（分析化学专业论文）壳聚糖纳米荧光探针的制备表征和应用.pdf

浙江大学硕士学位论文 摘要 本论文以壳聚糖为原料，采用过氧化氢氧化降解法制各低分子量壳聚糖；采 用离子交联法制各壳聚糖纳米微球，并用荧光素异硫氰酸酯( f i t c ) 标记该微球， 得到壳聚糖纳米荧光探针；论文对壳聚糖纳米微球的分散问题做了进一步研究， 探讨纳米微球稳定存在、良好分散的条件，并使用多种表面改性剂对壳聚糖纳米 微球进行表面改性以提高其稳定性；探讨了壳聚糖纳米荧光探针与生物活性物质 的偶联方法，并将其应用于荧光免疫分析检测人免疫球蛋白抗原。 本论文共分五章。 第一章分别介绍了荧光探针，壳聚糖的结构和性质，壳聚糖纳米微球制备方 法及微球表面改性等方法。 第二章用过氧化氢降解法制各低分子量壳聚糖，考察了降解反应的影响因 素。采用离子交联法，以三聚磷酸钠( 1 1 p p ) 为交联剂，制各壳聚糖纳米微球。探 讨成球的影响因素，并对纳米微球进行性能表征。实验结果表明，使用分子量 ( m r ) 为6 万左右的低分子量壳聚糖，在壳聚糖乙酸溶液浓度为o 5 ( w ，v ) 、交 联剂t p p 浓度为0 2 5 ( w v ) 、壳聚糖溶液和1 1 p p 溶液体积比为3 ：l 时制备得到 的微球性能较好。制得的壳聚糖纳米微球粒径在4 0 n m 左右，呈球形，粒径较为 均匀，分散性比较好。 第三章以自制的纳米壳聚糖微球为基质，利用壳聚糖链上丰富的氨基和荧光 素的异硫氰根反应制备壳聚糖纳米荧光探针。探讨了影响纳米荧光探针制备的条 件。实验结果表明，在碱性介质中f i t c 与氨基结合牢固、制得的壳聚糖纳米荧 光探针比较稳定，不易被光漂白。 第四章探讨了壳聚糖纳米微球稳定存在的条件。结果表明壳聚糖纳米微球在 p h = 2 6 基本保持稳定，在p h = 4 时稳定性最好，单分散性也最好。适当的离子强 度可提高纳米微球的稳定性。探讨用硅烷化试剂对壳聚糖纳米微球进行表面改 性，以提高其稳定性的方法。 第五章探讨了壳聚糖纳米荧光探针同生物活性物质的偶联方法，比较了几种 方法的偶联效率，发现戊二醛作为偶联试剂时，偶联效果最好。将壳聚糖纳米荧 光探针标记i g g 抗体，检测痕量i g g 抗原，获得了良好的检测效果。 浙江大学硕士学位论文 关键词：壳聚糖纳米微球，离子交联，荧光探针，f i t c ，表面改性，i g g v 堑江查堂罂圭堂苎笙查 a b s t r a c t hm i s 氆e s i s ，t 量1 ep r e p a 洲o na n d 印p l i c a t i o no fn o v e lc h i t o s a nn a n o p a n i c l e s l a b e l e dw i n lo 唱撕cf l u o r c s c e n td y ew e r e 咖d i e d c h i t o s a nn a l l o p a n i c l c sc o u l db e o 酞a i n e d b y i o n 主c a l c r o s s i n 姑n g o fl o w m o i e c u l 雒w e 曲t c 量l i t o s a nv d t h t r i p o l y 砖o s p h a t e ( 秤p ) b e i n gc r o s s l i n 轴n g 糟a g e 丑t f l u o r e s c e n ti a b e l e d c h i t o s a n n a n o p a n i c l e sc o l l j db es u b s e q u e n yp r e p a r e du s i n gt 1 1 er c a c t i o nb e t w e e nf i t ca 1 1 d t h ea m i n eg r 0 1 | po fm ec h i t o s a 娃n a n o p a 磁d e s t h 。s i z cd i s t f i b u t i o n ，f l u o r e s c e n c e 单e c t r o s c o p ya i mp h o l m s t a b i l i 锣o f 也e 蠡u o r e s c e n tc h i t o s a nn a n o p a n i d e sw e r c c h a r a c t e r i z e d t h cn u o r c s c e mc h i t o s a nn a n o p a n i c l e sw e r ef i n a l l yu s e da sas e n s i t i v e 玎u o r e s c e n tl a b e l 主l l gr e a g c n tf o rd e t e c t i n g 订a c el e v e lo f h u m a l li g gi nh u m a i ls e 煳 s a m p l eb yf l u o r o i m m u n o a s s a ym e 幽o d i nc h a p t e ro n e ，r