（分析化学专业论文）基于纳米材料修饰的电流型免疫及适体传感器的研究.pdf

西南大学硕士学位论文摘要 基于纳米材料修饰的电流型免疫及适体传感 器研究 分析化学专业硕士研究生管姝 指导教师袁若教授 摘要 生物传感器是利用生物活性单元( 如酶、抗体、核酸、细胞等) 与物理化学检测要素组合 在一起对被分析物进行检测的装置电流型生物传感器根据生物化学反应前后的电流变化来 检测生物分子的浓度，所以增加电流响应信号，发展灵敏度高、稳定性好的生物分析技术一 直是电流型生物传感器研究的一个重要方向。近年来，纳米材料( 如纳米粒子、纳米线，纳米 管等) 已被广泛应用到生物传感器，其具有较大的比表面积，良好的吸附能力和生物兼容性等 特点，作为生物活性物质的载体其不仅可提高生物分子的吸附量和稳定性，亦可很好的保持 生物分子的生物活性，还能很大程度上改善传感器灵敏度和使用寿命等性能。 电化学免疫传感器利用抗原和抗体间的高度特异性结合，将传统的免疫测试方法与近代 生物传感技术、电化学分析技术融为一体，既具有免疫反应的高选择性又兼有电化学分析的 高灵敏性，被广泛应用于临床诊断领域。将适体作为分子识别元件固定电极上的电化学适体 传感器，根据适体与目标分析物结合前后电化学信号的变化来实现对目标分析物检测的分析 器件，近年来的发展备受关注。 本论文将纳米技术、生物传感技术和电化学分析技术结合用于免疫及适体分析。应用导 电纳米聚合物、纳米金、碳纳米管、纳米铂等纳米材料，采用不同方法在电极表面构建功能 化生物分子固定界面，制备了一系列性能优良的电化学生物传感器。同时用扫描电镜( s e m ) 、 透射电镜( t e m ) 、光谱技术、电化学分析技术对电极的组装过程、功能界面进行了表征，对 其在生物分析方面的应用进行了探讨。具体而言本文开展了如下工作： 1 基于聚2 ，“二氨基吡啶膜及纳米金修饰的癌胚抗原免疫传感器研究 利用导电聚合物2 ，6 一二氨基毗啶( p p a ) ，以癌胚抗原( c e a ) 弄i ：i 癌胚抗体( a n t i c e a ) 为生物模 型分子，采用电聚合技术和共价键合作用，研制新型高灵敏电流型免疫传感器。采用简单快 捷的电聚合方法，在玻碳电极( g c e ) 表面聚合2 ，6 二氨基毗啶( p a ) ，创建了表面带- n i t 3 + ，导电 性能好，结构稳定，呈纳米线状的聚2 ，6 二氨基吡啶膜( p p a ) 免疫传感器固定矩阵。在此矩阵上 利用戊二醛交联电活性物质硫堇( t h i ) ，再利用硫堇分子丰富的氨基结合具有比表面积大、吸 l 两南大学硕士学位论文 摘要 鼍i , 一i i , ie e e l l e l l 一 鼍曼曼皇皇曼曼曼 附力强、生物相容性好等优点的纳米金( g n p s ) 。继而利用纳米金吸附固定癌胚抗体( a n t i - c e a ) ， 制得c e a 免疫传感器。经过扫描电镜( s e m ) 等实验表征发现，该电流型免疫传感器简便地 创建的聚合物固定矩阵，具有表面纤维网状结构，能较大的增加电极比表面积，为电子的转 移提供更多的通道。同时利用其表面大量的正电荷氨基能较好得固定t h i ，而采用的g n p s 增加 了抗体的固定量，并较好的保持了抗体的生物活性。该传感器具有制作过程简单，检测限低， 稳定性好以及线性范围宽等特点。 2 基于纳米金与碳纳米管j 硫堇复合物固定甲胎蛋白的电流型免疫传感器研究 利用多壁碳纳米管硫堇( m w n t s - t h i ) 复合物和纳米金固定a n t i - a f p ，成功构建了高灵敏的 电流型a f p 免疫传感器。本研究在电极表面创建固载基质时，选用被视为线性富勒烯分子，拥 有独特的分子结构的碳纳米管f i w r c r s ) ，利用它能与含有兀电子的化合物( 如硫堇) 通过觚 非共价键作用相结合，将功能化的m w m f s - 1 h i 膜修饰于玻碳电极表面。该固定矩阵中，碳纳 米管空心管状结构作为电活性物质硫堇的载体，可提高硫堇作为媒介体在修饰电极中的固定 量，稳定性并改善其电子的传递。同时经硫堇分子修饰的m w 卜r r s 表面得到功能化而带有丰 富的氨基，增强了其生物相容性，便于进一步固载纳米粒子、生物分子等。在此复合物膜上 通过静电吸附固定纳米金，从而吸附甲胎蛋白抗体。制得了一种性能优良的电流型甲胎蛋白 抗原免疫传感器。该传感器制作过程简单、稳定性好，线性范围0 2 0 - 2 0 0n g m l ，检测限为o 0 6 n g r n l ( s n = 3 ) a 3 基于纳米铂与酶标生物素亲和素构建的超灵敏凝血酶适体传感器的研究 利用纳米铂( p t m s ) 、过氧化氢酶标记凝血酶适体，通过其对过氧化氢的催化作用，构建 信号放大的新型电流型凝血酶传感器。本研究采用双适体夹心分析模式，以及酶标记催化放 大手段。玻碳电极电极表面的电沉积纳米金，可增大电极比表面积，改善电极表面与生物分 子之间的电子传输能力，提供良好的组装基质，为凝血酶适体i ( t b a i ) 的巯基自组装提高 固定量，改善检测的灵敏度。结合凝血酶后，将制成的含有酶标生物素亲和素( h r p - b i o t i n , h r p - a d i v i n ) 、纳米铂、凝血酶适体复合纳米粒子，通过适体与凝血酶蛋白的作用，固定于 电极表面。