（应用化学专业论文）生物大分子的光谱及分离纯化研究.pdf

西南科技大学硕士研究生学位论文第1 页 摘要 蛋白质及核酸的分光光度测定法具有简单、准确与快速等特点，已被广泛应用 于蛋白质、核酸等生物分子的定量分析，其研究对生命科学和分析化学都具有重大 的意义。而这些研究和应用中都需要纯净的物质，因而对所建立体系的分离、纯化 提出了要求。 利用紫外可见分光光度法研究了溴甲酚绿( x j f l ) 与脱氧核糖核酸( d n a ) 的相互作用，在t r i s h c l 缓冲溶液中( p h = 5 2 3 ) ，x j f l 与d n a 生成黄色的配合 物，吸光度与d n a 的浓度成线性关系，据此建立了该方法的最佳测试条件：实验 还研究了f l 与硫酸鱼精蛋白( p s ) 的相互作用，在b _ r 缓冲溶液中( p h = 3 9 5 ) ， x j f l 与p s 生成蓝色的配合物，吸光度与硫酸鱼精蛋白的浓度成线性关系，建立了 以f l 测试硫酸鱼精蛋白的光谱测定方法。还研究了茜素红s f e 3 + 牛血清白蛋白 ( a r s f e 一b s a ) 及茜素红s f e h 人血清白蛋白( a r s f e ”h s a ) 体系，建立了 茜素红s f e ”络合物作为光谱探针的三元研究体系，实验研究了牛血清白蛋白和 人血清白蛋白在各自体系中的酸度、温度、时间、表面活性剂等对反应的影响，以 此建立了该方法的最佳反应条件。 在光谱研究的基础上，分别对配合物茜素红s 牛血清白蛋白( a r s b s a ) 、锌 试剂牛血清白蛋白( z c n 。b s a ) 、茜素红s 人血清白蛋白( a r s h s a ) 进行了色 谱分离研究。 关键词：溴甲酚绿茜素红s 锌试剂d n a 硫酸鱼精蛋白血清白蛋白 西南科技大学硕士研究生学位论文第1 i 页 a b s tr a c t s p e c t r o m e t r yo fp r o t e i l la n dn u d e i ca c i d si sak i n do fm e t h o dw c hi ss i m p l e a c c u r a t ea 1 1 dr a p i d ，a 1 1 dh a sb e e nw i d e l yu s e dt oq u 趾t i 诅廿v ed e t e i i 】n i n a t i o no fp r o 把i n s a i l dn u c l e i ca c i d s t h es t i l d yo fb i o m 0 1 e c m e sa i l ds p e c 缸d s c o p i cp r o b e sh a st 1 1 eg r e a t m e a n 洫gf o rl i f es c i e n c ea n da l l a l y t i c a lc h e m i s t r y ，w h c r c a sp u r es u b s t a i l c ei su s e di nt h c f i e l do fr e s e a r c ha i l d 印p l i c a t i o n ，s e p a r a t i o na i l dp u r i f i c a t i o na r en e e d e d t h ei n t e r a c t i o nb e 押旧e nx j f la r l dd n aw a ss t u d i e di nt r i s h c lb u 虢rs o l u t i o n ( p h = 5 2 3 ) b yu v - ss p e c 仃o p h o t o m e t u f la 1 1 dd n a f o m l e dt h cy e l l o wc o i n p l e x t h ea b s o r b a i l c eo fs y s t e mw a sl i n e a r 谢t l lt l l ec o n c e n t r a t i o no fd n a t h eo p t i m a l c o n d i t i o n so fi n t e r a c t i o nw e r ea c q u i r e d t h ei m e m c t i o nb e t w e e nx j f la n dp r o t 锄i n e s u l f a t ew a sa l s o 咖d i e di nb - rb u 跣rs o l u t i o n ( p h = 3 9 5 ) b yu v - ss p e c 打0 p h o t o m e 仃y x j f la n dp r o t a m i n es u l f a t ef b 蛳e dt l l eb l u ec o m p l e x 1 ka b s o m m c eo fs y s t e mw a s l i n e a rw i 恤t l l ec o n c e n 扛a t i o no fp