e c e n tw o r k s 佗l a t e d 稍t l l1 1 i 曲s e n s m v en u o r e s c e n tp r o b e ， s 呻c t l l 】瞎a n dc h a f a c t e ro fc h i t o s a n ，m em e m o d s0 fp r e p 嘶n gc h i t o s a i ln a n o p a r t i c l e a n ds u 施c em o d i 谯c a 圭主o no f 毛l a n o p 8 r t i c kw e r e 糟访e w e d i nc h a p t e rt w o ，c h i t o s 觚w i 血l o wm o l e c u l a rw e i g h tw a sp r e p a r e db yo x i d a t i v e d e g r a d a t i o nm e m o d ，i n 、v h i c hh y d r o g e np e r o x i d ew a se m p l o y e da st h eo x i d a n t c 1 1 主协s a n n a n o p 缎i c l e sw e 砖触n e db y i o l l 主c a l c f o s s - l i 威证go fc 拯t o s a n 砌t h t r i p o l y p h o s p h a t e ( 1 1 p p ) t h ef a c t o r s a 疵c t i n g t h e p a n i c l ep r e p a 枷o n w e r e s y s t e m a t i c a l l ys t u d i e d ，a n dm ef h v o r a b l eo p e r a t i o nc o n d “i o n s w e r ef o u n da t ： m o l e c u ew e i g h 重幽协s a n 括a 抽u 圭5 0 她u s 躺d s ，t h cc k t o s a nc o n c 锄蚋圭 c i ni so 5 ( w v ) a i l dm et p pi so 2 5 ( v ，v ) ，m ev o l 啪ep r o p o n i o no f1 1 p pt o 出t o s a i ls o l u t i o n i sl ：3 确ep h y s i c a la 1 1 dc h e m i c a lp r o p e n i e so f 也em i c r o s p h e r e sw e r cc h a r a c t 硝z e d b yf t r 、翘l s m 主s s i o ne l e c 打o n 癌c r o s c o 辨锄ds oo n + r e 蹦l ss h o w 。d 也a l 龇 m i c r o s p h e r e sp r c p a r e dh e r ew e r e 砌f o r m 、s p h e r i cl n i c m s p h e r e sw i t l la b o u t4 0 n m d i a m e t e ra n d 、v e l ld i s p e r s e di nl a c e t i ca c i d 1 nc l l 带t e r 也糟e 爨h o r e s c e 嫩c h 呈t o s 强l 鞠_ n q ) a 撕d e sw 材ep r 。p a f e du s 主n g 搬e r e a c t i o nb 咖e e n 也ei s o t l i i o c y a i l a t eg r o u po ff i t ca l l dt l l ep f i m a r ya m i n og r o u po f c l l i t o s a l l t h ef a c t o r se f 舭畦n gt h ep r c p a r a t i o nw e r es t u d i e d r e 训t si n d i c a t e dm 缸 浙江大学硕士学位论文 f i t cc o u l ds t r o n g l yc o m b i n ew i 也c h i t o s a ni na l k a l i n ec o n d i t i o n 1 na 槭t i o n ，也e n u o r 。