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西南人学硕士学位论文摘要 基于纳米材料为载体的免疫传感器的研究 分析化学专业硕士研究生梁文斌 指导教师袁若教授 摘要 电化学免疫传感器是将免疫分析技术与电化学传感器相结合的一种新型免疫分析方法， 是基于测量电流、电位变化来进行免疫分析的生物传感器。电化学免疫传感器在临床医学、 环境和食品- 丁业等方面都有重要应用，并以其体积小、专一度强、灵敏度高、检测快速方便、 成本低和容易实现实时在线活体检测等优点，成为当前研究的热点之一。而电化学免疫传感 器的性能主要取决于生物活性物质的同定方法，冈此如何将生物活性组分有效地固定在电极 表面上并保持其良好的生物活性是电化学免疫传感器研究和开发中最为重要的工作。近年 来，纳米技术逐步进入生物传感器领域，并引发突破性的进展。纳米颗粒可以广泛地应用于 敏感分子的固定、待测物质的富集和浓缩、信号的检测和放大。由于纳米结构有着优异的化 学和物理性能，有着极高的比表面，有利于提高敏感分子的吸附能力，并能提高生化反应的 速度，因此被广泛用于生物传感器表面吸附层的制作。本文正是基于以上考虑，探索和研究 基于纳米材料为载体的一系列生物分子固定方法等。 第一部分基于功能化纳米材料的免疫传感器的研究 1 利用一种具有良好的导电功能的有机化合物制备了一种新型的具有良好导电性能的 功能化纳米二氧化钛( p v _ n t i p ) 材料，并将其应用于电化学免疫传感器的研究应用。采用 简单的滴涂法将p v 埘哪修饰于电极表面，再静电吸附纳米金，并进一步固定抗体于修饰电 极表面，制备成一种灵敏的电化学免疫传感器。通过循环伏安法( c v ) 和交流阻抗技术( e i s ) 考察了电极表面的电化学特性，并对该免疫传感器的性能进行了详细的研究。p v - n t i p 的引 入，使得电极的电流响应增强，并使得电化学免疫具有较高的灵敏度和较低的检测下限。该 免疫传感器线性范围为1 2 5 2 0 0 o n g n 0 1 ，线性相关系数为o 9 9 8 2 ，检出限为0 6 n g - m l - 1 。 将该免疫传感器用于病人的血清样品分析，并应用f 检验统计数据分析的方法将其与e l i s a 法的结果相比较，结果表明两者之间不存在显著性差异，即该免疫传感器能够代替现有的 e l i s a 法应用丁临床分析。 2 据文献报道及人量的实验证明，纳米金具有良好的蛋白质吸附能力和生物兼容性，适 用于生物分子，如抗体、酶等的同定。但是由于纳米粒子固定于电极表面形成纳米金层后， 纳米粒子之间存在一定的空隙，一定程度上降低了纳米金层的导电能力，影响了电化学免疫 西南人学硕士学位论文 摘要 传感器的电流响应及灵敏度等。基于此，我们合成了一种具有良好导电能力的双巯基功能有 机化合物，并将其与纳米金联合形成具有高导电能力及良好生物兼容性的功能化金纳米粒子， 将其修饰丁玻碳电极表面后，形成比表面人、吸附性能强且高导电能力的功能化纳米金层， 并进一步吸附甲胎蛋白抗体，将其| 古| 定到电极表面，从而制得甲胎蛋白抗原免疫传感器。该 免疫传感器的线性范围为2 o 2 0 0 on g m l 1 ，其线性方程为 卢o 0 4 7c _ ，p ，+ 0 1 8 0 3 ，线性相 关系数为0 9 9 8 3 ，检出限为0 8n g l l 1 。同时对该免疫传感器的选择性和再生性能等进行了研 究，表明该免疫传感器具有良好的性能，有望进一步应用于临床研究应用。 第二部分基于磁性纳米材料的免疫传感器的研究 1 在纳米技术发展过程中，纳米材料的开发和应用处于核心地位，纳米材料从根本上改 变了材料的结构，被公认为是2 1 世纪最具有前途的科研领域。纳米材料具有良好的吸附能力、 催化效果等，尤其是磁性纳米材料更具有独特磁性等，在近年来的研究中受到了特别的青睐。 通过磁性纳米粒子的掺杂可以使得导电能力较差的聚苯胺具有了较为良好的导电能力，从而 应用于电化学传感器的研究。i t o 导电玻璃是表面修饰有s r l 0 2 ，i n 0 2 薄层，从而赋予了其一 些特殊的性能，如良好的导电性、便于修饰等，另外其造价便宜、适合于机械加工等使得其 在电化学免疫传感器的应用中具有独特的研究前景。采用滴涂法将聚苯胺掺杂f e ，o 。纳米粒 子固定于l t o 导电玻璃表面用以吸附抗体，从而制得便捷、实用的电化学免疫传感器。采用 交流阻抗及循环伏安等技术对电化学免疫传感器的制备过程进行了表征。研究发现，该免疫 传感器具有良好的响应性能，其回归方程为故a ) = o 8 0 3 7c ( n g m l ) + 2 4 6 4 ，相关系数 o 9 9 7 5 ，检测限为o 6n 趴l l l ；同时，还对其选择性、再生性能进行了研究。 2 电化学免疫传感器由于其简便、快速、灵敏度高等特点而具有良好的应用前景，然而 其再生性能在一定程度上限制了其发展及在临床中的应用。我们采用制备的新型磁性金纳米 线研制了一种新型的免再生电化学免疫传感器，并取得了良好的响应性能。电位响廊差值丝 ( 抗原抗体反应前后电位差) 与a f p 抗原浓度( c 一南的对数值在0 4 5 0n g r n l - 1 范围内线 性相关，回归方程为：缸= 3 4 1 1 e 卿+ 3 9 4 3 ，相关系数( r ) 为0 9 9 7 8 ，检测限为o 1 3n g 。