（分析化学专业论文）基于阳离子共轭聚合物的核酸及单核苷酸多态性的均相检测.pdf

摘要 摘要 核酸及其单核苷酸多态性( s n p ) 的分析检测在当前生化研究和临床诊断等领域都 具有重要的意义。开发简便、快速、灵敏度高和特异性好的均相无标记的核酸和s n p 的 检测新方法具有广泛的应用前景。论文主要应用阳离子共轭聚合物，结合光散射、紫外 吸收光谱和分子荧光等检测技术研究开发了一系列均相无标记检测核酸和s n p 的新方 法，主要内容如下： 1 、建立了一种利用共振光散射技术，通过阳离子共轭聚合物与核酸d n a 作用后 散射强度的变化来均相、无标记检测d n a 杂交的方法。该方法是基于阳离子共轭聚合 物与核酸通过静电结合使共振光散射强度增加而建立的，目标d n a 链与探针杂交后的 双链较单链探针所产生的共振光散射强度大大增加，增强的共振光散射强度与目标d n a 在0 5 1 0n m o l l 浓度范围内成正比。该方法对目标d n a 链末端与探针之间存在一个 不匹配碱基的检测同样具有很好的选择性。 2 、基于d n a 诱导的聚噻吩衍生物( p m n t ) 构象变化，设计与突变型目标链相匹 配的引物探针，加入反转录酶r t a s em m l v 和d n t p ，在适当的条件下进行延伸反应， 突变型目标链的延伸产物就会形成双链，而野生型目标链的延伸产物依然是单链，根据 不同的延伸产物所引发的聚噻吩衍生物的紫外吸收光谱和溶液颜色的不同，建立了一种 基于阳离子共轭聚合物构象变化均相、无标记检测d n a 单核苷酸多态性( s n p ) 的新 方法，并且通过一步延伸反应在均相中同时检测s n p 分型，结合特异性降解杂合体 d n a r n a 中的r n a 的核酸内切酶r n a s eh 的降解反应，建立了均相、无标记r n a 的s n p 检测方法。 3 、基于d n a 诱导的聚噻吩构象变化，根据p m n t 在d n a p m n t 二聚体和 d n m i i 矾们m n t 三元复合物中构象和颜色的变化可方便地检测序列特异性的 m i r n a 。m i r n a 浓度在0 0 5 1 0g m o l l 范围内与吸收比率成线性关系。该法可用普通 的分光光度计甚至用肉眼可视法检测，这可以大大降低分析成本、提高分析的效率。同 时结合核酸内切酶r n a s eh 的降解反应，通过测定适量的r n a s eh 酶在一定的降解时 间内的吸收比率，建立了r n a s e h 酶活性的检测。 4 、利用阳离子共轭聚芴( p f p ) 的光学信号放大作用，结合引物延伸反应，建立了 摘要 高灵敏度、高选择性地检测m i r n a 的新方法。该方法以d n a 为模板，m i r n a 直接 作为引物，加入d n a 聚合酶和标记荧光素的d a t p 引发延伸反应，延伸产物与p f p 之间发生能量共振转移，大大增强了荧光素的荧光信号，实现高灵敏度地检测m i r n a 。 通过控制d n a 聚合酶的用量，实现了区别同一家族m i r n a 分子间单碱基的差别。 关键词阳离子共轭聚合物均相无标记 核酸检测单核苷酸多态性 h a b s t r a c t a b s t r a c t d e t e c t i o no fn u c l e i ca c i d sa n d s i n g l e - n u c l e o t i d ep o l y m o r p h i s m ( s n p ) i sv e r yi m p o r t a n t i nt h ef i e l do fb i o c h e m i c a lr e s e a r c ha n dc l i n i c a ld i a g n o s i s d e v e l o p i n gs i m p l e ，r a p i d ，h i g l l l y s e n s i t i v ea n ds p e c i f i cm e t h o d sf o rd e t e c t i n gn u c l e i ca c i d sa n ds n ph a v eg r e a tp o t e n t i a l a p p l i c a t i o n s ，e s p e c i a l l y , i nh o m o g e n e o u sa n dl a b e l f r e ef a s h i o n t h i sd i s s e r t a t i o np r e s e n t sa s e r i e so fs t u d i e sf o rh o m o g e n e o u sa n dl a b e l - f r e ed e t e c t i o no fn u c l e i ca c i d sa n ds n pw i t h c a t i o nc o n j u g a t e dp o l y m e r s ( c c p s ) b yu s i n gr e s o n a n c el i g h ts c a t t e r i n g ，s p e c t r o p h o t o