 铅不是植物所必需的微量元素，植物在环境中是被动的吸收铅。植物可通过 根部从土壤中摄取可溶性铅化合物，这是植物铅的一个主要来源。动物可通过食 物链而受到铅化合物的污染。 许多植物不仅能耐受土壤中的高含量铅，而且还可以清除土壤中的铅离子， 并通过根系将其转移到地面以上的茎、叶部分而造成铅蓄积，其铅浓度顺序是： 根 茎 叶 果。 根部吸收铅的多少不仅取决于土壤中的总铅含量，而且还与可溶性铅化合物 含量及铅的形态及土壤条件有关，条件依次为土壤p h 值、温度、钙的可利用程 度、重金属、磷酸盐及硅含量等。土壤中含有1 0 0 4 0 0u g m g 可溶性硝酸铅时， 番茄、马铃薯的根部能够很快蓄积铅 9 。植物的叶子部位，铅蓄积则相对慢得 多。从汽车废气中排出降落在附近土壤中的铅的卤化物是较易于溶解的，随着时 间的推移可转变成较难溶的磷酸盐、碳酸盐及硫酸盐等。有机螯合作用也可使铅 在士壤中难于移动，大部分铅局限在土壤上部1 5 c m 表层，深层的根部铅吸收是 较少的。不同植物对铅有着不同的吸收能力、耐受力及迁移能力。 大剂量的铅也可对植物产生毒害作用。它能阻碍植物的生长、降低光合作用、 减少蒸腾作用和水分的吸收，还能引起铜缺乏。植物中的铅能参与到线粒体和叶 q一 绿体中，k o e p p e 1 0 等人在玉米线粒体的活体外试验中，观察到铅能抑制琥珀酸 氧化及激活还原性辅酶( b i n ) h ) 的氧化。 中国科学技术大学硕士毕业论文 1 4 镉的生物学作用 1 4 1 镉在动物和人体的作用 镉具有致癌、致畸、致突变作用，镉对动物的细胞染色体有破坏作用，导致 基因物质的改变，引起遗传突变。镉还能引起实验动物睾丸损伤、坏死，抑制与 精子有关的许多酶，使精子畸形，进而导致不育症、性功能障碍等一系列病变。 动物实验表明，镉中毒首先损害肾脏系统。镉不仅损害近曲肾小管，而且也损害 肾小球和远曲肾小管。肝是镉的最大蓄积器官，是公认的亲肝毒物。有研究认为， 低剂量镉的长期作用，可引起肝组织坏死。肺是对镉敏感的器官之一，一般吸入 氧化镉粉尘浓度为1 0 0 g m 3p 41 - 1 构空气时，咽喉有刺激感，有肺气肿和肺活量 下降的症状 1 】。镉对骨骼的损害主要表现在骨密度降低，骨小梁减少，骨骼中 矿物质含量低于对照组，表现出骨质疏松现象，严重时出现以骨质软化为主要症 状的骨痛病。 1 , 4 2 镉在植物体的作用 种植在受镉污染土壤上的作物，对镉也有特殊的吸收和富集作用。作物的根 部对镉有选择性的吸收作用，例如某污染区( 1 2 土壤中含镉量为t l p p m ，而稻根 的灰分中含镉达3 7 4 p p m ，大米含镉为1 1 9 p p m ，这样通过食物链而造成的镉中毒 危害最大。镉主要通过食物进入人体，从谷物和蔬菜中摄取的镉量占总摄入量的 一半以上，因此农田土壤中的镉含量对生物的影响极其重要。 张学洵根据土壤一植物、土壤一微生物和土壤一水体系的各项指标，提出了镉 等重盒属的土壤临界含量。镉在草甸棕壤的背景值为0 0 8 6 m g k g 。镉含量大于 7 m g k g 时，农作物产量开始下降；大于3 0 m g k g 时，造成严重减产。董克虞等 认为，常见的9 种植物中，小麦对镉的吸收累积能力最强。麦粒平均值小于 4 “ 0 0 6 m g k g ，远低于食用卫生标准( 0 4 m g k g ) 。 在c d 胁迫下，植物幼苗保护酶活性的变化是引起膜透性改变的主要原因之 一。