在过氧化氢的存在下，适体上标记的p t n p s - h r p 复合物共同作用于底物，从 而产生催化放大电流信号。所采用的功能化适体i i ，利用n n p s 结合5 末端标记巯基的单链 适体，并通过生物素亲和素体系引入大量的过氧化氢酶，将p t n p s 和h r p 的催化放大作 用有机结合，通过酶催化和底物循环放大作用，极大地增加了响应电流，提高了传感器的灵 敏度。该传感器在灵敏度方面显示了较强的优势，凝血酶检测范围为2 3 1 0 以2 1 0 1 0 。9 m o l l ，相关系数为0 9 8 9 8 ，检测限为0 8 1 0 以2 m o l l 。 关键词：免疫传感器适体传感器导电聚合物碳纳米管信号放大 i l 西南大学硕士学位论文 a b sl r a c l s t u d i e so nn o v e la m p e r o m e t r i c i m m u n o s e n s o ra n da p t a s e n s o rb a s e do n n a n o m a t e r i a l s a n a l y t i c a lc h e m i s t r ym a s t e rp o s t g r a d u a t e - s h ug u a n s u p e r v i s o r - p r o f e s s o rr u oy u a n a b s t r a c t ab i o s e n s o ri sad e v i c ef o rt h ed e t e c t i o no fa na n a l y t et h a tc o m b i n e sab i o l o g i c a lc o m p o n e n t ( e g a l l z y l n e s ，a n t i b o d i e s ，n u c l e i ca c i d s ，c e l l ，a c ) w i t h a p h y s i c o c h e m i c a ld e t e c t o rc o m p o n e n t a m e p e r o m e t r i eb i o s e n s o ri sb a s e do i lt h ec h a n g ei nt h ea m p e r o m e t r i cr c s p o i s eb e f o r ea n da f t e r b i o c h e r n i c a lr e a c t i o nt od e t e c tt h ec o n c e n t r a t i o no fb i o m o l e c u l e s o ，e n h a n c i n gc u r r e n tr e s p o n s e s s i g l ea n dd e v e l o p i n go fs e n s i t i v eb i o a s s a yt e c h n o l o g yi so n e o ft h ei m p o r t a n tt a s k si nt h es t u d yo f a r n e p e r o m c t r i eb i o s e n s o r i nr e c e n ty e a r s ，n a n o - m a t e r i a l s ( e g n a n o p a r t i c l e s , n a n o w i r e s , r m n o t u b c s e t c ) ，e r d a b i t i n gl a r g es p e c i f i cs u r f a c ea r e a , g o o db i o c o m p a t i b i l i t ya n ds t r o n ga d s o r p t i o nc a p a c i t y , a r ef a v o u r a b l ef o rc o n s t r u c t i n gb i o s e n s o r s ，w h i c hn o to n l yr e t a i nt h eb i o l o g i c a la c t i v i t i e so f b i o m o l e c u l e s ，b u ta l s oe n h a n c et h es e n s i t i v i t ya n ds e r v i c el i f eo ft h es e n s o r s t h ee l e e t r o e h e r n i c a li n l m u n o s e n s o l u s e ss p e c i f i c i t yo ft h er e a c t i o no fa n t i g e na n da n t i b o d yt o c o m b i n et r a d i t i o n a lm e t h o df o