m e t e r a n dm o l e c u l a rf l u o r e s c e n c e t h em a i nc o n t e n t sa r e 弱f o l l o w s ： 1 al a b e l f r e ed e t e c t i o nm e t h o df o rd n a h y b r i d i z a t i o ni nh o m o g e n e o u ss o l u t i o n 谢t l l c c pb yu s i n gal i g h ts c a t t e r i n gt e c h n i q u ew a se s t a b l i s h e d t h i sm e t h o di sb a s e do nt h e o b s e r v a t i o no fg r e a t l ye n h a n c e dl i g h ts c a t t e r i n gr e s u l t e df r o mt h eh y b r i d i z a t i o nb e t w e e nt h e s s d n ac o m b i n e dw i t hc c pa n di t sc o m p l e m e n t a r yd n a t a r g e t t h ee n h a n c e m e n to fl i g h t s c a t t e r i n gi sl i n e a r l yd e p e n d e do nt h ec o n c e n t r a t i o no f t h ed n at a r g e ti nt h er a n g eo f 0 5 1 0 n m o l l m o r e o v e r , i tw a sa l s of o u n dt h a tt h ee n h a n c e dl i g h ts c a t t e r i n gi n t e n s i t yh a sw e l l s e l e c t i v i t ya g a i n s to n e - b a s em i s m a t c ha tt h ed n ad u p l e xt e r m i n a l 2 b a s e do nt h ec o n f o r m a t i o n a lc h a n g e so fp o l y t h i o p h e n ed e r i v a t i v e ( p m n t ) r e s u l t e d f r o mt h ef o r m a t i o no fi n t e r p o l y e l e t r o l y t ec o m p l e xw i t hd n a s t r a n d s ，an o v e lm e t h o d o l o g y f o rs n pg e n o t y p i n ga s s a yo fd n aa n dr n a t a r g e t sh a sb e e nd e v e l o p e d w i t ht h ep r o p o s e d m e t h o d ，a l lt h r e ek i n d so fs n pg e n o t y p e sc a l lb ec o l o r i m e t r i c a l l yi d e n t i f i e dw i t ho n ep r i m e r e x t e n s i o nr e a c t i o ni nh o m o g e n e o u ss o l u t i o n t h i sp r o c e d u r ec o u l dp r o v i d es i m p l eo p e r a t i o n w i t h o u tr e q u i r e m e n to fa n ys e p a r a t i o ns t e p sa n di n e x p e n s i v ei n s t r u m e n t a t i o nf o rr e l i a b l ea n d r o b u s ts n pd e t e c t i o n 3 b a s e do nt h ec o n f o r m a t i o n a lc h a n g e so ft h ec o n j u g a t eb a c k b o n eo fp m n t , w eh a v e d e v e l o p e dar a p i da n dc o n v e n i e n tm e t h o df o rd e t e c t i o no fm i r n aa n dr n a s eha c t i v i t yi na l a b e l f r e ea n dh o m o g e n e o u sm a n n e r t h ec o n f o r m a t i o n a la n dc o l