（分析化学专业论文）壳聚糖磁性微球的制备及其对胰蛋白酶的固定化研究.pdf

礓士学位沦乏 m a s t e r sr h e s i s 摘要 高分子磁性微球是近2 0 年来发展起来的一种新型功能材料，已在生物化工、 细胞学、生物医学工程等领域得到了厂泛应用。将高分子壳聚糖和磁性纳米粒子结 合制各壳聚糖磁性微球，具有重要的学术意义和应用价值。壳聚糖磁性微球因其表 面具有与生物活性物质反应的活性羟基和氨基，可被广泛用于生物活性物质的载 体，同时又因其具有磁性，在外加磁场作用下能快速分离，使原来昂贵、低效的分 离技术变为低廉、高效。壳聚糖磁性微球作为新型的功能高分子材料在精细化工、 环境监测、固定化酶、靶向药物、免疫分析、细胞分离等领域有着广泛的应用前景。 本论文主要包括以下两个方面的内容： ( 1 ) 以f e c 为磁性内核，液体石蜡为分散介质，s p a n 8 0 为乳化剂，环氧氯丙 烷做交联剂，采用反相悬浮包埋法制备了壳聚糖磁性微球。用t e m 、a f m 、z e t a 电位一粒度仪、瓜等对微球进行了表征，并对微球表面的活性基团数量进行了测定， 大微球表面氨基的含量为6 3 ，9g m o l g ( 3 8 5 1 0 ”个m g ) ，羟基的含量为1 3 0l a m o l g ( 7 8 1 x 1 0 ”个，m 劝；小微球表面的氨基含量为1 6 8g m o l g ( 1 0 1 x 1 0 ”个m 蓟，羟基含 量为2 5 2g m o l g ( 1 5 2 1 0 ”个，m g ) 。研究了用戊二醛活化、c i b a c r o nb l u ef 3 g a 修 饰后的微球对牛血清白蛋白的吸附性能。实验结果表明：当牛血清白蛋白浓度为1 5 0 m g m l 时，经戊二醛活化的大微球对牛血清白蛋白的饱和吸附量为2 4 6m g g ，小 微球的饱和吸附量为4 6 3m g g ：用c i b a c r o nb l u ef 3 g a 修饰后的大微球吸附蛋白 量达到5 6 7m g g ，小微球为6 6 2m g 。 ( 2 ) 固定化酶比游离酶具有多方面的优点。本文以壳聚糖磁性微球为载体，戊 二醛为交联剂制各固定化胰蛋白酶，研究了固定化反应中戊二醛浓度、给酶量、p h 值对固定化胰蛋白酶活力的影响。大小两种粒径固定化胰蛋白酶的最适p h 均为 6 5 7 5 ，最适温度均为8 0 0 c ，k 。值分别为7 0 8 和6 4 9m g m l 。固定化肤蛋白酶与 游离胰蛋白酶相比，无论对热、酸碱稳定性及在乙醇水溶液中的稳定性等方向都有 较大的改善。大粒径磁性固定化酶不仅稳定性强于小粒径磁性固定化酶，而且在磁 响应性、固定化酶活性回收率方面也优于小粒径磁性固定化酶，所以固定化胰蛋白 酶尤其是大粒径磁性固定化酶县有更广的使用范围和更好的使辟 特性，可用作t 业 化生产。 关键词：壳聚糖，磁性微球，活性基团，牛血清白蛋白，胰蛋白酶，固定化酶 碰士学位论支 m a s t e r st h e s l s a b s t r a c t t h ep o l y m e rm a g n e t i cm i e r o s p h e r e sa r ean e wt y p eo ff u n c t i o nm a t e r i a lw i t hw i d e a p p l i c a t i o n si nt h ef i e l d so fb i o c h e m i c a l ，c y t o l o g i c a la n db i o m e d i c a le n g i n e e r i n gt h a t h a v eb e e nd e v e l o p e do v e rt h ep a s tt w od e c a d e s c h i t o s a nm a g n e t i cm i c r o s p h e r e sh a v e a t t r a c t e dc o n s i d e r a b l ea t t e n t i o n 弱n l e yd i s p l a yv e r yi m p o r t a n ts i g n i f i c a n c ea n dv a l u ei n t h e o r e t i c a la n da p p l i c a t i o na s p e c t s f o re x a m p l e , t h e yc a l lb ea p p l i e da sc a r r i e ro f b i o m a c r o m o l e c u l e sa n dc e l l sb e c a u s eo ff u n c t i o n a l - n h 2a n d o ho fc h i t o s a n e n c a p s u l a t i n gm a g n e t i cp a r t i c l e s w h i l s t ，o w i n gt ot h em a g n e t i s mo ft h em i c r o s p h e r e s ， s e p a r a t i o ne f f i c i e n c yi si n c r e a s e di nt h ep r e s e n c eo fo u t e rm a g n e t i cf i e l d ，w h i c hl e a d st o a c h i e v eac h e a pa n dc o n v e n i e n ts e p a r a t i o ni nm a n ya s p e c t s i na d d i t i o n ，c h i t o s a n m a g n e t i cm i e r o s p h e r e sc a l lb ew i d e l yu s e di n f i n ec h e m i c a li n d u s t r y , e n v i r o n m e n t m o n i t o r i n g , i m m o b i l i z a t i o no fe n z y m e ，t a r g e t e dm e d i c i n e ，i m m u n o a s s a ya n dc e l l i s o l a t i o n t h i sp a p e rm a i n l yi n c l u d e st w oa s p e c t sa sf o l l o w s ： ( 1 ) c h i t o s a nm a g n e t i cm i c r o s p h e r e sw e r ep r e p a r e db yr e xe r s ep h a s es u s p e n s i o np r o c e s s u s i n gf e c a s c o r e ，p a r a f f i n 器d i s p e r s e dm e d i u m ，s p a n - 8 0a se m u l s i f i e r , a n d e p i c h l o r o h y d r i n a s c r o s s l i n k i n ga g e n t a n dc h a r a c t e r i z e db yt e m ，a r m ，z e t a p o t e n t i a l d i a m e t e ra n a l y z e ra n di r w h i l s t ，t h ea m o u n to fa c t i v ef u n c t i o n so nt h es u r f a c e o fm i c r o s p h e r e sw e r ea l s om e a s u r e d f o rt h eb i gm i c r o s p h e r e st h ec o n t e n t so f n h 2a n d o h w e r e6 3 9 o m o l g ( 3 8 5 x 1 0 1 6 - n h 2 g ) a n d1 6 8p m o l g ( 1 0 1x 1 0 1 6 o h 曲， r e s p e c t i v e l y , a n df o rt h es m a l lm i c r o s p h e r e st h ec o n t e n t so fa m i d o c y a n o g e na n dh y d r o x y w e r e13 0p m o l g ( 78 1 x 1 0 5 - n h 2 g ) a n d2 5 2l a m o l g ( 1 5 2 1 0 ”o h g ) ，r e s p e c t i v e l y w eh a di n v e s t i g a t e dt h ea d s o r p t i o nc a p a c i t i e so fc h i t o s a nm a g n e t i cm i c r o s p h e r e s ，w h i c h w e r ea c t i v a t e db yg l u t a r a l d e h y d ea n dm o d i f i e db yc i b a c r o nb l u ef 3 g a ，r e s p e c t i v e l y , f o rb o v i n es e r u ma l b u m i n t h er e s u l t si n d i c a t e dt h a tt h ea d s o r b a n c e so fl a r g ea n ds m a l l s i z ec h i t o s a nm a g n e t i cm i c r o s p h e r e sa c t i v a t e db yg l u t a r a l d e h y d ew e r e2 4 6a n d4 6 3 m g 舀 r e s p e c t i v e l y a n dt h ec a p a c i t i e so