（分析化学专业论文）微流控芯片毛细管电泳连续试样引入技术的研究.pdf

摘要 关键词微流控玻璃芯片；毛细管电泳；试样引入接口；电驱动；流通式；取样 探针；一体化探针；梯度电泳分离：氨基酸分离 浙江大学博士学位论文 摘要 a b s t r a c t i nr e c e n ty e a f s ，m i c r o n u i d i cc h i p - b a s e dm i c r o a n a l y t i c a ls y s t e m sh a v ee m e r g e d a sam a i na r e ao fd e v e l o p m e n ti ni h ef i e l do fm i c r ot o t a la n a l y s i ss y s t e m sc “1 1 a s ) o r l a b c h i p s ，t h eu l t i m a t eo b j e c t i v eo fw h i c h i st oi n t e 伊a t ea nm a i n 卸a l y t i c a lf u n c t i o n s ， i n c l u d i n gs a m p l e抽t r o d u c t i o n ，p r e t r e a t 1 e n t ， r e a c t i o n ， s e p a r a t i o n a n dd e t e c t i o n 叩e r a t i o n so nas i n 9 1 ec h i p o j e n y ，p a n i c u l a r 血t e r e t sa r ef o c u s e d0 na c h i e v i n g a u t o m a t e dc o n t i n u o u si i l t r o d u c t i o no fas e r i e so fs a m p l e st om e e tt h er e q u i r e m e n t sf o r a 1 1 a l y s i so fr e a lw o r l ds a m p l e s e f f i c i e n ti n f e r f h c i n gb e t w e e nt h em i c r o c h i pa n dt h e o u t s i d ew o r l di s n s i d e r e da sam a j o rc h a l l e n g e t h ep r e s e n tw o r ki sf o c u s e do n d e v e l o p i n ge l e c t r o k i n e t i cc o n t i n u o u ss a m p l ei n i r o d u c t i o ns y s t e m sf o rm i c r o n u j d i c c h i p b a s e dc a p i l l a r ye l e c t r o p h o r e s i s 1 n c h a p t e r1 ，s a m p l ei n t r o d u c t i o nt e c h n i q u e sf o r i i l i c i o n u i d i cc h i p b a s e d c a p i l l a r ye l e c t m p h o r e s i s a r ef e v i e w e d ， i n c l u d i n gt e c h n i q u e sj 1 v 0 1 v i n go n c h i p f a b r i c a t e dr e s e o i r s ，f l o w t l l r o u g hs a 瑚p l i n gr e s e o i i 嚣a n ds a m p l i i 堰p r o b e s i n c h a p i e r2 ， ac o n t i n o u ss a n l p l ei n 怕d u c t i o ns y s t e m d e v e l o p e df o rm i c r o n u i d i c c h i p _ b a s e dc a p i l l a r ye l e c t m p h o r e s i si sd e s c r i b e d t b es y s t e me m p l o y e daf l o w - t h ，口勋m z 一再日缈括跏蛔船2 d d 2 ，n a m ，j a p a i l ：u w e r a c a d 锄i cp u b l i s h e r s ，2 0 0 眨，6 8 5 6 8 7 【13】徐章润，王世立，樊晓峰，王福仁，方肇伦劳芴纪钱2003，3l：15271530 1 4 】z h a i l gb kf 0 r e t f ，勋r g e r b l 爿m ec 绷，2 0 0 1 ，7 3 ：2 6 7 5 之6 8 1 1 5 】c h e g gj 爿，1 4 0 岱2 0 0 4 ，1 2 9 ：5 0 7 6 1 1 【16】wang j ，s i a r l g p r o hw ；7 i h o n g n 砌d e es ，c h a n a p a k u l 0 i 瑗与a 罄a 5 ；堤蓑萎羟；知f 矗! 