ri m m u n o a s s a yw i t ht h et e c h n o l o g yo fm o d e r ns e n s o r , w h i c hb o t h h a st h eh i l 曲s p e c i f i c i t yo ft h ei m m u n o c h e r n i c a ls y s t e ma n dh a st h eh i 曲s e n s i t i v i t yo f e l e c t r o c h e m i c a la n a l y s i sa n d h a sb e e nb r o a d l ya p p l i e di nc l i n i c a ld i a g n o s i s e l e c t r o c h e m i c a l a p t a s e n s o r s ，w h i c ha r cb a s e d0 nt h es p e c i f i c i t yo fa p t a m e r - t a r g e tr e c o g n i t i o nw i t he l e c t r o c h e m i c a l t r a n s d u c t i o nf o ra n a l y t i c a lp u r p o s e s ，h a v er e c e i v e dp a r t i c u l a ra t t e n t i o ni nr e c e n ty e a r s i nt h i sp a p e r , t h en a n o - t e c h n o l o g y , b i o n s e n s i n gt e c h n o l o g ya n de l e c t r o c h e m i c a la n a l y t i c a l t e c h n i q u e sa r ec o m b i n e df o ri m m u n o a s s a ya n da p t a m e ra n a l y s i s i tf o c u s e s o nd e s i g n i n ga n d f a b r i c a t i n gn o , e lb i o m i m e t i ci n t e r f a c ec o m b i n i n gs o l l l ek i n d so fn a n o p a r t i c l e sw i t hc o n d u c t i n g p o l y m e r s ，c a r b o nn a n o t u b e s ，p l a t i n u mn a n o p a r t i c l e s ，a n dg o l dn a n o p a r t i c l e sf o rt h ei m m o b i l i z a t i o n o fb i o m o l e c u l e s t r a n s m i s s i o ne l e c t r o nm i c r o s c o p y , s c a n n i n ge l e c t r o nm i c r o s c o p y , a t o m i cf o r c e m i c r o s c o p y , 扩弘隧s 1 ) e e t r aa n de l e c t r o c h e m i c a lt e c h n i q u e sa r eu s e da st o o l sf o rs t u d y i n gt h e p r o p e r t i e so fi n t e r f a c e w ed i s c u s s e dt h e i ra p p l i c a t i o n si nb i o a n a l y s i sd o m a i n t h i sr e s e a r c hf o c u s e s o nt h ed e t a i l sa sf o l l o w ： 1 a m p e r o m e t r i c i i t l m u n o s c l l s o rf o r c a r c i n o e m b r y o n i ca n t i g e n b a s e do n p o l y ( 2 ，6 - p y r i d i n e d i a m i n e ) a n dg o l dn a n o p a r t i c l e s i l i 西南大学硕士学位论文 a b s t r a c t an e wh i g h l ys e n s i t i v ea m p e r o m e t r i ci l l l i i l u r l o s e n s o rf o rt h ed e t e r m i n a t i o no fc a r c i n o e m b r y o n i c a n t i g e n ( c e a ) h