（测试计量技术及仪器专业论文）光纤嵌入式毛细管电泳芯片的信号检测及其小波消噪.pdf

大连理工大学硕士学位论文 摘要 芯片毛细管电泳具有微型、快速、低样品量等特点，被认为是生化分析领域最具发 展潜力的一种技术。光纤嵌入式毛细管电泳芯片因其体积小、检测光路简单等诸多优点， 正在引起人们的关注。但是，其检测系统中外加高压电场、高强度激光、仪器和芯片结 构等诸多因素产生的噪声会混入检测信号，影响系统的检测灵敏度。因此，本文基于激 光诱导荧光检测原理，开展了光纤嵌入式毛细管电泳芯片的信号检测及信号消噪处理的 研究。 本文在大量实验的基础上，设计了光纤嵌入式“十”字型和弯曲型毛细管电泳芯片， 采用m e m s 技术制作了以玻璃为基体的毛细管电泳芯片。改进了以a t 8 9 c 5 1 单片机为 核心的高压控制系统，实现了样品的多次进样分离操作及信号的自动检测功能。开发了 基于v c + + 的系统应用软件，可实现数据通信、数据显示与保存等功能。在自行搭建的 检测系统上，利用毛细管电泳芯片对罗丹明b 、罗丹明6 g 进行了最低浓度限及分离等 检测。针对毛细管电泳信号的噪声特性，本文首先利用m a t l a b 软件模拟出毛细管电泳 信号，通过选取评价消噪效果优劣的标准，比较研究了三族小波基函数、分解层数、阈 值方法等对消噪的影响，确定出“小波基函数s y m 4 、分解层数4 、各级阈值方法” 的最佳消噪策略。通过与传统的傅立叶变换消噪算法比较，证明小波消噪能更有效地消 除电泳信号中的噪声，保留有用信号的特征，且消噪后峰形和峰高失真小，基线比较平 稳。本文利用该策略对检测到的真实电泳信号进行消噪处理，获得了较好的结果。实验 表明，该系统具有结构简单、操作方便、灵敏度高、可重复进样等优点，有利于微流控 系统的微型化和集成化。 关键词：毛细管电泳；激光诱导荧光检测；傅立叶变换；小波消噪；微型化 光纤嵌入式毛细管电泳芯片的信号检测及其小波消噪 s i g n a ld e t e c t i n ga n d w a v e l e td e n o i s i n gf o rc a p i l l a r y e l e c t r o p h o r e s i sm i c r o c h i pb a s e d o no p t i c a lf i b e re m b e d d e d a b s t r a c t m i c r o c h i pc a p i l l a r ye l e e t r o p h o r e s i s ( c e ) h a sb e e nr e c o g n i z e da sap o w e r f u lt o o lf o r b i o c h e m i c a la n a l y s e sd u et oi t sm i c r os i z e ，f a s ts e p a r a t i o na n dl o ws a m p l er e q u i r e m e n t c e m i c r o c h i pb a s e do no p t i c a lf i b e re m b e d d e da r o u s e sp e o p l e sa t t e n t i o nf o ri t ss m a l lv o l u m e s i m p l ed e t e c t i o no p t i c a lr o u t e h o w e v e r , s o m en o i s e sw h i c ha f f e c ts y s t e m sd e t e c t i o n s e n s i t i v i t ya r ei n t r o d u c e di n t ot h es i g n a lb e c a u s eo f t h ei n f l u e n c eo f h i l g hv o l t a g e ，i n s t r u m e n t , c h i ps t r u c t u r ea n ds o m eo t h e rf a c t o r s s ot h es t u d yo fs i g n a ld e t e c t i o no fo p t i c a lf i b e r e m b e d d e dc em i c r o c h i pa n ds i g n a ld e n o i s i n gd i s p o s a li sd i s c u s s e di nt h i sp a p e rb a s eo nt h e t h e o r yo f l a s e r - i n d u c e df l u o r e s c e n c e c r o s sa n dc u r v i n gc em i c r oc h i p sw e r ed e s i g n e da n dm a n u f a c t u r e du s i n gm e m s t e c h n i c su p o nm a n ye x p e r i m