主董霎曼l摇毳荤蛩戌警鎏蠢搿鞲攫骥蔷 h “ec o n 如u o u s s a m p l ei n t r o d u 甜0 nf u n c t i o n sb ym o d i f y i n g high v o l t 8 9 cs u p p l y0 u l p u td e si g n t h eo p e r a t i n gc o n d n i o n s f o rs a m p l e introduction s y s t e m w e r e 叩t i m i z e da ndt h ep e r f o 珊a n c eo f 出es y s t e m w a sd e m o n s t r a t e di nt h e separation a n d d e t e n n i i l a t i o n o f c y 5 一l a b l e da m i n o a c i d s c h a p t e r3d e s c r i b e sa 1 1 automated a n d n t i n u o u s s a m p l ei 1 1 t r o d u c t i o ns y s t e m d e v e l 叩e df o r c h i p b a s e d c es y s t e m s ，f c atu血gail e f e i d e n t w o d d - t o - c h i pi n t e r f a c ep r o d u c e db yh o r i z o n t a l i yc o n n e c t in ga zshaped f h s e ds i l i c a c a p i l l a r ys a m p l i n g p r o b e ! ! j ! 一 c b a p i e r4p r e s e n t s as i m p l et e c h n i q u ef o rf a b r i c a t i o no f0 n c h i ps a m p l i n gp r o b e sw i t ha m i n i m a n 砸d a m e t e t0 f3 0 0 岬f o r 出a s sc h i p s m i c r o f l u i d i cc h i p sw “ho n 。c h i pp m b e s f 曲r i c a t e d b yt h i sa p p r o a c hc o u p l e dw i c ht h es l o t i e dv 湖a r r a ys a m p l ep r e s e n i 撕彻s y s c e mw e r ea p p l i e d t o p e 渤n t lc o n t i n u o u ss a m p l ei n d u c t i o n n i ss y s t e mw a s “s ou s e d s u c c e s s f u l l yt op e r f o r r nc e s e p a f a t i o n si n v 0 1 v i n gg r a d i e n tv a r i a t i o n so f m u l t iw o r k i n ge l e c 【r 0 1 y t e sd u t i d ge a c hs e p a r a n o n 九】n 0 n c h i ph o r i z o n t a lt u b u l a rr e s e o i r sc o n t a i n i l l gw o 埘n ge l e c t r o l y t ea 1 1 dw a s t e sw e r e u s e dt om a i n t a i ns t a b l eh y d r o s i a t i cp r e s s u r ei nt h ec h i pc h 釉e l sd u r i n gp r o l o n g e d w o r l 【i n gp e r j o d s t h es a m p l i n gs y s t 锄c o n s u m e do n l ya b o u t3 0n l f o re a c hs a m p l e k e y w o r d s ：m i c r o f l u d i c 甜a s sc h i p ；c a p i l l a r ye l e c t r o p h o r e s i s ；s 锄p l ei n t r o d u c