研究表明 1 ：3 ，除p o d 活性随c d ”浓度增加和毒害时间延长稳定增加之外， s o d 和c a t 活性在低浓度c 扩处理的初期增加，表现出幼苗对初期低浓度c 酽+ 毒 害的抵抗作用，但随着c d 2 + 浓度的增加和毒害时间的延长，s o d 和c a t 活性迅速 中国科学技术火学砸：l 毕业论文 下降，从而使玉米幼苗对c d 2 + 毒害的抵御作用减弱，m d a ( 丙二醛) 浓度升高。 m d a 是脂质过氧化的产物，其浓度的升高标志着脂质已经发生了过氧化作用。膜 脂过氧化水平上升，质膜透性增加，细胞受到伤害。 1 5 选题依据 针对目前环境污染造成的蔬菜中有益元素不足、有毒有害元素超标不能有效 治理的现状，围绕环境绿色化学方向研究微量元素与重金属元素之间的关系。通 过不同蔬菜的瓮栽试验，初步探讨了微量元素强化栽培，微量元素的生物转化， 为蔬菜富集有益元素锌、硒，抑制( 或拮抗) 有毒有害元素铅、镉的吸收，提供 了一种有效的方法与途径。特别是研究锌、硒对铅、镉拮抗作用，这在环保( 如 改良土壤) 与无公害果蔬食品( 如减少有毒、有害元素吸收) 方面应用前景广阔。 1 6 本课题在研究方法上的新颖性 有研究者【1 4 通过叶面喷施的方法在农作物中富集锌、硒，但这些研究仅局 限于富集锌、硒的多少和对农作物产量的影响，并未涉及富集锌、硒后对农作物 吸收重金属元素的影响：也有研究者【15 1 通过连续浸取法对铅、镉的在农作物中 的化学形态进行研究，但仅局限于其对农作物毒害方面的研究。铅、镉、锌、硒 在土壤与植物体系中的相互作用，也被广泛关注，但由于土壤体系的局限性( 干 扰因素太多) ，研究者均无法得出明确的结论，更无法提出拮抗作用的机理 1 6 ，1 7 。本课题第一次用叶面喷旄锌、硒的方法来研究微量元素锌、硒在植物中 对重金属元素铅、镉的拮抗作用，完全避免了土壤体系、培养液体系中复杂的干 扰因素，使得研究对象简化：第一次将连续浸法应用于元素之间的拮抗研究，通 过对重金属元素的形态分析，使得讨论拮抗作用的机理成为可能。 中国科学技术大学硕士毕业论文 第二章硒研究的进展 2 1 含硒生物大分子化合物研究进展 把硒的生物活性与生物大分子联系起来开始于2 0 世纪7 0 年代。当时在 h o e k s t r a 实验室工作的r o t r u c k 对硒、v i t e 和含硫氨基酸与脂质过氧化之间的 关系产生浓厚的兴趣，终于在1 9 7 3 年采用7 5 s e 示踪技术，并结合d e a es e p h a d ex 柱层析，证实红细胞谷胱甘肽过氧化物酶( e r y t h r o c y t eg l u t h a t h i o n e p e r o x i d a s e ，r b cg p x ) 含有硒元素，且硒与酶的活性密切相关 1 8 ，确认了硒作为 人体必需微量元素的地位。后经对该酶进行细致而深入地研究，证实了硒是酶活 性中心的必需组分，该酶也成为硒的生物大分子研究的基本模型此后，随着分子 生物学研究的进展，又相继发现硒参与构成硫氧还蛋白还原酶( t h i o r e d o x i n r e d u c t a s e ，t r ) 和脱碘酶( i o d o t h y r o n i n ed e i o d i n a s e ，i d ) 等酶的活性中心 1 9 ， 多种硒蛋白( s e l e n o p r o t e i n ) 特别是硒酶( s e l e n o e n z y m e ) 的发现，显示了硒的生 物学意义，主要体现在硒酶的活性中心含硒半胱氨酸( s e l e n o c y s t e i n e ， s e c ) ，s e c 是生物合成和掺入到蛋白质分子中的第2 1 种氨基酸，硒是惟一受基因 调控的微量元素。