（应用化学专业论文）酸性蛋白酶及其在羊毛染色前处理中的应用.pdf

酸性蛋白酶及其在差墨鎏鱼煎丝墼中的应用 摘要 纯毛织物服装由于其结构上的特殊性能，如丰满、挺括、保暖 性好等特点，长期以来倍受人们青睐。但是羊毛纤维特有的鳞片结 构在双向摩擦运动的作用下却极易产生毡缩现象；而且致密的鳞片 层也阻碍了染料分子向纤维内部的扩散。传统的羊毛染色是经过严 格的控制升温过程，在长时间的高温工艺下完成的。这样处理，很 容易导致羊毛织物泛黄或凝胶化，严重影响染品的手感和鲜艳度。 因此，为了解决上述问题，需要破坏甚至去除羊毛纤维表面的鳞片。 在实际生产中往往采用“氯化赫科赛特工艺”对羊毛进行处理，这 种处理的优点是剥鳞效果明显，但是处理过程中产生的大量a o x 和 环氧丙烷等物质，对生态环境以及个人健康都是有害的。在许多国家， 这种处理方法都受到了不同程度的限制。然而，羊毛的酶处理工艺 可以在比较温和的条件下对羊毛纤维进行处理，不产生对环境和人 体有害的物质，处理后羊毛纤维的手感、染色性能都有很大的提高， 可望成为一种取代传统工艺的新工艺。w 本文以黑曲霉3 3 5 0 为出发菌株，经紫外线诱变和微波诱变，选 育出一株产酸性蛋白酶的高产菌株u 7 4 一w 2 0 7 ，并对其培养基的配方 和液体发酵条件进行了优化，在最佳液体发酵条件下，该菌株可以 产生2 1 6 7 u m l 的酸性蛋白酶，比初始菌株的产酶活力提高了近两 倍。f 通过系列的实验，确定了培养基中各成分的最佳含量分别是： 脱脂豆粉3 6 ，玉米粉o 6 ，鱼粉0 6 ，n i i 。c 1 1 2 ，c a c l ：o 5 ， n a z h p o t 0 2 ，豆粉水溶波1 5 。通过发酵培养得到的蛋白酶的目的是 用于羊毛的处理当中。本文通过一系列的正交试验分别确定了前处 理( h z o z 处理) 和酶处理的最佳工艺条件，它们分别是h 。0 ：4 0 m l l ， p h = 1 0 ，时间6 0m i n ，温度5 0 ，浴比i ：3 0 ；酶用量4 0 u m l ，n a h s o 。 用量为8 ( o w f ) ，p h = 5 5 ，时间6 0 m i n ，温度5 0 。c ，浴比1 ：3 0 。 将上述经过h 2 0 。和酶处理的羊毛连同未经处理的羊毛在相同的条件 下进行染色，结果表明：低温( 8 0 。c ) 染色时，经过处理的羊毛上 染率和上染速率都有较大的提高 而高温( 1 0 0 。c ) 染色时，上染率 和上染速率与未处理的试样相差不大。同时，从纤维强度和扫描电 镜的结果可以看出，经过h 。o 。和酸性蛋白酶处理后，羊毛纤维表面 的鳞片虽然受到了明显的破坏，但其机械强度的损失并不大。 关键词： a c i dp r o t e a s ea n di t sa p p l i c a t i o ni n t h ep r o c e s so fw o o ld y e i n g a b s t r a c t p e o p l ea r ei n f a v o ro fc l o t h e sm a d eo fw o o lf o rt h e i rs p e c i a lf e a t h e r s ， s u c ha sw a r m n e s sa n dt r i m h o w e v e ri ti se a s yt of e i tw h e nt h ew o o lf i b e ri s o nt h ef r i c a t i o n t h eh i g ha m o u n to fd i s u l f i d e b r i d g e sm a k e t h eo u t e rw o o l s u r f a c e h i g h l yh y d r o p h o b i c ，s o t h ed i f f u s i o no f d y e s i n t ot h ef i b r e si s h i n d e r e d i no r d e rt oi m p r o v et h er a t eo f d y eu p t a k e ，t h ec o m m o n m e t h o di st o i n c r e a s et h ed y e i n gt i m ea t h i g ht e m p e r a t u r e t h i s t r e a t m e n tw i l lc a u s e y e l l o w i n ga n dg e l a t i o no fw o o lf i b e r s t h eh a n d l ea n db r i l l i a n c yo fw o o lf i b e r s a r ea l s oa f f e c t e d i nt h ep a s td e c a d e s ，t h ep r o c e s so fc h l o r i n a t i o n h e r c o s e t t i sp e