t i o n i n t e r f a c e ；e l e c t r o k i n e t i c ；f l o w t h r o u g hs a 唧1 i n gi t r o d u c t | 0 n ；c a p i l l a r ys a m p l i n gp m b e ； o n c h i ps a 唧l i n gp r o b e ；g r a d i e n tc es e p a r a d o n ；s e p a r a t i o no fa m 抽oa d d s 浙江大学博士学位论文 第一章绪论 第一章绪论 本章综述了目前微流控芯片毛细管电泳分析系统中的试样引入技术的进 展，分别介绍了固定贮液池式、流通池式和取样探针式三种试样引入技术。 1 1 前言 基于微流控学( m i c f o f i u i d i c s ) 的微全分析系统( 麟) ，尤其是芯片毛细 管电泳( m i c m c h i p - b a s e dc e ) 分离分析系统在近几年中发展迅猛，已成为 1 1 _ a s 的发展重点【l “。在芯片上进行毛细管电泳分析可以显著地提高分析速度和分离 效率、降低试样及试剂的消耗量【4 吲。同时借助于m e m s 技术，可以在基片上加 工出多个阵列的分析单元，实现高通量的分离分析，甚至还可以加工出各种功 能部件，集合成以电泳分离为中心的微型化、集成化和自动化的微全分析系统 【6 以州。微流控分析系统的通道内部进行的是皮升至纳升级液体的操控，而在其涉 及的分析对象和试样储存系统中，试样量通常以微升或毫升计。如何实现这种 宏观系统与微观系统的衔接，是微流控分析系统试样引入技术研究的主要目标， 目前在该领域内的研究己引起特别的关注。自从2 0 0 1 年开始，历届国际们a s 会议均增设了外界与芯片接口( w o r l d t o c b j pi n t e 嘞c i l l g ) 的交流专题。 1 2 微流控毛细管电泳分离的试样引入技术研究的概况 在目前文献报道的微流控芯片电泳分离系统中，按试样引入装置的结构不 同，试样引入系统主要可分为固定贮液池式、流通池式、取样探针式三类。衡 量芯片上试样引入系统性能的指标包括换样时间、换样所需试样量、换样是否 干扰芯片上正常的分离分析操作、及换样和芯片分析系统工作的稳定性等。以 下将详细介绍微流控芯片毛细管电泳系统中采用的上述试样引入方法。 1 2 1 基于固定贮液池式的试样引入系统 基于固定贮液池式的试样引入系统是目前芯片毛细管电泳系统以及各种微 流控系统中采用最多的系统。其系统容易加工，进行单一试样分析时操作简单， 属于间歇式换样。图1 1 为典型的带有固定贮液池的十字通道毛细管电泳芯片 浙江大学博士学位论文 第一章绪论 结构示意图。系统包括垂直交叉的两条通道( 即充样通道s a m p l el o a d i n gc h a n n e l ， s l c 和分离通道s e p a r a t i o nc h a n n e l ，s c ) 和四个液池( 即试样池s 锄p l er e s e r v o i r 、 试样废液池s a m p l ew a s t er e s e r v o i r 、缓冲液池b u f f e rr e s e r v o i r 和缓冲液废液池 w a s t er e s e n r o i r ) 。该系统在进行单一试样分离操作时，只需通过控制和切换各个 液池中的施加电压即可以实现单一试样的充样和进样分离操作。如需进行多试 样分析时，则涉及到固定试样池内试样的更换问题。即在芯片试样池中的一个 试样测定完成后，中断分析过程，更换液池中的试样，然后再开始新试样的分 析【1 2 。4 1 。通常上述换样操作较为繁琐费时。以激光诱导荧光检测芯片毛细管电 泳系统为例，通常完成一次换样操作的过程是：首先，切断供毛细管电泳分离 的工作电压；移出各液池中电极，清洗电极和试样贮液池数次；然后再加入新 试样溶液；插入电极；调整光源位置以使激光斑点重新聚焦于通道上；再接通 工作电压恢复工作；总共需十几步完成一次换样操作。目前这些操作多采用手 工方法进行，步骤繁琐费时，效率低，使得换样的时间常远超过分析时间。在 换样阶段需中断试样的分析操作，除了降低系统的分析速度外还影响系统的稳 定性和重现性。 图1 1 带有固定贮液池的十字通道毛细管电泳芯片结构示意图 1 、试样池；2 、分离缓冲液池；3 、试样废液池：4 、缓冲液废液池；e p ，刻蚀片；b p ，基 片；s c ，分离通道：s l c ，充样通道。 、细d e nb e r g 等【1 5 】报道了一种用于微流控芯片上换样的“机器人”式自动换 样系统，系统结构如图1 2 所示。该自动化的换样系统，虽然实现了操作的自动 化，但操作步骤模仿手工操作过程，在换样原理上并无改进，换样效率依然不 高，一般仍需1 0 m i n 左右。 浙江大学博士学位论文 第一章绪论 图1 2 “机器人式自动试样引入系统【1 5 】 此外，为提高进行不同试样分析时的试样通量和分析速度，还可采用在一块 芯片上加工多个分析单元，测定时一次性引入多个试样，每个单元分析一个试 样的策略。