s c e n tc h i t o s a nn a n o p a n i c l e so b t a i n e dw c r em o r ep h o t o s 协b l e 协a i lc o n v e n t i o n a l o r g a n cd y e s ， c h a p t e rf o u rw a sa i m e da t t h ep h y s i c a lp r o p e r t i e so fc h i t o s a nn a n o p a r t i c l e s c o l l o i d a ls t a b i l i t ya s 如1 c t i o no fp ha 1 1 di o n i cs 仃e n g t ho ft l l em e d i u mw a sa l l a l y z e d r e 刚招s h a w e d 西鑫童馥i t o s a nn a n q 瑚嵋c l e sw e r ew e l ld i s p e f s e di ns 髓谢o na tp 珏篇4 t h ep r e s e n c eo fk c la tl o wa i l dm o d e m t cc o n c c n 扛瓶o n sp r o v o k e ds w e l l i n g 、w e a k e n c h i t o s a n _ t p pi o m ci m e r a c t i o n 姐dr a p i d l yt u m e do np a m c l ed i s i n t e 斟a t i o n ，t h e l e 确o d so f 瓢l r f 如ei n o d i f 呈c 菇o no f c h i t o s a nn 8 | 1 q 砖c l e sw e 羚翻s od i s c u s s e di n 畦l i s c h a p t c r c h a p t e rn v ep r e s e n t e ds e v e r a lc o u p l i n gm e m o d sb e t w c e nt h en u o r e s c e n tc h i t o s a l l n a n o p 酬c l e sa n da c 虹v eb o l o 昏e a ll i g a i l d s r c s u i t s 砌i c a t e d 血a t 龇b e s tc o u p l i n g f e a g e n tw a sg l u t a r a l d e h y d e g o 如a 畦_ h 砌a nl g gw a sl a b e l e db yn u o f e s c e n tc h 主t o s a 珏 n a l l o p a n i c l e s ，w h i c h w a su s e dt od e t e c tt r a c e1 e v e lo fh u m a n i g gb y n u o r o i 瑚m u n o 黯s a yi n 捌矗o d k e y w o r d s ：c 1 1 i t o s a i ln a i l o p a n i c l e s ，i o n i c a ic r o s s 一1 幽n g ，f l u o r e s c e n tp r o b e ，f i t c ， s u r 蠡瓣em o d i 蠡c a t i o 玛i g g v 珏 浙江大学硕士学位论文 第一章文献综述 1 1 研究背景 生命科学的飞速发展对分析化学提出了大量薪的课题，主要集中在多肽，蛋 白质，核酸等生物大分子分析，生物药物分析，超痕量，超微量生物活性物质分 析，甚至微生物分析等。生物分析化学已成为现代分析化学中最重要的前沿领域 之一。其中，生物大分子分析检测是其重要领域。由于许多生物分子自身可供分 析的信号较弱，因此常常借助外加标记物以获得可测量的信号，实现高灵敏度检 测。目前生物大分子分析检测的最主要方法之一是标记免疫分析法。 当前标记免疫分析法主要有：放射免疫分析( r i a ) 、酶免疫分析( e i a ) 、荧光 免疫分析( f i a ) 和发光免疫分析( c l i a ) 等“_ 3 1 ，这些方法各有利弊。放射免疫分 析摄早出现，它使用放射性核素作为标记物，成本低、灵敏度高。放射性核素半 衰期短，试剂盒不宜储存，且存在辐射安全等问题而逐渐被非放射性标记物所取 代”“。酶联免疫分析利用酶作为标记物，具有很高灵敏度，检测下线可达n g 水平，然而酶本身容易失活，且由于空间位阻影响，其灵敏度和重复性受到一定 的限制”“。近年来化学发光法由于灵敏度高、线性范围宽、标记物的有效期长 而发展较快，形成了化学发光酶免疫分析、生物发光酶免疫分析和电化学发光免 疫分析。然而化学发光影响因素多、稳定性差、瞬间的化学反应生成样品的发光 无法再现，导致结果重现性差，因此限制其广泛应用睁”1 。荧光免疫分析法由于 具有方法简便、特异性强、速度快等优点成为免疫分析最具前景的方法。目前荧 光免疫分析最常用的标记物是有机染料，已有商品化试剂盒出售。然而有机染料 激发光谱窄、很难同时激发多种组分、光稳定性差、易被光漂白、分解产物往往 对生物体有害“”。因此，研究新型、高灵敏高、稳定性的荧光探针是当前荧 光免疫分析领域研究的热点。 标记分析法提高灵敏度的最终目标是实现超灵敏的单个标记分子或单个微 球的检测。就目前而言，激光诱导荧光检测已达到单分子测定水平，但检测系统 复杂，尚未进入到普通的生化分析。如何采用更好的方法或较为简单的仪器而实 浙江大学硕士学位论文 现同样的检测水平是目前研究的热门课题。