r o t a m i n es u l f 孤t h eo 埘m a lc o n d i t i o n so fi r l t e r a c t i o n w e r ea c q u i r e d t h ea r s f e 3 + b s aa n di na r s f e 3 十h s ar e a c t a l l t sw e r es t u d i e di nb y u v ss p e c 仃o p h o t o m e t r 弘t e m a r yr e a c t a n t st h a ta r s f e ”c o m p l e xw a ss e r v e da s s p e c t r o m e t r yp r o b eo f s a l b 砌i nw e r ee s t a b l i s h e d t h ee 艉c to fa c i d i t y ， t e m p e m t w e ，t i m e ，s u r f a c t a mw e r es t i l d i e d t h eo p t i m a lc o n d i t i o n so fi n t e r a c t i o nw e r e a c q u i r e d b a s e do nt 1 1 es p e c t r o s c o p i cr e s e 盯c h ，w es 印a r a t e da l i z a r i nr e ds b o v i n es e m m a l b u m i n ( a r s - b s a ) ， z i n c o n b o v i n es e m ma l b u m i n ( z c n b s a ) a n da l i z a r i nr e d s h m a ns e m ma l b u r n i n ( a r s - h a s ) c o i r 巾l e x 矗o mc o n e 印o n d i n gm i x e ds y s t e mb y c h m m a t o g r a l l l ，a i l d 咖d i e dt h em e t l l o do f p _ i l i j f i c a t i o n k e y w o r d s ：b r o m o c r e s o l 瞽e e n ；a l i z a r i nr e ds ；z i n c o n ；d n a ；p r o t a m i n es u l f a t e ； s e m ma l b u r n i n ： 独创性声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作 及取得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方 外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为 获得西南科技大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。与 我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确 的说明并表示了谢意。 签名： 韩吗驹 日期2 刚。l 馏 关于论文使用和授权的说明 本人完全了解西南科技大学有关保留、使用学位论文的规定，即： 学校有权保留学位论文的复印件，允许该论文被查阅和借阅；学校可 以公布该论文的全部或部分内容，可以采用影印、缩印或其他复制手 段保存论文。 ( 保密的学位论文在解密后应遵守此规定) 签名：舶常跏始澎牟日期：抄f 肋 西南科技大学硕士研究生学位论文第3 页 1 1 2 蛋白质光谱探针的研究现状及研究意义 生物体内重要的组成物质是蛋白质和核酸。d n a 是遗传信息的载体。但 是遗传信息的复制、传递和表达则要依靠各种蛋白质才能完成，核酸本身的 合成也是依赖于蛋白质的一个复杂过程，因此蛋白质结构的研究具有十分重 要的价值。 蛋白质分子种类繁多，结构复杂，其结构人为地分为几个层次。一级结 构：即它的化学结构。二级结构：指借助主链( 不包括侧链) 的氢键形成的具 有周期性的构象。三级结构：指1 条肽链( 包括主链和侧链) 完整折叠而形成 的构象。四级结构：指含有多条肽链的寡聚蛋白质分子中各亚基间相互作用 形成的构象。 所谓蛋白质光谱探针，就是能与蛋白质发生相互作用的无机离子、有机小 分子或络合物，这些物质与蛋白质结合生成超分子复合物，体系的光谱性质 发生变化，从而可以提供蛋白质浓度或结构方面的信息。生物学对蛋白质分 子的探针( 如抗体) 仅在特定部位通过一系列力即疏水、离子和氢健与其特 定的靶分子作用。 蛋白质的分光光度法中用小分子作为光谱探针测定蛋白质因其简便、快 速、灵敏等优点而被广泛应用，目前测定蛋白质的光谱方法。，已被广泛研究。 蛋白质的分光光度法的选择性、稳定性、重现性和对照性都很好，操作简便， 所用的显色剂来源丰富。 