ft h em i c r o s p h e r e sm o d i f i e db yc i b a c r o nb l u ef 3 g a w a r5 6 7a n d6 6 2 m g g ，r e s p e c t i v e l y , c o r r e s p o n d i n gt ot h ec o n c e n t r a t i o no fb o v i n e s e d 1 ma l b u m i nw a s1 ，5 0 m g m l ( 2 ) i m m o b i l i z e de n z y m e ss h a r em a n ym e r i t si nc o m p a r i s o nw i t ha c t i v ee n z y m e s t h e r e 硕士学位论文 m a s t e r st h e s l s h a v eb e e nl o t so fr e p o r t so i li m m o b i l i z e de n z y m ew i t hc h i t o s a na sc a r r i e r i nt h i sp a p e r , i m m o b i l i z e dt r y p s i nw a sp r e p a r e du s i n gc h i t o s a nm a g n e t i cm i c r o s ；p h e r e sa st h es u p p o r t a n dg l u t a r a l d e h y d ea st h ec r o s s l i n k i n ga g e n ta n dt h ee f f e c t so fp hv a l u e ，g l u t a r a l d h y d e c o n c e n t r a t i o na n dt h ea m o u n to ft r y p a i no nt h ea c t i v i t yi nt h ew h o l ei m m o b i l i z ep r o c e s s w e r es t u d i e d i n d i c a t i n gt h a tb i gd i a m e t e ri m m o b i l i z e dt r y p s i nd i s p l a yt h eo p t i m u m a c t i v i t ya tp h6 5 7 5 ，t e m p e r a t u r e8 0 。ca n dk m v a l u e s7 0 8m 【g m la n ds m a l ld i a m e t e r i m m o b i l i z e dt r y p s i nd i s p l a yt h eo p t i m u ma c t i v i t ya tp h6 5 7 5 ，t e m p e r a t u r e8 0 。ca n d k mv a l u e s6 4 9m g m la n di nc o m p a r i s o nw i t hf r e et r y p s i n ，t h ei m m o b i l i z e dt r y p s i nh a v e b e t t e rs t a b i l i t yi nt h e r m a l ，p hs t o r a g ea n de t h y la l c o h o l ，w h i c hi n d i c a t ei m m o b i l i z e d t r y p s i nh a v eb e t t e rp r o p e r t i e sa n dc a nb ea p p l i e di nm o r ea r e a st h a nf r e et r y p s i n , t h el a r g e s i z em a g n e t i ci m m o b i l i z e dt r y p s i nh a sb e t t e rs t a b i l i t ya n dt h eh i g h e ra c t i v i t yr e c o v e r y y i e l dt h a nt h es m a l lo n ea n dt h el a r g es i z ei m m o b l i z e dm a g n e t i ce n z y m ec a nb ea p p l i e di n i n d u s t r i a l i z a f i o n k e y w o r d s ：c h i t o s a n ，m a g n e t i cm i c r o s h p e r e s ，a c t i v ef u n c t i o n ，b o v i n es e t q l m a l b u m i n ，t r y p s i n ，i m m o b i l i z e de n z y m e 1 1 1 硕士学位论炙 m a sr 1 r st h e s l s 华中师范大学学位论文原创性声明和使用授权说明 原创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师指导下，独立进行研究 工作所取得的研究成果。