a db e e nc o n s l r u c t e db ye m p l o y i n gan o v e lc o n d u c t i n gp o l y m e rf i l mc o u p l e d1 j l ，i t l l g o l dn a n o p a r t i c l e s t h ep o l y2 , 6 - p y r i d i n e d i a m i n e ( p p a ) f i l mw a sf o r m e do nt h eg l a s s yc a r b o n e l e c t r o d eb yu t i l i z i n ge l e c t r o p o l y m e r i z a t i o n ，w h i c hy i e l d e da ni n t e r f a c ew i t ha m i n eg r o u p s ，g o o d c o n d u c t i n ga n ds t a b l e n a n o w i r ec o n s t r u c t i o n o nt h es t r u c t i o n , t h i o n i n e ( t h i ) w e r ee a s i l y i m m o b i l i z e dt h r o u g hc o v a l e n tc o n j u g a t i o nu s i n gg l u t a r a l d e h y d e ，w h i c hb u i l ta ni n t e r f a c ef o rt h e a s s e m b l yo fg o l dn a n o p a r t i c l e s ( g n p s ) 。t h e n , t h ec a r c i n o e m b r y o n i ca n t i b o d y ( a n t i - c e a ) w a s c h c m i a d s o r b e do n t ot h es u r f a c eo fm o d i f i e de l e c t r o d e u n d e ro p t i m a lc o n d i t i o n s ，t h er e s u l t i n g i l m n u n o s e u s o rd i s p l a y e dah i g hs e n s i t i v i t yf o rt h ed e t e c t i o no fc e a ，a n de x h i b i t e dh i g hs e l e c t i v i t y , l o n g - t e r ms t a b i l i t ya n dg o o dr e p r o d u c i b i l i t y 2 a m p e r o m e t r i ci m m u n o s e n s o r f o r a - l - f e t o p r o t e i n b a s e d0 1 1g o l dn a n o p a r t i c l e sa n d m u l t i - w a l lc a r b o nn a n o t u b e - t h i o n i n ec o m p o s i t e an e ws e n s i t i v i t ya m p e r o m e u i ci m m u n o s e n s o rf o r t h ed e t e c t i o no fa - 1 一f e t o p r o t i e n ) w a s d e v e l o p e db a s e do nm u l t i - w a l lc a b o nn a n o t u b e ( m w n t s ) - t h i o n i n e ( t h i ) n a n o - c o m p o s i t em e m b r a n e c a r b o nn a n o t u b c ，勰t h ec a r r i e ra n dc o n d o n c t o ro ft h i ，p e r m i ta ni m p o r t a n td e c r e a s ei nt h e o v e r v o l t a g ef o rt h er e d o xo fc h e m i c a l sa n dad r a m a t i ci m p r o v c 珏n e n ti nt h er e v e r s i b i l i t yo ft h er e d o x b e h a v i o ro fb i o m o l e c u l e s t h eh i g hs u r f a c ea r e ai sp r o p i t i o u st ot h ei m m o b i l i z a t i o no ft i f fa n d p