（应用化学专业论文）酶工程技术制备右旋糖酐的研究.pdf

摘要张j j 域台肥t 业人学顾l 学位论文 酶工程技术制备右旋糖酐的研究 摘要 本论文通过对肠膜状明串珠菌- 0 3 2 6 ( l e u c o n s t o cm e s e n t e r i o d e s ) 发酵工 艺、产酶条件及右旋糖酐蔗糖酶固定化技术的研究获取右旋糖酐生产技术升级 的基础数据。提出利用酶工程技术改造现有传统发酵。使其技术升级， 提高产品质量、改普生产环境。为连续化生产，酶重复利用、右旋糖 酐分子量可控打下基础。 首先对由肠膜状明串珠菌l m - 0 3 2 6 ( m e s e n t e r i o d e s ) 发酵生产右旋精酐 的工艺过程及产酶条件进行了探讨。通过对其发酵过程中的粘度、p h 值、果糖、 右旋糖酐生成、分子量变化的研究及对发酵诱导物的考察得到了右旋糖酐发酵 工艺的相关工程曲线，据此提出通过定向发酵法生产不同分子量右旋糖酐的相关 工艺条件。其产酶最优化条件为：含5 左右蔗糖的培养基适宜产酶且产品易分 离：3 5 时产酶量最大：p h 8 0 酶活较高：m n 和c a 。的协同作用可使酶活有较 大提高。 在以上实验研究的基础上研究获得了海藻酸钠固定化右旋糖酐蔗糖酶的 工艺条件，并通过对固定化酶连续反应过程中流速流向底物蔗糖浓度，温度 以及p h 值等参数的控制和考察，得到填充床中连续反应的最佳条件为：顺流 3 0 的蔗糖，转速6 0 r p m 温度2 8 - - 3 0 c ，p h 4 5 一j 5 。但流化床模型比填充床模 型产量更高。 最后以壳聚糖为载体，研究了粉状、珠状两种形态的壳聚糖的制备：以戊 二醛为交联剂，采用麸价交联法固定化右旋糖酐蔗糖酶，研究其固定化效果结果。 得到：固定化5 h 、酶量为l jm i ( 5 4 6 n m 吸光度为0 j 左右) 、p h 为5 、戊二醛 浓度为1 0 、温度为2 j 为壳聚塘右旋糖酐蔗糖酶最佳固定化条件。 关键词：右旋糖酐右旋糖酐蔗糖酶蔗糖肠膜状明串珠菌 藻元酸钙壳聚糖固定化 e f l t 斌合肥t 业人学硕i ：学位论文 s t u d i e so fd e x t r a np r e p a r a t i o nb ye n z y m e e n g i n e e r i n gt e c h n o l o g y a b s t r a c t i nt h i sp a p e r , t h eb a s i cd a t ao fu p d a t i n gd e x t r a np r o d u c t i o n a lt e c h n o l o g yw a s a t t a i n e d b ys t u d y i n gf e r m e n t a t i o np r o c e s so fl e u c o n o s t o cm e s e n t e r i o d e s - 0 3 2 6a n d p r o d u c i n g d e x t r a n s u c r a s ec o n d i t i o na n dt h ei m m o b i l i z a t i o n t e c h n o l o g y o f d e x t r a n s u c r a s e r e f o r m i n gt r a d i t i o n a lf e r m e n t a t i o nt e c h n o l o g yw a sb r o u g h to u tb y m a k i n gu s eo fe n z y m a t i ce n g i n e e r i n g ，r e s u l t i n gi np r o m o t i n gd e x t r a np r o d u c t i o n a l t e c h n o l o g y , r a i s i n gp r o d u c tq u a l i t ya n di m p r o v i n gp r o d u c t i o ns u r r o u n d i n g s i tl