如m a t h i e s 研究组在9 7 年设计制作了采用固定试样池的1 2 通道阵列 毛细管电泳芯片【1 6 】。该芯片的阵列通道网络结构如图1 3 ( a ) 所示。每一条分 离通道( b ) 各配有独立的充样通道a 、接地液池2 、试样池3 和试样废液池1 ， 分离通道下部以每9 0 “m 一条的间距平行排列，十二条通道组成一个总宽为1 1 m m 的通道阵列，并与接高压的阳极共用池4 相联。为在有限的面积中容纳3 6 个( 3 n ，n 为独立分离通道数) 独立的储液池，每一条通道在上部的不同位置弯 折9 0 。，向横向方向延伸，十二通道阵列的上部分布成为一个伞形结构。最外侧 两条不带进样通道的c 通道是激光荧光检测系统的定位通道。玻璃芯片的总面 积为5 0 7 5m m 。将制成的芯片安装在光学平台上，使共焦荧光检测系统的激发 光聚焦在d 处，通过计算机控制，使芯片在水平方向上往复扫描、检测。用该 毛细管阵列芯片对p b r 3 2 2 i 印id n a 标准品进行电泳分离试验，平行1 2 个试 样的分离在1 6 0 秒内完成，分析速率达到1 3 秒，样。 此后，m a t h i e s 小组进步设计发展了4 8 f 1 7 】、9 6 【18 1 、3 8 4 【1 9 1 通道的阵列毛细 管电泳芯片。图1 3 ( b ) 为9 6 通道阵列的毛细管电泳芯片结构示意图。该圆形 阵列通道芯片的基本结构单元由一对的分离通道和四个液池所组成，每条分离 通道各单独占有一个试样池，而试样废液池和阴极缓冲液池为一对通道所共用 浙江大学博士学位论文 3 第一章绪论 ( 因此9 6 通道的总液池数减少到1 9 3 ，即2 n + 1 ) 。单元内的四个液池排列在圆 形芯片的边缘，以充分利用芯片外缘的较大空间。在圆心处，9 6 条通道会聚到 一个2m m 直径的共用阳极缓冲池。为解决众多通道手工加，换样的时耗问题， m a t l l i e s 研究小组还专门设计了一个9 6 道的自动加样装置，与圆形阵列通道芯 片、旋转扫描共焦激光荧光检测装置一起组成了一套分析速度更快、试样通量 更高的阵列通道芯片毛细管电泳分析系统。用p b r 3 2 刎印id n a 标准品考察该 系统时，在1 7 0 秒内完成9 6 个样品的分离分析，分析速度达到1 8 秒样。接着， m a t h i e s 研究组在2 0 0m m 圆盘玻璃芯片上集成了3 8 4 条阵列通道( 图1 4 所示) ， 用于高通量基因分析【1 9 1 ，是当前集成程度最高的芯片c e 系统。用此芯片分析系 统对3 8 4 名测试对象同时进行基因型测定，检测人类捌晒基因中与常见血色病 关联的h 6 3 d 变异，仅需3 2 5s 。所建立的超高通量基因分析每一测定耗时平均 不足1s 。 以上方法尽管可实现高通量的分离分析，但是装样数量受芯片尺寸的限制， 装样速度慢，而且也难以应用于在线过程监测中。 oo 7 j t # 芏 型型：i f i l 【i r _ ( a ) ? j ( b ) 图1 3 多道阵列微流控毛细管电泳芯片的通道网络结构示意图【1 6 1 q ( a ) 伞形1 2 道阵列毛细管电泳芯片；( b ) 圆盘形9 6 道阵列毛细管电泳芯片。a ，充样通 道；b ，分离通道；c ，光对准通道；d ，检测窗口；，试样废液池；，接地池； 试样池；，高压阳极池。 浙江大学博士学位论文 4 第一章绪论 ( b ) s 2 s l s 3 s 图1 43 8 4 道阵列微流控毛细管电泳芯片的通道网络结构示意图【1 9 】 ( a ) 3 8 4 道阵列微流控毛细管电泳芯片结构示意图；( b ) 单一分析单元扩展图：( c ) 所有 通道共用位于芯片边沿的阴极贮液池。s ，一s 。为单一贮液池。 1 9 9 9 年，安捷伦公司推出的2 1 0 0 芯片生化分析仪( a g i l e n tb i o a n a l y z e r2 1 0 0 ) 中，使用了一次性使用( “用后即弃”) 的1 2 通道毛细管电泳芯片f 刎。如图1 5 所示，在一个芯片上加工了1 2 个固定试样池，共用一个分离通道，测定前一次 性手工加入1 2 个试样，测定时通过各通道间液流的切换在芯片上实现换样，而 不需由外界再引入试样。一次分析任务完成后，芯片即被废弃。此类试样引入 方法虽然可行，只是在目前芯片( 如玻璃或石英基质芯片) 加工成本较高的情 况下，采用一次性使用芯片的方法存在较大的局限性。 图1 5c a l i p e r1 2 试样池玻璃毛细管电泳芯片口m 浙江大学博士学位论文 5 p 0 一r 一高 第一章绪论 1 2 2 基于流通式试样池的试样引入系统 目前文献报道的大多数微流控分析系统虽多具有多次重复测定的能力，然 而其报道的自动连续测定结果大多为同一试样的连续测定，较少进行不同试样 的连续测定及实时的在线过程监测。究其原因，在于系统大多缺乏高效率的换 样方法。这一薄弱环节，成为制约微流控分析技术实用化的瓶颈之一，使得芯 片分析速度快的主要优势难以在实际应用中得到充分的发挥。