1 2 生化分离的发展现状、特点及研究意义和凝胶过滤屡析 分离技术是化学和化工过程中一个非常重要的单元操作，是生物化学和 分子生物学非常活跃的一个研究领域，已经发展了各种各样的化学的、物理 的分离方法。但是，各种分离方法都有它的局限性，因此在有些化学领域中， 组分的分离仍然是一个非常棘手和复杂的问题。 1 2 1 生化分离技术的发展状况 生物技术产业可以追溯到古代的酿造业，它包括酿酒、制酱油、醋、酸 奶和干酪等。古代的技术比较原始，产物基本不经过后处理而直接使用。第 一代生物技术主要是指1 9 世纪6 0 年代到2 0 世纪4 0 年代青霉素等抗生索出 西南科技大学硕士研究生学位论文第4 页 现之前的生物技术产业。这一时期发现了发酵的本质是微生物的作用，掌握 了纯种培养技术，生物技术进入了近代酿造产业的发展阶段。第二代生物技 术以2 0 世纪4 0 年代出现的青霉素产品为代表。产品的品种、类型迅速增加， 不仅有初级代谢产物，也有次级代谢产物；不仅有小分子物质，也有生物活 性的大分子物质。产品的多样性决定了分离方法的多样性。这期间借鉴和引 进了大量的近代化学工业的分离技术，据报道有8 0 的化工单元操作技术被 引入生物工业。第三代生物技术一般认为以2 0 世纪7 0 年代末崛起的d n a 重组技术及细胞融合技术为代表。在此期间，生物分离技术产业迅速发展， 1 9 8 8 年，日本由四十多家公司组建了高度分离系统技术研究联合体；瑞典的 p h a r m a c i a ，a l f a - l a v a l 等四家以先进分离技术著称的大公司组建了b i o l i n k 公司，加强了在生物分离技术领域的研究开发力量。8 0 年代以来，生物分离 技术迅速发展，出现了很多新概念、新技术、新产品和新装备。固液分离技 术、初步纯化分离技术、高级纯化分离技术迅速发展，其他新型的分离技术 如介于反渗透和超滤之间的纳米滤( n a n o f i l t r a t i o n ) 技术，由于能使水和大 部分无机盐透过而截留分子量3 0 0 1 0 0 0 u 的小分子有机物，而且操作压力 低，在生物工业和水处理领域具有广阔的应用前景。渗透蒸发技术、液膜技 术和反胶团技术研究和应用也取得了很大进展。 蛋白质类生物大分子的测定、分离、提纯、富集的方法实验及生产工艺 中目前常用的有层析法【5 1 _ 7 l 】、电泳法m - ，】、结晶m 。s 1 等方法。 根据目前现有的实验条件及其分离物质的特性，我们采用凝胶色谱对混 合体系进行分离。目前凝胶色谱在高分子化学方面应用最为广泛，是最重要 的高聚物分子量分布的测定方法。由于高聚物的许多重要的加工性能和使用 性能与高分子材料的分子量和分子量分布有关，它们的快速和可靠的测定为 高分子材料聚合过程的控制、产品规格的合理制定以及加工条件的有效选择 提供了科学的依据，因而凝胶色谱法是高分子材料的研究和生产中非常有用 的手段。它先后在生物化学、高分子化学以及其他很多领域中得到了广泛的 应用，由于它的分离基础是溶液中组分的流体力学体积，故在一定程度上讲 是一种普适型的分离技术，它的应用范围将随着它的分离度和分离范围的提 高和扩大而日益扩大。 1 2 2 生化分离的特点 由于生物技术产品众多，原料广泛，产品性质多样，用途各异，因而分 离、提取、精制的技术生产工艺及相关设备也是多种多样的，分离制备与一 西南科技大学硕士研究生学位论文第5 页 般的分离纯化技术相比有着自己的特点m 】。其特点如下：( 1 ) 生物材料组成 非常复杂；( 2 ) 有些化合物在材料中含量极微，只达万分之一，几十万分之 一甚至几百万分之一；( 3 ) 许多具有生物活性的化合物一旦离开了生物体内 的环境，很易变性、破坏，分离具有生物活性的生物分子，特别一些生物大 分子，常选择十分温和的条件，并尽可能在较低温度和洁净环境下进行；( 4 ) 生化分离方法几乎都在溶液中进行，各种参数( 温度、p h 值、离子强度等) 对溶液中各种组分综合影响常常无法固定，以致许多实验的设计理论性不强， 实验结果常常有很大经验成份；( 5 ) 生化分离方法均一性的证明与化学上纯 度概念并不完全相同。这里由于生物分子对环境十分敏感，结构与功能关系 比较复杂，故对其均一性的评定常常是有条件的，或者只能通过不同的角度 测定，最后才能给出相对的“均一性”结论。只凭一种方法所得纯度的结论往 往是片面的，甚至是错误的。 尽管它与一般化学分离方法有着许多不同特点，但生化分离方法与一般 化学分离方法、原理上又有许多地方是相同的或者是相通的。生物化学分离 制备的技术大多根据混合物中的不同组分分配率的差别把它们分配于可用机 械方法分离的两个或几个物相中( 如有机溶剂抽、盐析、结晶等) 。或者将混 合物置于某一物相中。外加一定作用力使各组分分配于不同区域，从而达到 分离目的( 如电泳、超离心、超滤等) 。 1 2 3 分离、纯化的意义 蛋白质提纯的总目标是设法增加制品纯度或比活性，对纯化的要求是合 理的效率、速度、收率和纯度，将需要蛋白质从细胞的全部其他成分特别是 不想要的杂蛋白中分离出来，同时仍保留有这种多肽的生物学活性和化学完 整性。 蛋白质类生物分子在组织或细胞中一般都是以复杂的混合物形式存在， 每种类型的细胞都含有成千种不同的蛋白质。