m l - 1 。 关键词：免疫传感器功能化纳米材料磁性纳米材料 i l 西南大学硕十学位论文a b s t r a c t s t u d y i m m u n o s e n s o r sb a s e do na n t i - b o d y i m m o b i l i z e do nn a n o p h a s em a t e r i a l s a n a l 如c a lc h e m i s 仃y 撇s t e rp o s 啪d u a t e ：w e n b i nl i a l l g s u p e r v i s o r ：p r o f e s s o r r u oy u a l l a b s t r a c t i m m u n o s e n s o r s ，w h i c hi n t e 粤鼍t e dt h ee l e c 仃o a n a l y s i sa n di i l m n o 船s a y ，h a v eb e c o m eav e r y a c t i v er e s e a r c ht o p i c ，o w i i l gt ot l l ea d v a n t a g e so fm e i rh i g hs e n s i t i v i t y ，f a s ta n a l ”i c a l t i m e ，s i i n p l e m e 船u r e m e n t ，l o w c o s ta n dl l i g l ls e l e c t i v i 吼t h ei m l o b i l i z a t i o no ft 1 1 e 肌t i j b o d yo fi m m u n o s e n s o r w a sv e r yi r r l p o r t a n tt oi t sp e r f o r t 咖c e ，s ot l l ec r u c i a la u s p e c ti nm ef 拍订c a t i o no fab i o s e n s o ri sm e i m m o b i l i z a t i o no fb i o r e c o g i l i t i o nm o l e c u l ei nh i g ha 1 1 l l r 她w i t hr e t e m i o no ft h e i rb i o a c t i v i t y h l r e c e n ty e a r s ，m a n yk i n d so fi 删：1 1 u n o s e n s o r sh a v eb e e nd e v e l o p e db 雒e do nt 1 1 en a l l 叩h a s em a t e a l s f o rt 1 1 e yp r 0 v i d el a r g e rs u r f - a c ea r e a ，9 0 0 db i o c o m p a n i b i l i t y ，s t a b i l i 够o nm ee l e c 仃o d es u a c e 砒l d s oo n f o r 廿l e s er e a s o i l s ，w ee x p l o r ea n ds t u d yt h ei m m u n o s e i l s o r sb 雒e d c t i o m lo rm a 印e t i c n a n o p h a s ei m t e r i a l sf o r l e 觚t i g e i l sd e t e n ：n i n a t i o n p a r tii n v e s t i g a t e dt h en o v e l i m m u n o s e n s o rb a s e do nf u n c t i o n a ln a n o p a r t i c i 鹤 1 ah i g h l ys e i l s i t i v e1 a b e l 一丘e e 锄巾e r o m e t r i ci 1 1 哪i | 1 1 0 s e n s o rw 嬲d e v e l o p e db a s e do nt l l e f i l n c t i o n a lt i t a n i u md i o x i d e 啪o p a n i c l e s( p v n t i p ) ， w l l i c h w 弱p r 印a r e db yc a p p i n g 1 ，1 - b i s ( 2 - p h o s p h o n o e l y l ) _ 4 ，4 b i p 妒d i l l i u md i b m m i d e ( p v ) 0 nm es u r f a c eo fm et i t 孤i u md i o x i d e n 孤0 p a n i c l e s ( n t i p ) w i t hc o v a l e n ta t