因此，研制芯片 上的连续试样引入技术已成为当前微流控分析的重点解决问题之一【2 ”。 1 9 9 9 年，方群等首先在简易h 芯片实现了连续试样引入 2 2 】。系统结构如图 1 6 所示。采用了流通式换样法，通过增加芯片上试样引入通道与分离分析通道 横截面积比的方法，消除或降低了试样引入时产生的压力流对电泳分析的干扰 效应。在该系统中，试样引入通道与分离分析通道横截面积比超过4 0 0 。采用顺 序注射泵提供换样动力，即使换样液流以4 m 【m i n 的流速流动，亦不会对分离 通道内的进样和分离操作产生影响，两者可同时进行。此后，该研究小组分别 建立了连续试样引入与h 芯片毛细管电泳安培检测【2 3 】、化学发光检测【2 4 l 、电致 化学发光检测i ”】等多种分析系统。 c 瞎 a p n ww 图1 6 流通式h 芯片分析系统示意图f 2 l x ，通道封闭；m ，m i c r o l i n e 导管；a ，不锈钢管电极；g ，环氧树脂；p ，泵管；w ，废 液；b ，玻璃基片；c t ，石英毛细管；p t ，铂电极；c ，s ，载液或试样。 浙江大学博士学位论文 x 畦 a 崎 o p 第一章绪论 与采用固定试样池的传统芯片系统不同，在采用流通池式试样引入系统的 芯片中，需加工专门用于试样引入的通道( s a m p l ei n t r o d u c t i o nc h 8 n n e l ，s i c ) ， 该通道与芯片上的分析通道( 如毛细管电泳芯片中的充样通道和分离通道) 相 连通。在进行试样引入操作时，外部试样溶液通过导管首先被引入到试样引入 通道，再由此进入分析通道。 芯片的常见构型有图1 7 所示的两种基本构型，一种是试样引入通道( s i c ) 直接与充样通道( s l c ) 相连( 图1 7 a ) ，外界试样引入试样引入通道后，通常 采用简单迸样或夹流进样【2 6 】的方式进入充样通道，然后进行电泳分离；另外一 种构型是试样引入通道直接与分离通道( s c ) 的上游相连( 图1 7 b ) ，外界试样 引入试样引入通道后，采用门式进样f 2 q 的方式经分离通道的上游进入充样通道， 然后进行电泳分离。 s w r ( a )( b ) 图1 7 流通式试样引入芯片基本构型示意图 s l 试样入口；s o ，试样出口；s i c ，试样引入通道：s c ，分离通道：s l c ，充样通道 b r ，缓冲液池；s w r ，试样废液池；w r ：缓冲液废液池。 a t t i y a 等1 2 刀报道了用于毛细管电泳芯片上的自动试样引入装置。芯片结构和 换样操作程序如图1 8 所示。在该设计中，同样采用大内径试样引入通道的方法， 消除试样引入操作对芯片上操作的干扰。芯片的试样引入通道深3 0 0 岬，宽1 m m ，分析通道深1 0 1 3 岬，宽3 6 2 7 5h m 。前者通道内的体积流阻比后者低 o 5 4 4 1 1 0 6 倍。试样引入流速可高至1m j n ，而不会干扰芯片的分析分离操 作，因此系统可实现连续换样。以f i t c 标记的精氨酸和苯丙氨酸为研究对象， 浙江大学博士学位论文7 第一章绪论 考察了系统的分析特性。换样时消耗6 斗l 试样。该系统存在的问题是试样引入 通道实现换样后，采用简单进样方式，再将芯片充样通道内残留的试样更换为 新试样时( 通常需2 0s ) ，存在试样向分离通道的渗漏效应。因而系统在每次换 样后的第一个进样分离结果( 分离时间4 0 7 0s ) 难以利用。 f = = = ( d 缓冲液废液午 萎搿刊器商嚣 出。晦曼粕 固缈+ 翟司靴液 i ! ! i f 甚e 罩。试样废液 出。汨正粕 r 怍= = ：o 缓冲渍疰液 毒熟 涟大气若! 宁岛进口 d 图1 8 a t t i y a 等报道的流通式试样引入系统芯片结构示意图 换样操作程序：a ，将三通阀转向，使试样引入通道( s i c ) 与大气相通，在通道4 ，5 之间施 如3k v 电压，在分离通道内进行试样( p h e f r r c ) 的分离；b ，三通阀转向真空通道，吸 出s i c 中的p h e - 町c 溶液，同时利用6 l 的下一试样a 瑁f 溶液清洗s i c ；c ，再次 吸入6 旺的a r g f 1 t c 溶液进入s i c 后，三通阀转向，使s i c 与大气相通，清洗与吸入新 样的过程需要3s i 在通道l ，3 之间施加3l c v 电压，利用a r g _ 硼陀溶液清洗更换注样通 道；d ，在通道4 ，5 之间施加- 3 k v 电压，进行试样( 姆町c ) 的分离。 浙江大学博士学位论文8 第一章绪论 a u s s e r e r 等【2 8 】报道了可进行9 6 个d n a 片段试样分离分析的全自动微流控 芯片分析系统。该系统具有自动换样功能，试样引入系统集成于芯片，由真空 负压提供换样动力。图1 9 为具有连续换样功能的d n a 毛细管电泳芯片及其通 道结构示意图。2 5c m 长、5 0u m 内径石英毛细管作为取样导管，垂直连接于芯 片上。该系统一方面采用双通道深度设计、高通道截面比的方法，解决芯片上 试样引入和电泳分离系统的衔接问题；同时，电泳通道内充满粘稠的筛分介质， 使得通道内流阻较大。