r o m o t ee l e c t r o nt r a n s f e rb e t w e e nr c d o xc e n t e ro f t h ia n de l e c t r o d es u r f a c e ，w h i c hw i l li m p r o v et h e s e n s i t i v i t ya n ds t a b i l i t yo fb i o s e n s o r a tt h es a m e 6 m c ，t h em o d i f i e dm w n r s c r e a t e da ni n t e r f a c e w i t ha m i n eg r o u p s ，g o o db i o c o m p a t i b i l i t y , w h i c hm a d en a n o p a r t i c l e sa n db i o m o l e c u l e sc a nb ee a s i l y i m m o b i l i z e d g n p sw a si m m o b i l i z e do nt h ee l e c t r o d ea c c o r d i n gt oa u - n h 2c o v a l e n tb e n d , a n dt h e n t h ei n m u n o s e n s o rw a s p r e p a r e db yi m m o b i l i z i n ga n t i b o d yo fa l - f e t o p r o t i e n ( a f p ) w h i c hc a nm a l 【e b o n dw i t hg n p s t h ei l l l l n u l l o s s o rh a dg o o ds t a b i l i t yw i t haw i d el i n e a rr a n g eo fo 2 0 - 1 2 0n g m l a n dad e t e c t i o nl i m i to f0 1 2n g n 1 l ( s n = 3 ) 3 a nu l t r a s e n s i t i v ea m p l i f i e da m p e r o m e t r i ct h r o m b i na p t a s e n s o rt a k i n gl 地q p sa n dh r pl a b e l e d a d i v i n - b i o t i ns y s y t e mi ns a n d w i c hm a n n e r a na m p l i f i e da m p e r o m e t r i ca p t a s e n s o rf o rs e n s i t i v ed e t e c t i o no fu b i q u i t o u sp r o t e i nt h r o m b i nw a s d e v e l o p e db a s e do np t n p s - e n z y m el a b e l e dt h r o m b i na p t a m e r a d o p t i n gs a n d w i c hf o r m a t , g o l d n a n o p a r t i c l e s ( g n p s ) w e r ee l e c u o d e p o s i t e do n t o ag l a s s yc a r b o ne l e c t r o d e ( g c e ) t oc r e a t ea n a n o m a t e r i a lp l a t f o r mf o ri m m o b i l i z a t i o no ft h et h i o l a t e da p t a m e r ( t b ai ) a f t e rc a p t u r i n gt h e t a r g e tt h r o m b i n , s i g n a la p t a m e r st a g g e dw i t hp tn a n o p a r t i c l e s ( p t n p s ) a n da v i d i no rb i o t i nl a b e l e d h r p ( p t n p s - e n z y m el a b e l e d t b ai i ) w e r ea t t a c h e dt o t h ea s s e m b l e de l e c t r o d es u r f a c ef o r a m p l i f y i n gc u r r e n ts i g n a l t h eu s eo ft b ai i l a b e l e dw i t hp t n p s ，h r p a v i d i n , h f - b i o t i n ，a n d t h ec o n s u m p t i o n - r e g e n e r a t i o nc y c l eo fh 2 qc o u l ds i g n i f i c a n t l ya m p l i f yt h ec u r r e n ts i g n a la n d i v 西南大学硕士学位论文a b s t r a c t 皇曼皇曼皇皇曼曼曼皇曼曼曼鼍! ! 