a i dt h e f o u n d a t i o no f s e q u e n t i a l p r o d u c t i o n，r e u s i n g e n z y m e a n d c o n t r o l l i n g m o l e c u l a r w e i g h to f d e x t r a n f i r s t l y ，t h ep r o c c s si nt h ep r e p a r a t i o no fd e x t r a nt h r o u g ht h ef c r m e n t a t i o no f l e u c o n o s t o cm e s e n t e r i o d e s - 0 3 2 6a n dc o r r e l a t i v ef a c t o r so fp r o d u c i n gd e x t r a n s u c r a s e w e r es t u d i e di nt 1 1 ep a p e r n l ea d h e s i v ev i s c o s i t y p hv a l u e t h ep r o d u c t i o no f f r u c t o s ea n dd e x t r a n ，v a r i a t i o no fm o l e c u l a r - w e i g h ta n dt h ef e r m e n t a t i o ni n d u c e rw a s r e s e a r c h e d ，a n dt h er e l a t e de n g i n e e r i n gc u r v eo ft h ed e x t r a nf e r m e n t a t i o nw a s a c q u i r e d d i f f e r e n tm o l e c u l a r - w e i l g h to fd e x t r a nm i 【9 1 1 t b eo b t a i n e db yd i r e c t e d f e r m e n t a t i o no nt h i sb a s e t h eo p t i m i z a t i o nf a c t o r so fp r o d u c i n gd e x t r a n s u c r a s ef r o m m e s e n t e r i o d e s - 0 3 2 6w e r et h a tt h ec u l t u r em e d i u mo f a b o u t5 s u c r o s ew a so p t i m a l c o n d i t i o no fp r o d u c i n gd e x t r a n s u c r a s ea n dt h ep r o d u c tw a se a s yt ob ei s o l a t e d ，t h e y i e l do fd e x t r a n s u c r a s er e a c h e dm a x i m u ma t3 5 1 2 ，d e x t r a n s u c r a s ea c t i v i t yw a sr a i s e d r a p i d l yt h r o u g i lt h ec o o p e r a t i o no f m n ”c a ”o ra tp h 8 0 s e c o n d l yb a s e do nt h er e s u l t so ft h ee x p e r i m e n t sa b o v e w eo b t a i n e d t h e t e c h n o l o g yc o n d i t i o n sa n dm e t h o do ft h ei m m o b i l i z a t i o no fd e x t r a n s u c r a s eb ys o d i u m a l g i n a t