提高检测的灵敏度，可考虑以下三个 方面：选用标记物采用信号放大的方法降低背景的信号。其中，标记物的 性质是决定灵敏度的最主要因素。标记物，应具备安全灵敏( 非放射性，发光效 率高) 、化学性质稳定( 长的使用寿命) 、易于标记( 可实现多个标记，标记化学反 应简便或无需化学标记) 、发光信号稳定便于检测等特点。近年来用具有特殊光 电性质的纳米材料作标记物是一条新的途径，在f p n c p 等著名杂志上已有多篇论 文报道，引起人们的巨大关注“7 1 ”。此类标记物如纳米晶体、包裹着荧光分子 或其它发光分子的纳米球等，比单个荧光分子有显著提高的发光强度和光化学稳 定性，如再结合其它信号放大技术，将会把分析灵敏度提高到一个新的水平。 1 2 纳米荧光探针 分子光谱分析方法在生物医学及生命科学中有广泛的应用。其中，荧光光谱 灵敏度高、选择性好，因此分子荧光领域的研究十分活跃。荧光分析法常用于临 床测定生物样品中某些成分的含量，尤其应用于核糖核酸( r n a ) 和脱氧核糖 核酸( d n a ) 的测定。然而直接用荧光光谱法对它们进行研究时，碱基或核酸 的荧光量子产率很低，且在2 0 多种氨基酸中，只有色氨酸，酪氨酸和苯丙氨酸有 天然荧光。因此最好的检测方法是利用各种荧光探针。 纳米探针由于具有高选择性和高灵敏度可以用来探测很多细胞物质、监控活 细胞的蛋白质和其他生化物质。纳米探针还可探测基因表达和靶细胞的蛋白质生 成，并用于微量药物筛选。 1 2 1 纳米技术和纳米生物技术 纳米技术又称为分子纳米技术。2 0 世纪5 0 年代末，诺贝尔奖获得者、物理学 家融c h a r df e y 眦趾首次提出纳米技术的概念啪1 。他指出用大工具制造出适合制 造更小工具的小工具，直到得到正好能够直接操纵原子和分子的工具，这可能意 味着化学将成为这样的一件事即精确地按照你的安排一个一个排放原子，当我们 在很小尺度上对物质的构造拥有某种控制手段时，我们将得到许多新的材料特 性，能做许多不同的事。这段话实质上预测了一种新技术的出现，这就是纳米技 术。 2 浙江大学硕士学住论文 纳米技术一般是指在纳米尺度范围内，人类按照自己的意志直接操纵原子和 分子或原子团和分子团，进行材料加工以及创造具有特定功能的产品等。一般来 讲，纳米技术必须满足两个基本条件：材料尺寸小于1 0 0 m ，同时必须具有由尺 寸效应导致的独特的或大大提高了的物理、化学或生物性能。如果在颗粒尺寸上 满足条件，但不具有由尺寸减小所产生的独特性能如小尺寸效应、表面界面效应、 量子尺寸效应和量子隧道效应等，就不能称为纳米技术。 纳米生物技术是纳米技术和生物技术相结合的产物，是现代生物工程的重要 组成部分，并将在生物科学、医学、材料学、环境科学等诸多领域具有良好的应 用前景“。但与自然界的复杂性相比，目前装配分子工具、装置和材料的水平 还较低。近年来，基于自然界原型的纳米生物材料、芯片技术、分子马达、纳米 探针等纳米生物技术取得了迅速的发展口2 2 “。 纳米粒子具有良好的光学性能，常用作生物染色剂和免疫标记物。纳米粒子 用于细胞染色和发光生物标记比普通的荧光或有机探针具有明显优势。这是由 于：( 1 ) 它们的尺寸小，能充分与细胞或组织结合；( 2 ) 在纳米粒子表面修饰上具 有不同亲和性的物质，可实现对不同部位定向染色：( 3 ) 纳米粒子在显微镜下衬 度差别大，比普通染色剂有更高的分辨率；( 4 ) 在生物分析上有时需要同时检测 多个光学信号，一般的荧光和有机探针具有不连续的分子能级，要用不同的激发 源才能得到不同发光信号。目前用于荧光标记的纳米探针主要有：( 1 ) 金纳米 粒子( 2 ) 免疫磁性纳米粒子( 3 ) 发光量子点( 4 ) 有机染料标记的纳米粒子。 1 2 2 金纳米粒子( n a n o g o l d ) 近年来，随着纳米科技的兴起，金纳米粒子以其独特的光学和电学性质、良 好的稳定性、小尺寸和表面效应以及独特的生物亲和性，使其在生化免疫等领域 显示了潜在的价值，引起广大科技工作者的兴趣。 一般采用还原法，即将氯金酸或四氯化金与适当的还原剂作用制备胶体金。 常用的还原剂有柠檬酸三钠、鞣酸、抗坏血酸钠、白磷和硼氢化钠等。胶体金用 于标记的原理如下：胶体金是一种负电荷的疏水胶，靠静电粒子相互排斥作用来 维持稳定的胶体体系，其颗粒直径在1 1 5 0 n m 之间，属于多相不均匀体系，其颜 色依直径大小呈红色至紫色。不同直径的胶体金的光散射各异，导致溶胶颜色显 著变化，是胶体金用于被动凝集试验的基础。同时胶体金颗粒对蛋白质有很强的 3 浙江大学硕士学往论文 吸附功能，藤蛋自质鲍生物活後炙瞪显改变，霹j 怼它弼戳作为探铮送行缨薏蠹表露 和细胞内多糖、蛋白质、多肽、抗原、激素、核酸镣生物大分子的精确蹴位，成 为免疫反应的优良标记物 ”州。此外，金颗粒还可催化银离子还原成众祸银， 因此在胶体众兔疫测定时加入镶染色液，能放大反威信号，大大增加测懋的灵敏 痉。霹遥避浚变金镶纳寒粒予羧经大，j 、，形凌来获裰不秘静绩号，实瑗多缀份检 钡，如图l 。l 。 