e n t si nt h i sp a p a e r ml l i g hv o l t a g es y s t e mw a si m p r o v e dw h i c h r e a l i z e do p e r a t i o n so f r e p e a t e di n j e c t i o na n ds e p a r a t i o na n ds i g n a la u t o d e t e c t i o n j 1 1 璩s y s t e m a p p l i c a t i o ns o f t w a r eb a s e do nv c + + w a sd e v e l o p e dw h i c hr e a l i z e df u n c t i o n so fd a t a c o m m u n i c a t i o n 。d i s p l a y ，s a v i n ga n ds oo n 1 1 l ew h o l ed e t e c t i o ns y s t e mw a sc o n s t r u c t e da n d t h el o w e s tc o n c e n t r a t i o nd e t e c t i o na n ds e p a r a t i o nd e t e c t i o no fr h o d a m i n eba n dr h o d a m i n e 6 gw e r ec e m p l e t e d a c c o r d i n gt ot h ec h a r a c t e ro fc es i g n a la n dn o i s e t h es i m u l a t e dc e s i g n a l w a s p r o d u c e du s i n g m a t l a bs o f t w a r e t h r e e t y p i c a l w a v e l e ts e t s ，l e v e lo f d e c o m p o s i t i o na n dt h r e s h h o l d i n gm e t h o dw e r ee v a l u a t e db yc h o o s i n gd e n o i s i n gc r i t e r i o n t h es y m 4w a v e l e tw i t hal e v e ld e c o m p o s i t i o no f5a n dt h ea l ll e v e l st h r e s h o l d i n gm e t h o d w e r ec o n f o r m e da s t h eo p t i m u md e n o i s i n gs t r a t e g y c o m p a r e dw i t hf o u r i e rt r a n s f o r l n ， w a v e l e td e n o i s i n gc o u l dr e m o v et h en o i s ea d e q u a t e l y ，r e s e r v et h ec h a r a c t e ro fu s e f u ls i g n a l a n da c h i e v eab e t t e rp r e s e r v a t i o no ft h es h a p e so fs i g n a l u s i n gt h eo p t i m u md e n o i s i n g s t r a t e g y ag o o dr e s u l tw a so b t a i n e d 丑1 er e s u l ts h o w st h a t , t h i sd e t e c t i o ns y s t e mh a ss o m e c h a r a c t e r i s t i c s ，s u c ha sc o m p a c ts t r u c t u r e ，h i g hs e n s i t i v i t ya n dr e p e t i t i o n , w h i c ha r ef a v o u rt o t h ed e v e l o p m e n to f m i c r m a t i o na n di n t e g r a t i o no f m i c r oc ec h i p k e yw o r d s ：c a p i l l a r ye l e e t r o p h o r e s i s ；l a s e r - i n d u c e df l u o r e s c e n c e ：f o u r i e r t r a n s f o r m ；w a v e l e td e n o i s i n g ；m i c r o m a t i o n 大连理工大学硕士学位论文 1 绪论 1 1 课题的提出 随着科学技术的不断进步，一种用于生物分子反应、分离、检测的微型芯片生 物芯片i o e h i p s ) ，己成为国际上的研究前沿和热点，特别是芯片毛细管电泳技术的研究 在近十几年里取得了突破性进展。