e a n dd u r i n gt h ec o u r s eo fc o n t i n u o u sr e a c t i o ns o m ep a r a m e t e r ss u c ha si n d i f f e r e n t f l o w i n gv e l o c i t y ( r o u n d sp e rm i n u t e s ) ，f l o w i n gd i r e c t i o n ，c o n c e n t r a t i o n o f s u b s t r a t es o l u t i o n ( s u c r o s e ) ，t e m p e r a t u r e ，p hv a l u ew e r ec o n t r o l l e da n di n v e s t i g a t e d t h eo p t i m u mc o n d i t i o n sf o rd e x t r a n p r o d u c t i o n i n p a c k e d b e dr e a c t o rw e r e d o w n - f l o w i n gd i r e c t i o nf e e d i n g ，3 0 s u c r o s e ，6 0 r p m ，t 2 8 - 3 0 c ，p h 4 5 5 5 b u t t h ef l u i d i f y i n g b e dr e a c t o rm o d e li sb e t t e rt h a nt h ep a c k e d f i n a l l yw et o o kc h i t o s a na st oc a r r i e r r e s e a r c h i n gt h er e s u l tt h a tt w ok i n d so f a p p e a r a n c eo fc h i t o s a n ：p o w d e rf o r ma n db e a df o r mt oi m m o b i l z et h ed e x t r a n s u c r a s e t h er e s u l ti n d i c a t e dt h a tt h eo p t i m u mi m m o b i l i z i n gc o n d i t i o ni st h a tt e m p e r a t u r e ： 2 5 ，p h ：5 0 ，a m o u n to f e n z y m e ：1 5 m l ，d e n s i t y o f g l u t a r a l d e h y d e ：1 o ，5 h k e yw o r d s ：d e x t r a n ：d e x t r a n s u c r a s e ：s u c r o s e ；l e u c o n s t o cm e s e n t e r i o d e s ： c a l c i u ma l g i n a t e ； g u l t a r a l d e h y d e ： i m m o b i l i z a t i o n 合肥工业大学 本论文经答辩委员会全体委员审查，确认符合 合肥工业大学硕士学位论文质量要求。 答辩委员会签名： 主席：俪多钟 委员： 弘贺翔鹚筒绷 移刊 导师 ：幻少气， d 季仇 独创性声明 本人声明所提交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果据 我所知除了文中特别加以标注和致谢的地方外论文中不包含其他人已经发表或写过的研 究成聚也不包含为获得盒疆! ：些厶芏或其它救育机构的学位或证书而使 用过的材料与我一同l ：作的同占对本研究的所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明 井表示谢意 学位论文作青签名：哮，；弧 签字日期： 。