o r i m e t r i cc h a n g e so fp m n t i nt h ed n a p m n td u p l e xa n dd n a m i r n a p m n tt r i p l e xa r eu s e dt oc o n v e n i e n t l yd e t e c t t h es e q u e n c e s p e c i f i cm i r n a t h ea b s o r b a n c er a t i ol i n e a r l yd e p e n do nt h ec o n c e n t r a t i o no f t h em i r n ai nt h er a n g eo fo 0 5 1 0p m o l l t h i sa s s a yc a nb ea c c o m p l i s h e dw i t hc o m m o n s p e c t r o p h o t o m e t e r , e v e nw i t hv i s u a l i z a t i o nb y “n a k e de y e ”，w h i c hw o u l ds i g n i f i c a n t l yr e d u c e t h ea n a l y s i sc o s ta n di n c r e a s et h ea n a l y s i st h r o u g h p u t c o m b i n e dw i t ht h er n a s eht od i g e s t i i i a b s t r a c t t h em i r n ao ft h ed n a m i r n ah y b r i d s ac o l o r i m e t r i cm e t h o df o rr n a s eha c t i v i t yh a sa l s o b e e nd e v e l o p e d 4 c o m b i n i n gt h em i r n a - p r i m e de x t e n s i o n r e a c t i o na n dt h eo p t i c a la m p l i f i c a t i o no fc a t i o n i c c o n j u g a t e dp o l y m e r , t h es e n s i t i v e ，s e l e c t i v ea n dh o m o g e n e o u sm e t h o df o rm i r n a d e t e r m i n a t i o n h a sb e e nd e v e l o p e db a s e do nf l u o r e s c e n c er e s o n a n c ee n e r g yt r a n s f e r ( f r e dm e c h a n i s m b y c o n t r o l l i n gt h ea m o u n to fd n a 埘y m e r a s e t h ep r o p o s e dm e t h o dc a nd i s c r i m i n a t eo n e - b a s e d i f f e r e n c eb e t w e e nm i r n am o l e c u l e s 1 1 1 eh o m o g e n e o u sp l a t f o r mf o rm i r n aa s s a ye l i m i n a t e s t h eb s eo fl a b e l i n gp r o b e sa n dt h er e q u i r e m e n to fi s o l a t i o ns t e p s ，w h i c hg r e a t l ys i m p l i f i e st h e a s s a yp r o c e d u r ea n d r e s u r si nr a p i da n dl o w - c o s td e t e c t i o n k e yw o r d s c a t i o n i cc o n j u g a t e dp o l y m e r sh o m o g e n e o u sl a b e l f r e e n u c l e i ca c i d sd e t e c t i o n s i n g l e n u c l e o t i d ep o l y m o r p h i s m p h i s m i v 河北大学 学位论文独创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师指导下进行的研究工作 及取得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文 中不包含其他人已经发表或撰写的研究成果，也不包含为获得河北大学或其他教 育机构的学位或证书所使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何 贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了致谢。 