除文中已经标明引用的内容外，本论文不包含任何其 他个人或集体已经发表或撰写过的研究成果。对本文的研究做出贡献的个人和 集体，均已在文中以明确方式标明。本声明的法律结果由本人承担。 作者签名：王葛 日期：川年f 月日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，即：学校 有权保留并向崮家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查 阅和借阅。本人授权华中师范大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有 关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位 论文。同时授权中国科学技术信息研究所将本学位论文收录到中国学位论文 全文数据库，并通过网络向社会公众提供信息服务。 作者签名：王亳 日期：加0 7 年r 月加日 导师签名： 沥降诼 日期哆滞j 月鲫日 本人已经认真阅读“c a l i s 高校学位论文全文数据库发布章程”，同意将本人的 学位论文提交“c a l i s 高校学位论文全文数据库”中全文发布，并可按“章程”中的 规定享受相关权益。回童迨塞堡童后进厦! 旦兰生；旦= 生；旦三生茧鱼! 作者签名：王葛 日期：卅年岁月阳日 导师签名 梅恰葡 日期：a 吵年r 月。抽日 硕士学位论丈 m a s t e r5 st i i e s i s 第一章绪论 1 1 磁性高分子微球的研究进展 磁性高分子微球是指内部含有磁性金属或金属氧化物f 如f e 、c o 、n i 及其氧化 物1 的超细粉末、具有磁响应性的高分子微球。磁性高分子微球是近二十年来发展起 来的一种新型功能高分子材料f 1 1 。它的研究始于2 0 世纪7 0 年代末，u g e l s l a d 成功 的在重力条件下制各了尺度均一的单分散聚苯乙烯微球。它除具有高分子微粒的特 性，如：可通过共聚、表面改性等化学反应在微球表面引入多种反应性功能基( 如 o h 、- c o o h 、一c h o 、一n i l 2 等) ，也可通过共价键来结合酶、细胞、抗体等生物 活性物质；还因具有磁性，可在外加磁场的作用下方便地分离。高分子微球作为性 能优异的功能高分子材料在医学免疫、生物工程、化学化工、分析化学及微电子技 术等领域有着极其广阔的应用骑景。磁性高分子微球因其具有磁分离、引导、标记 和固定等功能，因而在功能材料、细胞生物学、分子生物学及医学、分离工程等方 面显示出强大的生命力弘j 。 1 1 1 磁性高分子微球的结构和性质 磁性高分子微球的结构与其制备方法有关，一般有三种类型。即：核一壳型、 壳一核型和壳一核一壳型。磁性高分子微球结构类型如图1 1 。 o 棱一震璺秃一菝星秃一菝一壳侧 o 一高分子材料；一磁性材料 图卜l磁性高分子微球的结构 核一壳型是由磁性材料组成核，高分子材料组成壳层；壳一核型是由高分子材 料为核，磁性材料料为壳层：壳一核一壳型结构的外层和内层为高分子材料，中间 为磁性材料。常用的磁性材料主要有：盒属合金( f e ，c o ，n i ) 、氧化铁( f e 2 0 3 ，f e 3 0 4 ) 、 铁氧体( c o f e 2 0 4 ，b a f e l 2 0 1 9 ) 、氧化铬( c r 0 2 ) 、和氮化铁( f e a n ) 等，其中以f e 3 0 4 应 用最多，但纯金属镍、钴磁性纳米粒子由于有致癌作用，不宜在生物医药领域使用。 硕七学住论之 m a s t e r st h e s i s 商分子材料主要有天然和合成两种，天然高分子材料如壳聚糖、纤维素、琼脂、淀 粉、乳清蛋白、牛血清白蛋白和磷脂等，合成高分子材料如聚丙烯酰胺、聚丙烯酸、 聚苯乙烯和聚乙二醇等p 1 。 高分子磁性微球主要有以下特性： 1 表面效应和体积效应：表面效应是指超细微粒的表面原子数与总原子数之比 随着粒径变小而急剧增大，表面原子的晶体场环境和结合能与内部原子不同，具有 很大的化学活性，其表面能大大增加。这是由于表面原子的周围缺少相邻的原子而 具有不饱和性，易与其他原子结合而稳定下来。可见表面效应是一种影响化学特性 的因素。体积效应是由于超细微粒包含的原予数减少而使带电能级加大，会使物质 的一些物理性质因能级间歇的不连续丽发生异常。上述两种效应可具体反映比表面 积激增，微球官能团密度及选择吸附能力变大，达到吸附平衡的时间大大缩短，粒 子的稳定性大大提高1 4 】。 2 磁效应：具有磁性可使生物高分子微球在外加磁场作用下方便地进行分离和 磁导向。当磁性f e 3 0 4 晶体直径小于3 0n n l 时，具有超顺磁性，即在磁场中有较强 磁性，没有磁场时磁性很快消失，从而使生物高分子微球能够在磁场中不被永久磁 化。 3 生物相容性：磁性微球在生物工程，特别是在生物医学工程中应用时，有一 个重要方面就是要有生物相容性。