印年7 月驴日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作青完全了解佥墨! ：些厶翌有荚保留、使用学位论文的规定有权保留并 向园家有芙部】或机构送交论文的复印佧和避盘允许论文拔轰阅和借阅本人授权盒壁 ! ：些厶堂可以将学位论文的全部或部分内容编入有天数据库进行捡索可以采刚影印、缩 印或扫描等复制手段保存汇编学位论文 ( 保密的学位论文牲解密后适 i 本授投l 学侥论文作青签字：弓氍l 重5 氏 签字日期：0 4 年 月日 f 掌羹兰耄： 黼枷袍 工作单位：蟊群。当峨缈”2 l 移 通讯地址： 导师肄知w 懂 签字日期：口v 年) 月鲈日 电话：谚。m 邮编： 致谢张淤斌台肥t 业人学硕f ：学位论文 致谢 本论文的研究工作是在导师姚同生教授的悉心指导和关心帮助下完成的。在 近三年的研究生生活中，导师不仅在研究上给予谆谆教导和大力支持还给予学 习和生活上的热心关怀和理解帮助使得我不仅顺利完成了学业，而且收益非浅。 恩师的言传身教让我明白了科研工作的真谛，也让我明白了做人的道理。 再此，谨向恩师致意晟衷心的感谢和最崇高的敬意。 此外，在本课题的完成过程中尤亚华老师、邓胜松老师、朱慧殁老师的大 力支持和指导，同时对曾经与我一起傲研究的高文霞、杨小明、刘跃进、邵胜男、 褚宏等同学以及方世东、何洪波、孙敏及徐玉福等同学的帮助，在此也一致表 示最忠实的感谢! 同时对我的亲人们给予我的辅神及学习生活上的鼓励、关怀、 支持和帮助也表示最诚挚的谢意! 路长情谊更长。三年的硕士研究生学习给予了我更多的知识与做人的道理 将伴随我一生指导我无畏的前进。 作者：张洪斌 2 0 0 4 年6 月于合肥 第一章概述张洪斌含肥t 业人学颤i j 论文 第一章概述 1 1 引言 1 1 1 右旋糖酐的结构与性质 右旋糖酐( d c x t r a n ) ，又名葡聚糖，是蔗糖经肠膜状明串珠菌发酵 后生成的高分子葡萄糖聚合物l l i 。它是撮早发现的微生物多糖，也是 世界上第一个工业化生产的微生物多糖，是较早作为代血浆应用的微 生物多糖。右旋糖酐的结构式如下： 它主要由葡萄糖1 1 ( 1 6 ) 苷键连接而成，同时还杂有t l ( 1 3 ) 和n ( 1 4 ) 连接形成的分支结构。水解产物中可分离出不同分子量 的右旋糖酐其中m = 5 0 0 0 0 - 9 0 0 0 0 的为中分子：m = 2 5 0 0 0 5 0 0 0 0 的为 低分子：m = 1 0 0 0 0 2 5 0 0 0 的为小分子；m m n c a 。 2 4 、结论 通过对由肠膜状明串珠菌l 一0 3 2 6 ( m e s e n t e r i o d e s ) 发酵生产右旋糖 酐的工艺过程及条件进行了探讨通过对其发酵过程中的粘度、p 值、果糖、 右旋糖酐生成、分子量变化的研究及对发酵诱导物的考察，得到了右旋糖酐发酵 工艺的相关工程曲线。研究表明：整个发酵过程中p 值的变化是递减的，发酵后 期发生酸解：通过定向发酵技术可得到符台要求的不同分予量的右旋糖酐，避免 了老工艺中的酸水解工艺：控制发酵培养基p h 值为8 0 ，可使产率最大：果糖作 为发酵的副产物在发酵后期也可作为碳源被细菌部分消耗：无机盐离子m n 和 c a ”能促进l - m 菌的生长，其促进菌生长的程度大小依次为：m n ”+ c a ” m n ” c a “。 第一章右旋搪酐发酵t 艺的优化研究 嫒泱斌台肥t 业人学硕l 学位论文 以上研究结果为传统发酵工艺的改进尤其是对定向发酵法生产右旋糖酐 工艺提供了初步数据，对于我国右旋糖酐工业生产技术的升级，改善产物的分子 量分柿，提高产品质量及产率均有一定意义。 第三章右旋错酐蔗糖牌产确条件的研究张沮斌 含肥t 业大学硕i ：学位论文 第三章右旋糖酐蔗糖酶产酶条件的研究 3 1 引言 右旋糖酐蔗糖酶( d e x t r a n s u c r a s e ) 是肠膜状明串珠菌( m e s e n t e r i o d e s ) 产生的一种胞外酶该酶能以蔗糖为底物生产出右旋 糖酐。关于该酶的特性及其催化机理已在第一章中做了详述。概括起来 其生产原理【6 6 i 用分子结构式表达如下： 姆。c i k o r 朝o - h k 。 ho ho hh 蔗糖 j-n 毛旋塘果糖 利用酶工程技术生产右旋糖酐足e l 河国际上较为先进的、研究关 注较多的工艺技术，该法与传统发酵工艺相比有可连续他生产、产品 分子量可控、分子量分布均匀、杂质含量低等优点。