r f o r m e dt or e m o v et h es c a l e so fw o o lf i b e r h o w e v e r , al o to fh a r m f u l m a t t e r ss u c ha sa o xa n d e p i h y d r i na r ep r o d u c e dd u r i n gt h i sp r o c e s s o nt h e c o n t r a r y , t h ep r o c e s so fe n z y m a t i ct r e a t m e n ti se n v i r o n m e n tf r i e n d l y i nt h e l o n gr u n ，e n z y m a t i ct r e a t m e n tw i l lb eu s e dw i d e l ya sa na l t e r n a t i v eo ft h e t r a d i t i o n a lp r o c e s s t h es t r a i nu 7 4 - w 2 0 7 c a p a b l eo fp r o d u c i n gh i g h - y i e l da c i dp r o t e a s ec a n b eo b t a i n e dt h r o u g hu l t r a v i o l e t l i g h t a n dm i c r o w a v em u t a t i o no fa s p e r g i l l u s n i g e r3 3 5 0a sa ni n i t i a ls t r a i n t h i ss t r a i nc a np r o d u c e2 1 6 7 u m lo fa c i d p r o t e a s e u n d e rt h e o p t i m a ll i q u i d f e r m e n t a t i o nc o n d i t i o n s as e r i e s o f e x p e r i m e n t s h a v eb e e nm a d et o d e t e r m i n et h e o p t i m u mc o n d i t i o n s a s f o l l o w s ： b e a np o w e r 0 6 ， c o r nf l o u r 0 6 f i s h m e a l 0 6 n h 4 c 1 1 2 ， 【c a c l 2 】o 5 ，【n a 2 h p 0 4 】0 2 i nt h ep a p e r , t h ep r o c e s so fh 2 0 2 t r e a t m e n ta n dp r o t e a s et r e a t m e n tw a s s t u d i e db yas e r i e so fo r t h o g o n a ld e s i g ne x p e r i m e n t s t h er e s u l t ss h o w t h a t t h e o p t i m u mp r o c e s s i n gc o n d i t i o n sf o rw o o lt r e a t m e n tb yh 2 0 2 w e r e ：【h 2 0 2 】- 4 0 m i l l ，p hv a l u e = 10 ，t i m e = 6 0 m i n i ti st h es a m et od e t e r m i n et h eo p t i m u m p r o c e s s i n gc o n d i t i o n so fp r o t e a s et r e a t m e n t t h er e s u l t sw e r e ： p r o t e a s e = 4 0 u m l ，【n a h s 0 3 = 8 ( o w f ，) t i m e = 6 0 m i n t h e w o o lf a b r i ct r e a t e db y p r o t e a s ea n du n t r e a t e ds a m p l e sw e r ed y e d a tt h es a m ec o n d i t i o n s t h e d y e i n gv e l o c i t ya n dt h er a t eo fd y e u p t a k eo fp r o t e a s et r e a t e dw o o lw i t ha n a c i dd y e ( c i b ap o l a rr e db l ) i se n h a n c e do b v i o u s l yc o m p a r e dt ou n t r e a t e d s a m p l e sw h e nd y e i n ga tt h et e m p e r a t u r eo f8 0 。