以上成果将含硒的生物大分子化合物研究推向一个新的高度， 也使之成为微量元素科学、营养学、生物无机化学等多学科的研究热点 2 1 1 硒蛋白的存在形式、功能及催化机理 2 1 1 1 硒在硒蛋白中的存在形式 从事生物化学研究的学煮普遍认必硒蛋白复合物是硒在机体内的主要存在 形态和功能形式。硒在蛋白质中有2 种存在状态，一种为非共价结合，另一种为共 价结合。硒非共价结合于蛋白质，主要见于硒代谢的中间形式。硒经过胃肠道吸 收后，血浆白蛋白是硒最先的受体，然后硒被释放并与其它血浆蛋白质结合进行 运载，人服用”s e 后2 4 1 7 3h ，有5 2 7 0 的硒被a - 2 和0 1 球蛋白结合，硒亦 可与血浆高密度脂蛋白或低密度脂蛋白结合，这种结合是非特异的，并随时间而 中国科学技术大学硕士毕业论文 有动态变化。此外，也有人观察到硒存在于人的血红蛋白、肌红蛋白、细胞色素 c 、肌激酶、肌球蛋白、醛缩酶、核蛋白以及细菌的黄嘌呤脱氢酶和烟酸羟化酶 中，但没有证明其中的硒是键合上去的，在分离纯化这些蛋白过程中形成不同的 含硒峰组分，并且硒可能会丢失。对硒的这种结合形式还有待深入认识，由此可能 会进一步解读硒功能的多样性。硒共价结合于蛋白质中的确切形式只有s e c 和硒 代蛋氨酸( s e t e n o m e t h i o n i q e ，s em e t ) 2 种。含s e c 的硒蛋白是哺乳动物中最主 要的含硒蛋白质，动物体中约有8 0 的硒是以这种形式存在。s e c 是新近认识的第 2 1 种编码氨基酸，其遗传密码子u g a 的发现，使人们认识到s e c 掺入到蛋白质中 是由密码子u g a 介导的翻译行为 2 0 。富有特色的是，u g a 同时是3 个终止密码 子之一。在转译过程中，分子如何识别u g a 作为s e c 密码子而不当作终止密码子， 是近年来含硒大分子的生物化学最具吸引力的研究热点，并且已经发现多个与硒 蛋白合成有关的基因，如s e l a 、s e l b 、s e l c 、s e l d 等。m r n a 结构3 一非转译区 ( 3 一u n t r a n s l a t e dr e g i o n s ，3 一u t r ) 的“杆环”( s t e m l o o p ) s e c i s ( s e l e n o c y s t e i n ei n s e r t i o ns e q u e n c e ) 元件可能是s e c 特异插入的识别标志。而s e m e t 进入蛋白质可能是随机插入，即由s e - m e t 随机替代蛋氨酸而掺入到蛋白质分子 中，如新近发现的硫解酶含有s e m e t ，并且是惟一的非氧还酶硒蛋白。目前一般 把咀s e c 形式掺入到多肽链的蛋白质称为硒蛋白( s e e n o p r o t e i n ) ，而把其它结 合硒的蛋白质统称为含硒蛋白( s e - c o n t a i n i n gp r o t e i n ) 。