毫曼皇曼鼍鼍兰i i ii ii i ii ii i 一一i 曼曼曼寰曼舅曼曼皇曼曼曼 i n c r e a s et h es e n s i t i v i t yo fa p t a s c n s o r t h eo n p se l e c t r o d e p o s i t e do ng c eu s e d 嬲a p l a t f o r mf o r i m m o b i l i z a t i o no ft h et h i o l a t e da p t a m e rt a i le l l h a l l c et h ei m m o b i l i z a t i o na m o u n to fa p t a m c ra n d i m p r o v et h es e n s i t i v i t yo fa na m p e r o m e t r i cb i o s e n s o rf i o r 曲d e t e r m i n a t i o no fp r o t e i n as i g n a l - o n s a n d w i c hs e n s i n gm a n n e ri sd e v e l o p e dt om o n i t o rt h ec u r r e n ti n c r e a s ec a u s e db yp t n p s - c n z y m e l a b e l e dt b ai i ，w h i c hw o u l dg r e a t l ya v o i dt h es e n s i n gs c h e m eb e c a u s eo fan e g a t i v er e a d o u t s i g n a l u n d e ro p t i m i z e dc o n d i t i o n s ，t h ea p t a s c n s o rb a s e d0 1 1p t n p sa n dh r pa se l k l l a l l c e re x h i b i t e d l o wd e t e c t i o nl i m i to f0 8p mw i t ht h el i n e a rr a n g ef r o m2 3p m 1 0n mt h r o m b i n n 圮d e v e l o p e d m e t h o ds h o w e dh i 曲s e n s i t i v i t y , a c c e p t a b l es t a b i l i t ya n dr e p r o d u c i b i l i t y ，a n dc o u l db eu s e df o r d e t e c t i o no f v a r i o u sp r o t e i nt a r g e t s k e y w o r d s ： i m m u n o s e n s o r a p t a s e n s o rc o n d u c t i n gp o l y m e r s c a r b o n - n a n o t u b e r s s i g n a l sa m p l i f y v 独创性声明 本人提交的学位论文是在导师指导下进行的研究工作及取得的 研究成果。论文中引用他人已经发表或出版过的研究成果，文中已加 了标注。 学位论文作者：锈珠签字日期：矽7 d 年印月m 日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解西南大学有关保留、使用学位论文的规 定，有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允 许论文被查阅和借阅。本人授权西南大学研究生院可以将学位论文的 全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫 描等复制手段保存、汇编学位论文。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权书，本论文：口不保密， 口保密期限至年月止) 。 学位论文作者签名：饶珠 签字日期：7d 年争月护日 导师签名： 签字日期：纱杪年幺月加日 两南大学硕士学位论文第1 章 第1 章绪论 1 1 生物传感器的概述 2 1 世纪是生命科学的世纪，也是信息科学的世纪，应生命科学和信息科学需 要，随着分析化学与生物科学的交叉融合，生物传感器已引起世界各国的极大关 注。