t a c h m e n t t h ep v - n t i ph a sp r o m m e mb i o c o m p a t i b i l i 坝9 0 0 d e l e c 廿0 nt r a m s f e ra b i l i 劬p r i m a r i l ye x c e l l e l l ta d s o 巾t i o n ，l a 唱es p e c i f i cs u r f a c ea r e a 孤dp o s i t i v e l y c h 孵de n v i r o 姗e n t a sar e s u l t ，m en e g a t i v e l yc h a r g e d g o l dn a l l o p a n i c l e s ( n g p ) c o u l db e a d s o 而e do nt l l ep 啪pm o d i 6 e de l e c 仃o d es l l r f a c eb ye l e c 们s t a t i ca d s o 叩t i o n ，a n dt 1 1 e nt o i i l l ：m o b i l i z e a 一1 如t 叩r o t e i i la n t i b o d y ( a n t i a f p ) f o rt h e 硒s a yo fa 一1 - f e t o p m t e i n ( 鲥甲) t h e f a b r i c a t e dp r o c e d u r e sa n de l e c 订o c h e i l l i c a lb e h a v i o r so fn l ei 姗u n o s e n s o rw e r ec h a r a c t e r i z e db y e l e c 仃d c h e n l i c a li 蝉e d a i l c es p e c 仃o s c o p y ( e i s ) ，s c 籼i n ge l e c 仃o ni i l i c r o s c 叩y ( s e m ) a n dc y c l i c v o l t a 姗e 仃y ( c v ) 1 1 1 ea n t i - a f p n g 胛v n t i pm o d i 6 e de l e c 仃o d ew 豁s e n s i t i v et oa f pi i ll m e a r r e l a t i o nb e t w e e n1 2 5a n d2 0 0n g m lw i t l lm ec o r r e l a t i o nc o e m c i e n to fo 9 9 8 2 ，a n dm ed e t e c t i o n l i m i t ( s n = 3 ) i so 6n g i n lu n d e rm eo p t i m a lc o n d i t i o n s i i la d d i t i o n ，m ep r 叩o s e di m m _ i l n o s e i l s o r e x h 曲i t sg o o ds e l l s i t i v i t y s e i e c t i v i 劬s 油i l i t ya n di o n g - t e 肌i m i n t e m n c eo f b i o a c t i v i t ya n di tm yb e i i i 西南大学硕十学位论文 a b s t r a c t u s e dt oi m m o b i l i z eo t h e rb i o m o l e c u l a r st od e v e l o pb i o s e n s o rf o rt h ed e t e c t i o no fo t h e ra n t i g e n so r b i o c o n l p o u n d s 2 1 1 1 eg o l dn a n o p a n i c l e sh a v eb e c o m eav e r ya c t i v er e s e a r c ht 叩i cd u et 0t l l e i rl a r g e rs u m c e a r e a ，g o o db i o c o m p a n i b i l i t y ，s 乜i b i l n yo nm ee l e c 仃o d es u m c e a 1 1 ds oo n b u tn l e r ea r es o m el i i i l i t s d u et om e 缸e r s p a c eb e 铆e e nt l l eg o l dn a n 叩a n i c l e sa r e ri m m o b i l i z a t i o no nt 1 1 ee l e c 缸硼es u 州e ， w l l i c hr e d u c e st h ee l e c t r i ca b i l 埘o ft h eg o l dn 柚o p a n i c l e sf i l m f 