作者签名： 貉毛。萄 日期：垮月日 学位论文使用授权声明 本人完全了解河北大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留 并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。 学校可以公布论文的全部或部分内容，可以采用影印、缩印或其他复制手段保存 论文： 本学位论文属于 1 、保密口，在年月日解密后适用本授权声明。 2 、不保密口。 ( 请在以上相应方格内打“，”) 保护知识产权声明 本人舯捌蝌学嘶臧的题嬲瓣绘器帮 的学位论文，是我个人在导师曙陪犀) 指导并与导师合作下取得的研究成果， 研究工作及取得的研究成果是在河北大学所提供的研究经费及导师的研究经费 资助下完成的。本人完全了解并严格遵守中华人民共和国为保护知识产权所制定 的各项法律、行政法规以及河北大学的相关规定。 本人声明如下：本论文的成果归河北大学所有，未经征得指导教师和河北大 学的书面同意和授权，本人保证不以任何形式公开和传播科研成果和科研工作内 容。如果违反本声明，本人愿意承担相应法律责任。 声明人：喜靼互扬一日期：互竺1 - 年月l 日 第1 牵引言 第1 章引言 1 1 选题背景与意义 核酸具有储存和传递遗传信息的作用，被称为“遗传大分子”，在生命活动中具有非 常重要的作用，同时也是分子生物学研究的重要内容之一【l 】。其含量的多少或结构的微 小变化都可能导致各种与基因相关疾病的发生 2 - 4 1 。人类基因组计划完成后，研究检测 特定序列核酸和基因突变，尤其是基因突变与人类重大疾病之间的关系显得越来越重要 4 - 7 。基因单核苷酸多态性( s i n g l en u c l e o t i d ep o l y m o r p h i s m ，s n p ) 是基因突变最常见的 形式，主要是指在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的d n a 序列多态性。它是 人类可遗传的变异中最常见的一种，占所有已知多态性的9 0 以上。不同个体之间约有 0 1 的d n a 序列差异，这些序列差异中的8 0 属于s n p ，决定了个体之间的不同。 s n p 在人类基因组中广泛存在，平均每5 0 0 1 0 0 0 个碱基对中就有1 个，估计其总数可 达3 0 0 万个甚至更多。在医学遗传学、药物遗传学、个体化医学、疾病遗传学、疾病诊 断学等研究领域具有重要的研究价值和应用前景。s n p 可以作为基因图谱的标志，它与 基因功能研究密切相关，可以满足对疾病相关基因定位研究的需要，尤其是对多基因遗 传病高精度基因定位，同时可以作为在基因水平上诊断重大疾病、研究不同个体之间药 物响应等的有力工具1 1 。因此，开发研究简便、快速、灵敏、选择性好，易于常规实 验室普及的核酸和s n p 的检测方法一直是生化分析工作者非常关注的课题。 m i c r o r n a ( m i r n a ) 是一种长度约1 9 2 5 个核苷酸的非编码单链小分子r n a ， 它们广泛存在于病毒、植物和高等哺乳动物的细胞中，在植物、动物和真菌中发现的 m i r n a 只在特定的组织和发育阶段表达，m i r n a 组织特异性和时序性，决定组织和细 胞的功能特异性。近年的研究发现，m i r n a 在动植物的发育、细胞生长分化和凋亡、 脂肪代谢等生命活动过程中发挥重要的调控作用【1 2 j 3 1 。m i r n a 突变或异位表达与多种 人类癌症相关，m i r n a 可以起到抑制肿瘤基因或癌基因的功能。研究表明，m i r n a 可 以抑制重要的肿瘤相关基因的表达，可能在癌症的诊断和治疗中起重要作用【1 4 】。例如： 癌症在发病早期很难被检测出来，也缺乏很好的治疗措施，如研究得到相关癌症特异性 m i r n a 表达图谱，有望成为诊断癌症的标志。研究m i r n a 对于深入探讨生命现象的本 河北人学理学博十学位论文 质，解释细胞行为和疾病发生机制，具有重要的理论意义，对于疾病的诊断、治疗和预 防具有潜在的实际应用价值。成熟的m i r n a 一般只有二十几个碱基，同族的m i r n a 之间通常只有一、两个碱基的差别，而且绝大部分m i r n a 在细胞内的表达水平比较低， 因此，深入研究m i r n a 的功能和调整作用急切需要快速、准确、选择性好和灵敏度高 的检测方法【l 5 1 。 近年来，水溶性阳离子共轭聚合物( c c p ) 在核酸分析中发挥了重要作用。主要是 因为d n a 链的主链带负电荷，利用聚合物的正电荷和d n a 的负电荷之间的静电吸引， 可以将聚合物和d n a 结合而不需要共价连接。其中包括通过底物诱导的聚合物构象变 化来检测目标分子，这种方法比较简单、直观，探针分子无需标记。还可以利用阳离子 共轭聚合物，通过荧光共振能量转移( f r e t ) 中对荧光信号强烈的放大作用有效的提 高检测的灵敏度。