多数生物高分子如多聚糖、蛋白质类具有良好的 生物相容性。它们在人体内安全无毒，可降解，不与人体组织器官产生免疫原性， 这种性质在靶向药物中尤其重要。 4 功能基特性：生物高分子有多种反应活性功能基团，如一o h 、- c o o h 、一n h 2 ， 可连接具有生物活性的物质，如免疫蛋白，生物酶等。 ! 1 2 磁性高分子微球的制备 目前国际上有关磁性高分子微球的制备方法的报道较多，总体看来是通过以下 三种方法来制备的，即包埋法、单体聚合法和原位法 1 1 2 1 包埋法 包埋法是制备磁性高分子微球最早的一类方法。它是运用机械搅拌、超声分 散等方法使磁性粒子均匀悬浮于高分子溶液中，通过雾化、絮凝、沉积、蒸发等手 段制得磁性高分子微球。为了增加微球的稳定性，可用交联剂交联高分子壳层等进 行稳定化处理。d e k k e r i5 】将磁性粒子悬浮于聚乙烯亚胺( p e l ) 溶液中，通过过滤、干 燥处理得到外包p e i 的磁性微球。g u p t a 等【6 l 将磁性粒子与牛血清白蛋白和棉籽油 2 硕士学位论文 m a s t e rst h e s i s 进行超声处理，然后加热至1 0 5 1 5 0 0 c ， 磁性粒子高分子材料 得到外包牛血清白蛋白的磁性微球。 磁性高分子微球 l o 一o 一 图卜2 包埋法制备磁性高分子微球 包埋法制备磁性高分子微球过程如图1 - 2 所示。包埋法得到的磁性微球其磁性 粒子与夕卜壳层高分子之间的结合主要通过范德华力( 包括氢键) 、磁粒表面的金属离 子与高分子链的螯合作用、磁性粒子表面的功能基团与高分子壳层功能基团共价键 相结合。利用包埋法制各磁性高分子微球需要的条件简单，易于进行，但制得的粒 子粒径分布宽，形状不规则，粒径不易控制，壳层中难免混杂一些诸如乳化剂之类 的杂质，极大的限制了磁性微球的应用。同时该法仅限于某些可溶的聚合物，且需 要分离设备和能源耗费。 1 1 2 2 单体聚合法 由于包埋法存在诸多缺陷，因此粒径分布相对较窄，可得规整球形的单体聚 合法应运而生，且逐渐取代了包埋法。单体聚合法是在磁性粒子和单体存在下，加 入引发剂、表面活性剂、稳定剂等进行聚合反应，得到内部包有磁性微粒的高分子 微球。迄今为止，单体聚合法制备磁性微球的方法主要有：悬浮聚合【7 8 l 、分散聚合 1 9 - 1 0 1 、乳液聚合i l l l ( 包括无皂乳液聚合、种子聚合) 等。 1 ，悬浮聚合法 悬浮聚合法制备磁性高分子微球的主要原理是在磁粉、悬浮稳定剂和表面活 性剂存在的条件下、依靠引发剂的作用使一种或几种单体在磁性粒子表面发生均聚 或共聚，将磁性粒子包裹在聚合产物中。c h a r m o t ”】等采用微悬浮聚合合成了粒径 范围为o 0 5 1 0g m 的憎水交联复合磁性微球。在该发明中，磁性微粒集中于微球的 内部，即复台微球的壳体几乎不含磁性颗粒。但所得微球中仍有大于1 0 的不含磁 粉的“空白”微球，需要在磁场下加以分离。悬浮聚合法具有微球粒径分布宽的缺点， 目前研究较多的是乳液聚合法和分散聚合法。 2 乳液聚合法 乳液聚合法是目i l l j - 应用较多的一种制备磁性高分子微球的方法，无皂乳液聚 合、种子乳液聚合也都归属于这一类方法。乳液聚合法制备磁性毫微粒具有操作简 便、设备简单等优点，而且所制备的微球具有粒径小( 约为几百个纳米) 、粒径分布 窄、粒子可控等优点，因此是制各磁性毫微粒比较理想的方法。s o l c l l 3 1 在分散有磁 硕士学位论炙 m a s t e r st h e s l s 性粒子的水相体系中乳化单体，得到稳定的乳化体系，然后应用乳液聚合得到了胶 体尺寸的疏水磁性高分子微球。邱广明等f 1 4 】利用乳液聚合法，制备出单分散的亚微 米级磁性微球，研究了分散介质、单体、种子粒子及p h 调节剂等因素对聚合行为 和磁性微球的影响。邓建国等【1 5 l 采用乳液聚合制备了同时具有导电性和磁性能的 f e 3 0 d 聚吡咯纳米球，饱和磁化强度为2 3 4e m u g ，可用作电磁材料。 磁性高分子微球在生物医学领域应用较广，但该领域对磁性高分子微球的要求 较高，不但要求其单分散性好，并且应无非特异性凝聚因素( 如乳化剂等) 。而普通 乳液聚合产品由于其中的乳化剂量较多等原因，无法满足这些要求。因此人们又开 发了无皂乳液聚合技术。无皂乳液聚合是指在不含乳化剂或仅含微量乳化剂( 其浓度 小于临界胶束浓度1 的条件下进行的聚合反应。因此无皂乳液聚合反应得到的乳胶粒 表面纯净，且乳胶粒径分布比常规乳液聚合反应的要窄的多。h w e e 等i l6 1 采用无皂 乳液聚合技术，在磁流体存在的条件下，合成出表面含羧基，平均粒径为3 0n n l 的 磁性高分子微球，并对微球平均粒径及分布、表面羧基含量、磁含量、酸碱稳定性 进行了测定。他们发现，用丙烯酸钠( n a a a ) 代替甲基丙烯酸( m a a ) 不但能提高磁性 微球的单分散性，还能提高其表面羧基含量。 3 分散聚合法 利用无皂乳液聚合技术难以得到粒径大于1p a n 的磁性高分子微球，而当磁性 高分子微球用于细胞分离、固定化载体的领域时，为了能在磁场下快速分离，多希 望利用粒径大于ll u n 的磁性高分子微球。