与传统的毛细管电泳技术相比，芯片毛细管电泳具有 微型、快速、低样品量等特点，被认为是在生物化学分析领域最具发展潜力的一种技术。 激光诱导荧光检测方法是毛细管电泳芯片检测系统中最灵敏的方法之一，浓度检测 限可达1 0 - 1 2 m o l l 。同时，它还具有很高的选择性，仅对产生荧光或被选择性荧光标记 的分子产生响应，能有效地消除基体成分的干扰，广泛地应用于超痕量生物活性物质、 环境污染、d n a 测序、后基因时代的蛋白质测序以及临床检测等方面。 常规的共聚焦式毛细管电泳芯片检测系统，其庞大的激光器件和光学对准装置限制 了检测系统的微型化、集成化。近些年，有关的研究人员将光纤嵌入到毛细管电泳芯片 中实现信号检测的方法。但是，快速、低样品量、光纤导光损耗等问题给系统检测灵敏 度带来挑战，影响了低组分含量样品的定量分析。所以，为了能够获得较精确的分析结 果，必须对采集到的毛细管电泳信号进行消噪处理。 在信号处理领域中，最常用的消噪方法是用傅立叶变换直接对信号进行低通滤波或 带通滤波。这种方法虽然简单、易于实现，但它只适合处理平稳信号，对滤除有用信号 频带内的噪声无能为力，而且有可能将某些突变点的信息模糊掉。毛细管电泳信号峰形 尖锐，消噪后需保留突变点的信息，利用傅立叶变换进行消噪处理的方法无法满足实际 信号分析的要求。 小波变换是近十几年来发展起来的一种新的信号处理方法，它的主要优点是在时域 和频域同时具有良好的局部化特性，利用信号和噪声表现出的截然不同的特性进行分 时、分频处理。这种方法不但能够获得较高的信噪比，而且能够保持良好的时间分辨率。 采用小波消噪算法能够有效地消除噪声，而且消噪后信号的基线平稳，峰形和峰高失真 小，可以满足分析的要求。 本课题来源于国家自然科学基金项目( 资助号：6 0 5 7 4 0 9 2 ) 。 独创性说明 作者郑重声明：本硕士学位论文是我个人在导师指导下进行的研究工 作及取得研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外， 论文中不包含其他人已经发表或撰写的研究成果，也不包含为获得大连理 工大学或者其他单位的学位或证书所使用过的材料。与我一同工作的同志 对本研究所做的贡献均已在论文中做了明确的说明并表示了谢意。 作者签名：驻日期：皂竺纽， 大连理工大学硕士研究生学位论文 大连理工大学学位论文版权使用授权书 本学位论文作者及指导教师完全了解“大连理工大学硕士、博士学位论文版权使用 规定”，同意大连理工大学保留并向国家有关部门或机构送交学位论文的复印件和电子 版，允许论文被查阅和借阅。本人授权大连理工大学可以将本学位论文的全部或部分内 容编入有关数据库进行检索，也可采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编学位论 文。 作者签名 导师签名 照型年上月盟日 大连理工大学硕士学位论文 1 绪论 1 1 课题的提出 随着科学技术的不断进步，一种用于生物分子反应、分离、检测的微型芯片生 物芯片i o e h i p s ) ，己成为国际上的研究前沿和热点，特别是芯片毛细管电泳技术的研究 在近十几年里取得了突破性进展。与传统的毛细管电泳技术相比，芯片毛细管电泳具有 微型、快速、低样品量等特点，被认为是在生物化学分析领域最具发展潜力的一种技术。 激光诱导荧光检测方法是毛细管电泳芯片检测系统中最灵敏的方法之一，浓度检测 限可达1 0 - 1 2 m o l l 。同时，它还具有很高的选择性，仅对产生荧光或被选择性荧光标记 的分子产生响应，能有效地消除基体成分的干扰，广泛地应用于超痕量生物活性物质、 环境污染、d n a 测序、后基因时代的蛋白质测序以及临床检测等方面。 常规的共聚焦式毛细管电泳芯片检测系统，其庞大的激光器件和光学对准装置限制 了检测系统的微型化、集成化。近些年，有关的研究人员将光纤嵌入到毛细管电泳芯片 中实现信号检测的方法。但是，快速、低样品量、光纤导光损耗等问题给系统检测灵敏 度带来挑战，影响了低组分含量样品的定量分析。所以，为了能够获得较精确的分析结 果，必须对采集到的毛细管电泳信号进行消噪处理。 在信号处理领域中，最常用的消噪方法是用傅立叶变换直接对信号进行低通滤波或 带通滤波。这种方法虽然简单、易于实现，但它只适合处理平稳信号，对滤除有用信号 频带内的噪声无能为力，而且有可能将某些突变点的信息模糊掉。毛细管电泳信号峰形 尖锐，消噪后需保留突变点的信息，利用傅立叶变换进行消噪处理的方法无法满足实际 信号分析的要求。 小波变换是近十几年来发展起来的一种新的信号处理方法，它的主要优点是在时域 和频域同时具有良好的局部化特性，利用信号和噪声表现出的截然不同的特性进行分 时、分频处理。这种方法不但能够获得较高的信噪比，而且能够保持良好的时间分辨率。 采用小波消噪算法能够有效地消除噪声，而且消噪后信号的基线平稳，峰形和峰高失真 小，可以满足分析的要求。 本课题来源于国家自然科学基金项目( 资助号：6 0 5 7 4 0 9 2 ) 。 