利用荧光共振能量转移( f r e t ) 进行均相d n a 分析方面具有以下优 点： c c p 提供了一个在均相溶液中分析d n a 的理想传感元件； c c p 具有庞大的共 轭结构和巨大的摩尔吸光系数，在f r e t 中对目标荧光信号产生强烈的放大作用； c c p 的正电荷与d n a 链的负电荷进行强烈的作用，大大增强了f r e t 的效率，同时降低了 荧光背景，由此使均相f r e t 分析的灵敏度大大提高。 1 2 核酸及s n p 的研究进展 迄今为止已报道了多种核酸和s n p 的分析技术和方法 1 6 - 1 8 】。按分析模式的不同可 分为固相和均相方式；依据不同的信号检测模式可以分为标记探针检测和无标记检测。 固相分析方式多应用玻璃载玻片、硅芯片、乳胶微球、磁珠或微孔板等作为固体支 持物，一般是先固定特异性基因探针，然后通过核酸杂交反应捕获目标核酸序列，目标 核酸序列可先进行标记后直接被检测，q i 等【1 9 】利用标记有链霉抗生物素的磁珠固定5 端标记有生物素的d n a 引物。使其连接成环，然后进行滚环扩增( r c a ) ，最后滚环扩 增的产物分别用标记有c y 3 和c y 5 的荧光探针检测，实现了等位基因的多元化测定。 l i 等【2 0 】利用微米级微球作为固体支持物固定d n a 捕获探针，被捕获的挂锁探针仅与完 全互补的目标d n a 杂交成环，进行滚环扩增，最后应用流体细胞仪检测与r c a 产物杂 交的荧光标记探针，可实现低至1 0a m o l 突变d n a 的分析检测。也可加入表达探针与 被捕获的目标核酸杂交形成三明治结构，根据表达探针的信号可实现对目标核酸的定性 或定量检测【2 1 2 2 1 。固相分析方式的主要优点是高通量、同时平行分析多个目标物、特异 2 第1 章引言 性好等。但是其缺点是需要设计和优化大量的基因探针而导致实验成本高、分析时间长； 试验过程中的多步杂交、分离、洗涤纯化等步骤使实验操作复杂、分析时间延长。 核酸或s n p 的均相检测方法主要有荧光偏振( f l u o r e s c e n c ep o l a r i z a t i o n ，f p ) 2 3 , 2 4 】 和荧光共振能量转移( f l u o r e s c e n c el e s o n a l l c ee n e r g yt r a n s f e r , f r e t ) 2 5 - 2 7 】。 荧光偏振是指当溶液的温度和粘度一定时，荧光偏振强度与其受激发时分子转动的 速率成反比，大分子物质旋转慢，发出的偏振荧光强；小分子物质旋转快，其偏振荧光 弱。核酸及s n p 研究中可以采用荧光偏振为基础的f p t d i ( f l u o r e s c e n c ep o l a r i z a t i o n t e m p l a t e d i r e c t e dd y e t e r m i n a t o ri n c o r p o r a t i o n ) 技术，实验过程中先通过p c r 获得包含有 s n p 位点的扩增产物，针对此序列设计一条寡核苷酸探针，在d n a 聚合酶和荧光标记 的d d n t p 存在下，进行探针的单碱基延伸，特定的d d n t p 将结合在s n p 位点上，自由 的荧光标记d d n t p 分子体积小，在液体环境中旋转速度快，受激发后的偏振光强度小， 而结合到d n a 链上的荧光标记的d d n t p ，受偏振光激发后偏振值高，因此可以进行高 通量单核苷酸多态性分型。b r a d l e y d 等【2 8 】就是利用这一原理区分给定的9 0 个样品中的 6 4 中基因。在s n p 检测中，f p t d i 法简便、可靠、条件溶液优化，该方法相对于其他 高通量基因检测技术具有很大的应用潜力，适合于临床上高通量的样品分析。s h e r i f l a t i f 等【2 9 】利用荧光偏振原理，通过监测荧光基团的偏振光强度，不用分离和净化，就可以检 测出荧光基团的分子质量的强烈变化，从而达到核酸检测的目的。荧光偏振是均相的， 可以实时检测( 动力学检测) ，对于浓度变化不敏感，但是荧光偏振的方法由于有较高 的背景，一般灵敏度低、选择性差。 基于荧光共振能量转移的t a q m a n 探针( 3 0 抛1 和分子信标【3 3 3 7 1 取得了较高的灵敏度 ( 一般检出限在n m o l l ) 。t a q m a n 探针是指p c r 扩增时在加入一对引物的同时加入 一个特异性的荧光探针，该探针为一寡核苷酸，两端分别标记一个报告荧光基团 和一个淬灭荧光基团。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收； p c r 扩增过程中，t a q 酶的5 一3 t 夕卜切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和 淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条d n a 链， 就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与p c r 产物形成完全同步。