分散聚合法对于合成大粒径、单分散性 的磁性高分子微球具有得天独厚的优势。同时，该方法是向微球表面引入功能基最 为方便的方法。分散聚合是指一种由溶于有机溶剂( 或水) 的单体通过聚合生成不溶 予该溶剂的聚合物，而且形成胶态稳定的分散体系的聚合方式。刘学涌等| l7 】采用分 散聚合法，以乙醇，水为介质，在f e 徊4 磁流体存在下，通过苯乙烯与聚氧乙烯大分 子单体共聚制备两亲磁性高分子微球。r i c h a r d 等在磁流体、有机溶剂，单体、 稳定剂、共稳定剂、引发荆共存的条件下利用分散聚合法合成了粒径范围为 0 1 5 9 i n ，磁含量0 5 5 0 ，粒径分和标准偏差不大于1 5 的单分散疏水磁性高分 子微球。作者认为，为了得到单分散微球，制各过程中必须满足以下i 条件：( 1 ) 成 核阶段快，所有核应同时形成；( 2 ) 微球成长阶段，连续相中的所有共聚物自由基 在达到掐界凝聚尺寸之前，必须被体系中已存在的微球所捕获，避免形成新的微球； ( 3 ) 在微球的成长阶段必须避免微球j b j 彼此的凝聚。 1 1 2 3 原位法 该法首先制得致密或多孑l 聚合物微球，此微球含有可结合铁、钴、镍、锰等金 4 属离子的基团( 例如可与铁离子等形成配位键的卟m 2 、一n h 、n 0 2 等含氮基团以及 可与铁离子镜形成离子键的- c o o h 、一s 0 3 h 、- ( ) h 等基团) ，随后依靠高分子在金 属盐溶液中的溶胀以及功能基团与金属离子的作用来制备磁性高分子微球。如果含 有寸q h 2 、一n h 、- c o o h 等基团，可直接加入合适比例的二价和三价铁盐溶液，使 聚合物微球在铁盐溶液中溶胀、渗透，再升高温度和p h 值，制得磁性高分子微球； 如果含有- n 0 2 、- o n 0 2 等氧化性基团，可加入二价铁盐，使其氧化而得到磁性高 分子微球；如果含有卟m 、一n h 2 等还原性基团，可加入三价铁盐，使其还原而制 得磁性高分子微球。 原位法的突出优点在于：1 磁性微球的粒径和粒径分布取决于聚合物微球本 身，因此磁性微球具有良好的单分散性：2 每个微球磁含量相同，从而保证所有磁 性微球在磁场下具有一致的磁响应性：3 可以制备各种粒径的致密或多孔磁性高分 子微球，且可制备磁含量大于3 0 高磁含量微球。其缺点在于：1 对聚合物的要求 比较严格，一般不适用于那些不含上述基团的高聚物；2 由于磁性粒子在聚合物微 球表面的沉积，导致所制微球表面不平滑。 1 1 3 磁性高分子微球的应用 磁性高分子微球因具有磁响应性和不同的表面功能基团，自上世纪七十年代中 期以来，已经在细胞分离、固定化酶、蛋白质纯化、靶向药物等领域得到广泛的研 究。 1 l 3 1 细胞分离 细胞的标记与分离是磁性高分子微球最早的应用研究之一，自上世纪7 0 年代 以来便有很多学者致力于该领域的研究。磁性微球作为不溶载体，在其表面接具有 生物活性的吸附剂或其它配体( 如抗体、荧光物质、外源凝结素等) 活性物质，在外 加磁场作用下，利用他们与特定细胞的特异性结合，可快速有效地将细胞分离、分 类或检测细胞的种类或及数量分布【1 9 】。 磁性粒子在分离癌细胞和正常细胞方面的动物临床试验已获成功。把单克隆 抗体与磁性微球结合可将磁性微粒直接地连接到肿瘤细胞上，利用外加磁场可将结 合的肿瘤细胞与未结合的正常骨髓细胞分离开。p o y n t o n 2 1 l 用含有抗生素蛋白的磁 性微球进行骨髓t 细胞分离，用于白血病的治疗。刘利萍【2 2 】研究了利用氟尿嘧啶磁 性丝心蛋白一壳聚糖磁性微球( m f c m s ) 在体外对人肝癌细胞株s m m c - 7 7 2 1 和人肺 腺癌细胞株a 5 4 9 生长的抑制作用，结果表明，m f c m s 对s m m c 一7 7 2 1 的抑制表 现为明显的时效和量效特征：对a 5 4 9 的抑制主要呈时效关系特征，与剂量的依赖 关系无显著性意义。m f c m s 能有效抑制s m m c - 7 7 2 1 和a 5 4 9 癌细胞增殖，为 m f c m s 的应用提供了初步的实验依据。 j h u n u 等f 2 0 i 用外源凝结素分别修饰聚苯乙烯磁性微球和白蛋白磁性微球，通过 实验发现两者都有分离红细胞的能力，白蛋白磁性微球效率比聚苯乙烯磁性微球的 效率高得多，但是成本高。 p a r t i n g t o n 等f 2 3 】提出了一种新的细胞分离方法双参数法( d u a lp a r a m e t e r s o r t i n g ) 。该方法先用5 0 n m 的小磁珠( m i e r o b e a d s ) 和m i n i m a c s 系统对细胞进行正选 择，在此基础上不需分离除去m i c r o b c a d s ，直接用更大粒径的微米级磁珠p y n a b e a d s ) 和d y n a lm p c 系统直接进行正负选择。因为仅吸附有m i c r o b e a d s 的细胞在弱磁场 的d y a a lm p c 系统中不被吸引，因此该技术充分利用了不同粒径磁珠在不同磁场强 度下引力的不同，从而达到了简化实验操作的目的。作者用该技术对多种淋巴细胞 进行了分离，并将其用于含量少( w o - 2 ) 的细胞，如幼鼠肝脏中造血干细胞的分离。 