0 rt 1 1 e s er e 弱o n s ，w ed e v e l 叩e da n o v e l a m p e r o m e 仃i c i m m u n o s e n s o rw i t l l 锄叩l m e ds e n s i t i v i t yf o rt 1 1 ed e t e m i n a t i o no f 小1 - f e t o p r o t e i i l ( a f p ) b 弱e do nt h e 如n c t i o n a lg o l dn a i l o p a n i c l e sp r 印a r a t e db yan e wo r g a i l i c c o n l p o u n da l l dg o l dn a n o p a r t i c l e s e l e c 仃o c h e r n j c a li m p e d a n c es p e c 昀s c o p y ( e i s ) a n dc y c l i c v o l t a m m e 仃y ( c v ) w e r eu s e dt om o n i t o r a l l dc o n f i r i nm ef i l h 塔g r o w 吐1 t h er e d u c t i o nc u n e n to fm e i n 珊u n o s e 璐o rd e c r e a s e sl i n e a d yi n 吐l er a n g eo fa f p 丘o m2 ot o2 0 0 。on 鲈n lw i t had e t e c t i o n l i m i to f0 8n g m lw i t l lt h ec o r r e l a t i o nc o e m c i e n to fo 9 9 8 3 m o r e o v e r ，n l ei m m u n o s e n s o rs h o w e d a c c 印t a _ b l er e p r o d u c i b i l i t y ，h i 曲s e n s i t i v i t ya 1 1 dl o n g t e ms 协b i l i t y p a ni ii n v e s t i g a t e dt h ei m m u n o s e n s o r sb a s e do nt h em a g n e t i cn a n o p h 叠s em a t e r i a b 1 a v e l 油r 姗n s e l l s o ra p p l i e dt 0m ed 醣锄i n a t i o no fq 一1 一f e t 叩r o t e i l l ( a f p ) l l a sb e e i l d e v e l o p e db ym e 锄so fc h e i i l i c a l 锄dp h y s i c a la d s o 印t i o nt o i l i l 】m c i b i l i z ea i l t i 0 【- l f c t o p r o t e i n ( 纽t i - a f p ) o n t ot h ef e 3 0 4 - c r o s s l i i l l ( e dp o l y a l l i l i n en 锄o p a n i c 】e ( f e 3 0 4 一p a n i ) m o d i f i e di n d i 哪t i n o x i d e ( 1 1 o ) c o n d u c t i n gg l a s s ac l e a i l e d1 1 oc 伽【d u c t m gg l a s sw a sf l r s t m o d i f i e db y 1 e f e 3 0 4 一p a n i ，a 1 1 dm e i li tw 嬲d i p p e di nt h es o l u t i o no f 柚t i - a f pt oa d s o r bi tb yc h e 嘶c a l 锄d p h y s i c a la d s o r p t i o n t h em o d i f i e dp r o c e d u r ea n dn l ee l e c n o c h e n l i c a lb e h a v i o r so fp r o t e i n so ns u c h 锄i n t e r f a c ew e r ec h 狮c t e 订z e db ye l e c 仃o c h 谢c a li i i l p e d a i l c es p e c 臼o s c o p y ( e i s ) a 1 1 dc y c l i c v 0 1 t a 埘m e n y ( c v ) u n d e r 叩t i m lc o n d i t i o n s ，t h ei m m u n o s e n s o rw a sh i g l l i ys e i l s i t i v et oa n i i l l