由于以上两因素的影响，系统工作时试样在引入通道内 的快速流动，不会在电泳通道内产生明显的压力流。芯片系统的基本操作分三 阶段进行，首先进行试样引入操作，待试样充满引入通道后，加电压进行电泳 通道的充样操作，而后换电压进样，进行电泳分离操作。芯片为石英基质，具 有重复使用能力，使用寿命超过1 0 0 0 次。系统对每个试样的分析时间3 0 5 5s ， 换样量约1 0 0n l 。芯片系统配有可定位移动的9 6 孑l 试样板，计算机控制* y z 三维移动试样板，可实现全自动化换样操作。 1 2 3 4 ( a ) 接口 8 7 6 5 ( b ) 图1 9 a m s s e r c r 等报道的自动试样引入d n a 分离毛细管电泳芯片【2 8 】 ( a ) 通道结构示意图；( b ) d n a 分离毛细管电泳芯片。池1 与真空泵连接；电极插入3 4 ，5 ，6 和8 池。 浙江大学博士学位论文 第一章绪论 l i n 等1 2 9 】设计了用于芯片毛细管电泳的流通试样引入系统。芯片通道构型及 操作程序如图1 1 0 和1 1 1 所示。在通道的设计上，试样引入通道宽3m m ，电 泳分析通道宽7 5m 。采用门式进样法，其优点是在分离过程中，依然可保持试 样在试样引入通道和充样通道内的连续流动，因此换样操作和分离操作可同时 进行。系统用于荧光染料混合物的分离。采用连续和间歇两种试样引入方式， 前者保持恒定的试样流速，由注射泵提供动力，流速5 7 m i n 。后者采用注样 阀( 6 0n l ) 注样，可实现连续换样。连续测定系统的保留时间和峰高重现性， r s d 分别为0 6 和8 。但是，该系统进行换样操作时，因储液池中液位高度 变化的影响，系统连续工作时间约2 0m i 。而后，该研究小组在上述技术基础 上将该系统应用于蛋白质分析中【3 0 】。 图1 1 0 n 等报道的流通试样引入系统芯片通道结构o q a ，试样入口：b ，试样出口；c ，该实验中没有使用；s c ，试样引入通道；d ，试样废液 池：e ，缓冲液池( 门控高电压端) ；f ，废液池。 浙扛大学博士学位论文1 0 第一章绪论 出 出口 ( a ) ( c )( d ) 图1 1 1 n 等报道的流通试样引入系统操作程序口9 1 系统工作过程：( a ) 试样流在泵推动下，由入口a 进入试样引入通道；( b ) 试样流在通道 内分流，太部由出口b 流出，小部进入电泳通道。在液池e 施加门控电压，d 、f 液池接 地，使得进入电泳通道的试样液流，流经通道交叉处，由液池d 流出，而不会渗漏到分离 通道；( c ) 进样过程，所有液池处于电悬浮状态，依靠流体动力将一定量试样压入分离通 道；( d ) 分离分析，电压施加方式同( a ) 与( b ) 。 2 0 0 2 年，方群等【3 l l 报道了一种用于毛细管电泳芯片上的高通量连续试样引 入接口装置，系统结构如图1 1 2 所示。除采用在芯片上垂直钻孔的方法加工大 内径( 1 7m m ) 试样引入通道外，其重要特征是在芯片上设计了由滤纸圈导流 的溢流式试样池，以及大口径( 9m m ) 的其他三个贮液池，以保证在长时恩连 续引入试样时芯片各液池液位的相等与相对恒定。系统被应用于f r r c 标记的氨 基酸的分离及标记反应过程的在线监测。采用上述方法，在蠕动泵驱动的试样 流速低于o 6m u m 证时，系统可实现连续换样，分析速度达到4 0 一8 0 样纠、时， 换样量8 0 2 4 0 此，。系统具有较好的工作稳定性，不需任何液位调整操作，可保 证系统在1 小时内稳定工作，对不同氨基酸组分分析的重现性为1 5 2 6 r s d ( n = 1 1 ) 。如定时调整其他液池的液面，可使系统连续工作的时问更长。如在 进行标记反应在线过程监测时，系统曾连续工作长达4 小时，对内标物测定的 浙江大学博士学位论文 第一章绪论 重现性为4 8 r s d ( n = 1 6 6 ) ，图1 1 3 为f i t c 标记氨基酸反应过程的在线监 测记录图。 图1 1 2 方群等报道的高通量连续试样引入芯片系统结构示意图p 1 】 ( a ) 大口径贮液池；( b ) 芯片系统整体结构；( c ) 流通溢流式试样引入接口。 岫 l - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 一 。拙6 蛳j j i l 篙蠲洮；。啦i i 【i l 溢湓l 曲捌黼浏幽：盛猫i 豳龇曲i 4 咖j 枷 | 止0 浊“。t “i b 图1 1 3f r r c 标记氨基酸反应过程在线电泳监测记录p 1 浙江大学博士学位论文 第一章绪论 此后，方群等 3 2 和徐章润等1 3 3 1 均报道建立了用于芯片毛细管电泳分析的滴 液式流通换样接口。 图1 1 4 方群等报道的液滴式流通换样系统示意图1 3 2 1 ( a ) 液滴式流通换样系统示意图；( b ) 液滴式流通池接口。c ，毛细管；i t ，试样引入管； p ，泵；s ，试样；s c ，分离通道；s l c ，充样通道；e p ，刻蚀片；b p ，基片；b r ，缓冲液 池：s r ，试样池：w r ，废液池；s w r ，试样废液池 方群等报道的芯片系统结构如图1 。