有时为表述方便也把 一些含硒蛋白称为硒蛋白。 2 1 1 2 主要硒蛋白及其生物学功能 分子生物学研究发现，从微生物到哺乳动物都存在有硒蛋白或潜在的硒蛋白 基因。多种病毒具有编码硒蛋白的潜力，如传染性软疣病毒( m c v ) 含有与g p x 同源 的硒蛋白基因，产物对人角质细胞抗u v 辐射和超氧离子引起的细胞毒有保护作 用，同时也为m c v 提供保护：出血热病毒含有一种潜在的硒蛋白基因，经p c r 分析， 它含有1 7 个u g a 密码子和数个s e c i s 元件，每个蛋岛分子可能组装1 6 个s e e ，并 可能与该病毒致病性有关。在哺乳动物体内己发现并分离至少有3 5 种硒蛋白 2 1 ，有许多硒蛋白的确切功能至今还未阐明，比较明确的1 7 种硒蛋白如下表所 示。 中国科学技术大学硕士毕业论文 谷胱甘肚过氧化物酶 ( c p x t ，g p x 2 ，g p x 3 g 鲰4 ) 髓碘酶( 1 日，lr h ，l 马) 硫氧还蛋白还原酶 ( t r ，t 如，丁鸭) 硒磷酯舍成酶is p 乌) ( 精子j 线粒体膜硒蛋白 ( m c s ) 精子d n a 结合硒蛋白 ( m - 3 40 0 0 ) 前列腺上皮硒蛋白 e 矾= l50 0 0 ) 硒蛋白p 硒蛋白w m = i 80 0 0 硒蛋白 抗氧化酶清除过氧化氨、脂及磷脂自由基，保护膜结构：保护脂蛋 白、d n a 等生物丈分子：调节廿碳化台物合成，参与炎症调节尊 催化l 腔殃。合或蒡调节蘑性甲状腺襄l 水平等 还原核苷酸参与d n a 台成：再生抗氧化体系：维持细胞内氧化还原 状态：在细胞生长和墙殖中起关键作用：通过氧化还原修饰作用于 转录因子而涌节d n a 表达等 催化硒硝酯化舍物合成提供s e c 硒供佛，参与硒蛋白含成等 具有g p x 4 棒藉性，纺止精子发育坦程串的氧化祸伤，阻止成熟蓿子 之间结构蛋白的聚合维祷精子的稳定性和活力等 有g p x 掸活性，存在于精子核内可能对精子的生成起作用等 在前列腺分泌部上皮细胞中发现，具有与g p x 4 相似的功能，有防止 腺细胞癌变作用等 存在于血浆，台有9 或i0 个s e c ，与内皮细胞结合，有保护内皮细胞 抗氧化损伤活性另有认为其是血硒的贮运蛋白 主要存在于肌肉组织，对维护肌肉组织的正常功能是必要的 在茸及大量组织中存在，是防止硒缺乏的一种重要硒蛋白 对动物细胞来说，至少有2 类含硒蛋白是必不可少的 2 2 。一类是gpx 家 族。结构分析发现硒以$ e c 存在于酶的活性中心，每个亚单位含1 个s e c 残基。 gpx 是机体内最强的抗氧化酶，催化还原型谷胱甘肽变成氧化型谷胱甘肽，同 时使过氧化物及自由基还原成水或羟基化合物，防止生物大分子发生氧化应激反 应，保护细胞膜的结构和功能。缺硒会造成g p x 活性降低，导致组织细胞抗氧化损 伤能力减弱，直接影响细胞的分裂、繁殖、遗传及生长，进而干扰核酸、蛋白质、 粘多糖及酶的合成及代谢。另一类是脱碘酶( i d ) 家族。脱碘酶是一类膜硒蛋白， 催化4 碘甲腺原氨酸( t 。) 脱碘生成3 碘甲腺原氨酸( t 0 ，t ：，是甲状腺素活性形式， 是对所有组织细胞起作用的重要激素，在个体生长发育、代谢调节上极其重要。 硒蛋白p 2 3 j 是一种胞外糖蛋白，具有与肝素结合活性，并与内皮细胞相连， 。 