新型 t a q m a n m g b 探针使该技术既可进行基因定量分析，又可分析单核苷酸多态性 ( s n p ) 。n g u y e nd l 等( 3 2 j 建立两种t a q m a n 实时p c r 分析在l i g h t c y c l e r2 0p l a t f o r m 上定量c y p 2 d 6g c n 方法。 3 河北人学理学博十学位论文 分子信标( m o l e c u l a r b e a c o n ，m b ) ，如图1 1 所示，一种在其两端分别标记荧光基 团和猝灭基团的寡聚核苷酸探针，其茎环结构使荧光基团和猝灭基团靠近，光激发时， 由于f r e t 作用，发生荧光猝灭；当m b 探针与目标核酸分子杂交时，荧光基团和猝灭 基团被打开而使荧光发出。s t y a 西等【3 3 】利用这一原理实现了均相、高灵敏度的检测目 标分子中包含一个碱基不匹配或是少一个碱基，他们【3 4 】还利用分子信标技术，在不同的 目标分子中标记上不同的荧光基团，实现了同一种溶液中多种目标核酸分子的荧光探针 标记s n p 检测。 图1 1 分子信标检测原理图 均相分析方式在溶液中进行，可不经分离、洗涤等处理步骤而直接进行核酸和s n p 分析检测，实验操作简单、快速、检测灵敏度高，缩短了分析时间、降低了分析费用。 但t a q m a n 探针、分子信标需要在寡聚核苷酸探针的两端进行双标记，合成困难，使分 析s n p 的费用提高。 标记探针检测，包括同位素标记、荧光探针标记、电化学氧化还原标记【3 8 1 、纳米粒 子以及酶标记法【3 9 】等。n a l l u r 等【4 0 1 把引物固定在微阵列芯片上，利用放射性3 2 p 同位素 标记和c v 3 荧光标记，通过激光扫描微阵列芯片成像，对目标d n a 的检出限为4 8 0 f m o l l 。c h e n 等通过在p c r 产物上标记同位素1 3 c 1 5 n ，利用质谱准确的检测d n a 目 标分子，并实现了s n p 的检测【4 。 z h o n g 等t 4 2 1 5 1 j 用环形d n a 探针的滚环扩增，提出了一种检测细胞内d n a 单碱基 突变的方法。利用d n a 探针和目标d n a 杂交后进行滚环扩增反应。通过加入与扩增 产物互补的分别标记c y 3 和c y 5 的表达探针( d e c o r a t o r p r o b e ) ，利用荧光原位杂交技 4 第1 章引吉 术( f i s h ) 榆测结果。方法结合滚环扩增和核酸杂交反应，应用多色荧光成像实现了衅 倍体型人细胞内短序列d n a ( f i - ) c y 3 的多步f r e t ，结果在5 2 5 n m 年订5 7 4 n m 都产生荧光信号。通过 一步反应和检测，可准确得| 基因分型的结果。而且在紫外灯下，可以用肉眼直接观察 到分型的结果。 水溶性聚嚷吩衍生物由于其共轭骨架在外界环境影响下( 如温度、相反电荷底物 等) ，紫外吸收和溶液颜色可发生明显变化，因而浆噻吩的设计合成及其在生物传感方 h“nhi协舯 i b “o i ”o 潞1iiuh朗 l 0 n h u h i i 篙 一譬 河北大学理学博十学何论文 面的应用，成为人们研究的热点之一。2 0 0 2 年，加拿大l e c l e r c 1 2 7 】研究组报道了一种 无标记的d n a 检测法。以水溶性阳离子聚噻吩衍生物为探针，通过d n a 诱导的聚合 物构象变化机理，根据聚噻吩衍生物的溶液颜色变化和紫外吸收的不同，检测d n a 。 聚噻吩和带负电荷的d n a 分子通过静电相互作用形成配合物，诱导聚噻吩衍生物的骨 架共平面化，使分子链共轭增强，直观表现在聚合物的颜色发生明显变化，吸收红移。 以p o l y 3 一( 3 - n ，n ，n t r i e t h y - l a m i n o - 1 - p r o p y l o x y ) - 4 一m e t h y l 一2 ，5 - t h i o p h e n eh y d r o c h l o r i d e 】 ( p m n t ) 为例，如图1 1 3 所示，在水溶液中单独存在时，聚噻吩衍生物的最大吸收在 3 9 7 n m 处，溶液为黄色，这时聚噻吩分子呈非平面构象；当加入s s d n a 后，聚噻吩与 谚奄 $ ：i i m i t v a f l ye m r 舯d 锄孽l e 嘲哺，i d 鲥 阳懒h e 胁d p r o b e e善磐蓼 移 谚。 移 i 黪删锄蛳e i 户 移潮和移一谚f ? 0 l ee ：渤毋 翟 移移8 - 移 。 ! ： l 旁 馈瞄酣制 图1 1 3 聚噻吩与s s d n a 及d s d n a 的自组装示意图 s s d n a 通过静电相互作用形成复合物，s s d n a 诱使聚噻吩的有效共轭长度增加，聚合 物链平面化增强，这时聚噻吩呈红色，最大吸收红移到5 2 7 n m 处；当加入与探针s s d n a 配对的单链d n a 时，它们杂交形成螺旋结构，这时的聚噻吩衍生物共轭减弱，平面化 降低，最大吸收蓝移到4 2 1 n m ，溶液仍为黄色。