1 4 所示。其主要特征是：采用大内径试 样引入通道，避免换样操作对电泳系统的干扰；采用滴液型接口保证换样系统 和电泳系统的电隔绝。采用分流型模式接口，多余试样溶液从试样引入通道与 流通池的出口流出。该系统被应用于单个荧光素样品和氨基酸混合样品的毛细 管电泳分离。在优化的实验条件下，系统分析速度可达4 0 样h ，换样流速 o 1 8 加2 5m u m i n ，换样时间为3 8s ，试样引入流通池死体积最小为2 1 肛l ， 每次换样量1 0 3 2 砸。携出量低于4 。 2 0 0 3 年，徐章润等【3 3 】将滴液式试样引入系统和微流控玻璃芯片毛细管电泳 浙江大学博士学位论文 第一章绪论 系统集成到了分析仪器中，报道了一种小型可连续进样的微流控芯片分析仪。 采用十字通道构型的玻璃芯片，电泳通道为1 0 0 m 宽、2 0 m 深。试样经o 5 m m 内径的p 礓管滴入圆锥型接口( 中心为1 4m m 内径通孔) ，废液由底部的 p t f e 管流出。单次顺序注射系统试样引入量为1 5 0 口l ，采用气泡间隔引入办法。 该系统测定c y 5 染料的峰高r s d 为1 9 ( n = 1 1 ) ，理论塔板高度7 4 岸m 。试样速 度为3 5 样h ，携出量低于4 ， 1 2 3 基于取样探针式的试样引入系统 ( a ) ( b ) 图1 1 5l i n 等报道的基于取样探针式试样引入芯片系统结构示意图 ( a ) 试样引入系统结构示意图：( b ) 芯片及接口结构示意图。a 、b 、c 、d 池分别为试样池、 缓冲液池、试样废液池和废液池；c ，g ，s 分别为通用通道、门式通道和分离通道。 浙江大学博士学位论文1 4 第一章绪论 除了基于固定试样池和流通试样池的试样引入系统之外，文献3 4 枷】还报道 了一类基于取样探针的芯片试样引入系统。其特征是芯片上没有专用的固定或 流通试样池，而是加工与芯片分析通道直接相连的取样探针，通过将取样探针 插入试样容器内完成试样引入。 l i n 等f 3 4 】在微加工试样引入通道的基础上对连续试样引入系统进行改进。采 用如图1 1 5 所示芯片构型，无需试样引入通道，将一段3 4c m 长、2 0 叫1 内径 的石英毛细管一端直接连接于芯片分离通道上游的入口，毛细管另一端与自动 采样器相连，采用门式迸样方式，顺序注射泵依次交替地注入试样一缓冲液，实 现高通量连续试样引入。接口处死体积约为3 0 01 1 l ，系统换样量o 2 1u l 。 图1 1 6z h 锄g 等报道的取样探针式试样引入系统吲 z h a g 等【3 5 】利用化学刻蚀方法，在芯片分析通道末端加工形成直径为3 9 0 p m 的圆形引导通道，将一段1 5c m 长的石英毛细管( 2 0 0 一岬i d ，3 7 5 h mi d ) 插入引导通道内，并用一滴硅密封剂固定，以此作为取样探针。整个系统及芯 片结构如图1 1 6 所示。在该研究中整个分析过程包括充样( 1 0 a d i n g ) 、迸样 ( i n j e c t i o n ) 、分离( s e p 姗t i o n ) 和清洗( w a s h i n g ) 四步( 图1 1 7 所示) 。首先， 浙江大学博士学位论文 第一章绪论 利用真空泵抽吸将外界试样通过毛细管引入芯片通道内；接着，在进样端口施 加一短时间的真空脉冲，使试样充满采样环( 限定试样塞长度为1 5m m 、试样 体积约6 6n l ) ；然后，关闭真空泵，分离通道中施加高电压，进行电泳分离、 e s i m s 检测；最后，用泵在贮液池中施加正压，清洗通道。计算机控制各步的 时间，外界试样管水平放置，通过x y z 三维平台自动更换试样。试样消耗量为 5 0 0n l 。 图1 1 7z h a n g 等报道的连续试样引入操作程序【3 5 】 a 、试样引入；b ，进样；c 、分离；d 、清洗 c h e n 等报道了一种新的试样引入接口。即在芯片通道末端加工成取样探 头( 图1 1 8 所示) ，直接插入外界试样管中，采用电动进样，通过控制取样探头 在试样管中的停留时间及电压来控制进样的体积和试样塞长度，建立了连续试 样引入一毛细管电泳分离安培检测的分析系统。系统试样引入操作采用手动方法 进行，分析速度达1 0 0 样，j 、时，对n 盯组分的分析精度为3 7 ( 阼= 1 0 0 ) 。 图1 1 8 取样探头式试样引入芯片基本构型口6 】 s c ，分离通道：s v ，试样管。 浙江大学博士学位论文 第一章绪论 最近w a i l 2 等【3 7 】在以上基础上进行了改进，仍然采用十字构型的玻璃芯片、 分离通道末端电化学检测，系统结构及操作程序如图1 1 9 所示。将分离通道上 端加工形成试样引入口，原十字通道中充样通道的一端加工形成缓冲液引入口。 分别将两段2m m 内径的聚乙烯泵管套入并固定在两探头处，外界试样通过蠕动 泵泵入聚乙烯泵管，多余试样从废液管g ( 距离通道入口1m m 处) 中流出，缓 冲溶液通过毛细作用进入聚乙烯泵管。