蛋白质的分离和提纯工作是一 项十分艰巨而繁重的任务，到目前为止，还没有一个单独的或一套现成的方 案能把任何一种蛋白质从复杂的混合物中提取出来，但对任何一种蛋白质都 有可能选择一套适当的分离提纯程序来获取高纯度的制品。 在科学研究及试剂应用中我们需要的蛋白质、核酸光谱探针及其配体应 该是纯净的，对混合体系进行分离具有极其重要的意义，它直接关系着光谱 探针的实际应用及研究的目的和意义。经过分离、提纯后的生物物质需要用 一定的物力或化学方法富集起来，以便用于科学研究和实际应用。 西南科技大学硕士研究生学位论文第6 页 1 2 4 凝胶过滤层析法 生物分离的方法有以下几种：层析法、膜分离( 超滤) 、树脂分离、电泳 法、沉淀、结晶等方法。在本文我们主要介绍实验中所用的凝胶层析法。 层析是根据混合物中，溶质在互不相溶的两相之间分配行为的差别，引 起移动速度的不同而进行分离的方法。互不相溶的两相分别称为固定相和流 动相。固定相填充于柱中，在柱的顶端加入一定量的料液后，连续输入流动 相，料液中的溶质在流动相和固定相之间发生扩散传质，根据分配系数的不 同进行分离。 凝胶过滤层析法也称分子筛层析法，是指混合物随流动相经过层析柱时 各组分按其分子大小不同而被分离的技术。该法设备简单、操作方便、操作 性好、回收率高，故常除了常用于分离纯化蛋白质、核酸、多糖、激素等物 质外，还常用于测定蛋白质的相对分子量，以及样品的脱盐和浓缩等。由于 整个层析过程中一般不变换洗脱液，有如过滤一样，又称凝胶过滤。 凝胶是一种不带电荷的，具有三维空间的多孔网状结构，是呈珠状颗粒 的物质，每个颗粒的细微结构与筛孔的直径均匀一致，小的分子可进入凝胶 网孔，而大的分子则排阻于颗粒之外。当含有分子量大小不同的混合样品加 到凝胶颗粒装填而成的层析柱上时，被流动相带入层析柱内，这些物质即随 着洗脱液的流动而发生移动，就在固定相和流动相之间不断进行分配平衡。 大分子物质沿凝胶颗粒间隙随洗脱液移动，流程短，移动速度快，先被洗出 层析柱，小分子物质可通过凝胶网孔进入颗粒内部，然后再扩散出来，流程 长、移动速度慢，最后被洗出层析柱，从而使样品中不同大小的分子得到分 离。 1 2 4 1 分离机理 凝胶分离柱的总床体积( v ：) 由三部分组成：凝胶颗粒之间液体的体积 ( 外水体积) v o ；颗粒内所含的液体体积( 内水体积) v i ；凝胶颗粒本身的 体积v 。，即v i _ v o + v i + v 。每个溶质分予在流动相和固定相之间有一个特 定的分配系数k d 。它的洗脱体积v 。为v 。一v o + k d v i ，k d = ( v 。一v o ) v i 。 当k d = 0 时，v 。= v o ，即溶质分子完全不能进入凝胶颗粒内，被排阻于颗 粒孔之外而最先被洗脱出来：当k d = 1 时，溶质分子完全向颗粒内扩散。一 般情况下，0 k d 1 。 1 2 4 2 凝胶的类型及应用选择 层析用的凝胶都是三维空间的网状高聚物，有一定的孔径和交联度。它 西南科技大学硕士研究生学位论文第7 页 们不溶于水，但在水中有较大的膨胀度。具有良好的分子筛功能。它们可分 离的分子大小的范围比较广，相对分子质量在1 0 2 1 0 8 范围之间。在柱层析 分离中常用的凝胶有交联葡聚糖凝胶、琼脂糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶、交联 葡聚糖l h 一2 0 和s e p h a c r y l 。 交联葡聚糖凝胶，商品名为s e p h a d e x ，按其交联度大小分成8 种型号。 交联度越大，网状结构越紧密，孔径越小，吸水膨胀就愈小，故只能分离分 子量较小的物质；交联度越小，孔径就越大，吸水膨胀大，则可分离相对分 子量较大的物质。交联葡聚糖凝胶在水溶液、盐溶液、碱溶液、弱酸溶液和 有机试剂中较稳定，但当暴露于强酸或氧化剂溶液中时，则易使糖苷键水解 断裂。在中性条件下，交联葡聚糖凝胶悬浮液能耐高温，用1 2 0o c 消毒3 0 分钟而不改变其性质。如要在室温下长期保存，应该加入适量的防腐剂，如 氯仿、叠氮钠，以免微生物生长。交联葡聚糖可用于分离蛋白质、核酸、酶、 多糖、多肽、氨基酸、抗生索，可用于高分子物质样品的脱盐以及测定蛋白 质的相对分子量。 琼脂糖凝胶由d - 半乳糖和3 ，6 位脱水的l 半乳糖连接构成的多糖链， 在温度1 0 0o c 时呈液态，当下降至4 5o c 以下时，它们之间相互连接程线性 双链单环的琼脂糖，再凝聚就成为琼脂葡聚糖凝胶。琼脂糖凝胶的机械强度 和筛孔的稳定性均优于交联葡聚糖凝胶。 丙烯酰胺凝胶由丙稀酰胺与交联剂双丙稀酰胺交联聚合而成。 交联葡聚糖l h 一2 0 是亲脂性交联葡聚糖的衍生物。 s e p h a c r y l 是由烷基葡聚糖与双丙烯酰胺共价交联而成。可用于蛋白质、 核酸、多糖及蛋白质，甚至大的病毒颗粒的分离。 1 2 4 3 葡聚糖凝胶层析法分离过程 图卜l 为层析示意图，简单表示出了层析柱的构造，分离原理。左图为 层析柱的构造图，中图为进样图，右图为分离原理图，迸样后大分子物质从 凝胶之间的空隙中经过，流程较短，所以先出来；小分子进入凝胶内部后， 流程较长，后出来。 