已证实硒蛋白p 存在2 种构型，从分子克隆摧译得到的硒蛋白p 的氮基酸顺序中 可看出，它具有1 0 个tga 密码，表明硒蛋白p 含有多个$ e c 残基( 9 或1 0 个) ， 对纯化硒蛋白p 的直接分析，得到的结果是每个硒蛋白p 分子含有约7 5 个s e 原子，这使它与其它的硒蛋白显著区别开来。硒蛋白p 具有抗氧化作用，还有人推 测认为它是一种硒的贮运蛋白，并可能参与血红素代谢 2 4 j 。 中国科学技术大学颂= 卜毕业论文 硒蛋白w 是一种细胞内硒蛋白，只有一个s e c 残基，可结合g s h ，有抗氧化作用 还与肌肉组织代谢有关，是维持肌肉组织正常功能所必需的【2 5 。另外，在肾和其 它许多组织中发现有一种重要的m r = 1 8 0 0 0 硒蛋白，对防止硒缺乏有重要作用 2 6 。可以预见，更多利用硒化学特性的蛋白质将被发现。 第1 个微生物硒蛋白甲酸脱氢酶在1 9 5 4 年由p i n s e n t 发现后，人们对微生物 中的含硒生物大分子的生物化学研究不断取得新的进展，并相继发现了一系列含 硒酶。它们主要有： 1 ) 甲酸脱氢酶( f o r m a t ed e h y d r o g e n a s e )该酶存在于许多产生甲烷的微生 物中，以甲酸作为惟一发酵的底物，硒以s e e 形式存在于酶的活性中心，为酶的活 性所必需。硒还与钼或钨、铁硫中心一起参与电子传递过程。甲酸脱氢酶与硝酸 还原酶共同催化的包括钼或钨、铁硫中心、泛醌、细胞色素b 在内的反应体系相 当复杂，其反应机理还有待进一步研究。 2 ) 甘氨酸还原酶( g l y c i n er e d u c t a s e )最先发现于梭菌属，催化甘氨酸还原 脱氨基生成乙酸并释放a t p 。该酶由蛋白a 、b 、c 三个组分组成，已查明蛋白a 是一种硒蛋白，称为硒蛋白a ，它是一种酸性的热稳定蛋白，相对分子质量约 1 2 0 0 0 ，其中硒以s e c 存在，并在催化反应中起重要作用。 3 ) 氢化酶( h y d r o g e n a s e )这个酶的相对分子质量为3 4 0 0 0 0 ，含有4 个s e c 残基，分别位于4 个mr = 4 2 0 0 0 亚单位中。此外，该酶还有2 个m r = 5 6 0 0 0a 亚单 位和2 个m r = 3 5 0 0 0y 亚单位。有证据表明：离子化的硒氢基是这个酶的氧化还 原中心。植物蛋白质结合硒看来更为复杂，一般认为硒积聚植物硒结合蛋白很少， 而非聚硒植物硒则主要与蛋白质结合，且已发现其中主要以s e m e t 存在，也有 s e c ，但缺乏有关转译水平调控的实验证据。郭宝江及其课题组 2 7 通过对钝顶螺 旋藻进行富硒化培养获得富硒螺旋藻，从富硒螺旋藻中提取纯化到含硒藻蓝蛋白 进一步得到该蛋白的2 种结晶型，x 线衍射数据分析有望阐明其硒的结合形式。 2 1 1 3 硒酶的催化机理 许多硒蛋白是重要的酶，这类酶的活性中心含s e c ，硒是其中的必需组分，如 微生物的甲酸脱氢酶和哺乳动物的g p x 、脱碘酶等。通常把硒以s e c 的形式特异 插入蛋白质的那些酶称为硒酶( s e l e n o e n z y m e ) ，而把硒以其它形式存在于蛋白质 中国科学技术大学硕士毕业论文 中的酶称为含硒酶( s e l e n i u mc o n t a i n i n ge n z y m e ) ，有时也把一些含硒酶称为硒 酶。 g p x 的催化原理已经提出多种假说其中g a n t h e r 于1 9 7 5 年提出的g p x 作用 机理已被大多数人所接受，即通过所谓“乒乓”机理发挥作用。