该系统采用门式迸样的方式，操作程序 如图1 1 9 ( b ) 所示，包括：( i ) ，缓冲液引入通道：( i i ) ，进样：( i i i ) ，分离、 检测。系统用于酚类和爆炸物分离检测，1 5p p m 的1 ，3 ，5 t n b ( 三硝基苯) r s d 为3 7 ( n = 4 0 ) 。分析速度约为2 0 样m 。 ( a ) b 缓冲液入口 ( i ) ( i i )( m ) 图1 1 9 双探头式试样引入芯片毛细管分析系统及操作过程示意图口7 】 ( a ) 系统结构示意图：a ，分离通道；b ，试样引入探头；c ，缓冲液引入探头；d ，没用的 液池；e ，检测间隙；f 1 、f 2 ，聚乙烯泵管；g ，塑料管；h ，p t 电极( 接地) ：i ，碳工作电极； j ，a g 恼g c i 参比电极；k ，p t 电极；i l 、1 2 。p t 丝；p ，蠕动泵。( b ) 操作过程示意图：( i ) ， 缓冲液引入通道；( ) ，进样；( i ) ，分离、检测。 浙江大学博士学位论文 第一章绪论 e w i n g 研究组【3 8 】设计了一种不同于上述试样引入方法的自动毛细管试样引 入d n a 电泳分离芯片。系统结构如图1 2 0 所示，在玻璃芯片中平行加工五条 5 0 0 7 0 0 m 宽、2 5 0 3 5 0 m 深的线型阵列电泳通道，作为取样探针的毛细管内 充满d n a 试样，在计算机控制下进行平面二维移动，依次使其尖端插入芯片中 每一电泳分离通道，并且控制其在各通道内滞留时间通过电动驱动进样。此系 统通过往复移动毛细管可实现连续重复地进样、分离。此后该研究小组将所建 立的方法应用于连续检测d n a 限制性酶解反应【3 9 】、脱氧核糖酶反应【4 0 1 。 心 ， c7 一 p 图1 2 0 自动毛细管试样引入的d n a 电泳分离芯片p ” c ，毛细管；s ，试样：e s l ，电泳分离通道 e s l 1 3 其他试样引入技术 黄艳贞等【4 1 】报道了一种可连续换样的集成化重力驱动微流控芯片连续流动 分析系统，以蠕动泵作为试样引入和换样的动力源，以重力作为微通道内试样 迁移和分析的驱动力，系统采用化学发光检测，进行连续高通量的h 2 0 2 试样分 析。系统装置见图1 2 1 。系统特点：( 1 ) 通过选择较大的贮液池通道与芯片微通 道截面积比( 4 0 0 ：1 ) ，以降低试样贮液池内试样的流动所产生的液压对芯片微通 道内的流体产生干扰作用。( 2 ) 在微通道出口加装引流管的方法提高重力驱动 系统的流速；( 3 ) 系统中还采用了水平通道贮液池，在较长时间内可保持液流 流速的稳定。以h 2 0 2 为分析对象，考察系统分析性能。系统响应信号的r s d 为 2 1 ( n = 1 1 ) 。在换样流速为o 2 4m l m i n 条件下，分析速度达到8 0 一1 0 0 样h ， 浙江大学博士学位论文 第一章绪论 单次换样所需换样时间1 5s ，换样量6 0 l 。 图1 2 1 集成化重力驱动微流控芯片系统装置结构图h 1 】 杜文斌等盼4 3 】报道了一种基于取样探针和缺口型试样管阵列的微流控芯片 试样引入系统，在流动注射芯片上实现高通量和快速的换样操作。该系统具有 结构简单、体积小、试样消耗少( n l 级) 、操作方便和易实现自动化等特点。 该系统以重力为试样引入和试样分析动力源，图1 2 2 为系统装置图，采用液芯波 导光度检测系统。以1 7c m 、5 0 m 内径毛细管作为取样探针，端与芯片微通 道直接相连，另一端则插入水平放置的缺口型试样管中。通过试样管阵列一维 线性平移实现高通量自动换样。采用邻菲咯琳( o - p h e n a n t h r o l i n e ) 铁( i i ) 显色体系 考察系统的分析性能，系统测定的r s d 为o 6 伽= 8 ) ，分析通量高达1 0 0 0 样h ， 每次进样量仅0 6n l a 浙江大学博士学位论文1 9 第一章绪论 图1 2 2 重力驱动高通量试样引入芯片流动注射分析系统装置图【4 3 1 微流控分析是一种具有微型化、自动化、集成化和廉价、节省等优点的分 析体系，可被用于生产与过程的在线检控、生命科学、环境科学等许多领域。 但是，毕竟研究的时间尚短，还有许多问题有待解决。试样引入是任何分离技 术的关键部分，芯片毛细管电泳分析系统对试样引入提出了新的挑战。当前， 各种外界试样与芯片的接口( w o r l d ，t o c h i 口) 技术已不断形成，近年来微流控芯 片试样引入技术已有较快的发展，文献报道了多种不同结构的芯片试样引入系 统，可实现芯片上连续、自动化的试样引入。但在改善试样引入系统的工作稳 定性、试样消耗量以及系统集成度方面的研究，尚有待进一步加强。 参考文献 【1 】r e y e sdr ，i o s s i f i d i sd ，a u r o u xp a ，m a n za 一万以c 凫删，2 0 0 2 ，7 4 ：2 6 2 3 2 6 3 6 【2 a - u r o u xpai o s s i f i d i s ，d ，r e y e s