生物传感器可定义为一种装置，其采用具有分子识别能力的生物活性物质( 如： 酶、微生物、动植物组织切片、抗原或抗体、d n a 等) 与物理化学转换器相结合， 利用生物识别反应进行定量或半定量分析【l 】o 生物传感器的结构一般有两个主要 组成部分，生物识别元件( 感受器) 和信号转换器( 换能器) 。识别元件是各类传感 器装置的关键部分，与物理传感器、化学传感器相比，关键不同之处在于，生物 传感器其识别元件在性质上是生物质。 生物识别元件；：j ：酶： ：= = = ：组织： ：= = ：细胞： ： ：；= 抗体： ：! ：核酸： ：檄素：；：! ：奠 信号转换器 电化学测量装置 热敏电阻器 f e t i s f e t 光敏二极管 光纤 压电元件 图i i 生物传感器示意图 生物传感器的检测手段与传统的分析方法相比，具有体积小、响应快、成本 低等优点。选择性、稳定性、灵敏度是生物传感器的重要性能指标。可通过改善 生物单元与信号转换器之间的联系减少干扰，或设计新的活性单元以增加其对目 标分子的亲和能力，从而提高生物传感器的选择性。而最常用的增加稳定性的手 段是，采用对生物单元具有稳定作用的介质、固定剂来克服生物单元结构的易变 性。灵敏度可通过催化循环放大信号、良好的分散、固定技术等手段来提高【2 4 1 。 环境监测、食品药品分析领域是发展较早的生物传感器应用领域。用于测定 生物需氧量的b o d 微生物传感器、用于测定有机农药d d v p 和伏杀磷的离子酶 敏场效应晶体管酶传感器，用于食品添加剂分析的各种酶传感器以及用于临床检 测和生物医药分析的酶、免疫传感器都日趋成熟。 1 2 电化学生物传感器的概述 电在生物体内普遍存在，可以认为组成生物体的每个细胞都是一合微型发电 机。人体任何一个细微的活动都与生物电有关，某一部位受到刺激后，感觉器官 产生的兴奋就是生物电。电化学生物传感器的历史开始于1 9 6 7 年u p d i k e 制成的 夏秽 西南大学硕士学位论文 第1 章 第一支葡萄糖传雅器嘲，随着生物、亿学、物理电子、医学等相关学科的迅速发 展以及生物技术和传感技术的相应提高，具有快速检测、方便、价廉的电化学生 物传盛器也得到了迅速发展。1 9 5 1 年，b r e y e r 和r a d c b f f 首次用极谱方法测定了 由偶氮标记的抗原，这成为电化学免疫分析的开端州。 1 2 1 电化学免疫传感器 将电化学分析方法与免疫分析技术相结合构建而成的电化学免疫传感器，用 于测量免疫反应前后引起的电化学信号变化。电化学免疫传感嚣的原理与传统免 疫分析方法的检测原理相似，既把抗原或抗体固定在电极表面，通过固定化的抗 原或抗体识别待测样品中与它相对应的抗体或抗原并形成稳定的复合体来实现对 待测样品的检测。它兼具有生物传感嚣快速、灵敏、选择性高、操作简便等特点 还具有仪器设各相对简单，构制敏癣电极方法灵活，体系容易集成化、微型化 测定不受样品颜色、浊度的影响，可以在线检铡等优势。因此，电化学免疫传感 器已成为当前研究的热点课题之一，按测定信号可分为电位型、电流型、电导型 和电容型等，其中研究较多的是电位型和电流型免疫传感器。 1 9 8 0 年a i t a w a 将a f p 抗体固定于醋纤膜上，并将此膜紧贴在电流型氧电极 的透氧膜表面，组装成测定a f p 的免痤电极m ，开创了以抗体为识别元件的免疫 传感器。电流型免疫传感器是在恒定电压下，检测免疫反应前后通过电化学室的 电流变化，完成对待铡抗原或抗体的定量检测为了把抗原和抗体结合的信息转 变为可测的电化学信息( 电流) ，又由于抗原一抗体生物分子本身不具备电活性， 电流型免疫传感罂一般需要使用标记物标记抗原或抗体其标记物有酶i s l 和电活 性物质例两类。将标记物交联在抗体( 或抗原) 上然后采用夹心法或竞争法进行 安培分析。由于酶的化学放大作用，在安培免疫分析中大多采用酶作为标记物。 图1 2 a l p 酶标记电化学幢蠹鼠i g g d a s f 3 肄，用碱性磷酸酶a l p 标记= 抗，通过催化底物p 一氨基磷酸盐还原为 两南大学硕士学位论文 第1 章 对氨基苯酚( a p ) ，后者通过电极表面参杂二茂铁的高聚物从电极上得到再生，从 而放大电流，成功制备检测限为o 1p n l l 的鼠i g g 免疫传感器，如图1 2 所示。 电流型免疫传感器研究的情况来看，目前仍在寻找更合适的固定材料与方法，探 求更灵敏稳定的标记物和电活性物质，追求更灵敏更稳定的信号检出系统。 1 2 2 电化学适体传感器 1 2 2 1 适体的简介 适体( a p t a m e r ) 也称为核酸适体、适配体、适配子等，是一段由2 5 8 0 个碱基 组成的单链寡核苷酸片段，可以是d n a ，也可以是r n a 。它是通过一种新的体外 筛选技术( 指数富集配体系统进化s y s t e m a t i ce v o l u t i o no fl i g a n d sb ye x p o n e n t i a l e n r i c h m e n t , s e l e x 技术) ，从人工构建的随机单链寡核苷酸文库里筛选出来，可以 特异结合如蛋白质、氨基酸、药物或无机离子等目标分子【1 0 1 。 