关于脱碘酶的催 化机理也有种假说认为，酶蛋白活性中心的硒与n a d p h g s h 一硫氧还蛋白组成 了氧化还原体系，并通过“乒乓”动力学机理催化反应进行 2 踟。然而，关于o p x 的催化机理，至今未见有人从硒的成键特性和基因结构上加以阐述。笔者最近的 研究认为，硒的d 轨道参与成键可能是g p x 中硒催化机理的关键所在，催化过程 可能涉及硒的s p 3 杂化和s p 3 d 2 ( 不等性) 2 种形式的更替变化( 与不同氧化态相对 应) ，当硒活性中心与底物结合时，将用s p b d 2 不等性杂化形式( 部分杂化轨道被 成对电子占有，部分杂化轨道是空的) ，其中空的轨道将向底物分子进行亲电进攻 而填充有电子对的杂化轨道则可向底物分子进行亲核攻击( 例如进攻与过氧键直 接键合的氢) ，即过氧化物上2 个氧原子的孤对电子进入空轨道，继而导致过氧键 断裂，而g s h 结合是一个相反的过程，其结果是导致硫硫键断裂，g s s g 键的形 成。耐人寻味的是，整个过程都是涉及氧族的3 个元素，涉及0 - 0 键的断裂和s s 键的形成，而起催化作用( 活性中心) 的是氧族的第3 个元素一硒。 2 1 2 植物硒多糖的研究进展 由于多糖分子的结构特点，有可能与硒结合，含硒多糖在自然界，尤其是在植 物中的存在已经得到证实。其中硒以2 种可能形式存在： o l 一s e h 、r - - s e - - 0 一强 研究者不断地从植物中提取出硒多糖，并对其结构和功能进行了研究。 2 ，1 2 1 大蒜硒多糖 大蒜含硒多糖的平均相对分子质量约1 5 0 0 0 ，通过对硒多糖水解产物进行高 效液相色谱( h p l c ) 和不同溶剂体系的纸上层析( p c ) 分析，结果表明：大蒜含硒多 糖是一种甘露聚糖。经纯化，硒的质量含量可达1 2ug g 。合成的模型化合物 1 2 中囡科学技术大学硕士毕业论文 d 一甘露糖硒酸酯与大蒜硒多糖的红外吸收光谱基本吻合。证明大蒜硒多糖中的硒 可能是以硒酸酯形态存在。大蒜硒多糖的生物活性明显优于多耱或亚硒酸钠。它 不仅能抑制s i o ：对细胞的毒害作用，并且还能抑制人胚肺巨细胞病毒。 2 1 _ 2 2 箬叶硒多糖 从高硒地区生长的箬竹中提取的多糖进行测定，发现其中含有丰富的硒。陈 春英等【2 9 用箬叶多糖与硒化合物反应得到硒酸酯多糖。对箬叶多糖的化学和生 物学性质进行了大量的研究，结果表明，箬叶硒多糖能有效地提高血液中的硒含 量和6 p x 的活性，显著降低脂质过氧化产物丙二醛的含量，增强红细胞抗h 。o 。氧化 损伤的能力，具有明显的免疫增强效应。 2 i 2 3 螺旋藻硒多糖 庞启深等 3 0 在1 9 8 9 年从螺旋藻中分离纯化了一种多糖( s p 一1 ) ，相对分子质 量为1 2 5 9 0 。其多糖组成为d 一甘露糖( w = 3 0 9 ) ，d - 葡萄糖( w = 2 9 8 ) ，d - 半乳糖 ( w ：2 2 7 ) 和葡萄糖醛酸( w = 1 6 5 ) ，进一步研究表明：螺旋藻多糖对细胞的辐 射遗传损伤有防护效应，并从分子水平上阐明螺旋藻多糖对核酸内切酶活性的影 响与d n a 修复合成的增强作用有关。