i n e a rr e l a t i o nb e t w e e n1 锄dl2 0n g m lw i m l ec o n e l a t i o nc o e m c i e n to f0 9 9 7 5 ，a 1 1 d 雠 d e t e c t i o nl i i l l i t ( s n = 3 ) i so 6n g l 试，t h e 如c u b a t i o nt i m e ，r 印r o d u c i b i l i 哆如ds 协i l i t yw 嬲 s t u m e d 2 1 m m u n o s e 璐o r sw e r ew i d e l yu s e df o rt l l ea n a l y s i so fb i o l o 舀c a la 1 1 a l y t e s ，d u et om e i r a d v 锄t a g e so fh i 曲s e n s i t i v i 劬缸t 锄a l y t i c a lt i m e ，s i m p l em e a s u r e m e n t ，l o w 嵋o s ta n dm 曲 s e l e c t i v i 够t l l er e g e l l e m t i o na i l dr 印r o d u c i b i l i 锣i sv e 巧i n l p o r t a j l tt ot l l ei n h n u n o s e n s o r s ，w h i c h c o n f m e s l ea p p l i c a t i o no fi m m u n o s e n s o r s an o v e li r n m 吼o s e n s o ra v o i d i l l gr e g e n e m t i o n 锄d r e p r o d u c i b i l i t yf o r t l l ed e t e c t i o no fa - 1 - f e t o p r o t e i n ( a f p ) h 雒b e e nd e v e l o p e db ym e a 璐o f s e l f - 器s e m b l ya d s o 甲t i o nt 0i m m o b i l i z e 瑾一l f _ e t o p r o t e ma n t i b o d y ( a n t i a f p ) 0 nt 1 en e wm a g l l e t i c g o l dn a i l o w i r e s t h ei i l l m u n o s e n s o rr e s p o i l s et on l ea f p ，p r 0 v i d e daw i d el i n e a rm g e f 如mo 4t 0 5 0n g n 正1w im ad e t e c t i o nl i i i l i to fo 13 n g i i “1a tas i 伊a l - t o m o i s em t i oo f3a n dac o 盯e l a t i o n l v 西南大学硕士学位论文 a b s t r a c t c o e m c i e n to fo 9 9 7 8 m o r e o v e r t h em e t h o do fi m m o b i l i z a t i o nb a s e do nt h em a g n e t i cg o l d n 锄o w i 咒sc o u l d b eu s e di no t h e ri r r l i i ：岫i l i z a t i o no fp r o t e i l l k e y w o r d s ： i m m u n o s e n s o r s ； f u n c t i o n a l n a n o p h a s em a t e r i a l s ； m a g n e t i c n a n o p h a s em a t e r i a i s v 独创性声明 学位论文题目：基王绝苤整抖超夔佳丝鱼痤笾蹙墨笪婴塞 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研 究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他 人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得西南大学或其他教育机构的学 位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在 论文中作了明确的说明并表示谢意。 学位论文作者激拭 签字日期：触移年岁月工日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解西南大学有关保留、使用学位论文的规定，有权保 留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。 