适体不仅具有类似抗体对目标分子高亲和力和高特异性，而且具有许多抗体 都无法比拟的优点【1 l 】，并有利于生物传感器的构建，例如：( 1 ) 筛选合成快速简便： 无需依赖细胞或是动物，通过s e l e x 技术体外筛选获得，改变筛选条件及筛选后 修饰，可得到适应不同反应体系需要的适体。再通过化学合成生产，组成确定、 纯度高，并且几乎消除了制备的批间误差，较抗体制备更快速、更廉价。这有利 于生物传感器的批量生产。( 2 ) 分子量小：适体分子量一般为8 1 5k d a ，与目标分 子结合空间位阻小，有利于构建高密度阵列生物传感器。( 3 ) l 互- d 体广泛：与适体结 合的配体，不仅有大分子，如蛋白质、核酸、酶、生长因子、抗体等，而且也有 小分子如金属离子、氨基酸、辅因子、抗生素、核苷酸等。( 4 ) 性质稳定可复：抗 体的蛋白质本质决定了它容易变性，保存时间短，活性易受温度、p h 值等外界条 件的影响。而适体的核酸本质，使它能在冷冻条件下保存数年，即使在高温、高 盐浓度、络合剂等的作用下发生变性，活性在适当条件下可以恢复。这有利于提 高传感器的使用寿命和实现重复使用。 1 2 2 2 电化学适体传感器的简介 适体电化学传感器是根据适体与目标分析物( 配体) 结合前后电化学信号的变 化来实现对目标分析物的检测的装置，一直被认为是一种很有前景的分析测试方 法，在快速检验中发挥着重要作用。适体电化学传感器，根据检测信号的不同， 存在着电压型、电流型和阻抗型适体传感器。根据识别方式的不同，可分为标记 型和非标记型两类适体传感器。 电流型适体传感器，主要为标记型适体传感器，通过吸附、化学修饰、或生 物亲和等方法在寡核苷酸链或配体上修饰些具有电化学活性或催化活性的无机 西南大学顿士学位论文第1 章 或生物分子，如a u 、量子点、二茂铁、亚甲蓝、辣根过氧化酶等，然后通过检测 修饰物本身或其催化底物的电流信号来实现检测具有灵敏度高的优点，在电化 学适体传感器中研究较多。 对于使用电活性标记物的电化学适体传感器来说，又可以分为信号减小型 ( s i 毋a a lo l i ) 和信号增大型( 甄g n a lo n ) 。p l a x c okw 等人 1 2 , t 3 1 通过自组装作用将亚甲 蓝标记的凝血酶适体固定在金电极表面，构建了信号减小型和信号增大型的电化 学适体传感嚣。如图l _ 3 所示，s i g n a lo 理型加入凝血酶后，适体由随意的卷曲状态 变为折叠( 与凝血酵特异性结合形成。一四聚体椅状构象) ，同时亚甲蓝离电极表 面的距离由近变远，电子传递能力由强减弱，电流信号显著降低。s i 弘缸。趔的优 点是电极的表面可以更新，缺点是会检测到由于污染引起的假阳性结果。而s i g m l o n 型，则将亚甲蓝标记在一条与适体链部分互补的d n a 链上，并通过杂交固定在 电极上，此时亚甲蓝距离电极表面较远，加入凝血酶后，凝血酶与适体强； ! ! 的结 合力使杂交双链部分解离，亚甲蓝离电极表面的距离由远变近，亚甲蓝的还原电 流由小增大。两种方法的灵敏度分别为64n m o l l 和3n m o l l 。由此可见，s i g n a lo l l 型克, 眠t s i g n a io 趔可能会检测到的假阳性结果，提高了检测的灵敏度。但是。 s i g n a lo i l 型的电极无法更新，且只能在2 4h 内保持稳定。 。心 蓄盗 围1 3 信号藏小型和信号增大璺的电化学适体传露器 s e l e x 技术自问世已有2 0 多年，较之于光学适体传癣器十几年的发展历程， 电化学适体传感器的研究还处于初级阶段。如今的电化学适体传感器在设计、特 性、灵敏度、稳定性以及实际应用方面已经取得了显著的发展，具有灵敏度高、 选择性好、适于联机化、不破坏测试体系，不受颜色影响，操作简便及测试费用 低等优点。寻求其它技术与电化学适体传感器的结合，扩大电化学适体传感器的 研究应用领域：筛选新的高亲和力、高灵敏度、高选择性的电化学活性物质；寻 找稳定的固定化方法：提高适体电化学传感器的稳定性和灵敏度等都将是是遁体 电化学传感器研究的热点。随着生物技术和电化学技术的不断完善和改进，电化 学适体传感器的研究仍将是一个活跃的研究领域，它的应用范围也将会更加广阔。 景鉴蚤立 西南大学硕士学位论文 第1 章 1 3 导电聚合物概述 导电聚合物( c o n d u c t i n gp o l y m e r ) 又称导电高分子，世纪之交2 0 0 0 年诺贝尔化 学奖颁给了它的三位发现者，自1 9 7 7 年第一个导电聚合物聚乙炔( p a c ) 发现以 来，导电聚合物经过数十年的研究，被定义为经化学或电化学方法聚合的，以7 c 共 轭双健为主链的聚合物【1 4 1 。一般说来，物体可以分为四种形态：绝缘体、半导体、 导体和超导体，导电聚合物实现了从绝缘体到半导体、再到导体的变化，是所有 物质中能够完成这种形态变化跨度最大的，正是这些特性使导电聚合物具有了许 多优异的应用性能。 目前人们已经发现了多种聚合物，如聚乙炔( p a c ) 、聚吡咯( p r y ) 、聚噻吩 ( p t h ) 、聚苯胺( p 触町、聚对苯( p p p ) 、聚并苯( p a s ) 等经掺杂后电导率可达到半导 体甚至是金属导体的导电水平( 表1 1 ) 。导电聚合物具有质量轻、易成型和许多特 殊的电、光