圈1 ip h a t o i n d u c e de 锄v e r s j 咖o fs i i v e rn 抽o s 岫e 揩st on a n o p d s m s ，s m i s s i o nc i c c 圩o nm i c s 垂y i 舶8 9 s 剐嚣瓣卿n l ，h 弹嚣p 鞠矗i 摊氇em 曲曩o g y 曲黼嚣黼b b 陀i 玎t d i a t 。n ( 磅鞠d 撩e f4 0 辞，5 5 c 黼d7 9 鸯b h 砖。f i m d i a 蛞徽r a y l 畦垂逸鼙s c g 鞋酾n g o f 瓣 c l e s d 荦“协d o n & 搬l c f 辅c a 辨 蓟a s ss l d e 1 1 u s t r a t i n gm ed i 矗b 铷tc o l o r so f n 釉0 p 矾i c l e so f d i 掩佬n ts h a p c s 踟d 甄z c s i o w e rp 蝴c l s ) t h e s l i d ei su s c da sap l 蚰a rw a v e g i l i d e ，w h i c hj si l i 啪i n a t c dw 岫at i l n 嚣舭ns 咖亿e n ei i i l 4 b ew a st 8 k e nw m am 嘶ic 黼雌r e p r o d c e d 痧0 珥j i he tn 1 f 2 0 0 1 ) p h 。| o i n d “de o 种e r s i o n 可s i w rh 口n o 举h e r e st o 加印r 珏m 船妇船2 舛， j 如j j 9 j 3 w w w s c i e n c e m a g o 曙 金绣寒粮予终为特殊标记貔避行生纯分撬豹磅究始手2 0 整绍6 0 每健。1 9 铭 年f e l d h e r r 等用金纳米标记细胞进行电子显微镜研究；1 9 7 1 年t a y l o r 又将金纳米 微粒引入e 巍镜免疫技术中，从而众纳米微粒开始用于免疫标记技术( 纳米金微粒 由于在免疫化学中豹这一应用又被称为免疫金) 。此后又发展斑点兔痰盒渗滤 分叛国i g 默) 辩荻体金免疫屡辑分摄( g i 泓) 。g i 泓燕2 0 凝纪9 0 年我蠡在免疫技本、 渗滤技术基础上建立瓣简易、快速、灵敏、效果确实的免疫学检溅技术，对于解 决动物及人体检疫的快速诊断撼肖较大的现实意义。 毒 浙江大学硕士学位论文 由于金颗粒具有很强的激发电子能力，还可用于扫描电镜和x 射线衍射分析 等。胶体金是高电子密度颗粒性标记物，电镜下分辨率高，对超微结构遮盖少， 易与其他颗粒性结构相区别，具有较精确的定位能力。免疫胶体金对组织细胞的 非特异性吸附作用小，故具有较高的特异性。此外，免疫胶体金制各不需经过化 学反应交联，可根据不同的实验目的、要求，采用不同试剂、剂量和方法，选 择制备不同直径的胶体金颗粒，多种生物大分子均可与金颗粒吸附形成复合物， 且生物大分子活性保持不变。利用不同直径胶体金颗粒标记不同抗原，可实现电 镜下的双重或多重免疫标记口”1 。 1 2 3 免疫磁性纳米粒子( i m m u n o m a g n e t i cn a n o p a n i c l e s ) 纳米免疫磁性颗粒是以磁性材料为固相载体，在其表面引入活性基团( 氨基、 羧基、羟基、醛基等) ，通过偶联反应将抗体、酶等物质结合在载体上，既保留 了大分子的生物学活性，在外加磁场作用下又可定向移动，在细胞、蛋白质、核 酸的分离；微生物检测、肿瘤诊断、药物靶向治疗中发挥了重要作用沁“1 。形 成免疫磁性粒子的关键是磁载载体，按照其结构的不同可以分为三大类：( 1 ) 壳 一核结构，高分子材料作为核，磁性材料作为壳层。( 2 ) 核一壳结构，磁性材料为 核，高分子材料组成壳层。( 3 ) 壳一核一壳结构，外层和内层为高分子材料，中间 为磁性材料。用作免疫磁性粒子载体的磁性粒子主要是后两种，其中核壳式结构 为最多。磁性材料多为f e ，c o 和n i 等过渡金属特定晶型的氧化物、混合氧化物及 其水化物。 1 2 4 发光量子点( q u a n t u md o t s ，q d s ) 量子点( q u a n t u md o t s ，q d s ) 也称半导体纳米晶体( n a n o c r y s t a l s ，n c s ) 。 它是由半导体材料制成的，尺寸在2 2 0 m 之间的纳米晶体。当半导体纳米粒子 的尺寸与其电子空穴半径( e x c i t o nr a d i u s 约5 1 0 m ) 相接近时，由于电子波函 数的量子限制效应( q u a n t u mc o n f i n em e n te f f e c t ) ，半导体纳米粒子能带的有 效带隙( b a n dg a p ) 随粒子的半径减少而增加，导致吸收光谱和荧光光谱的蓝移。 光谱性质主要取决于半导体纳米粒子的半径大小，而与其组成无关，通过改变粒 子的大小可获得从紫外到近红外范围内任意点的光谱口“。 纳米晶体的高表面区会降低其发光效率，发生光化学降解，将它直接用于生 物分析也存在着许多问题。运用材料科学和电子的带系能量概念，发展了核一壳 浙江大学硕士学位论文 结构的纳米晶体，可用于标记生物大分子。