周志刚等i 3 王 从添加硒培养的极大、钝顶、 盐泽3 种螺旋藻中分离得到胞内多糖和胞外多糖，经测定，多糖分子中结合有硒， 推测可能是硒与藻体表面多糖分子形成硒酸酯，但胞外多糖中的含硒量较大，而 胞内多糖结合硒的能力很弱，并分析认为胞内的还原环境不利于多糖与硒结合， 胞外的氧化环境可能使多糖一金属离子一亚硒酸根离子易于形成配合物。对于螺 旋藻多糖结合硒及其意义将会有更加深入的研究。 硒多糖是生物体对无机硒进行生物有机化的形式之一，研究发现硒多糖的生 物学活性普遍高于多糖和硒，所以硒多糖的研究具有一定的开发价值，特别是植 物硒多糖可以作为一种良好的天然补硒剂，将会有较好的开发前景。 2 1 3 硒与核酸的研究进展 硒与核酸特别是硒与转移核糖核酸( t r n a ) 间的关系是随着人们认识硒蛋白 合成的生物化学机理的过程而不断深入的。早在1 9 7 5 年，y o u n g 等人就从大肠杆 中国科学技术大学硕士毕业论文 菌( e c o l i ) 中发现了含硒t r n a 的存在，到1 9 8 2 年，h a w k e s 等 3 2 从大鼠肝切片 中证实s e c 能键合在一种特异的t r n a 上。发现能携带s e c 并识别u g a 的t e n a 是阐明硒蛋白合成的分子生物学机理最直接有力的证据。经研究，t r n a 是一种称 为s eic 基因的产物，为一典型的三叶草型t r n a 分子，是迄今为止所知的最大的 t r n a 之一，并拥有一个独特的氨基酸长臂，它多出的一个可变动碱基，使其可以 在结合丝氨酸基础上，以丝氨酸为碳架合成s e c 。后由l e e 指认它为t r n a 。”“， 并相继有人发现s e r - t r n a o ”“、s e c t r n a 。“”“和一些异构体，它们的水平与硒 蛋白的表达及g p x 活性是一致的。当然这种含硒核酸只是硒蛋白合成过程中s e c 的转运形式，并且硒是由硒磷酯化合物作为硒供体经酶促作用( 由含硒酶 s e l e n o p h o s p h a t es y n t h e t a s e ，s p s 。催化) 结合到丝氨酸碳架上的，其主要意义也 体现在为硒蛋白合成的确切机理提供证据。 另外，在生物体对硒的代谢、转化特别是植物对无机硒的生物有机化研究中 发现了核酸中有硒存在。刘曼西等 3 3 测定了含硒3 1 2 5 ( 1 0 “) 的富硒酵母中 的粗提r n a 中硒含量高达6 7 5 ( 1 0 。6 ) ，但纯化t r n a 中没有检测到硒，而蛋白水 解液有硒代蛋氨酸及硒代半胱氨酸。胡文军等 3 4 在研究含硒8 4 ( i 0 “) 的富硒 金针菇菌丝体中的含硒生物大分子中，发现硒核糖核酸占总有机硒的0 0 1 ，但 含硒量仅为0 0 5 ( 1 0 1 ) 。周志刚认为 3 5 螺旋藻中蛋白质含量很高，其中结合 硒量只不过占细胞含硒量的3 4 4 7 ，加上脂类结合的硒，两者结合的硒只占细胞 含硒量的半，因此，细胞中的硒可能还有其它的结合方式，例如与核酸结合或者 与小分子化合物结合形成有机硒化合物。左银虎 3 i j 也论述了植物中除硒蛋白外 一部分有机硒是以rna 结合态存在的，植物中己发现的s e r n a 确切形式都是 转移核糖核酸，结构为5 甲胺基2 硒代尿嘧啶。这些结果说明了核酸中存在硒， 但硒核酸的结合形式除较清楚的s e c - t r n a “川“。外，还没有发现d n a 或r n a 直接 键合硒。含硒核酸有许多要探索的问题，如硒的结合形式、含量、生物学意义等。 