u g e l s t a d 2 4 】认为作为动力粒子的磁性微球用于细胞分离时需考虑以下几个关 键因素：1 在细胞分离介质中高分子微球不凝结：2 具有灵敏的磁响应性：3 不 与非特定细胞结合：4 能快速、彻底的分离细胞；5 最低程度吞噬细胞等。细胞 分离的原理及过程如图1 - 3 。 图卜3 细胞标记、细胞分离原理 1 1 3 2 固定化酶 固定化酶的研究始于1 9 1 0 年，正式研究于2 0 世纪6 0 年代，7 0 年代已在全世 界普遍开展。固定化酶是指利用物理或化学结合法将自由酶固定到载体上，以提高 6 硕士学位论炙 m a s t e r st 1 4 e s i s 酶的操作稳定性和反复回收利用酶的技术。常用的酶固定方法有：吸附法、包埋法、 共价结合法和交联法。 近年来磁性高分子徼球也用于固定化酶的研究1 2 5 - 2 7 j ，与非磁性材料相比，磁性 高分子微球用于固定化酶具有以下优点【2 8 。2 9 j ：1 有利于固定化酶从反应体系中分离 和回收，操作简便，对于双酶反应体系，当种酶的失活较快时，就可以用磁性材 料来固载另一种酶，回收后反复使用，降低成本；2 。磁性载体固定化酶放入磁场稳 定的流动床反应器中，可以减少持续反应体系中的操作，适合于大规模连续化操作： 3 利用外部磁场可以控制磁性材料固定化酶的运动方式和方向，替代传统的机械搅 拌方式，提高固定化酶的催化效率；4 可以改善酶的生物相容性、免疫活性、亲疏 水住：5 提高酶的稳定性。但是固定化酶也存在一些缺点，如使用过程中酶从载体 上脱落；由于底物必须经扩散才能和载体中的酶接触，反应产物也要经过扩散进入 液相，所以固定化酶的催化速度一般低于相应游离酶的反应速度：由于化学反应、 空气或者固态污染物堵塞酶的活力中心及载体结构而导致酶活力下降。 t o r c h i l i n 等1 3 0 ! 进行了磁性交联葡聚糖作为固定载体的研究工作。h n a n 等【3 1 1 利 用紫外线照射聚苯乙烯磁性微球得到羰基，然后将微球加入脲酶的磷酸缓冲液中， 3 5 0 c 水浴下搅拌1 5 0m i n ，得到固定化酶，这种微球在外部磁场的作用下在流动反 应器中可以不停的运动，磁性徼球对弱磁场有较好的响应性，而且本身不会聚集。 k o n d o 等p 副采用碳化二亚胺法共价偶联胰蛋白酶到含羧基的热敏性磁性复合微球 上，研究了固定化条件。 国内徐显慧等p 3 1 1 9 9 6 年做了葡聚糖磁性毫微粒固定化l 一天冬酰氨酶的研究 工作。作者先将葡聚糖磁性毫微粒在一定浓度的n a l 0 4 溶液中氧化，使其带上醛基， 再加入卜天冬酰氨酶进行固定化反应，最后用磁场分离出固定化酶。讨论了n a l 0 4 浓度、加酶量、反应时间、温度对固定化酶的影响。实验表明，l _ 天冬酰氨酶游离 酶在糜蛋自酶水解作用下而会很快失去活力，而卜天冬酰氨酶固定化以后，经 1 5 m i n 糜蛋白酶水解，其活力仍保留在8 0 以上。这说明这种抗蛋白酶水解的作用 能够提高葡聚糖磁性毫微粒固定化l _ 天冬酰氨酶在体内的半衰期。 磁性载体的性质对固定化酶的应用很重要，它必须满足一定的条件：1 无毒： 2 可生物相容；3 能够提供足够大的表面积，使酶反应顺利进行，降低酶反应基 质和产物的分散限制；4 具有定的机械强度。 1 1 3 3 蛋白质纯化 以磁性微球为固相介质对蛋白质纯化是一项新兴的蛋白质分离技术。它是遥过 对磁性微球表面改性，共价结合能被目标蛋白质识别和可逆结合的配基，然后对目 硕士学位论文 m a s t e r st h e s l l g 标蛋白质进行分离。传统的蛋白质分离方法般是通过改变p h 值、温度、粒子强 度、介电常数等因素来达到分离的目的，分离过程繁杂，而且目标蛋白质的损失大。 与传统分离方法相比，蛋白质的磁分离技术具有快速、高纯、高收率等优点。目前 已经成功地对溶胞产物、血浆、原生质和腹水中的各种蛋白质进行了分离和纯化。 磁性微球分离蛋白质的过程如图l _ 4 ： 图1 - 4 磁性微球的蛋白质分离过程 余艺华等【3 4 】以壳聚糖为包裹材料包埋自制的磁流体，制备了具有核一壳结构 的磁性毫微球，并偶联色素配基c i b a c r o nb l u ef 3 g - a 得到了一种新型亲和磁性毫微 粒，并考察了它对蛋白质的吸附性能，发现其对牛血清白蛋白( b s a ) 和溶菌酶( l y s ) 的吸附量分别为4 m g 值和2 8 m g g ，吸附行为满足l a n g m u i r 吸附等温式，且对时间 依赖性小。 温敏性高分子微球用于蛋白质的纯化是近十年的研究成果【3 7 1 。采用无皂乳 液聚合合成的p n i p a m 水凝胶微球或以p s 为核，p n i p a m 为壳的p s p n i p a m 核壳 结构的微球，具有温度敏感特性。也就是说，在不同的温度条件下呈现某些不同特 性。该类微球吸附蛋白质的能力会随温度改变而变化，具有个最低临界共溶温度 l c s t ( l o w e rc r i t i c a ls o l u t i o nt e m p e r a t u r e ) 。这种微球吸附蛋白质的能力，在l c s t 附近呈突跃式变化。