它是以一种量子点( c d s e 、c d t e 等) 为核，在其外部使用另一种材料( z n s 、z n s e 、c d s 等) 形成表面的薄层，这种结构 能有效限制对核的激发，消除非辐射弛豫途径和防止光化学褪色。室温下，它们 具有较高的量子产率( 5 0 ) ，且光化学稳定性得到很大提高“1 。 作为荧光探针，q d 的光学特性比在生物成像中经常采用的传统发色团如罗 丹明6 g 或其他有机染料分子有明显的优越性：首先，不同粒径大小的量子点具 有不同的颜色，激发量子点的激发波长范围很宽，且连续分布，所以可以用同一 波长的光激发不同大小的量子点。如用z n s 包裹的c d s e 量子点标记d n a ，可以得到 1 0 种不同的标记颜色叩2 “1 。而多种染料的荧光( 多种颜色) 却需多种激发光加以 激发；其次，被激发的量子点所发射的荧光谱峰狭窄而对称，半峰宽通常只有4 0 n m 甚至更小，这样就允许同时使用不同光谱特征的量子点，而发射光谱不出现交叠， 使生物分子的多组分检测变得容易；第三，量子点探针的荧光强度比最常用的罗 丹明6 g 染料高2 0 倍，稳定性是它的1 0 0 倍以上，它可以经受反复多次激发，而不 像有机荧光染料的荧光信号随着照射时间的延长而很快暗下来( 光褪色) ，这为 研究细胞中生物分子之间长期相互作用提供了有力工具。这些独特的光学特性使 量子点成为一种理想的荧光探针应用于分子生物学和生物工程学的超灵敏、多色 和多组分检测“7 。7 “。 倒1 2q u 锄t i l m d o c t 8 9 9 e dm i c r o b e a d sf 叶咖i t i p j e x c do p t i c a ic o d i n go f b i o m o l e c l l l e s ( a ) f l u o 他s c c n c c m i c r o f a p ho fam i x t 呲o fc d s e 亿n sq d a 黯e db e a d se m i 埘n gs i n g l e - c o l o rs i 龃a l sa t4 8 4 ，5 0 8 ，5 4 7 ， 5 7 5 d 6 l l m n e b c a d s w “s p m d d i m m o b i l i z e do na p o l y l y s i n c - c o a t c d g i ss l i d e ，w h i c hc s e d as l i 曲tc l u 咖一“ge f 触( ”t e nd i 砒i n g u 油a b l e 锄i s 对o nc o i o r so f z n s c 印p e dc d s eq d se x c i t e dw 油a n e a 卜u vl a i n p f r o mi e nt 0 g h t ( b i u et o 佗d x t l l ee m i s s i m a x i m aa r el o c a i e da t4 4 3 ，4 7 3 ，4 8 1 ，5 0 0 ， 5 | 8 ，5 4 3 ，5 6 5 ，5 8 7 ，6 1 0 锄d6 5 5 砌r e p r o d u c e dw i mp c m i s s i o n 疗o mh n p ：，w w n 咖m c o 耐 6 浙江大学硕士学位论文 结合生物分子的半导体q d 具有优良的光谱特征和光化学稳定性，可以大大 拓宽利用荧光探测生物体系的应用范围，如实现对活细胞内部分子运动规律的监 测，或实时观察给体一受体的相互作用。目前q d 最有前途的应用领域是在生物 体系中作为荧光标记物。图1 2 为发光量子点监测不同分子口“。 1 2 5 有机染料标记的纳米粒子 有机染料标记的纳米粒子根据纳米粒子基质的不同又可分为高分子微球和 无机纳米粒子。 高分子微球可分为天然高分子微球和合成高分子微球两大类。前者主要有聚 多糖类和蛋白质。3 。7 ”。后者主要以苯乙烯、乙烯基吡啶、丙烯酸酯、丙烯酰胺 及它们的衍生物为原料制备口6 “1 。天然高分子微球本身带有反应性基团，可直 接用于生物活性物质的固定化，但对此类纳米微球作为荧光探针的报道仍较少。 合成高分子微球则必须通过如下方法引入功能基团：( 1 ) 功能单体共聚法。即 少量功能单体与主单体进行共聚的方法，有时可以加入交联剂以获得交联的微 球：( 2 ) 微球载体表面修饰法。其中，功能单体共聚由于易控制功能度及交联 度，不易产生副产物而倍受青睐；微球载体表面修饰法也较常用，它可以作为对 方法( 1 ) 的补充。功能单体共聚法其主要的聚合方法有悬浮聚合、沉淀聚合、 分散聚合、乳液聚合等，各种方法所制得的微球体具有不同的尺寸范。以功能高 分子为基质的荧光微球日益受到人们的关注，它作为一种新型的载体材料已广泛 应用于医学领域，如免疫检测、细胞标记、核酸杂交等的检测。特别是近年来邻 近闪烁荧光技术在高通量药物筛选( h i 曲一t h 砌j g h p u ts c r e e i l i n ga s s a y s ) 中的应 用，极大地促进了对高分子荧光微球的深入研究印2 8 “。