c t h e6 l y e u p t a k eo fw o o l “ p r o t e a s e t r e a t e di n c r e a s e d f b y7 0 c o m p a r e d t ou n t r e a t e d s a m p l e s j h o w e v e r ，t h ed y eu p t a k ea n dd y e i n gv e l o c i t yo fp r o t e a s et r e a t e dw o o lw i t ha n a c i dd y e ( c i b ap o l a rr e db l ) a r ee n h a n c e dl i t t l e c o m p a r e dt o u n t r e a t e d s a m p l e sw h e nd y e i n ga tt h et e m p e r a t u r eo f10 0 。c t h es u r f a c ea n a l y s i so f p m t e a s et r e a t e d f i b r e b ys e ms h o w st h a t t h ef i b r es c a l e sh a v eb e e n d a m a g e d h o w e v er t h et e n s i l es t r e n g t ho fw o o lf i b r ed o e sn o to b v i o u s l y d e c r e a s e a c c o r d i n gt ot h ee x p e r i m e n tr e s u l t s x u m i n g l i ( a p p l i e dc h e m i s t r y ) d i r e c t e db y p r o f e s s o r l ud a n i a n k e y w o r d s ：w o o la c i dp r o t e a a e m u t a t i o n w e i g h t l o s e d y e u p t a k e 碧霉天学 硕士研究生学位论文 一 1 1 引言 第一章前言 纯毛织物服装由于其结构上的特殊性能，如丰满、挺括、保暖性好等特点， 长期以来倍受人们青睐，尤其是在礼服、西装等高档服装面料领域中更是一枝 独秀，经久不衰，至今很难找到与之媲美的材料。近年来，随着全毛高支纱以 及薄型面料，特别是凉爽羊毛的不断推出，为羊毛内衣化、衬衫化奠定了良好 的基础。但是羊毛纤维具有特殊的鳞片包裹结构，因此羊毛织物一般常温下难 以染色，传统的羊毛染色是经过严格的控制升温过程，在长时间的高温工艺下 完成的。这样，很容易导致羊毛织物泛黄或毡缩，严重影响染品的手感和鲜艳 度。近年来，随着国内生活水平的提高与出口的增加，对羊毛纺织品的外观质 量与内在品质的要求也日益提高。因此，为了解决上述问题，满足人们不断增 长的需求，必须对羊毛进行处理、改善其表面性质、提高其服用功能。传统的 处理方法大都采用大量的化学制剂对羊毛进行处理，虽然成本低廉，但是其引 起的环境问题日益引起人们的注意，随着人们的环保意识的不断增强，生物酶 处理的方法不断受到人们的重视。酶处理的方法的优点是对环境和个人都是友 好的，但是由于现在用于羊毛处理的蛋白酶成本较高，适用酶种较少，羊毛酶 处理工艺不成熟，酶处理的方法离工业化应用还有一段距离。因此在羊毛处理 用酶产生菌种的筛选、蛋白酶的制备以及相应的酶处理工艺等方面的研究”“”1 ， 一直以来都是国内外相关领域研究的热点。羊毛的性质和羊毛纤维的组成和结 构密切相关，为了选择适宜的处理方法，首先要了解羊毛纤维的组成和结构。 1 1 1 羊毛纤维的组成和结构 羊毛纤维不同于合成纤维，就其化学组成来看，本质是一类复杂的蛋白质 化合物，这类蛋白质化合物称为角质蛋白；角质蛋白( 角朊) 属于高分子化合 第1 页 碧霉天学 硕士研究生学位论文 物。在各种蛋白质中都含有碳、氢、氧、氮四种元素，而这种角朊和其他朊类 的主要区别就在于角朊含有较多的硫。硫在羊毛中主要存在于胱氨酸和蛋氨酸 中。从分子上来看，羊毛纤维中包括了所有的十八种氨基酸，其中含量较高的 有胱氨酸、谷氨酸、精氨酸、亮氨酸、苏氨酸和酪氨酸；而最主要的还要算胱 氨酸。胱氨酸含有双硫键，对坚固鳞片层的形成起着重要作用。羊毛处理在一 定意义上主要针对胱氨酸的这种结构。 从形态和结构上看，羊毛纤维主要由鳞片层、皮质层和髓层组成，它们的 细胞由细胞问质c m c 相互隔离，并把细胞粘连在一起。鳞片层( 约占1 0 ) 在纤 维皮质层外面，由片状角质细胞组成，并通过细胞间质c m c 相连，是纤维的保 护性外壳。早有研究表明鳞片层细胞由性质不同的三部分构成。”