光纤嵌入式毛细管电泳芯片的信号检测及其小波消噪 1 2 毛细管电泳及激光诱导荧光检测 微全分析系统( m i c r ot o t a la n a l y s i ss y s t e m ，t a s ) 是2 0 世纪9 0 年代瑞士c i b a g e i g y 分析实验室的w i d m e r 和m a n z 等提出的一个全新的概念【l , 2 1 ，它把整个实验室的功能， 包括采样、稀释、加试剂、反应、分离、检测等集成到尽可能小的操作平台上。1 - t a s 的出现不仅使生物样品的消耗降低到微升甚至纳升级，而且使分析速度成十倍、百倍地 提高，费用成十倍、百倍地下降，从而为分析测试技术普及到户外及家庭创造了条件。 它充分体现了当今分析设备微型化、集成化与便携化的发展趋势，它将引发生化分析领 域新一轮的革命【3 】，并可能在未来的几十年中对人类的生存质量产生重大影响。 随着微全分析系统的发展，一种用于生化样品分析、检测的微型芯片毛细管电 泳芯片，也已成为国际上的研究前沿和研究热点。毛细管电泳芯片具有体积小，分离效 率高，分析用样品少，分析速度快，分析过程自动化等特点，可用于无机分子、有机分 子、生物大分子、细胞、细菌及病毒等分析检测，并可望发展成微全分析系统和芯片实 验室的主流技术。由于芯片体积非常小，进样量仅为纳升甚至皮升级，而且分析检测多 在秒级内完成，故对其检测体系的灵敏度和响应速度要求很高。检测技术是决定系统最 终检测限的关键因素，因此检测方法的研究也成为t a s 研究领域中的重点和热点【4 】。 ( 1 ) 毛细管电泳简介 电泳是电解质中带电粒子在电场力作用下，以不同的速度向电荷相反方向迁移的现 象。利用这种现象对化学和生物化学组分进行分离的技术称之为电泳技术。传统的电泳 技术由于受到焦耳热的限制，只能在低电场强度下进行电泳操作，分离时间长，效率低。 8 0 年代初，细径毛细管被用于电泳，由此产生了一种新型的分析技术毛细管电泳。 毛细管电泳( c e ) 又称高效毛细管电泳( h p c e ) ，是指离子或带电粒子以毛细管为分离 室，以高压直流电场为驱动力，依据样品中各组分之间淌度和分配行为上的差异而实现 分离的液相分离分析技术。由于毛细管内径小，表面积和体积的比值大，易于散热，因 此毛细管电泳可以减少焦耳热的产生，广泛应用于物质组分的检测。 c e 开始主要用于蛋白质和多肽的分析，以后逐渐被广泛应用于生物、化学、医药、 环保等领域。它具有分离效率高，分析速度快，样品及试剂用量少，洁净无污染等特点， 与高效液相色谱法( h p l c ) 成为分析化学中互补的技术。随着生命科学的发展，毛细管电 泳技术也有了广阔的发展空间。目前，不同分离模式的毛细管电泳技术正成为最重要的 生物样品分离分析手段。 毛细管电泳芯片是指利用微细加工技术，将高效毛细管电泳移植到平方厘米大小的 芯片上，通过在芯片上加工出沟道和其它的功能单元，实现样品的进样、反应、分离和 大连理工大学硕士学位论文 检测等过程。毛细管电泳芯片的基本结构比较简单，就是在几个到几十个平方厘米的基 片上加工出微通道，然后将盖片和基片键合到一起，以形成封闭的微流通沟道。最典型 的毛细管电泳芯片结构如图1 1 所示。芯片中有4 个储液池，包括1 个缓冲液池、1 个样品 池和2 个废液池，以及连接各池的微沟道。 进样沟道 缓冲液池 图1 1 “十”字型毛细管电泳芯片示意图 f i g 1 1s c h e m a t i co f c ec h i pw i t hc r o s sc h a n n e l 毛细管电泳芯片的工作原理是：在进样电压作用下，分析样品从样品池经进样沟道 进入到样品废液池中，然后迅速在缓冲液池和废液池之间加分离电压，并同时改变进样 池与样品废液池的电压，将十字沟道中心处的样品挤入分离沟道。在分离电压的驱动下 样品会出现电泳现象，样品中各组分在缓冲液中因荷质比不同而产生淌度的差异，各组 分在电场力的作用下将以不同速度运动，从而使不同的组分区带在不同的时刻经过位于 分离沟道末端的检测器。此时，利用合适的检测方法便可获得电泳谱图，完成样品的分 析过程。 ( 2 ) 激光诱导荧光检测 在毛细管电泳分析的初期，不断缩小毛细管内径成为提高分离效率的最佳方法，但 也造成了注入体积太小与检测光程过短，从而导致检测灵敏度不高，限制了在微量分析 领域的应用。因此，提高灵敏度成为毛细管电泳研究的一个重要目标。在改善毛细管电 泳的检测灵敏度方法中1 5 】，曾采用了注入大量样品后进行浓缩的方法，如利用毛细管电 泳原理中的电场加强效应堆积法、酸碱调控堆积法、毛细管等速电泳与扫清法，利用层 析原理中的薄膜预浓缩与中空纤维线上浓缩技术等。另外，提高灵敏度较为成功的方法 是采用光学检测方法。因为光学检测系统与毛细管没有接触，从而高压电源对其的影响 可以降到最低，其检测范围广，可应用到毛细管电泳的各种模式。 在光学检测方法中，激光诱导荧光检钡t ( l a s e r i n d u c e df l u o r e s c e n c ed e t e c t i o n , l i f d ) 方法是目前公认的最灵敏的方法之一，其检测限可达1 0 _ 1 2 m o l l 1 6 。