廖险峰等以甲基丙烯酸 甲酯( a ) 为单体、以八羟基喹啉铝( a 1 q 。) ( 激发光波长3 6 5 n m ，发射光波长5 3 0 n m ) 为荧光物质，在醇体系中，通过分散共聚，一步反应得到粒径为2i lm 7 u m ，粒 度分布较为均匀的荧光微球( p m m a a l q 。) 。所制备的荧光微球功能化后可用于免 疫分析、高通量药物筛选等领域汹1 。 最近以无机硅核壳型材料为主的纳米颗粒引起众多科学工作者的关注。采 用水油微乳液技术合成发光氧化硅纳米颗粒作为光稳定生物标志物近年来有较 多报道m 删。这种纳米颗粒发光性质稳定，颗粒分布均匀，表面光滑，是一种 新型的超微检测纳米探针凹7 。厦门大学许金钩等通过控制荧光团修饰的硅烷 7 渐江大学硕士学位论丈 羲体在反稿胶寐体系中懿汞解绻台，合成了蘑予生秘染色和诊甄静离灵敏发、高 稳定性的新型荧光团杂化纳米s i o 。粒子( n f h s 粒予) 。以n f h s 粒子为标记探针，建 立了夹心型荧光免疫分析人n 一甲胎蛋白( a f p ) 的方法，测定a f p 的梭测限为 o 0 5 n g m l 。作为生物标记探针，n f h s 粒子制各和衍缴方法篱单( 易与生物分子偶 联) 、凌褒豫警稳定毪努及鼹生物薅毒注疆零，霉逶避改变荧光透秘臻烧蘧碡藜 种类合成发咒性质不同的n f h s 粒子，适应不同实验的需要阻“。可i 冀预计硅基纳 米粒子作为种新型的光稳定嫩物标志物，在细胞生物学、超微化学与免疫检测 等领域将具肖重要应用前景。 曩兹纳涨荧蠢搽赞匏磷究较多戆是发走量子点及聚合离分子微球，它嬲交骚 了有辊染籽瀚些缺点。僵虫予豢予点黏度大、闵光瞧，穰多含有毒衾稀镛亿台 物，生物相容性差。因而在生物医学等领域受到一淑的限制。“”1 。聚合高 分子微球( 如聚苯乙烯颗粒) ，颗粒粒径较大，易于聚集，溶胀，表蕊不圆润， 发光不稳定镣阔题面限制了它农超灵敏生托分析中的成用“咖。金纳米探针帮 硅墓荧必骞l 洙探赞藕联荧走染瓣分子螽稳定性较褰，并显戆实褒较褰豹拣记率， 大大提高了分析灵敏度。但金纳米探针和硅基纳米探针的表面缺乏活憾富能团， 在标记荧光分子和生物分子前鬻引入反应活性较高的官能团。由于上述袋光探针 的缺点，因而迫切需要研究新兴获光探针。天然高分子由于具有很好的生物相容 牲帮活牲露熬瀵，班窀为基矮豹荧必探锋具有较离瓣潜在应瘸赞擅。 壳聚凝麓一耱天然多糖，其裔炎菇的生物籀容僚釉生物降解往麓，鳓箍被广 泛应用在搬物医学领域。由于壳聚糖含丰富的氨藏和羟基等活性官能团，因而易 于标记荧光分子( 分子信号物) 和偶联生物活性物质( 分子识别物) 。并且壳聚 糖易成球，因就它有可能成为制备荧光探针的良好槠料。 1 3 壳聚糖的简介 l 。3 。l 结构 壳聚糖e h i t o s 懿 铯学名为聚( 1 ，4 ) 一2 一氨萎一2 一裁氧一多一d 一蘩浆耱，是 甲壳素部分脱乙酰化而得到的一种直链大分子生物多糖。壳聚糖的结构与纤维素 很相似，并腻壳聚糖内的b 一( 1 ，4 ) 糖苷键也存在于纤维素中，不同的怒纤维素上 塞 浙江大学硕士学位论文 2 位碳的一o h 被一n h 2 取代，但它的性质却不同于纤维素。它们的结构如图1 3 。 国嘲喻o i 甲壳素壳聚糖纤维素 图1 3 壳聚糖的结构 壳聚糖是一种天然的可再生资源( 像蟹和虾壳等) ，它可以通过人工养殖得以 增长。目前，实际应用的壳聚糖主要来源于甲壳素。甲壳素( c h i t i n ) ，又名甲壳 质、壳多糖、几丁质，壳蛋白，是自然界中储量仅次于纤维素的第二天然有机化 合物。甲壳素是壳聚糖最实用的资源。壳聚糖的来源丰富，而且具有优良的生物 相容性、生物可降解性和无毒性等特性，因此大大地推动了壳聚糖应用的发展。 此外，壳聚糖分子中的活性氨基可与许多功能基反应，生成多种衍生物，这些衍 生物具有更优良的性能。 1 3 2 脱乙酰度 脱乙酰度( d e g r e eo fd e a c e 母1 a t i o n ，缩写d d ) 是壳聚糖的一个重要性质， 它决定了多糖中自由氨基的含量。壳聚糖脱乙酰度高低，直接关系到它在稀酸中 的溶解能力，粘度，离子交换能力，絮凝性能和与氨基有关的化学反应能力，以 及许多方面的应用阴”。测定壳聚糖脱乙酰度的方法有红外光谱法、酸碱电导滴 定法、气相色谱法和折光指数增量法。在这些方法中，紫外光谱法是既不破坏样 品又能精确测定壳聚糖脱乙酰度的方法，而酸碱电导滴定法是最简单而又不需特 殊仪器设备的方法汹“1 。 1 3 3 平均分子量 天然甲壳素分子量通常大于1 ，0 0 0 ，o o o ，商业用的壳聚糖产品分子量一般在 1 0 0 ，o o 一1 ，2 0 0 ，0 0 0 。这是由于在加工过程中，激烈的反应条件能导致壳聚糖降解。 壳聚糖分子量测定方法有凝胶渗透色谱法( 即g p c ) ，光散射法和粘度法等。最常 用的方法是粘度法，粘度法是测定壳聚糖分子量最简单和快速的方法。分子量高 9 浙江大学硕士学位论文 低不同，对材料物理机械性能有直接影响，如成膜性及强度等此外，分子量分 布范围宽或窄，对材料物理机械性能影响很大。这是由于天然存在的甲壳素有一 定的分子量分布，另一方面，制备过程中各种因素也会影响分子量分布，尤其是 脱乙酰化时强碱和高温影响最大阳“。 