：( 1 ) 鳞片表层 ( e x i c u t i c l e ) 位于鳞片层的最外面，其性质与一般细胞膜相似，但又非双脂层结 构，主要含有磷脂化合物，角质化蛋白质及少量的碳水化合物，具有极好的化 学惰性，耐化学药品。( 2 ) 鳞片外层( e x o c u t i c l e ) ，是典型的角质化蛋白，氨基 酸残基( c y s ) 含量相当丰富，是羊毛结构中含硫量最高的部位，其结构紧密难 以膨化，有保护毛干的作用。e x o 层本身又可分为u 、b 两层，e x o a 层比e x o _ b 层更紧密，其胱氨酸残基含量高达3 5 ( 摩尔含量) ，即肽链中每三个氨基酸残 基中，就有一个胱氨酸残基。( 3 ) 鳞片内层( e n d c u t i c l e ) ，属于非角质蛋白， 胱氨酸残基含量低于3 ，其极性基团如一c o o h 、- n h 。基含量相当丰富，因而化 学性质活泼，膨润性极高，对化学试剂敏感组成，两者通过细胞间质粘联在一 起；鳞片层仅占羊毛总量的1 0 左右，由表层，外层和内层构成，鳞片表 图卜1 羊毛纤维结构图1 - 2 羊毛鳞片形态结构 第2 页 碧季支学 硕士研究生学位论文 层和外层含角质蛋白，难以降解。由于鳞片层的特殊结构，使其在羊毛的性质 中扮演非常重要的角色。羊毛纤维结构如图卜1 、图卜2 所示： 1 1 2 蛋白酶及其对羊毛的改性 酶是一种能催化特定反应的蛋白质，也即所谓的“生物催化剂”。与一般的 催化剂相比，酶催化反应具有温和性、高效性、专一性的特点。羊毛纤维就其 本质来看是一类复杂的蛋白质化合物，可以作为蛋白酶作用的底物。同常势塞 化学处理工艺不同，蛋白酶处理可以在温和的条件下对羊毛纤维进行处理，而 且蛋白酶很容易生物降解，因此对环境无害；同时也不会在羊毛纤维上残留， 不会对人身体产生潜在的伤害，也不会象“氯化赫科赛特工艺”口j 中产生可 吸收的有机卤化物( a o x ) 。蛋白酶改性处理目的，主要是为了破坏羊毛纤维表 面的鳞片，因为鳞片的存在，使得羊毛遇水容易产生毡缩；同时也不利于羊毛 的染色，阻碍染料分子向羊毛纤维内部扩散。为了取得良好的染色效果，只能 通过提高染色温度来使羊毛纤维的膨胀，但是过高温度显然会对羊毛产生不可 逆的损伤。对于羊毛纤维的酶法处理，国内外都进行了广泛的研究”“。 利用生物酶技术改善羊毛织物的品质并不是近年来才出现的新技术，早在 本世纪四j 甄十年代就有人研究用蛋白酶对羊毛进行防毡缩整理1 5 j 。近年来，随着 v 生物技术的飞速发展，酶的品种不断增加，不但可以大规模的生产各种高性能酶， 还可以按照需要设计、培养和提取具有特殊功能的酶，为酶的广泛应用奠定了 ；i 基础：特别是由于羊毛氯化工艺产生的可吸收有机卤级o x ，造成严重的生态环 境污染，已经受到工业化国家的严格限制，而酶处理作为一项无污染的“绿色” 技术，越来越引起人们的重视。国内外研究人员对羊毛酶处理的工艺条件、影 响因素、以及处理后羊毛的各项性能的改变报道较多【6 叫o l ，分别从不同的角度进 行了研究和论述。根据羊毛和酶的特性，一般的处理工艺是联合工艺。羊毛经 过氧化处理后，再用蛋白酶处理，这样对脱去鳞片和改善纤维的性能相当有效 弘j 。例如，日本专利采用高锰酸钾预处理，再用中性蛋白酶处理，结果羊毛鳞片 层被去除，纤维平均直径减少1 5um ，织物的光泽和手感获得较大的改善，防 毡缩性能和抗起球性大大提高。北京联合大学商学院的黄玉丽，王树兰等人发 第3 页 碧季支学 硕士研究生学位论文 展的工艺是预处理酶壳聚糖防缩整理工艺【1 0 1 ，此工艺也是分三步：首先进行 前处理，然后用碱性蛋白酶处理，最后用壳聚糖处理，通过电镜照片可以看出 羊毛经蛋白酶壳聚糖处理后，羊毛纤维表面变得平滑，鳞片边缘部分损伤，呈 不规则形状，并明显钝化，鳞片张角变小，在获得良好的防毡缩的同时也提高 了羊毛的上染率，降低染色温度。 1 2 本文研究的目的和主要内容 由于酶法处理羊毛具有很多其他方法所不具备的优点，所以酶处理法将会 成为取代传统处理方法的一种有前途的新方法。现在用于羊毛处理的蛋白酶主 要是碱性蛋白酶或其与中性蛋白酶的复配物，碱性蛋白酶在碱性条件下稳定， 效率最高，而在碱性条件下，羊毛不仅受到蛋白酶分子的作用，同时也受到碱 的作用，因此，一般情况下，经过碱性蛋白酶的处理后，羊毛减量和强度损伤 都比较大【1 1 】：酸性介质对羊毛的损伤比较小，所以考虑用酸性蛋白酶来处理羊 毛纤维。同时，为了取得良好的处理效果，选择合适的酶种也是一个很重要的 方面，最好能够找到适合羊毛处理的特效蛋白酶，这样才能更加有效的降低酶 处理的成本，促使其工业上的应用。 基于以上目的，本文在以下三个方面进行了的研究和探讨。 酸性蛋白酶高产菌株的选育 通过紫外诱变结合微波诱变的方法对酸性蛋白酶产生菌黑曲霉3 3 5 0 进行诱 变，选育生产酸性蛋白酶的高产菌株。 酸性蛋白酶产生菌黑曲霉培养条件的优化 对于新选育的高产菌株，还需要对基本培养基配方进行优化以及理化条件 的选择，才能确定诱变菌株最适宜的培养条件，提高菌株的产酶活力。 酸性蛋白酶处理对羊毛性能的影响 运用酸性蛋白酶处理羊毛织物，探索最佳的处理工艺条件。 