本人授权西南大学研究生院可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进 行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权书，本论文：口不保密，口 保密期限至年月止) 。 学位论文作者签名：身殳状导师签名： 签字日期：倒年j 月z 日签字日期： f 月乙日 西南大学硕士学位论文第1 章绪言电化学免疫传感器概述 第1 章绪言电化学免疫传感器概述 生物传感器是一门由生物，化学，物理，医学，电子技术等多种学科相互渗 透发展起来的新型信息技术，其结合了生命科学、分析化学、物理学和信息科学 及其相关技术，能够对所需检测的物质进行快速分析和追踪。生物传感器的出现， 是科学家的兴趣和科学技术发展及社会发展需求多方面双驱动的结果，经过3 0 多年的发展，已经成为一个涉及内容广泛、多学科介入和交叉、充满创新活力的 领域【。由于它具有设计制备简单、选择性好、灵敏度高、分析速度快、操作简 易、成本低、能在复杂的体系中进行在线连续监测等特点；生物传感器的高度自 动化、微型化和集成化，减少了对使用环境和技术的要求，适合野外现场分析要 求，在生物、医学、环境监测、食品、医药以及军事医学等领域有着重要的应用 价值2 1 。 生物传感器是一种能够连续和可逆地感受生物量的传感装置，它既可以进行 分子识别，还可以被视为信息采集和处理链中的一个逻辑元件。它主要由生物识 别元件和换能器两个识别元件组成。生物识别元件能将生物化学反应的信息( 通 常为分析物的浓度) 转译为具有一定灵敏度的化学或物理输出信号；换能器部分 则负责把识别系统输出的信号进行转换。生物识别元件一般是由具有分子识别能 力的生物活性物质( 酶、抗原、抗体、激素、微生物、组织等) 组成，常用的换 能器有电化学换能器，光化学换能器，热换能器，电导阻抗换能器等。电化学换 能器是目前所采用的换能器中研究最多的之一。当待测物与生物识别元件特异地 结合后，所产生的复合物通过信号转换器转变成可以输出的电信号，然后把所得 的信号经过电子技术的处理后，在仪器上显示或记录下来【3 l 。生物传感器的质量 主要取决于接受器的选择性，换能器的灵敏度以及它们的响应时间，可逆性，寿 命和电子系统的可靠性。 生物传感器的类型和命名方法较多且不尽统一，主要有两种分类法，即分子 识别元件分类法和器件分类法。 电化学免疫传感器是生物传感器中种类最多、也较为成熟的一大分枝。电化 学免疫传感器将免疫技术与电化学检测相结合，由于抗原和抗体的特异性反应， 免疫传感器较其他生物和化学传感器有更高的专一性和选择性，通过测定免疫反 应前后界面电流、电位、电导、电容等的变化可以直接测定抗原抗体间的结合【4 。5 】。 基于较高的灵敏度和短的响应时间，近年来，关于电化学免疫传感器的研究颇多。 西南大学硕士学位论文第l 章绪言电化学免疫传感器概述 图1 1 生物传感器按不同分类方法的分类 1 1 电化学免疫传感器的简介 1 1 1 电化学免疫传感器的分子识别元件及其生物反应基础 “免疫( h i l l l l u n i t y ) ”源于拉丁文“i r l l l i l u n i t a u s ”，原意是免除税赋和差役；通常， 免疫指机体对病原生物感染的抵抗能力；免疫在医学、生物学方面的概念是机体 免疫系统对抗原物质的一种生物学应答过程，其生理功能是识别和排除抗原等异 性物质，以维持机体的生理平衡与稳定 6 7 】。免疫可区别为自然免疫和非特异性免 疫，但无论是何种免疫过程，抗原与抗体的反应都是最基本的反应。抗原( a n t i g e n ) 是指可被t 淋巴细胞、b 淋巴细胞识别，能够刺激机体免疫系统，诱导免疫应答 产生相应的抗体或致敏淋巴细胞等免疫物质，同时又能在体内、外与抗体或致敏 淋巴细胞发生特异性结合的物质，即能够刺激动物机体产生免疫反应的物质，但 从广义的生物学观点看，凡是具有引起免疫反应性能的物质，都可称为抗原。一 个完整的抗原具有两种基本性能：诱导机体产生免疫应答反应，即免疫原性或抗 原性；能够与相应免疫反应产物发生特异性结合反应，即免疫反应性或反应原性。 抗体( a i l t i b o d y ) 是b 细胞接受抗原刺激后增殖分化为浆细胞所产生的能与抗原 发生特异性结合的糖蛋白，简单来说，即由抗原刺激机体产生的具有特异性免疫 功能的球蛋白，又称为免疫球蛋白( i m m u n o g l o b u l i n ，i g ) ，抗体或者可以定义为 人和高等动物免疫系统产生的一类能与侵入机体的抗原异物发生特异性结合的球 2 西南大学硕士学位论文第l 章绪言电化学免疫传感器概述 蛋白。人类免疫球蛋白有五类：i g g 、i g m 、i g a 、i g d 和i g e 。以免疫球蛋白g ( k g ) 为例，它是由四条多肽链组成，如图1 2 所示，整个分子主要有两个功能区组成： f c ( f r 姐g m e n to fc r y s t a l l i z a t i o n ) 区和f a b ( f r 孤g m e r i to fa n t i g e nb i n d m 曲区。抗原是一 种能够诱导免疫应答、激活免疫系统产生抗体的物质。