1 3 4 溶解性 壳聚糖分子的立体规整性及分子间的氢健使它在多数有机溶剂，水，碱中难 以溶解，但由于有氨基，在稀酸中当h 十活度足够，使一n h 2 质子化成一n h 3 + ，破 坏了分子间的氢健和立体规整性，使一0 h 与水分子发生水合作用，导致壳聚糖 分子膨胀而溶解口“。因此壳聚糖可溶于p h 6 的大多数有机酸中，最常用的是乙 酸和甲酸。在延长搅拌时间和加热的条件下，壳聚糖也能溶解在某些稀的无机酸， 如硝酸、盐酸、高氯酸和磷酸稀溶液中。 很多因素会影响壳聚糖溶液的粘度，如脱乙酰度、分子量、浓度、离子强度、 p h 值和温度等。壳聚糖分子量越大，粘度越大；温度升高，粘度降低。 1 3 5 应用 壳聚糖由于其生物相容性好等优点在生化领域的研究受到日益广泛的关注。 对近2 5 年来国际上对壳聚糖在生化分析与分离领域的应用研究发表的论文统计 如图1 4 。 图1 4 壳聚糖生化分析领域应用现状 1 0 浙江大学硕士学位论文 从表中可见，国际上对壳聚糖在生化领域研究应用的热起起于九十年代后 期，进入2 1 世纪得到飞速发展。目前壳聚糖在生化领域应用集中在药物缓释、金 属离子的吸附等“”1 。最早将壳聚糖用作亲和层析基质是日本学者山岸，他于 1 9 9 1 年用壳聚糖制得了一种多孔介质，具有抗菌性好、亲水性高的优点，用于蛋 白质和金属离子的吸附“，于是壳聚糖作为一种良好的层析载体材料而受到越 来越多的关注。本试验室以壳聚糖为基质制各了一系列用于蛋白质分离及固定的 材料n o ”。 1 4 壳聚糖降解 壳聚糖的分子量通常在几十万左右，当壳聚糖降解成为低分子后，其理化性 质及某些生理功能将会发生变化。不同分子量的壳聚糖具有不同功效，低分子量 壳聚糖的生理活性与它们的分子尺寸、氨基含量、物理性质和化学结构紧密相关。 因此，可控地制备特定分子量范围的壳聚糖，尤其是分子量小于1 0 万的壳聚糖， 对农业，医药及化妆品行业具有重要意义“”。1 ”3 。很多文献报道指出，壳聚糖微 球粒径主要由壳聚糖分子量决定。壳聚糖分子量越大，所制微球粒径越大，因此 为制备纳米级壳聚糖微球，需将高分子壳聚糖降解“”1 。 目前，制各低聚壳聚糖的方法主要有化学降解法，物理降解法，合成法和酶 解法四大类。 1 4 1 化学降解法 1 4 1 1 酸降解法 壳聚糖在酸性溶液中是不稳定的，会发生长链部分水解，即糖苷键断裂，形 成许多相对分子量大小不等片断，所得分子量分布比较宽，严重水解则大部分变 成单糖。酸降解法主要有醋酸法，亚硝酸法，浓硫酸法，氢氟酸法等几种。采用 酸法降解，降解过程及降解产物的分子量分布均较难控制，然而酸法降解反应试 剂廉价易得，易于实现产业化。酸降解法是制备单糖和一系列相应寡糖的主要途 径之一。 1 4 1 2 氧化降解法 浙江大学硕士学位论文 氧化降解法是目前研究较多方法，其中h 。0 ：氧化法更有大量文献报道，并已 用于生产。h 。o 。在酸性碱性及中性介质中均能氧化降解壳聚糖，生成低分子壳聚 糖和水溶性低聚糖，添加其它化学物质( 如n a c l0 2 ) 可促进h ：o ：对壳聚糖的降解 反应。在这类方法中，h 2 0 ：浓度，反应温度，反应时间及添加物的种类，数量对 产物性质有重要影响。通过大量实验研究，证实在酸性介质中用h ：o ：均相氧化壳 聚糖以制各相对分子质量分布较均匀的低分子壳聚糖和在中性介质中非均相氧 化制各水溶性低聚糖较为适宜“”。 1 4 2 酶降解法 酶降解法是用专一性或非专一性酶对壳聚糖进行生物降解的方法，能够得到 平均相对分予质量较低壳聚糖和单糖。在整个降解过程中，无需其它反应试剂， 不发生其它副反应，降解条件温和，降解过程及降解产物相对分予质量分布都较 易控制，且不对环境造成污染。但以酶降解法进行大规模的工业化生产尚有很多 困难。据报道已有3 0 多种专一性或非专一性酶可用于壳聚糖降解，专一性酶如 壳聚糖酶，非专一性酶如脂肪酶、溶菌酶、蛋白酶、元酶等”“。 1 4 3 物理场降解法 微波，超声波，y 射线等物理方式处理也可降解壳聚糖。微波降解法可使甲 壳素脱乙酰化反应与壳聚糖降解反应同时进行，这样可以降低甲壳素脱乙酰化过 程中碱的用量，减少生产成本，缩短生产周期。超声波降解壳聚糖反应温和，可 在低温下进行，且在降解过程中不会发生氨基被缔合的反应。在一定辐射剂量照 射下，y 射线能有效降解壳聚糖，使用不同的辐射剂量可得到不同分子量的产品。 但这些方法有一定局限，如：微波降解过程中容易发生交联反应，超声波降解只 适合在浓度极低的状态下进行，y 射线降解法难以得到分子量在4 0 0 0 0 以下的产 品”1 ”。 1 4 4 化学合成法 化学合成法又称酶法合成或糖转移法，在过去2 0 年取得较大进展。它建立 在酶反应基础上，是利用低聚合度寡糖在酶参与作用下，延长糖链成为高聚合度 甲壳低聚糖。糖基转移反应受温度，p h ，底物浓度和反应时间等因素影响，利 用糖基转移反应合成低聚糖，不仅可调节聚合度，而且还可通过设计基质以合成 浙江大擘硕士学位论文 特殊结秘甲壳低聚糖锈雯纺。毽楚霹翦台成法仍簸予研究阶段，即使成功，其应 用也只能怒揭限在某些寡糖的合成上“”“”。 1 5 壳聚糖微球的制备方法 壳聚糖是甲壳素脱乙酰化衍生物，是一种天然碱性多糖，来源丰寓，制各简 摹，具有叟猕懿瓣牲窥生物胡签瞧好、毒