第4 页 聋霉天学 硕士研究生学位论文 第二章酸性蛋白酶高产菌种的选育 2 1 引言 蛋白酶是酶制剂工业的重要酶种，广泛应用于饲料、皮革、医药和酿造中， 具有广泛的市场潜力。近年来，蛋白酶在纺织工业上的应用也越来越受到人们 的重视，尤其是在羊毛纤维处理上。通过蛋白酶的作用，可以破坏羊毛纤维表 面的鳞片层，使其在染色、防毡缩、穿着舒适感上都有明显的提高。工业酸性 蛋白酶在1 9 5 4 年首先由吉田在黑曲霉中发现。许多真菌酸性蛋白酶已经提纯并 进行了鉴定。商品酸性蛋白酶的生产菌主要是黑曲霉“”( 商品p a n p r o s i n ) 、黑曲 霉大孢子变株( p r o c t a s e ) 、斋藤曲霉( m o l s i n ) 根菌 ( d e n a p s i n ，s u n p r o s e ，n e w l a s e ，a c i d - p r o t e a s e ) 、杜邦青霉、血红色陀螺孔菌 ( r e p i t a s e ) 和微小毛霉( 凝乳酶) 、m u c o rm i e h e i ( 凝乳酶m a r z y m ) 等少数菌 种。其中高产菌株主要有黑曲霉、宇佐美曲霉、斋藤曲霉根霉、青霉，拟青霉， 以及米曲霉，血红色陀螺孔菌，粘红酵母等。 2 1 1 酸性蛋白酶的一般性质 酸性蛋白酶在许多方面与动物胃蛋白酶和凝乳蛋白酶相似，其适用p h 为 2 6 ，分子量3 0 0 0 0 3 5 0 0 0 ，等电点较低( p h 3 5 ) ，大多数酶在其活性中心含有 两个天冬氨酸残基。多数酸性蛋白酶在p h2 5 范围内稳定，若在p h 为7 ，温 度4 0 ，3 0 分钟处理后立即失活。 一般霉菌酸性蛋白酶在5 0 。c 以上很不稳定，斋藤曲霉酸性蛋白酶在p h 为 5 5 ，温度5 0 。c ，黑曲霉3 3 5 0 的酶在p h 2 5 ，温度6 0 c 处理2 0 分钟可引起完 全失活。但是杜邦青霉k 1 0 1 4 酸性蛋白酶在6 0 。c 历时一小时仍不会失活。 2 1 2 酸性蛋白酶的分类与命名 酸性蛋白酶按其性质不同可分成四种类型，如表2 1 所示： 第5 页 第雩天学 硕士研究生学位论文 表2 - 1 酸性蛋白酶的分类 类型性质适宜作用p t l 分子量代表菌种 2 1 3 诱变育种及诱变剂的选择 一般情况下，我们可以通过合理改善培养基配方中的成分( 如：碳氮源的 选择和配比，以及无机盐成分的选择和含量的变化) 和发酵条件的优化( 如： 培养基初始p h 、摇瓶装量、种龄和种量、培养温度、培养时间等) 来提高霉菌 的产酶能力，但是用这种方法提高酶活是有一定限度的，要想大幅度提高产酶 能力还得从改变微生物细胞遗传物质结构入手，现在主要可以采用以下三种方 法达到此目的：突变、基因重组以及采用d n a 重组技术的基因工程。 诱变育种是基于基因突变的菌种改良。其理论基础是d n a 结构的改变，包 括染色体基因突变和染色体外基因的突变，前者指染色体结构改变和染色体数 目的改变；后者指质粒等染色体外遗传因子的变化。诱变育种主要通过物理诱 变剂( 如：紫外线、x 射线、y 一射线、快中子、激光、微波、超声波等) 和 化学诱变剂( 如：亚硝酸、硫酸二乙酯、亚硝基胍、亚啶类染料等) 处理微生 物群体细胞，通过合理的筛选程序和方法，从中选出遗传物质分子结构发生改 变的少数细胞。常利用形态突变型、生化突变型、条件致死突变型和致死突变 型进行初筛而获得优良性状的突变株。诱变育种不仅可以提高菌株的生产能力， 而且还可以改进产品的质量，扩大品种，简化工艺，从方法上来说，它具有速 度快、收效显著和方法简便等优点。因此，在科学实验和生产上都得到了广泛 的应用。但是这种方法仍然缺乏定向性，工作量大，有的诱变因素对某一些菌 第6 页 碧季天学 硕士研究生学位论文 _ _ 一 种的作用并不明显，同时对高产菌株进一步提高产量仍较困难等。 基因重组是把两个不同形状的个体细胞内的遗传基因汇集到一个个体细胞 内，增加优良性状的组合或产生多倍体，是细胞虽未发生突变，但是经过基因 重新组合而发生变异。原核微生物基因重组的主要方式有转化、转导、转染、 接合；真核微生物基因重组的主要方式为有性杂交和准性生殖。微生物细胞中 的原生质体融合也是基因重组载体细胞水平上的反映。基因重组与诱变育种技 术相比，是向更自觉、更有效和一定的方向前进了一步，特别是对那些长期诱 变不显著的菌株，可通过杂交育种等手段，实行优良性状的组合，目前在育种 工作中也占有重要地位。 基因工程和基于d n a 重组技术的菌种改良途径。对不同生物的遗传物质进 行体外人工“剪接”，构成重组d n a 分子，然后通过载体导入微生物或动植物 受体细胞中，进行无性繁殖，并使所需要的基因得以表达，稳定遗传，这是实 现超远缘杂交、最新、最有前途的定向育种新技术。通过诱变育种、基因重组、 基因工程、蛋白质工程以及代谢途径工程等育种技术的发展，使人类可以按照 自己的设想，对微生物进行细胞水平、分子水平不同层次的改造，构建出具有 特殊功能的变异或重组菌株造福于人类。 由于实验条件以及仪器设备的限制，以诱发突变为基础的育种仍是迄今为 止国内外提高菌种产量和性能的主要手段。 2 1 3 1 紫外诱变 紫外线辐射是物理诱变因子中较有效，较普遍方法之一。