它是在普通荧光检 测器的基础上发展起来的，因其灵敏度极高、性能可靠、易操作、使用成本低，获得了 光纤嵌入式毛细管电泳芯片的信号检测及其小波消噪 广泛的应用，尤其适合应用于口t a s 氨基酸、d n a 片段等生化样品的检测，曾有人采 用l i f d 毛细管电泳对单个分子进行测定 7 1 。l i f d 采用相干光为激发光源，可以聚焦至 微米级，适用于小内径毛细管及毛细管电泳芯片。在光电检测系统中，除了常规的p m t 和c c d 外，为了提高测定的灵敏度，高灵敏的光予计数器也已用于测定荧光信号。 激光诱导荧光检测系统根据光学系统的不同，可分为共聚焦式和非共聚焦式检测系 统。典型的共聚焦式激光诱导荧光检测系统的结构如图1 2 所示。 共聚焦式激光诱导荧光检测系统通常由共聚焦荧光显微镜作为光学系统，主要由二 色镜( d i c h r o i cm i r r o r ) 、聚焦透镜和干涉滤光片等组成。激光束经过二色镜反射并由显微 物镜聚焦到芯片的检测区域，激发产生的荧光经二色镜透射后由同轴且共焦的显微目镜 聚焦，再经过光阑和干涉滤光片进一步滤除干扰光，由光电检测元件进行检测，检测到 的信号经过预处理后传送给计算机。这种检测系统的特点是能有效地降低杂散光的影 响，信噪比高；但光路比较复杂，价格昂贵。 图1 2 共聚焦式检测装景 r i g 1 2s c h e m a t i cd i a g r a mo f c o n f o c a ld e t e c t i o ns y s t e m 非共聚焦式激光诱导荧光检测系统结构如图1 3 所示。激光束经过透镜聚光和反射 镜反射后，以与芯片面成4 5 。并垂直于微通道的方向照射芯片的检测区域，在与入射光 成1 3 5 。并垂直于微通道的方向上用物镜收集激发的荧光信号，再由滤光片滤除激发光 和杂散光后，用光电倍增管、c c d 等光电检测元件进行检测。这种检测系统的特点是 结构简单，易微型化，但激发光和杂散光的干扰较大，导致检测的信噪比较差。 大连理工大学硕士学位论文 鲁透境 图1 3 非共聚焦式检测装置 f i g 1 3s c h e m a t i cd i a g r a mo f n o n - c o n f o c a ld e t e c t i o ns y s t e m 1 3 光纤嵌入式毛细管电泳芯片研究现状 m e m s 技术的发展促使电泳芯片向着微型化、集成化方向发展，但对常规的毛细管 电泳芯片的激光诱导荧光检测系统来说，其庞大的激光器件和光学对准装置限制了检测 系统的微型化。 近两年，有人从电泳芯片的制作入手，利用m e m s 技术在毛细管电泳芯片上制作 光纤通道，利用光纤传导激光并收集荧光信号来简化检测光路实现样品的检测，以达到 将整个系统进一步微型化与集成化的目的。 2 0 0 4 年，h a i f a n gl i t 8 】等人提出了一种将光纤嵌入毛细管电泳芯片内作为导光介 质，通过光纤将激光导入检测点，激发用荧光标记的待测样品，产生的荧光由芯片下方 的光电倍增管接收的检测系统，其芯片结构如图1 4 所示。该实验中使用的芯片分离沟 道长为3 8 c m ，电压为6 0 0 v c m ，使用f i t c 对样品进行标记，系统的检测限为1 0 。m o l l 。 b b w 图1 4 光纤嵌入式毛细管电泳芯片 f i g 1 4c a p i l l a r ye l e e t r o p h o r e s i sc h i pw i t ho p t i c a lf i b e re m b e d d e d 2 0 0 4 年，台湾的c h e - h s i nl i n 9 1 等人设计了嵌有两条光纤沟道的毛细管电泳芯片， 如图1 5 所示。该系统可以使用两种波长的激光对混合物进行激发，同时将两路激发的 光纤嵌入式毛细管电泳芯片的信号检测及其小波消噪 荧光收集后传输给计算机进行后续的处理工作。在实验中，c h e - h s i nl i n 使用双波长激 光( 5 7 0 h m ，4 8 0 h m ) 对1 0 。m o l l 的罗丹明b 和1 0 。3 m o l l f i t c 的混合物进行了分离检测。 图1 5 双光纤沟道嵌入式毛细管电泳芯片 f i g 1 5 c a p i l l a r y e l e c t r o p h o r e s i sc h i p w i t h t w o o p t i c a l f i b e r c h a n n e l se m b e d d e d 此外，2 0 0 5 年，苏波【1 0 1 、穆小引“1 等人也设计了此类光纤毛细管电泳芯片，并搭 建出配套的微型化的检测系统，对整个系统的可行性进行了分析。其中，穆小敏设计了 在分离沟道两侧对立布置两条光纤沟道的芯片，激光通过光纤引入到检测点处，产生的 荧光由另一端的光纤收集后做相应地处理，如图1 6 所示。配套的检测系统对罗丹明b 进行了检测，最低检测限为1 0 4 m o l l 。 