西南科技大学硕士研究生学位论文第8 页 圈1 1层析示意图 fg 1 1c h r o m a t o g r a p hs k e t c hm a p 1 3 课题来源 本项目“生物大分子的光谱及分离纯化研究”，是教育部重点研究项目 ( 0 2 1 2 6 ) 及教育部自然科学基金资助项目( 2 0 0 2 c 0 4 ) ；并受“新型生物探针 标记物的化学标记及分析方法的机理研究”国家自然科学基金项目 ( 4 0 0 7 2 0 2 0 ) 的资助。 1 4 本文拟解决的问题及课题设计 综合以上的论述，蛋白质类生物大分子探针的光谱及分离纯化研究具有 十分重要的意义，在生产、生活中有广泛的应用。利用光谱探针在生物分析 化学中的操作简便、灵敏度高，选择性好等特性，在本论文中，结合实际应 用的角度和实验室现有条件，拟解决以下问题： f 1 ) 二元体系的研究 实验采用紫外一可见分光光度法选择溴甲酚绿( x j f l ) 作为光谱探针， 建立了溴甲酚绿一脱氧核糖核酸( x j f l d n a ) 及溴甲酚绿硫酸鱼精蛋白 ( x j f l p s ) 的研究体系，研究了二元反应体系x j f l d n a 及x j f l p s 体系。 实验还研究了d n a 、p s 在各自体系中的酸度、加入顺序、温度、时间、离 子强度、表面活性剂等基本情况，以此建立了上述研究体系及相应的检测方 西南科技大学硕士研究生学位论文第9 页 法及手段。 ( 2 ) 三元体系的研究 实验采用紫外可见分光光度法研究了茜素红s f e 3 + 牛血清白蛋白 ( a r s f e 3 + b s a ) 及茜素红s f e 3 + 人血清白蛋白( a r s f e 3 十h s a ) 体系， 建立了a r s f e 配合物作为光谱探针的研究体系。实验还研究了b s a 和 h a s 在各自体系中的酸度、温度、时间、离子强度、表面活性剂等基本情况， 以此建立了上述研究体系及相应的检测方法及手段。 ( 3 ) 分离纯化的研究 在上一步工作的基础上，采用凝胶层析手段，在室温和对应的酸度条件 下，通过进行对牛血清白蛋白茜素红s ( b s a a r s ) 、牛血清白蛋白埠# 试剂 ( b s a z c n ) 及人血清白蛋白茜素红s ( h a s a r s ) 体系的分离纯化，找 到了分离体系的条件实验，建立了牛血清白蛋白茜索红s 、牛血清白蛋白 锌试剂及人血清白蛋白一茜素红s 化学结合反应的分离纯化的研究体系。 西南科技大学硕士研究生学位论文第10 页 2 j f l 与d n a 及硫酸鱼精蛋白的分光光度研究 有关d n a 染色测定的分光光度研究已有不少报道，其中有些已用于 d n a 的分析测试，本实验首次发现了溴甲酚绿( x j f l ) 与d n a 作用生成黄 色配合物，并研究了反应的基本条件，建立了以x j f l 作为光谱探针测定d n a 的紫外可见分光光度法。 硫酸鱼精蛋白( p s ) 是一种重要的蛋白质，它可作为抗肝索的特效药物 等多种用途；另外，还它还可作为防腐剂，食品添加剂等，在日常生活中有 重要的作用，因此对于p s 的显色测定具有重要的价值。 本方法具有操作简便，灵敏度高，重现性好，体系稳定等特点。 文中所标浓度为测试浓度。 2 1 x j f l 与d n a 的作用 2 1 1 实验部分 2 1 1 1 主要仪器及试剂 t u 一1 8 0 0 s p c 分光光度计( 北京普析通用仪器有限公司) ；酸度计( 美国， t h e r m oo r i o n ) ；恒温制冷加热水浴( 丹麦，h e t o ) ；移液器( 德国，e p p e n d o r f ) ： 梅特勒电子天平( 成都伯乐科技有限公司) ； 牛血清白蛋白( b s a ) ( 上海丽珠东风生物技术有限公司) ；腺嘌呤 ( a d e n i n e ) ( s i g m aa 8 6 2 6 北京欣经科技生物技术公司) ；脱氧核糖核酸 ( d n a ) ( s i g m a c h e m i c a l c o ) ；尿嘧啶( u r a c i l ) ( s i g m a c h e m i c a l c o ) ；胞 嘧啶( c y t o s i n e ) ( s i g m a c h e m i c a l c o ) ；胸腺嘧啶( t h y m i n e ) ( s i g m a c h e m i c a l c o ) ；溴化十六烷基三甲胺( 进口分装上海化学试剂站) ；十二烷基硫酸钠 ( 进口分装上海化学试剂站) ；t r i s 川c l 缓冲溶液：t r i s ( a n g u s 7 7 - 8 6 1 北 京欣经科技生物技术公司) ；盐酸( h c l ) ( 成都方州化学试剂厂) 标准溶液： k + 2 0 m g l ；c a 2 + 2 2 m g l ；m 9 2 + 2 0 m g l ；z n 2 + 2 0 m g l ；c u 2 + 2 0 m g l ； p b 2 + 1 0 0 m g ，l 。 