到目前为止，对 于经过诱变处理后得到的高单位抗生素产生菌种中，有8 0 左右是通过紫外线 诱变后经筛选而获得的。因此，紫外线作为诱变因子还是应该首先考虑的。 紫外线的波长在2 0 03 8 0 n m 之间，但是对诱变最有效的波长仅仅是 2 5 3 2 6 5 n m ，一般紫外线杀菌灯所发射的紫外线大约有8 0 是2 5 4 n m 。紫外线 诱变的主要生物学效应是由于d n a 变化而造成的，d n a 对紫外线有强烈的吸 收作用，尤其是碱基中的嘧啶，它比嘌呤更为敏感。紫外线引起d n a 结构变化 的形式很多，如d n a 链的断裂、碱基的破坏。但是其中最主要的作用是使同链 第7 页 露季天学 硕士研究生学位论文 d n a 的相邻嘧啶间形成胸腺嘧啶二聚体，阻碍碱基间的正常配对，从而引起微 生物突变或者死亡。由于胸腺嘧啶二聚体的交联，当d n a 复制时便会阻碍双链 的分开与复制，同一链上相邻胸腺嘧啶之间的二聚体的形成会阻碍碱基的正常 配对，在正常情况下，胸腺嘧啶应与腺嘌呤配对，而如果两个相邻的胸腺嘧啶 连接起来就可能改变这种情况，足以破坏腺嘌呤的正常参入作用，复制便会在 这一点上突然停止或者错误地继续进行，这样就会在新形成的链上出现一个改 变的碱基顺序，在随后的复制过程中，已改变的d n a 仍然自身复制产生出一 个两条链上残基顺序都是错误的分子，因而引起突变。 紫外线照射后造成的d n a 损伤，一般在可见光照射下，由于光激活酶的作 用，可将嘧啶二聚体解开，使其恢复正常，这称为光复活作用。为了避免光复 活，经紫外线照射后的样品必须用黑纸或者黑布包裹。另外，微生物的培养过程 中也应在黑暗条件下进行。 在没有紫外线剂量测定仪的情况下，紫外线的绝对剂量很难测定，一般可 用其相对剂量来表示，剂量大小与紫外灯的功率、距离和照射时间有关。在前 两者不变的前提下，相对剂量可用照射时间来表示。 除了紫外线诱变之外，近年来关于微波作为诱变剂的报道也不少，加上其 使用设备简单，处理方便，也成为一种常用的诱变方法。 2 1 3 。2 微波诱变 微波用于诱变育种，近几年才见诸报道，由于不同菌株，其生理特性是千 差万别，对有的菌株会产生作用，对其他菌株可能不产生作用，但是，实践证 明微波的确具有生物热效应【1 4 1 。 其机理可能源于以下几个方面：( 1 ) 微波是一种电磁波，能引起水、蛋白 质、核苷酸、脂肪、和碳水化合物等极性分子的转动，尤其是水分子，在2 4 5 0 m h z 微波作用下，能在1 s 内1 8 0 0 来回转动2 4 5 x 1 0 8 次，从而引起分之间强烈的摩 擦，使得孢子内的d n a 分子氢键和碱基对受损，最终引起d n a 分子结构发生 变化，导致遗产变异。( 2 ) 微波具有极强的穿透效应，因此能同时使细胞壁内 外的水分子产生剧烈转动，从而引起细胞壁通透性发生变化，更易使胞内酶分 第8 页 囊霉夫学 融研究生学位论文 泌出来。( 3 ) 微波引起的分子强烈的热运动所产生瞬间强烈热效应，容易引起 酶失活，从而引起生理生化变异。( 4 ) 微波对微生物的诱变效应，除了热效应 外，还存在非热效应。这是由于诱变过程中，微生物的动态代谢受微波干扰而 平衡过程紊乱，从而使代谢路径发生改变。 微波的热效应对生物体也会产生相应的影响。这种热效应是由于生命体中 的某些成分，在吸收了微波后，能把这部分电磁能转变为这些成分的无规运动 的热能的结果。接受者应当是带电的或者是具有偶极距的( 因为只有这样才能与 包括毫米波有内的微波相互作用) ，大量存在的( 因为热是大量微观粒子无规则运 动的结果) 和分子量小的微观分子( 所吸收的微波能量才能使它产生无规则的平 动) 。同时根据分子物理学的理论，只有这些分子的转动频率处在微波范围内， 通过共振吸收原理才能吸收微波。由很多小分子组成的分子量巨大的蛋白质、 d n a 、r n a 及糖类和脂类分子是不满足这个条件的。它们不可能是微波热效应 的承受者。剩下的唯一对象就是水分子。它是生命体中大量存在的生物小分 子并是具有一定偶极矩的极性分子，再受微波能加热水的实验事实的启示， 能够断定所吸收的微波是引起了生物体中水的无规则热运动，使水温升高，从 而产生了微波生物热效应。 当生命体中的液态水在吸收微波后，会引起水分子随外加电磁场而变化， 但由于这些游离水分子的个体性，在它们中并不存在能把这种振动能量转化为 生物组织所需要的生物能的结构，因而仅可使水分子的氢键断裂，变成单个水 分子，并使每一个水分子的内能增加。即仅可将这部分能量转化为水分子无规 运动的动能，它们之间的相互碰撞也增加，从而使液态水的温度增高，这就是 说，液态水分子在吸收了微波的能量后，只是用来断裂氢键，转化为无规则运 动的热能，使液态水的温度上升，这就是微波的热效应的机理。 2 2 实验部分 2 2 1 实验方案的设计 本实验以黑曲霉3 3 5 0 为出发菌株，以紫外诱变为主，辅助以微波诱变，以 第9 页 望至量垒!塑堂燮 期提高菌株的产酶活力，获得酸性蛋白酶的高产菌株，为羊毛处理提供高效实用 的生物酶。