基片 麟抱 图1 6 带有两条光纤沟道的毛细管电泳芯片 f i g 1 6s c h e m a t i co f c ec h i pw i t l lt w oo p t i c a lf i b e re h a r m e l 1 4 小波消噪的发展及应用 目前，在毛细管电泳芯片上主要采用的是高灵敏度的激光诱导荧光检测方法。被激 发产生的荧光信号经过光电转换后进入计算机进行分析、显示，在激光诱导荧光检测系 统中，常用来进行光电转换的器件是p m t 、c c d 或光子计数器。图1 7 是两组实际的 电泳信号，波峰一般为高斯峰。谱图中的各个尖峰是最有用的信号，它们是特定物质的 特征谱线。在对物质作组分分析时，不同位置的尖峰代表了不同的物质组分，对应的组 一6 一 大连理工大学硕士学位论文 分含量可通过相应的峰形面积来确定。因此，要分析样品溶液中各物质的成分和含量， 就必须准确测出各个峰的高度及其对应的峰形面积。 时间( s )i c n ( s ) 图1 7 实际的电泳信号 f i g 1 7r e a lc a p i l l a r ye l e c t r o p h o r e s i ss i g n a l 从图1 7 中可以看到，电泳信号中含有大量的噪声，影响了峰高和峰形面积的测定， 降低了分析的准确度。这些噪声主要来源于系统仪器的稳定性、高压电源、毛细管芯片 内部结构以及高强度激光产生的背景噪声等诸多方面。所以，只有将这些噪声有效地滤 除掉，才能得到准确的物质组分的分析结果。 在信号处理领域中，小波变换主要用于信噪分离及弱信号的提取、信号奇异性探测 与瞬态信号的检测。毛细管电泳信号是一种含有尖锐的突变峰形的非平稳弱信号，适用 于小波变换消噪的范围，因此本文采用小波变换作为消噪算法来对毛细管电泳信号进行 消噪处理。 小波的起源可以追溯到上世纪初。1 9 1 0 年，h a r t 提出了小波规范正交基的思想， 构造了紧支撑的正交函数系h a r r 函数系；1 9 3 6 年，l i t t l e w o o d 和p a l e y 1 2 】对傅立 叶级数建立了二进制频率分量分组理论，构造了一组l i r l e w o o d p a l e y 基，这为小波 后来的发展奠定了理论基础；1 9 4 6 年，g a b o r 1 3 】提出了加窗傅立叶变换( o a b o r 变换) 理论，使得对信号的表示具有时频局部化性质；1 9 8 4 年，g r o s s m a n 和m o r l e t 1 4 】首次 提出了小波( w a v e l e t ) 的概念；随后，m a l l a t 提出了多分辨分析的理论框架，为正交小 波基的构造提供了一般的途径。至此，小波分析才真正形成一门学科。之后，人们构 造出了大量的小波。其中比较引入注目的是，1 9 8 8 年，d a u b e c h i e s 构造了一类具有 紧支集的有限光滑正交小波函数，该小波得到了非常广泛的应用。1 9 8 9 年，随着小 波理论进一步发展，m a l l a t 1 5 , 1 6 提出了实现小波变换的快速算法m a l l a t 塔式算法。 在毛细管电泳信号的消噪处理中，很多人做了相应的工作。1 9 8 8 年，m a l l a t 提 出了小波分解和重构的方法。1 9 9 2 年，m a l l a t t l 6 1 又提出非线性小波变换阈值去噪方法。 光纤嵌入式毛细管电泳芯片的信号检测及其小波消噪 有用信号通常表现为较低频信号或一些比较平稳的信号，而噪声信号则表现为高频信 号，小波变换阈值去噪方法通过设定阈值去掉小波系数高频分量中的噪声系数，再由 小波系数重构检测到的电泳信号，从而达到滤除信号中噪声的目的。莫金垣【1 7 9 1 、刘 中华1 2 0 、b i f e n gl i u 2 1 1 等人利用其理论对毛细管电泳信号进行了消噪处理，并研究 了信号的半峰宽、信噪比以及阈值的选取对消噪结果的影响。1 9 9 5 年，d o n o h o e 2 2 - 2 4 提出了平移不变量小波去噪方法，c a t h e r i n ep e r r i n t 2 s l 、w e i d o n gc a 0 1 2 6 1 等人进行了一 定的研究。1 9 9 5 年，c o i f m a n t z t l 提出了模极大值去噪方法，仲洪波【2 8 等人利用真实信 号和噪声信号的模极大值特性之间存在着较大差异的特点，对信号进行消噪处理。 进入9 0 年代以后，由于大量小波函数的出现及快速算法的建立，小波变换被广 泛地应用于诸多领域。尤其在工程应用领域中，在信号处理、图像处理、模式识别、 语音识别、量子物理、地震勘测、流体力学、电磁场、c t 成像、机器视察、机械状 态监控与故障诊断等领域，被认为是近年来在工具和方法上的重大突破。 1 5 本文的主要工作 本文开展光纤嵌入式毛细管电泳芯片的激光诱导荧光检测及其信号的小波消噪研 究，主要工作有以下五个方面： ( 1 ) 通过对传统的激光诱导荧光检测理论的分析，改进光纤嵌入式毛细管电泳芯片 激光诱导荧光检测系统。 ( 2 ) 在理论分析与实验验证的基础上，设计嵌入光纤沟道的“十”字型和弯曲型毛 细管电泳芯片，并利用m e m s 工艺制作出毛细管电泳芯片。 ( 3 ) 开发基于v c + + 的激光诱导荧光检测系统，可以实时、直观地检测并显示采集 到的毛细管电泳信号，并具备数据及曲线的保存功能，为下一步的信号消噪工作奠定基 础。 ( 4 ) 利用“十”字型沟道进行不同荧光剂的系统最低检测限分析，并利用弯曲沟道 实现不同浓度的两种荧光剂的分离检测。 ( 5 ) 根据电泳信号的特征，利用计算机仿真出电泳信号，确定消噪效果的评价标准， 选择出最优的小波参数对仿真信号进行消噪处理，进而应用到罗丹明b 、罗丹明6 g 的 荧光信号上进行消噪处理。 大连理工大学硕士学位论文 2 毛细管电泳及激光诱导荧光检测的基本原理 2 1 毛细管电泳的基本原理 毛细管电泳为近十几年来发展迅速的一种分析方法。毛细管电泳是离子或荷电粒子 以高压电场为驱动力，在毛细管里按照淌度或分配系数的不同进行高效分离的一种液相 分离技术【2 9 】。毛细管电泳芯片技术是毛细管电泳技术微型化、集成化方向发展的产物， 因此两者的基本原理相同。图2 1 为毛细管电泳的基本装置图，主要包括高压电源、铂 电极、毛细管、光源、检测装置及两个缓冲溶液槽。在毛细管中注满缓冲溶液后，将两 端置于插有铂电极的缓冲溶液槽中，在样品注入后施加高电压，毛细管中形成一直流 电场，荷电溶质便与其电荷极性相反的电极方向移动。各种样品粒子因具有不同的荷质 比，在电场中产生不同的电泳淌度，因而它们的迁移速度不同，经过一定时间后，各荷 电溶质将按照其速度大小顺序，依次到达检测器而被检测。 高压电慑 图2 1 毛细管电泳基本装置图 f i g 2 1b a s i cc o n f i g u r a t i o nd i a g r a mo f c a p i l l a r ye l e c t r o p h o r e s i s 2 1 1 电泳迁移与电渗流 电泳是在电场作用下样品带电粒子定向移动，其迁移速度可以用式2 1 表示： 屹= 以e = 以兰 ( 2 1 ) 式中：屹为样品带电粒子的迁移速度，以为样品带电粒子的电泳淌度，e 为外加电场 强度，y 为外加电压，三为毛细管总长。 光纤嵌入式毛细管电泳芯片的信号检测及其小波消噪 毛细管通常以熔融硅为材质，外覆一层强韧的聚酰亚胺以保护脆弱的内管。当管柱 中缓冲溶液p h 值大于3 时，毛细管表面的硅醇基( s j o h ) 会解离成s 0 一而带负电，此 时溶液中正粒子会因静电吸附力吸附而紧靠管壁，形成电双层，在外加电场的作用下， 扩散层中的水合正离子会牵动整个溶液往负极方向移动，形成电渗流( e l e e t r o o s m o t i e f l o w ，e o f ) ( 图2 2 1 ，以式2 2 、2 3 表示： 9 oe 8 9 。 。 国。 审e 国 毋e、 e 。$ 国囝。国乞国。扩散层 ( a ) 水合阳离子吸附到管壁上 帕。p 拿帕砂国渺 q 一一 口矿l 乞b 西o y 日m毋 7 o 毋囝。国国。国oo毋o c o ) 两端加电压，电渗流形成 图2 2 电渗流形成示意图 巩小心兰 纯5 芴 s 式中：为电渗流流速，心为电渗流淌度， 层中的z e t a 电势。玎为缓冲溶液的黏度。 ( 2 2 ) ( 2 3 ) 占为缓冲溶液的介电常数，f 为管壁电双 电渗是伴随着电泳产生的一种电动现象，在毛细管电泳中扮演着重要角色。电渗流 的一个独特性质是具有平面流型，如图2 3 所示，由于引起流动的推动力沿毛细管均匀 分布，不会在毛细管内形成压力差，所以整体溶液的流速一致，而不似利用压力控制的 h p l c ，会产生抛物线型的流速，故分离效率较h p l c 为佳。 大连理工大学硕士学位论文 ( a ) 在电渗流压力下( b ) 在流体动力压力下 图2 3 液体的流动剖面图 f i g 2 3s e c t i o nd i a g r a mo f l i q u i df l o w 2 1 2 毛细管区带电泳 毛细管区带电泳( c a p i l l a r yz o n ce l e c t r o p h o r e s i s ，c z e ) 是毛细管电泳中应用最广的一 种操作模式，其分离原理是利用粒子的荷质比不同将待测物进行分离。多数情况下，e o f 速度比电泳速度快5 7 倍。其中，阳离子电泳运动方向和电渗流相同，会最先通过检 测器；中性粒子的电泳速度为零，将随电渗流带动；而阴离子因其运动方向和电渗流相 反，但电渗流速度一般都大于电泳流速度，故它将在中性粒子之后通过检测器，最后流 出，从而实现了各种粒子的分离。 在c z e 中，影响实验的因素有；电压、温度、缓冲溶液和p h 值。当管柱长度固定 时，电泳和电渗流的速度随外加电压增加而加快，由于电渗流速度一般远大于电泳速度， 因此使粒子的总迁移速度加快，缩短移动时间；当温度升高或黏度减小时，也会缩短移 动时间。缓冲溶液的种类和浓度对分离效果也有相当程度的影响，一般需考虑分析物在 缓冲溶液中的溶解度、稳定性、解离程度以及电解质中阴、阳离子对溶质的作用力等因 素。不同p h 值会直接影响粒子的迁移速度，也是影响分离效果的关键之一。 有时针对不同的需要，可在缓冲溶液中加入一些修饰剂，如有机修饰剂、界面活性 剂及手性选择剂( c h i r a ls e l e c t o r s ) 等，通过不同的机制作用，达到不同的分离效果。 