抗原一抗体的特异性结合 点位于f a bl 链及h 链的高变区，又称抗体活性中心，其构型取决于抗原决定簇 的空间位置，两者可形成互补性构型。在溶液中，抗原和抗体两分子的表面电荷 与介质中离子形成双层离子云，内层和外层之间的电荷密度差形成静电位和分子 问引力。由于这种引力的存在，使得抗原与抗体分子之间的结合时对位十分准确， 这种准确对位主要是由于两个条件所致：首先是抗体结合部位的形状互补于抗原 的形状；其次是抗体活性中心带有与抗原决定簇相反的电荷。抗原抗体的结合取 决于两个因素，即抗体对相应抗原的亲和力以及环境因素对复合物的影响。抗原 抗体结合的特点是：特异性结合、结合具有可逆性、结合常数很高、结合具有阶 段性【8 9 】。高亲和性的抗体上抗原结合点与抗原表位在空间构型上非常适合，两者 结合牢固，不易解离；低亲和性抗体与抗原形成的复合物较易解离。在一定的外 界环境下，如低p h ，高浓度盐等条件下，抗原抗体复合物也可被解离，并且解离 后抗原抗体仍保持原有的结构、活性和特异性。 + 小 i i ： 二_ w 曲 r ?r 。 ii 图1 2 抗体分子示意图 免疫分析法【1 0 1 2 1 是基于抗原与对应抗体之间高度选择性反应而建立起来的一 类分析方法。抗原抗体反应的特异性和专一性决定了免疫反应具有高度的选择性， 也正因为此，它作为检测手段胜于任何其他方法，故应用十分普及。通常，免疫 分析法分为非标记免疫分析法和标记免疫分析法【1 3 - 1 4 】( 如图1 3 ) 。基于抗原与抗体 结合形成抗原一抗体复合物沉淀，来进行分析的方法诸如絮状沉淀反应，环状沉淀反 应，单向扩散反应和双向扩散反应，只能进行定性或半定量分析，灵敏度低，且缺 乏可供检测的信号。2 0 世纪5 0 年代y a l o w 等【1 5 】发展了放射性免疫分析法( r 认) ， 西南人学硕士学位论文第l 章绪言电化学免疫传感器概述 利用具有放射性1 2 5 i 标记抗原，极大地提高了免疫分析的灵敏度，但该法存在放射 性污染。6 0 年代，e n g v a l l 等【1 6 j 提出了酶联免疫分析技术( e l i s a ) ，用特定酶代 替放射性同位素作为示踪物，通过测定酶催化底物反应间接定性或定量分析待测 物。酶联免疫分析技术现已成为临床免疫检验中的主导技术，这是与它的方法上 的特异性、操作上的简便性和试剂的稳定性分不开的，还有重要的一点是其对环 境没有污染威胁。但这时的免疫分析过程烦琐，对分析人员技术要求高，不便于 分析系统集成化、微型化，而且假阳性假阴性结果的存在也在一定程度上限制了 其的使用范围。近年来发展的电化学免疫传感器是将抗体或抗原固定在固体基质 上，可从复杂组分中富集抗原或抗体，使固定化的生物敏感膜发生电化学信号变 化，达到检测特定抗原或抗体的目的。它集免疫反应、信号产生、信号检测一体 化，具有结构紧凑、使用方便、灵敏度高、成本低、能微型化等特点。因此，以 免疫分析技术为基础而发展起来的免疫传感器的应用，大大地推动了免疫分析技 术在医学、临床、生物、化学、环境、农业、工业等领域的应用和发展。 图1 3 免疫分析法的分类 1 1 2 电化学免疫传感器的定义 电化学免疫传感器是将免疫分析与电化学传感技术相结合而构建的一类新型 生物传感器，应用于痕量免疫原性物质的分析研究。它即具有电化学传感技术的 高灵敏度，又具有免疫分析的高特异性和专一性。免疫传感器的工作原理和传统 的免疫测试法相似，都属于固相免疫测试法，即把抗原或抗体固定在固相支持物 表面，来检测样占j 中的抗原或抗体。不同的是，传统免疫测试法的输出结果只能 定性或半定量地判断，且一般不能对整个免疫反应过程的动态变化进行实时监测。 而免疫传感器将抗原( 或抗体) 固定在传感器基体上，通过传感技术使吸附发生 4 鹾南大学硕士学位论文 第1 章绪言电化学免疫传感器概述 时产生物理、化学或电学上的变化，转变成可检测的信号来测定环境中待测分子 的浓度【1 7 】。它具有能将输出结果数字化的精密换能器，不但能达到定量检测的效一 果，而且由于传感与换能同步进行，能实时监测到传感器表面的抗原抗体反应。 1 1 3 电化学免疫传感器的分类 1 1 3 1 按照测定原理分类 根据测定过程是否使用标记物分为直接型( 非标记型) 电化学免疫传感器和 间接型( 标记型) 电化学免疫传感器。 直接型( 非标记型) 电化学免疫传感器：抗原或抗体携带有大量的电荷， 利用待测抗原( 或抗体) 与固定在传感器表面的抗体( 或抗原) 发生特异吸附时 所产生的直接电信号( 电流，电位，介电常数或电导率等) 进行检测。 一般来说，直接电化学免疫传感器不需额外试剂，仪器要求简单，操作简单， 响应快。但是其灵敏度较低，获得足以响应信号的样品需要量大。 间接型( 标记型) 电化学免疫传感器：选用一定的物质作为标记物( 如： 酶、二茂铁衍生物、苯醌、血红素等) 对抗原抗体进行标记从而实现把抗原抗体 结合的信息转变为可测信号或者利用标记物将免疫信号放大后间接地测定抗原 或抗体。 间接电化学免疫传感器主要包括电化学酶联免疫传感器以及以电活性物质为 标记物的电化学免疫传感器。其中，利用电活性物质标记的电化学免疫传感器可 以通过均相或异相免疫分析方式进行测定，此时抗原或抗体所产生的信号一般与 指示剂的量相等，一定程度上限制了方法的灵敏度。