其它无机试剂均为分析纯，所用水为二次蒸馏水。 2 1 1 2 实验方法 最焦巨h 值选搔：在一系列1 0 m l 的比色管中依次加入1 o m l 浓度为 西南科技大学硕士研究生学位论文第11 页 4 1 3 1 0 。m o l l 的x j f l 溶液，2 o m l 不同p h 值的t r i s h c l 溶液和2 o m l 浓 度为6 0 9 1 0 。m o l ，l 的d n a 溶液，用二次蒸馏水稀释至刻度，摇匀，以二 次蒸馏水为参比，采用l c m 石英比色皿测定溶液的吸光度。 拯壅兰佳些线：在一系列1 0 m l 比色管中依次加入1 o m l4 1 3 1 0 4 m o l l 的x j f l 溶液，2 0 m lp h 值为5 2 3 的t r i s h c l 溶液和不同浓度的d n a 溶液， 用二次蒸馏水稀释至刻度，摇匀，以试剂空白为参比，采用1 c m 石英比色皿 测定溶液的吸光度。 王盐厦廑：在l o m l 比色管中依次加入2 o m l 浓度为4 1 3 1 0 4 m o l l 的 x j f l 溶液，2 0 m lp h 值为5 2 3 的t r i s h c l 缓冲溶液和2 0 m l 浓度为 6 0 9 1 0 4 m o l l 的d n a 溶液2 0 m l 的d n a 溶液，然后加入不同的干扰物质 1 0 m l ，以二次蒸馏水稀释至刻度，摇匀，以试剂空白为参比，采用1 c m 石 英比色皿测定溶液的吸光度。 2 1 2 结果与讨论 2 1 2 1x j f l 与d n a 的吸收光谱 定量加入x j f l ，在2 0 0 8 0 0 n m 的波长范围内扫描测定，x j f l 的最大 吸收波长为4 4 4 n m 和6 1 6 n m ，溶液为绿色。向体系中加入d n a 后反应，溶 液迅速变为黄色，最大吸收波长为4 4 4 n m ，结果见图2 1 。随着d n a 量的增 大，黄色加深，吸光度与d n a 的浓度呈线性关系，服从朗伯比尔定律。 姻 l 蚓，k ，fl | 弋 搬 图2 1x j f l 一0 n 体系吸收光谱图 f i g 2 1s p e c t r ao fx j f la n dd n c o m d ie x 1 x j f l ；2x j f l d n c n ，l = 41a 1 0 m o l l ；c = 12 2 x 1 0 一m o i l 西南科技大学硕士研究生学位论文第12 页 2 1 2 2 最佳p h 值的选择 圃定x j f l 和d n a 的量，使其在一系列不同p h 的t r i s - h c l 缓冲溶液中 反应，以相应的p h 的t r i s h c l 试剂空白作参比，测定吸光度。结果见图2 2 。 实验选用p h 5 2 3 的t r i s - h c l 缓冲溶液作为测定的酸度条件。 p h 图2 2p h 对x j f l d n 体系吸光度的影响 fjg 2 2e f f e c to fp ho na b s o r b a n c eo fx j f l d n c o m ple c l = 41 3 1 0 一_ o i l c _ = 12 2 o m o l 儿 p h ：37 0 3 9 8 42 4 4 46 6 4 9 0 51 0 52 3 ，5 4 55 6 56 8 2 1 2 3 反应温度及时间对反应体系的影响 固定x j f l 、d n a 的量及缓冲溶液的p h 值，分别在1 7 、3 0 、4 0 等不同温度及不同时间下反应，测其吸光度，结果见图2 3 。实验说明： ( 1 ) 该体系反应很快，加入d n a 后x j f l 溶液立即由绿色变为黄色， 3 5 m i n 后达到最大并稳定： ( 2 ) 体系基本稳定，在3 5 m i n 后的8 5 分钟内，吸光度变化相对偏差小于 3 2 ： ( 3 ) 随着温度的升高，吸光度略有下降，但下降不多，可认为温度对反 应影响不大。 西南科技大学硕士研究生学位论文第13 页 口口a 0 0 4口；瓤 a_|口鼻口 1 z 口 t 耐n 圈2 3反应温度、时间对体系吸光度的影响 fig2 3 e f f e c to ftim ea n dt e m p e r a t u r eo nt h ea b s o r b a n c e c l = 4 3 1 0 m o i l ：c = 12 2 1 0 一m o i 儿： ”3 0 4 0 2 1 2 4 试剂加入顺序对体系吸光度的影晌 固定参与反应的各种物质的含量改变加入顺序，分别测定吸光度，实验 结果表明，试剂的加入顺序对体系的吸光度没有影响。 2 1 2 5 标准工作曲线 d n a 与涣甲酚绿结合后光谱性质发生变化，当我们固定x j f l 的薰及缓 冲溶液的口h 值，依次加入不同量的d n a ，即改变d n a 的浓度时，可以得 到溶液的吸光度随d n a 浓度变化的曲线，反应个小时。在一定范围内， 随着d n a 浓度的增大，吸光度值与d n a 浓度呈线性关系，符合朗波比尔 定律；当浓度达到一定范围，随着d n a 浓度的增大，吸光度值与d n a 浓度 的变化出现另一斜率，根据摩尔比法原理，我们作圈2 4 。 