即在高于l c s t 的条件下，微球表面因脱水作用，疏水性强， 吸附蛋白能力强，吸附蛋白质量大。相反，在低于l c s t 的温度条件下，微球表面 硕士学位论文 m a s 丁e r st h e s t s 亲水性增强，吸附蛋白的能力减弱，吸附功能受到抑制，吸附蛋白量减少。并且， 实验结果表明，在高于l c s t 时吸附的蛋自在温度低于l c s t 时，易于脱落下来。 同时还发现用这种微球吸附酌蛋自质，再解吸下来后变性小，能保持高的生物活性。 因此，把这种微球用于蛋白质的纯化时非常有用的。成都有机化学所的丁小斌等f 3 8 】 人也制备了热敏性的磁性f e 3 0 v p ( s t - n i p a m ) 微球，将其用于人血清白蛋i 刍( h s a ) 的吸附解吸研究，讨论了温度，保温吸附时间，蛋白质初始浓度等因素对微球吸附 解吸蛋白质的影响。其结果表明该微球具有简便、快捷的磁分离特性。 1 1 3 4 靶向药物 随着社会的进步，科学技术的发展，人们希望使用长效、高效、毒副作用低的 药品。传统的药片、注射剂等不能达到这种理想的效果。靶向药物作为一种新的制 剂技术和工艺正成为当今的热门课题。所谓靶向药物技术就是利用药物载体的p h 敏，热敏、磁敏等特点在外部环境的作用下对病变组织实行定向给药。通过对磁性 微球表面功能化，在外加磁场作用下，将药物载至预定区域，实现靶向给药技术。 世界上第一例应用磁性药物靶向治疗的临床试验是由德国的l u b b e 等【3 9 1 在 1 9 9 4 年7 月到1 9 9 5 年1 月期间完成的。他们应用磁流体作为药物表面阿霉素的载 体，使末端带有一个负电的磷酸基团的脱水葡聚糖包覆的磁性颗粒可逆性的与表面 阿霉素上带正电的氨基糖基结合，经静脉注入体内，通过在肿瘤部位的皮外提供一 个强度为o 8 t 的恒定磁场，将磁流体定位于靶部位，让药物与肿瘤完全反应。 国内惠旭辉等【帅悃自制的聚甲基丙烯酸甲酯( p m m a ) 磁性微球血管内栓塞效果 及对血细胞的影响进行研究，术中栓塞观察：注射磁性微球后均有磁栓固位于磁控 处股动脉管腔内，形成灰黑色栓塞，栓塞以下动脉波动消失，颜色苍白。磁栓1 5 m i n 断磁，磁栓无脱落及移位，股动脉下段血供无再通。 磁性微球作为给药载体，具有以下优点：1 药物随着载体被吸附到靶区周围， 使靶区很快达到所需浓度，而在其它部位分布量相应减少，因此可以降低给药剂量： 2 药物绝大部分在局部作用，相对减少了药物对人体正常组织的副作用，特别是降 低对肝、脾、肾等造血和排泄系统的损害：3 加速产生药效，提高疗效。 另外，作为成功的药物载体，磁性微球必须满足：1 具有良好的生物降解性； 2 粒径 1 4 岬，以免阻塞血管，利于微球在靶区均匀分布；3 具有一定的缓释性： 4 具有最大的生物相容性和最小的抗原性：5 载药微球及其降解产物无毒或毒性 极低，并在一定时间内经皮肤、胆汁、肾排出体外。 9 硕士学位论文 m a s t e r st h e s i s 1 1 3 5 核酸的研究 随着生命科学的不断进步，磁性高分子微球越来越多的应用于生物学领域， 如用于m r n a 的纯化与分离、d n a 的纯化分离及核酸的杂交、扩增、检测等。传 统的核酸分离技术有超离心密度梯度技术和凝胶电泳等，这些纯化方法步骤繁杂、 费时长、收率低。磁性微球分离核酸是基于碱基配对原则，通过偶合与目标核酸碱 基互补的一段引物链而达到分离目标核酸的目的，这种分离方法简单、快速、选择 性高。 偶合有d n a 碎片的磁性微球可以用作d n a 探针或者序列反应的模板。由于 其迅速分离的特性，磁性微球用来代替传统的亲和色谱法提纯d n a ，含有双链识 别序列的磁性微球，只需通过三次吸附一解吸循环，在不到lh 的时间即可从酵母 原始溶液中得到均匀的核因子；含有单链的d n a 的磁性微球可用来分离、纯化d n a 和r n a ；单分散键合有多糖的磁性微球也可用来纯化m r n a ，可得到高的产率， 且其操作处理步骤大为减少，所用时间也相应缩短。 对于大量的测序工作( 例如人类基因组计划) ，一般需要将模板纯化、测序反应、 产品分离和检测等操作步骤一体化。u h l e n h ”和r o l l s 4 2 】等用磁性高分子微球做固相 载体对d n a 测序工作的半自动化和全自动化进行了尝试，r o l f s 的测序系统每周的 分析能力可达3 0 0 0 0 - - - 4 0 0 0 0 个碱基。虽然目前这一领域的报道还不多，但是人们将 磁性分离、样品处理等连续操作自动化应用与临床检验和大规模的测序工作，这更 加显示出磁性高分子微球在核酸研究中的作用。 1 1 4 磁性高分子微球的应用实例及存在问题 目前，生物高分子磁性微球的研究多处于实验室研究阶段和初步的应用阶段， 但其中仍有一些成功应用的例子，如挪威的d y n a l 公司开发了一系列的商品化磁性 高分子微球d y n a b e a d s 。该公司的系列产品已经成功应用于微生物学、免疫学、分 子生物学、癌症研究等领域。美国c i b ac o m i n g 公司所生产化学发光免疫分析试剂 盒也全部采用微颗粒磁化固相抗体f 4 3 】。伦敦的儿童医院、挪威工科大学和美国喷气 推进研