而由于酶具有高效的催化能 力，利用酶作标记物，综合了电化学技术的高灵敏度和多样性以及酶联免疫分析 技术的专一性和特异性等优点，利用酶催化底物发生相应的水解、氧化或还原反 应，形成具有电化学活性的产物，进而采用不同的电分析方法进行测定。 图1 4 电化学免疫传感器的分类 西南大学硕士学位论文第1 章绪言电化学免疫传感器概述 1 1 3 2 按检测信号分类 根据检测信号的不同，电化学免疫传感器可分为电位型、电流型、电导型和 电容型【1 8 】。 电位型免疫传感器电位型免疫传感器兴起于2 0 世纪七十年代，是基于离子选 择电极原理发展起来【1 9 之o 】的，通过测量电极表面电极电位变化进行免疫分析的技 术。抗原抗体在电极表面( 膜表面) 的结合反应会引起电极表面电荷密度变化，从而 引起电极或膜的d o i l l l a i l 电位和离子迁移变化，最终导致电极电位或膜电位发生改 变，而且电位变化正比于待测物浓度的对数值，其关系遵循能斯特方程。电位型 免疫传感已成功地用于检测人血清中梅毒抗体、人绒毛膜促性腺激素( h c g ) 、 人血清蛋白( h a s ) 等【2 1 1 。但电位型免疫传感器一般信噪比较低，线性范围较窄。 电位型免疫传感器又分为直接型电位传感器、非酶标记电位型免疫传感器，酶标 记型电位免疫传感器。 电流型免疫传感器电流型免疫传感器是在恒定电压情况下监测由于抗原抗 体结合或继后反应中电流的变化。电流型免疫传感器代表了生物传感器中高度发 达的领域，已有部分产品已商品化。电流型传感器主要基于探测生物识别或化学 反应中的电活性物质，通过固定工作电极的电位给电活性的电子转移反应提供驱 动力，探测电流随时间的变化，该电流直接测量了电子转移反应的速度，反映了 生物分子识别的速度，即该电流正比于待测物质的浓度。 由于抗原抗体生物分子本身不具备电活性，电流型免疫传感器一般需要标记， 标记物有酶和电活性物质两类。最常用的标记酶有碱性磷酸酶、辣根过氧化氢酶、 葡萄糖氧化酶等。电活性标记物一般有二茂铁、【f e ( c n ) 6 4 们。、硝基雌三醇、金属 离子p b 2 + 、z n 2 + 等。电流型免疫传感器目前已被用于多种物质监测【2 2 l ，但仍然在 寻找更合适的固定方法和固定基质，探求更灵敏稳定的标记体系，追求更便利的无 标记方法，以得到更完美的信号检测系统。 电导型免疫传感器电导型免疫传感器是利用免疫反应产生或消耗离子，引 起溶液或电极膜的导电能力发生变化( 导电率变化) 来进行分析的传感器。y a 百u d a 等【2 8 】用电导法测定了尿中吗啡，解决了原来吗啡测量设备昂贵、费时、麻烦的问 题。但是电导免疫传感器易受被测样品离子强度和缓冲液容积影响，并且难以克 服非特异吸附。 电容型免疫传感器电容型免疫传感器是一种高灵敏非标记型免疫传感技 术。当金属电极与电解质溶液接触在电极溶液的界面存在双电层。物质吸附和表 面电荷改变对双电层结构都会产生显著影响。电容型免疫传感器是基于将识别分 子固定在电极表面，在电极溶液界面存在双电层，当抗原抗体在电极表面复合时， 6 西南大学硕士学位论文第l 章绪言电化学免疫传感器概述 相关复合物及液体移动引起双电层介电常数的改变，导致电容变化而进行检测。 电极上电层电容( c d ) 可用方程表达：c d = a o r d ，其中o 为真空介电常数，r 为电极与移动电荷隔离开的物质介电常数，a 是电极面积，d 是移动电荷与电极表 面最近的距离。电极表面抗原抗体复合物( 绝缘层) 的形成，导致d 增加而使界面 电容相应降低，同时，介电常数减小引起电容的进一步下降。其测定通常基于电 化学交流阻抗谱进行，有关这类传感器的报道甚少。 1 2 电化学免疫传感器中分子识别元件的固定化 电化学免疫传感器中的分子识别元件即抗原或抗体，在电化学免疫传感器的 制备过程中将其固定在电极表面，实现分子识别元件的固定化，形成一层生物敏 感膜。生物敏感膜是电化学免疫传感器的关键组成部分，其性能将直接影响传感 器的灵敏度、重现性和循环使用等性能。因此在电化学免疫传感器制备中，将抗 原或抗体固定在转换器( 固体电极) 表面是一个非常重要的步骤，它是影响电化 学免疫传感器的稳定性( 或寿命) 、分析灵敏度和选择性的关键因素之一。适合 于电化学免疫传感器的常用固定方法有：吸附法、共价键合法、交联法、包埋法、 定向固定法、自组装法、溶胶凝胶法和丝网印刷技术等。 1 2 1 吸附固定法 经非水溶性载体物理吸附或离子结合作用使生物敏感元件固定，称为吸附法， 这些结合可能是氢键、范德华力或离子键等，也可能是多种键合形式共同发生作 用。吸附固定法是一种较为简单的固定化方法，通过物理吸附作用将生物免疫组 分固定在电极表面。吸附载体的种类繁多，如金胶，壳聚糖以及纳米氧化物等。 吸附的牢固程度与溶液的p h 、温度、溶剂性质和种类等有适当处理，用抗体或抗 原溶液浸泡或涂敷，抗体或抗原由于分子间作用力固定在电极表面。该法固定化 过程简单，由于无需使用化学试剂，对免疫组分生物活性影响较小。但是由于生 物分子与载体相互作用力弱故存在电极稳定性不佳，易脱落等缺点，特别在环境 条件改变时，但若能找到适当的载体，这是很好的固定化方法，而且与其他方法 结合使用可以在很大程度上减小环境条件的影响以及减少关，因此，为了得到最 好的吸附效果并保持最高的活性，控制实验条件非常重要。电极表面经过生物