值得注意的是，最近我国学者报道 3 7 ，通过制备含有谷胱甘肽结合位点的 单克隆抗体，然后用化学突变法将谷胱甘肽过氧化物酶催化基团一s e c 残基插入 抗体结合部位，由此获得了含硒的抗体酶。活性检测表明，这种抗体酶的谷胱甘肽 过氧化物酶活性较目前世界上最成功的g s h g p x 模拟物一e b s e l e n 的活性高 1 1 0 0 倍，甚至超过g p x ，这也是世界上首次合成的具有这么高活性的含硒抗体酶。 4 中国科学技术大学硕士毕业论立 由于抗体对抗原有特异识别和结合能力，可以把含硒抗体酶直接导向靶位而发挥 作用。唐家骏等【3 8 j 通过对卡拉胶和角叉菜胶进行硒化处理获得富硒卡拉胶和角 叉菜胶，研究发现其具有一定的生物活性。这些人工富硒化的含硒生物大分子无 疑将为生物大分子研究和生物活性物质的富硒化改性研究开辟一个新的途径。越 来越多的证据表明，增加硒摄入的确可降低恶性肿瘤( 如肝癌、胃癌、肺癌、前列 腺癌等) 和心血管系统疾病( 如冠心病、动脉粥样硬化等) 的发生率：可增强免疫功 能：可阻止病毒( 如h b v 、h i v 等) 感染：并可延缓h i v 感染发展为a i d s 的进程 ：3 9 。 但时至今r ，一般补硒的方法仍是用无机硒化合物制成口服制剂，研究显示有机 硒化台物毒性低且在激发免疫反应上比无机硒显著 4 ( ) 。但有机硒的来源有限， 利用生物体对无机硒进行有机化即硒的生物有机化是获取有机硒的合理途径，国 内已开发的有富硒酵母、富硒食用菌、富硒茶等产品。硒在这些生物体内的代谢、 转化及硒的存在形式，特别是硒在其中生物大分子中的结合是急需研究和证实的 课题。 2 2 硒在动物体作用的研究进展 2 2 1 在动物体硒对镉的拮抗研究 g a s i e w i c z 的研究表明，当体系无红细胞存在时亚硒酸盐、硒酸盐等都不 与c d 发生反应 4 1 ，s e 0 3 2 - 与红细胞中的g s h 作用生成硒代三硫化物( ；s s e s g ，再 形成g s s e 从细胞中释放，这种活性产物和c d 反应形成s e - c d 复合物，从而降低 c 矿的毒性和改变c d 的组织分布。而骨骼中红细胞很少或没有，但s e 和进入体内 的c d 在肝、肾或血液等处均可发生反应，从而阻断或降低c d 对骨骼的毒性。s e 和c d 主要储存在肝和肾，而在血液中的含量较低，但同时注射s e 和c d 后，小鼠肝 和肾中的s e 、e d 含量降低而血液中的s e 、c d 含量大大增加，即改变了s e 和c d 的分布，使它们在血液中富集。这也符合上述s e c d 复合物形成的推理。肝和肾 中g s h 含量较低，因此s e 、c d 主要在血液中发生作用形成s e c d 复合物，从而使 它们在血液中积累，含量增加。许多研究表明c r 可与蛋白质及酶的巯基( 一s h ) 结 合从而改变蛋白质和酶的活性，而s e 是比s 更软的碱，根据软硬酸碱规则( h s a b 规则) ，s e 能优先于s 和软酸c d 2 + 结合成s e c d 复合物，从而使c 矿转变为稳定的、 中国科学技术大学颂。卜毕业论文 无毒性的8 e c d 大分子配合物，经代谢而排出体外，使一s h 等“靶分子”免受e 矿 的进攻，从而保护生物体。 硒的催化作用机理可表示如下： 4 g s h + h2 s e o ，毒g s s 6 g + g s s g + 3 h ：o