为方便起见，本部分的实验流程图如图2 - 1 所示： 图2 一l 酸性蛋白酶高产菌株选育流程图 2 2 2 仪器设备及药品 2 2 2 1 主要实验仪器 第j o 页 碧季天学 硕士研究生学位论文 _ 一 仪器名称 型号 生产厂家 手提式压力蒸汽灭菌器 y x q s g 4 1 2 8 0 a 上海市医用核子仪器厂 振荡培养箱 b s i e金坛市富华电器有限公司 回转式恒温调速摇瓶柜 y p w i 型金坛市富华电器有限公司 离心沉淀器800型 上海市手术器械厂 电子调速搅拌器 g s l 2 2上海市医疗器械专机厂 电热恒温水浴锅h h s l 2 上海跃进医疗器械厂 自动电位滴定仪 z d 一2 型上海雷磁仪器厂 紫外一可见分光光度仪 u v - - 7 5 5 b上海精密科学仪器有限公司 显微镜x s p 肼 紫外诱变箱华东理工大学 接种棒江苏镇江生物仪器厂 微波炉青岛海尔集团 海尔冰箱 b e d 一2 1 6 f青岛海尔集团 电子天平 f a 一2 0 0 4上海精科天平厂 试管移液管三角瓶 2 2 2 2 主要实验药品 第j i 页 察霉天学 硕士研究生学位论文 一一 c o l ，c o o h分析纯 上海试剂三厂 1 ：2f o l i n 试剂 豆饼粉 玉米粉 鱼粉 酪蛋白 酪氨酸 麦芽汁 琼脂 分析纯 分析纯 分析纯 自制 浙江 浙江 浙江 德国默克药厂 中国医药集团上海化学试剂公司 上海市力波啤酒厂 中国医药集团上海化学试剂公司 2 2 3 实验步骤及过程 2 2 3 1 培养基 1 、斜面培养基成分： 5 b r i x 麦芽汁l o o m l ，琼脂2 0 9 ，p h = 5 4 2 、平板分离培养基成分： 5 b r i x 麦芽汁1 0 0 m l ，琼脂2 0 9 ，干酪蛋白0 4 9 ，胆酸钠o 2 9 ，p h = 5 4 3 、摇瓶培养基成分( ) ： 豆粉：3 6 5 ，玉米粉：o 6 2 5 ，蛋白胨：0 6 2 5 ，n 1 - 1 4 c 1 ：1 0 ， c a c l 2 ：o 5 ，n a 2 h p 0 4 ：0 2 ，豆粉水溶液：1 5 7 ，p h = 5 5 ， 2 2 3 2 菌悬液的制备 将黑曲霉3 3 5 0 菌株在斜面培养基上传代活化次，用5 0 m l 生理盐水将菌 苔洗下，然后倒入盛有玻璃珠的锥形瓶中，强烈振荡5 6 h ，以打碎菌块，离心 ( 3 0 0 0 r m i n ) 1 5 m i n ，弃去上层清液，将菌体用无菌生理盐水洗涤2 次，最后制 成菌悬液，用血球计数板在显微镜下直接计数：调整孢予的浓度为1 0 6 m l t h l 。 第1 2 页 露季大学 硕士研究生学位论文 2 2 3 3 紫外诱变处理 取5 m l 已制备的菌液，加到无菌培养皿内，放入一无菌磁力搅拌子，然后 置于1 5 w 紫外灯下3 0 c m 处。在正式照射前，先开启紫外线l o m i n ，让其预热， 然后打开皿盖正式在搅拌下照射，剂量分别为5 m i n 、6 m i n 、7 m i n 。操作在红灯 下进行，紫外照射过的装菌液的试管外用黑纸包住，避免白光照射【1 4 】。 2 2 3 4 微波诱变处理 紫外诱变选育出的高产菌株按本文2 3 3 2 方法制备菌悬液，取5 m l 已制备 好的菌悬液，置于最大功率为8 0 0 w 、脉冲频率为2 4 5 0 m h z 的微波炉内，对孢 子悬浮液进行辐射处理，处理时间为l o s 3 0 s 。 2 2 3 5 稀释涂平板 在红灯下( 紫外诱变样品，微波诱变的不需要红灯条件) 分别取未照射的 菌悬液( 作为对照) 和照射过的菌液各0 5 m l ，进行不同程度的稀释，取最后三 个稀释度的菌悬液涂于平板培养基上，每个稀释度涂三个平板，每个平板加稀 释液0 1 m l ，用无菌玻璃棒涂匀，用黑布包好，3 0 。c 下在培养箱中培养4 8 h ，注 意每个平板背后都要标明时问、稀释度等信息【1 4 i 。 2 2 3 6 计算存活率与致死率 将培养4 8 h 后的平板取出，进行细胞菌落计数，计算出对照样品l m l 菌液 中的活菌数。 存活率( ) = ( 处理后l m l 菌液中的活菌数对照l m l 菌液中的活菌数) 1 0 0 致死率( ) = 1 0 0 一存活率 第1 3 页 第季天学 硕士研究生学位论文 2 2 3 7 斜面培养 从平板上选取水解圈较大菌落，在其上刮一环孢子接到斜面培养基上，在 恒温培养箱中( 3 0 c ) 培养2 3 天，以获得稳定而健壮的孢子。 2 2 3 8 摇瓶培养 挑取一环生长在斜面培养基上的新鲜孢子接入装有5 0 m l 液体培养基的 5 0 0 m l 三角瓶，然后将三角瓶放入回转式恒温调速摇瓶柜( 3 0 。c ，2 2 0 r m i n ) 培 养8 8 个小时，取出，分别测定酶活。 2 2 3 9 活力的测定 酸性蛋白酶的活力采用f o l i n 法测定f ”】。( 具体测定过程见附录) 定义：l m l 液体酶在一定温度和p h 值条件下( 本实验温度为4 0 。c ，p i - i 值为2 5 ) ，l m i n 水解酪蛋白产生1 1 1g 酪氨酸为一个酶活力单位，以u m l 表示。 