从图2 4 可以看出：d n a 浓度在o 6 l 7 3 0 1 0 。7 m o l ，l 的范围内线性关 系较好。在d n a 浓度为9 6 9 l o 。7 m o l l 以后曲线开始出现另一斜率。通过拟 合，绘制出这两段的回归方程直线。两直线相交于一点，该点对应的d n a 浓度为c d n a = 9 6 9 1 0 。m o l l 。已知x j f l 的浓度c x j f l = 4 1 3 1 0 4 m o l 几，则 d n a 与x j f l 的最大结合数为n = 4 3 。由朗伯比尔定律可以求得表观摩尔吸 光系数= 1 7 0 1 0 5l - c m m o l ，离解度a = o 1 6 ，最低检出限 西南科技大学硕士研究生学位论文第14 页 c = 7 7 4 1 0 。8 m o l ，l 。 目前普遍认为，小分子与d n a 以非共价键的作用，主要有静电结合、 沟渠结合和嵌插结合3 种方式肿1 。小分子物质与d n a 作用的方式与二者的 分予结构、分子构象及电子云分布密切相关。有些有机小分子与d n a 的结 合方式随p h 值的变化而有所不同，如中性红与小牛胸腺d n a 作用，随着溶 液p h 值的改变，中性红与小牛胸腺d n a 之间相互作用的方式也随之改变。 在p h = 7 0 时，二者的作用方式主要为嵌插作用，当p h = 6 o 时，二者主要的作 用方式改变为静电作用。其原因是由于中性红在p h = 7 0 的溶液中以中性分 子形式存在，而在p h = 6 0 的溶液中，中性红以质子化的正离子形式存在f 9 0 1 。由 于时间的关系，本论文没有对d n a 与溴甲酚绿的反应机理做详细的探讨。 014 012 010 o0 6 oo e o0 4 o0 2 c ，1 o x1 0 4 m o l - l 。1 图2 4x j f l d n 标准曲线 fig 2 4s t a n d a r dc u r v e so fx j f l d n c l = 413 x 1 0 m o i l 2 1 2 6 离子强度对反应体系的影响 固定x j f l 、d n a 的量及溶液的p h ，加入不同浓度的n a c l ，测定相应 的吸光度，结果见图2 5 。 由图2 5 可知：随着体系中n a c l 浓度的增大，吸光度减小，灵敏度降 低，这是由于共存离子对体系的电荷起竞争和屏蔽作用，阻碍了溴甲酚绿 与d n a 结合。因此，离子浓度越大，结合数就越低，表现为吸光度减小， 灵敏度降低。 西南科技大学硕士研究生学位论文 第15 页 v ，m 图2 5离子强度对x j f l d n 体系吸光度的影响 f ig 2 5 e f f e c to fs tr e n g t ho nt h er e a c t l o no fx j f l 一0 n c # m = 4 3 1 d 。舯i l ：c t = l2 2 1 0 i l ( h c 1 ) ：o0 0 00 ”1 00 2 r 00 5 v 01 0 2 1 2 7 不同类生物物质及各种离子对反应体系的影晌 固定x j f l 和d n a 的量及体系的反应条件，分别加入不同量的各种生物 试剂、离子，测定其吸光度，结果见表2 1 。 由表2 1 知：上述生物物质在此条件下与x j f l 有一定程度的响应；金 属离子对体系影响较大，p b 2 + 与c a 2 + 在一定程度上使体系吸光度的值增大。 生物物质中，蛋白质和核苷酸有一定的影响。 可以采用采用掩蔽的方法对溶液的存在的p b 2 + 、c a 2 + 进行处理，金属离 子掩蔽法主要有络合掩蔽法、沉淀掩蔽法、氧化还原掩蔽法，如沉淀掩蔽法 可以用c 0 3 2 + 离子让其进行沉淀处理，但是当离子含量非常低时用离子沉淀 法很难除净其中含有的p b 2 + 、c a 2 + ，可以用氧化还原掩蔽法使其中的p b 2 + 氧 化为p b 4 十，用络合掩蔽法使其中的c a 2 + 与e d t a 络合剂形成络合物而不影响 d n a 的测定，对于不同的金属离子要采用不同的方法进行处理。对于生物物 质中蛋白质的影响可以在测定前用饱和硫酸铵溶液进行处理，使样品中蛋白 质沉淀，用离心机分离，离心分离法适用于各种密度的蛋白质的分离；由于 核营酸是小分子物质可以用色谱方法进行分离。 慵 博 懵 蚶 埘 册 舢 衄 如 玑 a 乱 口 d n o a 口 d 西南科技大学硕士研究生学位论文第16 页 表2 1干扰物质的影响 t a be 2 1 e f f e c to fin t e r f e rn gs u b s t a n c e s 2 1 3 结论 紫外一可见分光光度法研究表明：x j f l 与d n a 相互作用随着p h 值的不 同而变化，p h 值对体系的影响较大，实验选用p h 5 2 3 的t r i s h c l 作为体系 的缓冲溶液；反应温度、时间对体系的较小的影响，故实验选用在常温条件 下进行；离子强度对反应的影响不大，随着离子强度的增大，反应的结合数 有所减小：某些生物物质及金属离子有一定程度的响应，因为x j f l 可以和 些生物物质发生反应预先除去蛋白质后进行测定；x j f l 作为光谱探针， 操作简单、方便、省时。 