获得高活性、商 稳定性、高产量的右旋糖酐蔗糖酶，是酶工程技术制备右旋糖酐的关 键，也是该课题研究的基础和难点。因为培养右旋糖酐蔗糖酶的碳源 与酶反应的底物为同一种物质即蔗糖，导致在生物培养过程中随着右 旋糖酐蔗糖酶的出现也生成了右旋糖酐，商分子的右旋糖酐与菌体和 酶缠绕在一起很难将其分离，从而难以培养获得所需的游离右旋糖酐 蔗糖酶。 针对要获得符合要求的游离右旋糖酐蔗糖酶，研究人员做了许多 工作 5 3 , 5 6 , 57 5 8 】。如用酶阻断剂暂时阻止酶的合成以此来富集游离的右 旋糖酐蔗糖酶，但同时带来了酶的失活及分离阻断剂等问题。用控制 2 9 、iij_ill 第三帝右旋搪酐蔗糖髓产醇表件的研究嫩洪斌 台肥t 业人学愤i ：学位论文 产生右旋糖酐蔗糖酶的相关条件如培养基配方、培养温度和时间等参 数来获取符合要求的游离右旋糖酐蔗糖酶是一个较为可行的方案。 本研究主要从已获得的菌株l m - 0 3 2 6 入手，考察影响右旋糖酐蔗 糖酶的产酶相关因素通过改变蔗睹浓度、温度、p h 值、诱导剂、不 同的氮源和碳源等不同因素，得到了肠膜状明串珠菌右旋糖酐蔗糖酶 产酶的最适条件为酶工程技术制备右旋糖酐的工艺研究提供依据， 目的是实现右旋糖酐的生产技术升级。 3 2 实验仪器及试剂 3 2 1 实验仪器 袭3 1 实验仪器 3 2 2 实验试剂 袭3 ，2 实验试刺 试刺名称 生产厂家 蛋白胨 c p 上海化试制采购供应站中心化1 - 厂 琼脂 c p 青岛碍；粉厂 磷酸氢二钠 a r 广尔金砂化i ：厂 蔗糖 食川级交i 敦话厂 3 ，5 二硝基水扬酸 r 中国越约集团上海化学试剂公吲 间苯二酚 a r 上海白鹳化i 厂 盐酸 a r 合h e 医约站化玻部 乙醇 c p 安徽特酒总厂 冰醋酸 a r 台肥医约站化玻部 碳酸钙 a r 北京市红星化i ：厂 氢氧化钠 a r 上海试刺一厂综合经营公司 ；f = 章右旋锖6 f 蘸齄酶产酶条件的研究 张浃斌 台肥丁业人等堕兰垡羔垫 3 2 3 材料与方法 3 2 3 1 菌种 肠膜状明串珠菌l m - 0 3 2 6 ( m e s e n t e r i o d e s ) 为本实验室选育 保藏的菌株。 3 2 3 2 培养基 斜面培养基：蔗糖15 ，蛋白胨0 17 ，n a z h p o 0 15 t 琼脂2 液体培养基：蔗糖l o a 6 ，蛋白胨0 1 7 ，n a ：h p o t0 15 ： 均在i 1k g f c m2 的蒸汽压力下灭菌2 0 分钟。 3 2 3 3 实验工艺过程 2 5 5 ，2 4 h 2 5 5 2 4 h 斜面培养基叶液体培养基_ 接种量5 接种量5 ，l2 0 转分 2 j j ，定时取样 产酶培养基_ + 样品分析 5 l 发酵罐内，12 0 转分 3 2 3 4 检测方法 ( i ) 右旋糖酐蔗糖酶酶活的测定：通过右旋糖酐的生成量柬确定 酶活。一个酶活单位( 1l ) 的定义为：l o 的蔗糖溶液在理想的反应 条件下( t = 3 0 、p h = 5 0 ) lh 生成l m g 右旋糖酐所需的酶量。 ( 2 ) 右旋糖酐产量的测定 6 6 i ：用7 j 的乙醇沉析、4 0 f i 勺乙醇捏洗 2 次、6 0 真空干燥后研细即得右旋糖酐成品，然后称量。 ( 3 ) 聚糖的测定：果糖是发酵的副产物，其测定方法主要是二硝 基水杨酸试剂法1 2 8 i 。 ( 4 ) 细菌浓度的测定：利用分光光度计v is7 2 3 在6 0 0 h m 处测定 吸光度，吸光度的大小可代表菌浓的大小。 第三章启旋话酐戚糖酶产酶条件的研究强班斌台肥丁业人学母。学位论文 3 3 结果与讨论 3 3 1 蔗糖含量的影响 我们考察了4 个不同蔗糖浓度的培养基( 见表3 3 ) ，培养条件 为：p h 6 0 、2 5 、1 2 0 转分。 表3 3 不同蔗糖浓度培养基 由图3 i 、图3 2 可知，蔗糖浓度越高，其诱导产生的右旋糖酐 蔗糖酶酶量就越多，发酵后期生成的右旋糖酐产量就越大，同时菌体 浓度也在迅速增加，这与t s u c h iy a 等l l 。i 研究所得结聚基本一致。