酸性蛋白酶的活力x = a k n 4 1 0 式中x _ 一样品的酶活力( u g 或u m 1 ) ； a 样品平行试验的平均吸光度； k 吸光常数( 经实验测定，对于本实验所用药品k 值为1 0 0 ) ： 4 反应试剂的总体积( m 1 ) 1 0 反应时间1 0 m i n ，以1 m i n 计 n 稀释倍数 2 3 结果与讨论 本实验以黑曲霉3 3 5 0 为出发菌株，其原始活力为7 3 0 u m l ，经过紫外线诱 变与微波诱变，活力最后提高并稳定到1 8 4 0 u m l 左右，提高了1 5 倍，效果比 较明显的，从实验中，我们发现这种提高的过程是逐步曲折上升的，由此可以 第1 4 页 碧季天学 硕士研究生学位论文 看出微生物的性状变异具有遗传性，其结果可能是正突变也可能是负突变，每 代生物又会有很多的变化因素，而且其稳定性更加需要时间来证明。我们要 做大量的工作才能够保证最后得到的菌株产酶稳定并且活力最高。 下面就本部分实验所取得结果进行分析和讨论。 2 3 1 紫外辐照诱变 根据平板分离培养基产生透明圈与菌落直径之比，初筛出1 0 个菌落。通过 摇瓶培养基摇瓶复筛，选取酶活力为7 3 0 u m l 的8 号a 1 菌株作为出发菌株。然 后在紫外诱变箱中对出发菌株单孢子悬浮液进行辐照诱变，辐照时间为3 m i n 、 5 m i n 、7 m i n 。辐照处理后，孢子致死率和辐照时间关系如图2 2 所示。 1 0 0 ，、8 0 琶6 0 篓。o 舔2 0 0 o246 诱变时间m j i l 图2 - 2 紫外辐照黑曲霉孢子致死率与辐照时间关系图 由图2 2 可以看出，随着时间的增加，致死率逐渐增大，3 r a i n 时为9 4 ，5 r a i n 时 为9 6 ，而到了7 m i n 时就已经达到了9 9 8 ，说明诱变时间范围的选择比较恰 当，能够达到预期的效果。而且在经过紫外诱变之后，在分离平板上很容易观察 到某些菌落形态、色泽和出发菌株有一些区别。在此基础上进行初筛和复筛。 2 3 2 紫外诱变效果 紫外诱变处理过的菌悬液，经平板培养基粗筛得到8 0 个菌株，然后进行摇 瓶培养基复筛，实验测定的结果如表2 3 所示。 第1 5 页 碧季天学 硕士研究生学位论文 表2 3 紫外对黑曲霉的诱交效果 辐照时间m i n 致死率( ) 正变率( )最高酶活( u m 1 ) 最大提高率( ) 79 9 8 8 21 3 1 4 7 8 7 5 9 7 3 9 47 6 1 1 1 8 5 2 - 1 从表2 3 中的数据可以看出，5 m i n 的紫外照射时间的正变率最高，酶活最 大提高率可达6 5 7 ，而7 m i n 正变率稍小，但是其酶活最大提高率可达7 8 7 。随着紫外诱变时间的增长，诱变菌种的产酶活力在提高，但是同时其致死 率也在急速的升高，如果继续增加诱变时间，致死率还会提高，这对我们选育 菌种也是不利的，因此，综合考虑，紫外诱变时间选择在7 m i n 为佳。另外，从 表中的数据可以发现，经过紫外诱变的菌株其产酶活力都有明显的提高，说明 了紫外诱变确实是一个很好的诱变手段，效果明显。观察相应的菌落可以看出， 高产菌株大都集中在正常菌落之中，为了进一步提高产酶活力，需要继续对高 产菌株进行诱变：因此我们从正变的菌株中选取4 株产酶活力最高的突变菌株， 进行复筛和复测，结果显示编号为u 7 4 的菌种稳定性较好，连续五次传代，没 有发生较大的回复突变，因此选择u 7 4 作为继续诱变的出发菌株，进行微波诱 变处理。 2 3 3 微波辐照诱变 以u 7 4 为出发菌株，然后在微波炉中对u 7 4 菌株单孢子悬浮液进行微波诱 变，辐照时间分别为1 5 s 、2 0 s 、2 5 s 。微波照射过的菌悬液和未经微波照射的悬 浮液经不同程度的稀释，进行平板培养，根据长出菌落数，计算致死率，孢子 致死率和辐照时间关系如图2 3 所示。 第1 6 页 凳季天学 硕士研究生学位论文 拿 褂 碌 豁 0 1 02 03 0 微波辐照时间8 图2 3 微波辐照黑曲霉的致死率曲线 由图2 - 3 可以看出，微波对黑曲霉孢子的杀伤力还是很大的，2 0 s 的致死率 可达9 5 5 ，2 5 s 孢子死亡率接近1 0 0 。一般的情况下，高的致死率的同时孢 子的突变率也会相应的提高，但是太高的致死率对我们选育菌种也是不利的。 在接下来的微波辐照处理，选择2 0 s 作为处理时间。 2 3 4 微波诱变效果 微波诱变后，在平板分离培养基上初筛1 0 0 个菌株，经摇瓶培养基的反复 筛选，其实验结果如表2 - 4 所示： 表2 - 4 微波对黑曲霉的诱变效果 从表2 - 4 中的数据可以看出，2 0 s 的微波辐照处理，正变率最高，酶活提 高率最大为4 0 9 ，也是最高的；2 5 s 的微波辐照，致死率是最高的，接近1 0 0 ，但是，正变率和酶活最大提高率都不是最大的，由此可见，低剂量的微波 第1 7 页 如 加 0 聋季支学 硕士研究生学位论文 辐照可以促使孢子萌发的时间提前，而高剂量的辐照可能太强烈，使得孢子的 遗传物质的缺陷增多，其酶活最大提高率反而下降。所以，微波的辐照时间应 该根据所用菌