并且根据不同的物质( 如匹配s s d n a 、 金属离子、蛋白质、凝血酶以及加入不同的卤离子等) 1 2 8 - 1 3 0 】，结合s s d n a 时致使其 结构发生变化，根据聚噻吩衍生物的紫外吸收变化和颜色的不同，实现了对不同目标物 的检测。n i l s s o n 等 i3 i 】将水溶性聚噻吩材料通过s p i n c o a t i n g 的方法固定在玻璃上，然后 通过微流芯片实现了对d n a 芯片级检测。i n g a n i s 1 3 2 】等利用两性聚噻吩衍生物 ( p o 、胛) ，实现了d n a 及单个碱基突变的检测。随后，l e c l e r c 研究小组又发展了一种 电化学方法检测d n a 1 3 3 】的方法，该法同样无需探针d n a 标记。检测原理如图1 1 4 所 示，以侧链带二茂铁的阳离子聚噻吩为信号转导体，将p n a 探针固定在模板上，聚噻 吩与p n a 不存在静电相互作用，检测不到电流信号，当加入匹配s s d n a 与之杂交后， 镑8毋8谚8够 书 奄黪 摩hn秣；。、。 ，移黪心 磐黔0 蠢 铲，：黟 第1 章引言 加入阳离子聚噻吩，通过静电相互作用形成复合物，可检测到强的电流信号：当加入的 是不匹配的s s d n a ，则检测不到明显的电流信号。该体系也可以实现单个碱基错配检测。 吨州嗍一嚣警 蔓羔羔兰羔 羔萎 重至鍪，一， 图1 1 4 电化学法检测d n a 的原理示意图 在核酸检测中，对r n a 的检测同样重要。w a n g 等【1 3 4 】提出了一种基于发光共轭聚合 物的荧光信号高倍增幅的r n a 检测方法。他们选用h i v - 1 的特异性序列t a rr n a 作 为靶基因，以荧光素标记的与艾滋病相关的多肽t a t c 木为探针，t a t 多肽是一个带部分 正电荷的肽段，因而荧光素与聚芴不能靠近，f r e t 效率很低。阳离子共轭聚合物作为光 能采集器进行实验，在阳离子共轭聚合物、t a t c 幸混合液中加入t a rr n a ，t a t c 母特异 性识别t a rr n a ，由于阳离子共轭聚合物与t a rr n a 的静电相互作用吸引，激发阳 离子共轭聚合物是能量转移到c 奉，c 枣发出增幅4 0 倍的荧光；反之，在阳离子共轭聚合 物、t a t c 木混合液中加入d t a rr n a ，或在阳离子共轭聚合物、非特异性识别s h 3 c 奉 混合液中加入t a rr n a ，则没有f r e t 发生，c 毒不发出荧光。该方法具有灵敏度高和 选择性好的特点。2 0 0 4 年l i u ”5 】等报到了一种荧光素( f 幸) 标记的r n a ( r n a f 掌) 作 探针，依赖共轭聚合物与r n a 静电相互作用的区别来检测基因r n a 的新方法【”6 1 。 综上所述，以上核酸和s n p 以及m i r n a 的分析方法在灵敏度、选择性和实验操作 等方面各有优缺点。研究表明水溶性阳离子共轭聚合物在核酸研究中显示出了很大的优 势。因此应用水溶性阳离子共轭聚合物有望建立快速、低成本、均相、无标记的核酸和 s n p 的分析方法。而m i r n a 尺寸小，设计杂交探针困难，结合底物诱导阳离子共轭聚 合物构象变化的性质，有望实现均相、无标记m i r n a 的检测；m i r n a 家族相似性强， 1 9 童 尹静 一 雳荔辱o _ 一 鼙一 河北大学理学博十学位论文 区分困难，结合引物延伸反应，利用阳离子共轭聚合物与荧光素之间的能量共振转移使 荧光信号倍增的优势，有望实现高灵敏、高选择性的检测m i r n a 。 1 5 论文主要研究内容 本课题拟利用阳离子共轭聚合物( c c p ) 在检测核酸方面的显著优势，结合光散射、 紫外吸收和分子荧光检测，探索研究均相、无标记检测核酸和s n p 及高灵敏、高选择 性检测m i r n a 的新方法。 1 、根据水溶性阳离子共轭聚合物的性质，在水溶液中与带负电荷核酸d n a 可以通 过静电作用相互结合。，比较单链d n a 探针和与探针匹配的目标d n a 杂交后形成的双 链d n a 与阳离子共轭聚合物结合后所产生的共振光散射强度的不同，对目标d n a 进 行定量研究和末端有一个错配碱基的研究。 2 、基于d n a 诱导的聚噻吩衍生物( p m n t ) 构象变化机理，以突变型和野生型目 标链为模板，加入与突变型目标链相匹配的引物探针，在聚合酶作用下进行引物延伸反 应，比较突变型和野生型目标链所产生的不同延伸产物引起的聚噻吩衍生物的紫外吸收 光谱和颜色的差异，进行d n a 的s n p 分析；通过加入特异性的核酸内切酶，比较突变 型和野生型r n a 目标链产生的延伸产物引起的聚噻吩衍生物的紫外吸收光谱和颜色的 差异，进行r n a 的s n p 分析。 3 、基于d n a 诱导的聚噻吩衍生物( p m n t ) 构象变化机理，结合特异性的核酸内 切酶r n a s eh 的降解反应，比较p m n t 在d n a p m n t - - 聚体和d n m i r n p m n t 三元 复合物中颜色的变化和紫外吸收光谱的不同，进行m i r n a 的研究。通过比较适量的 r n a s eh 酶在一定的消化时间内的紫外吸收光谱，进行r n a s eh 酶活性的研究。 