2 2 x j f l 与硫酸鱼精蛋白的作用 2 2 1实验部分 西南科技大学硕士研究生学位论文第17 页 2 2 1 1 主要仪器及试剂 t u 1 8 0 0 s p c 分光光度计( 北京普析通用仪器有限公司) ；酸度计( 美 国，t h e r m oo r i o n ) ；恒温制冷加热水浴( ( 丹麦，h e t o ) ：移液器( 德国， e p p e n d o r f ) ；梅特勒电子天平a l 2 0 4 ( 成都伯乐科技有限公司) ； 硫酸鱼精蛋白( p r o t a m i n es u l f a t e ) ( p s ，上海化学试剂厂) ；牛血清白蛋白 ( b s a ) ( 上海丽珠东风生物技术有限公司) ；腺嘌呤( a d e n i n e ) ( s 塘m a a 8 6 2 6 北京欣经科技生物技术公司) ；脱氧核糖核酸( d n a ) ( s i g m a c h e m i c a lc o ) ；尿嘧啶( u r a c i l ) ( s i g m ac h e m i c a lc o ) ；胞嘧啶( c y t o s i n e ) ( s i g m ac h e m i c a lc o ) ；胸腺嘧啶( t h y m i n e ) ( s i g m ac h e m i c a lc o ) ；溴化 十六烷基三甲胺( c t a b )( 上海化学试剂站) ；十二烷基硫酸钠( s d s ) ( 上 海化学试剂站) ；b r 缓冲液( 由0 0 4 m o l l 的磷酸、冰醋酸、硼酸和o 2 m o l l 的氢氧化钠溶液按一定的比例配制丽成) 标准溶液：k + 2 0 m g ，l ；c a ” 2 2 m g l ：m g ”2 0 m g l ；z n ”2 0 m l ；c u ”2 0 m g l ；p b ”l o o m g l 。 其它无机试剂均为分析纯，所用水为二次蒸馏水。 2 2 1 2 实验方法 基建乜珏值选捶：在一系列1 0 m l 比色管中依次加入1 o m l 浓度为 4 1 3 1 0 4 m o l l 的x j f l 溶液，2 o m l 不同口h 值的b r 缓冲溶液和3 0 m l 浓 度为1 1 0 m g ，l 的硫酸鱼精蛋白( p r o t a m i n es u l f a t e ，p s ) 溶液，用二次蒸馏水 稀释至刻度，摇匀，以二次蒸馏水为参比，采用1 c m 石英比色皿测定溶液的 吸光度。 拯准王佳茴线：在一系列l o m l 比色管中依次加入1 o m l 浓度为 4 1 3 1 0 4 m o l l 的x j f l 溶液，2 0 m ld h 值为3 9 5 的b r 缓冲溶液和不同浓 度的硫酸鱼精蛋白溶液，用二次蒸馏水稀释至刻度，摇匀，以试剂空白为参 比，采用l c m 石英比色皿测定溶液的吸光度。 壬垃厦廑：在1 0 m l 比色管中依次加入1 o m l 浓度为4 1 3 1 0 4 m o l l 的 x j f l 溶液，2 0 m lp h 值为3 9 5 的b r 缓冲溶液和3 o m l 浓度为1 1 0 m g ，l 的硫酸鱼精蛋白溶液，然后加入不同的干扰物质1 o m l ，以二次蒸馏水稀释 至刻度，摇匀，以试剂空白为参比，采用l c m 石英比色皿测定溶液的吸光度。 2 2 2 结果与讨论 2 2 2 1 吸收光谱 定量加入x j f l ，在2 0 0 8 0 0 n m 的波长范围内扫描测定，x j f l 的最大 西南科技大学硕士研究生学位论文第18 页 吸收波长为6 1 6 n m ，溶液为绿色。向体系中加入p s 后迅速变为蓝色，最大 吸收波长为6 2 3 n m ，x j f l 与硫酸鱼精蛋白结合生成了二元配合物x j f l p s ， 吸收光谱图见图2 6 。 八l 2 ( ， 吣，逝煎1 、一， 文 地 图2 6x j f l p s 体系吸收光谱豳 f jg2 6 s p o c t r ao fx j f la n dp r o t a m in es uj f a t ec o m p i e x 1 x j f lf 2x j f l p s ；c i j r l = 41 3 1 0 一m 。i l p _ ，兰3 66 7 m # l 2 2 2 2 p h 值对反应体系的影响 p h 圈2 7p h 对x j f l p s 体系吸光度的影响 fg 2 7e f f e c to fp ho n8 b s o r b a n c eo fx j f l p sc o m pie x c i 叭= 41 3 1 0 们i l ；ph = 3 68 7 _ g 儿 p h ；32 8 3 4 7 3 6 9 3 9 5 4 f 8 4 2 5 i 3 4 4 5 4 4 7 0 48 4 西南科技大学硕士研究生学位论文第19 页 固定硫酸鱼精蛋白和溴