2 1 3 迁移时间、分离效率与分离解析度 毛细管内的样品离子因本身电泳淌度与电渗流双重影响，产生一净移动速度y ，以 式2 4 表示： 矿 y = 匕+ y 。= ( 以+ 。) e = 。+ 。) x ( 2 4 ) l 式中：p 为电泳的净速度。 样品在毛细管中的移动时间，可以用式2 5 表示； 光纤嵌入式毛细管电泳芯片的信号检测及其小波消噪 f ：生： 厶工 矿 ( 地+ a 。) 矿 ( 2 5 ) 式中：f 为样品离子在毛细管中的迁移时间，厶为注入端到检测器的距离，上为毛细管 总长度。 另外，毛细管的分离效率可用式2 6 或2 7 表示理论塔板数： ；量：罢：丝2 鲨( 2 6 ) n = 5 5 4 ( 旁2 ( 2 7 ) 式中：h 为理论塔板高，艿2 为变异度，d 为样品在电泳缓冲溶液中的扩散系数，阡0 为 波峰半峰高。 毛细管电泳分离的解析度r ，可以用式2 8 表示： 拈去咄z 嗍， 蒜 2 亿s ， 式中：丑为解析度， 以。、以：、厄分别是两种离子的电泳淌度及两种离子的平均电泳 淌度，上钎为检测窗口到入口端的距离。由式2 8 可知，对阴离子而言，移动方向与电 渗流反向，死与，正负相反，分母较小，所以解析度较大，最大解析度发生在电渗流 约等于阴离子的平均移动速率，即i ，i “恳i ，但需相当长的时间才会达到刚。对阳离子 而言，因移动方向与电渗流相同，解析度较差，可考虑控制分离电压或者增减毛细管长 度，甚至将毛细管壁改性，以改善解析度。 2 2 毛细管电泳芯片进样原理 样品注入( 进样) 是样品分析过程的重要操作步骤之一。毛细管电泳常用的进样方式 包括电动进样( e l e c t r o k i n e t i ei n j e c t i o n ) 与流体力学进样( h y d r o d y n a m i ci n j e c t i o n ) 两种方式。 流体力学进样依驱动力形式的不同，又可分为压力、真空与重力三种模式。 流体力学迸样中的压力、真空与重力三种方法，分别由外加压力、真空吸引与高度 差所造成的驱动力，将样品导入毛细管，且流体力学进样不受样品电泳淌度的影响，适 用于定量分析。电动进样是将高压电极置入样品槽中，通过施加固定时间的高电压后， 样品因自身的电泳淌度与电渗流的推动而导入毛细管内，但因样品进量多少会随离子电 大连理工大学硕士学位论文 泳淌度而不同，所以比较适合用在定性分析。毛细管电泳芯片上主要采用的就是这种进 样方式。到目前为止，电动进样主要有门进样( g a t e di n j e c t i o n ) 和收缩进样( p i n c h e d i n j e c t i o n ) 2 种方式嘲。 门进样过程如图2 4 所示。进样前，在u 3 和u 4 之间加一定的电压，样品在电场的 作用下从u 3 流向u 4 。为了遏制样品溶液向u 1 、u 2 方向扩散，在u 1 和u 2 也加上一 定的电压，使样品溶液主要从u 3 流向u 4 。进样时，在u 3 和u 4 之间加电压，同时u 1 和u 2 仍保持一定的电压，于是一段样品就从交叉口处进入分离通道。可通过控制此过 程的时间长短来改变进入分离通道样品的体积大小。分离时，在u l 和u 2 之间加电压， 使样品流向检测点处，同时u 3 和u 4 通道内的样品在电场的作用下会流回到溶液池中。 在进样前，微沟道内壁需要经过修饰，以减少内壁对样品的吸附，同时也降低对电渗流 的影响。门进样可以实现连续进样，这对于需要不断进行样品载入和分离的模式，如柱 后反应是十分有用的。 m 样品孢 帽弛_ _ 废 僦 m 样品孢 中鞯弛i _ 赓 废蒗急 玉 ( a ) 迸样前( b ) 进样时 图2 4 门进样示意图 f i g 2 4s c h e m a t i cd i a g r a m o f g a t e di n j e c t i o n u 4 ( c ) 分离时 收缩进样过程如图2 5 所示。进样时，u 1 、u 2 、u 3 施加电压，u 4 接地，u 3 的电 压高于u 1 、u 2 ，样品溶液在u 1 、u 2 电压的挤压下从u 3 流向u 4 。进入分离阶段时， 四个端的电压同时切换，使u 2 端接地，u 1 、u 3 、u 4 施加电压，并且u 1 的电压高于 u 3 、u 耳端的电压，样品在u 1 和u 2 之间的电场下流向检测点处。若在分离阶段，仅在 u 1 、u 2 端施加电压，而使u 3 、u 4 悬空，那么留存于“十”字交叉口上下两边的样品 会受到分离沟道中流动着的缓冲液的拖动而被携入分离沟道，形成很高的背景噪声，影 响检测效果。收缩进样的优点是样品的进样量可以得到精确控制，并且不随时间而改变， 实验重复精度大大提高。 光纤嵌入式毛细管电泳芯片的信号检测及其小波消噪 缓 u i ( a ) 进样时( b ) 分离时 图2 5 收缩进样示意图 f i g 2 5s c h e m a t i cd i a g r a mo f p i n c h e di n j e c t i o n 目前，电动进样的主要问题是存在样品进样歧视现象。所谓迸样歧视，就是指样品 中电泳淌度( 单位场强下离子的平均电泳速度) 越大的离子越先到达交叉处。j a c o b s o n 等 曾认为收缩进样可以克服