4 、以m i r n a 直接作为引物，设计合适的d n a 探针模板，加入聚合酶和标记荧光 素的d a t p ，在最佳条件下引发延伸反应，利用阳离子共轭聚芴( p f p ) 与延伸产物中 荧光素之间的荧光共振能量转移使其荧光信号的倍增效果，进行高灵敏度检测m i r n a 的研究。通过控制d n a 聚合酶的用量，研究同一家族m i r n a 分子间的单碱基差别。 第2 章摹丁阳离子共轭聚合物光散射均相检测d n a 杂交 第2 章基于阳离子共轭聚合物光散射均相检测d n a 杂交 2 1 本章引言 在诊断和治疗遗传疾病中，核酸和单核苷酸多态性( s n p ) 的检测是至关重要的。 检测方法一般是依靠杂交反应，目前已报道了多种d n a 杂交检测方法，然而，这些方 法大都是通过电泳分离或是将寡核苷酸探针固定在固相表面，需要多步杂交和多个洗涤 步骤。为提高检测效率，科研工作者提出了几种均相溶液中基于荧光分析的d n a 杂交 检测方法，如荧光偏振、荧光共振能量转移，然而由于荧光背景高使得这些方法的检测 限都较低。 近来，基于荧光共振能量转移( f r e t ) ，水溶性阳离子共轭聚合物( c c p ) 被广泛 用于均相溶液中d n a 杂交的检测【”7 】。在水溶液中，c c p 和d n a 链可以通过静电作用 相结合。而且，共轭聚合物包含有大量的吸收单元，并且可以将能量沿整个c c p 骨架 传递给受体，强烈的放大标记荧光探针的荧光信号【1 2 5 1 。 本文中，我们报道了一种利用共振光散射，通过阳离子共轭聚合物均相、无标记检 测d n a 杂交的方法。该方法是基于单链d n a 和互补的目标链d n a 杂交后与c c p 通 过静电结合使共振光散射增强，增强的共振光散射强度与目标d n a 浓度在0 5 1 0 n m o l l 范围内成正比。并且，我们发现该方法对双链d n a 末端存在一个不匹配碱基的 检测有很好的选择性，为均相、低成本检测单核苷酸多态性( s n p ) 的研究提供了参考 0 3 8 o 2 2 实验部分 2 2 1 仪器与试剂 日立f - - 4 5 0 0 型荧光分光光度计( 日本) 用来测定散射强度和散射光谱；b i o m e t r a t l t h e r m o c y c l e r 热循环仪( 德国) 用来控制杂交反应的温度；w h 8 6 1 漩涡混匀器( 江苏太 仓) 用来混匀溶液。 阳离子共轭聚芴p f p 参照文献【1 1 6 1 合成，所有合成的d n a 序列和四种脱氧核苷三磷 酸的混合物( d n t p s ) 购自宝生物科技有限公司( 大连，中国) 。所用d n a 序列如下： 寡核苷酸探针( p r o b e ) ：5 g t gc c tg t cc x gg g a g a g a c c 3 ： 野生目标链( t a r g e td n a ) ：5 ，g g tc t c t c cc a gg a c a g g c a c 3 2 1 河北人学理学博十学何论文 突变e l 标链( m u t a t i o nd n a ) ：5 - a _ g tc t c t c cc a g g a ca g gc a c 3 下划线和粗体标记的碱基为突变点。突变型d n a ( m u t a n td n a ，m u t d n a ) 和野生型 d n a ( w i l dd n a ，w t d n a ) 都是选自人p 5 3 基因片段( e x o n 8 ) 。所有寡聚核苷酸都是经过 p a g e 纯化。十六烷基三甲基溴化铵( c t a b ) 购于北京化工厂。所有溶液都是由灭菌 的二次去离子水配制，其他试剂均为分析纯。 2 2 2 杂交反应 在杂交反应中，于1 5m l 的离心管加入lm l 的杂交混合溶液，其中包括缓冲溶液 6 0m m 磷酸盐( p b s ) 缓冲溶液( 其中氯化钠的浓度是6 0m m o l l ，磷酸缓冲的浓度是 1 0m m o l l ，p h 为7 2 ) ，寡核苷酸探针p r o b e 的浓度是1 0n m o l ，一定量的野生目标 d n a 链或突变目标d n a 链( 1 0n m o l l ) ，混合均匀后7 0 加热变性5 分钟，室温冷 却1 5 分钟杂交。 2 2 3 测量过程 杂交反应完成后，在溶液中依次加入1 5 此c t a b ( 1 0 x 1 0 。3t o o l l ) 和2 0u lp f p ( 1 x 1 0 8m o l l ) ，混匀后，用l x lc m 2 的石英玻璃池在f - 4 5 0 0 型荧光分光光度计上进行光 谱测量对混合溶液在波长范围为2 0 0n n l 7 0 0n n l 内进行激发波与发射波的同步扫描，光散 射强度在波长3 1 0h i 1 下测定。 2 3 结果与讨论 2 3 1 光散射的光谱特性 按共振光散射理论，产生强烈共振光散射的条件是形成具有大的离域7 【键体系和超 分子结构的大的分子聚集体 1 3 9 ，1 钧j 。p f p 作为水溶性阳离子共轭聚合物，具有较大的共 轭7 【键体系，但由于在溶液中呈现任意卷曲的构象，共平面性低，尢键的离域共轭减弱， 只产生了较弱的共振光散射信号，如图2 1a 。当p f p 与单链d n a ( s s d n a ) 由于强烈 的静电