这表 明蔗糖是诱导肠膜状明串珠菌产生右旋糖酐蔗糖酶的关键物质，或者 说，只有当培养基中含有蔗糖时爿能产生酶。研究中发现当蔗糖浓度 为3 时虽然菌体浓度有所增长，但在2 4 h 内测不出右旋糖酐的产生 此时的酶活较低，仅为l5 ( u c m ) ，说明蔗糖含量太低不利于生产右 旋糖酐蔗糖酶：蔗糖含量为5 、培养2 4h 后菌体浓度与右旋糖酐产量 均较高，且易分离获得所需的右旋糖酐蔗糖酶酶活很高，达到5 8 ( u c m ) ： 81 0 121 41 61 82 02 22 42 6 土卉养时问( h ) 幽3 1 菌浓吸光度随培养时间的变化曲线 不i 司蔗糖浓度一- 一1 0 一一7 一一5 一，一3 4 3 2 ， 0 o o o 0 o 型景象一最鼋 第三章占旋糖酐蔗馆确产酶条件的研兜强小斌台肥t 业大学碰i j 学位论文 1 61 82 02 22 4 j 弁莽时问( h ) 图3 2 右旋话酐产量随培养时问的变化曲线 小同蔗塘浓廑一一1 帆一一7 一- 一5 、 当蔗糖浓度增加到7 或者l o f | 6 时微生物细胞与右旋糖酐产物无 法分离即无法在菌体生产旺盛时期分离得到所需要的胞外酶而且 无法测定酶活，这主要是由于菌体与右旋糖酐产量增长过快导致培养 液粘度过大。 因此过低或过高的蔗糖浓度均不利于生产右旋糖酐蔗糖酶，蔗糖 浓度保持较低即5 左右适宜产酶。 3 3 2 温度对产酶的影响 肠膜状明串珠菌发酵生产右旋话酐温度一般在2 3 2 6 【i ，但温 度对产酶的影响较大，鉴于此设计了5 个不同的温度来考察温度对右 旋糖酐蔗糖酶产酶的影响，如表3 4 所示。 表3 4 不同温度对台旋话酐蔗糖酶的影响 由表2 可知，在除温度外的其它各因素均相同的培养条件下，右旋 糖酐产量由2 0 的2 3 0 9 1 0 0 m l 上升到3 j 的6 8 5 9 l o o m l ，达到最 大。并且3 5 时的发酵速度快，时自】比2 0 短4 小时。 4 0 使菌体 o 5 o 5 o 5 o ：= i-i-)liji蕾塔掉 第三章右艇糖酐虎：糖晦产确条件的研咒张，批斌台肥t 业人学坝i 学位论文 过早死亡同时酶失活无法测出右旋糖酐。酶活随温度的上升呈升后 降趋势，但幅度不大，右旋糖酐产出不受影响。 从以上研究中可得出：肠膜状明串珠菌在3 5 时产生右旋糖酐蔗 糖酶的酶量最大，右旋糖酐产量最多，酶活较高，为最适产酶温度。 3 3 3p h 对产酶的影响 一般认为p h 7 2 是菌种生长和右旋糖酐发酵的最适p h 值12 9 1 。从图2 4 可见培养基的不同p h 值对发酵获得的右旋糖酐产量的影响较大，产生 右旋糖酐蔗糖酶的酶量及酶活也有差异。p h 7 2 的培养基与p h 6 0 的培 养基相比，右旋糖酐产量略有增加；而培养基p h 值为8 0 时右旋糖 酐产量大幅提高、达到5 7 9 9 m 1 是p 7 2 时的2 5 倍。 山图2 4 得出：p h 值对肠膜状明串珠菌合成右旋糖酐的影响较大， p h 8 0 时右旋糖酐产量最多、酶量最大、酶活较高。 3 3 4 诱导剂的影响 结合文献报道【2 32 引，我们分别对c a c o 。，m n ”，c a c o ，和m n ”三组成 分做促进剂进行了探讨，含量分别为c a c o ，为0 2 ，m n ”为0 0 0 5 将 细菌在不同的促进剂培养液中培养2 4 h 测其菌浓吸光度与酶活。结果 如表3 5 所示。 表3 5 不同无机盐离子对细菌生产及酶活的影响 由表3 5 中可看到：细菌在加入细胞生长促进剂的培养液的生长明 显好于没有加促进剂的培养液：不同促进剂对细菌生长的促进效果不 同，促进菌生长的程度大小依次：m n 。和c a ” m n ” c a 。：酶活有所增 加，但m n 。、c a ”对酶活的影响不大而m n ”和c a 。的协同作用使酶活 提高较大。 3 3 5 不同碳源对产酶条件的影响 配制不同碳源培养基配方如下： 第二币右旋糖酐蔗糖鹄产酶条件的研究张洪斌合肥t 业人学耐! l ：学位论文 蔗糖l o ，蛋白胨0 17 ，n a ：h p o 0 15 ； 果糖1 0 ，蛋白胨0 17 ，n a ：h p o 。0 15 ； 葡萄糖1 0 ，蛋白胨0 17 ，n a ：h p o 0 1 5 ： 果糖5 葡萄糖5 ，蛋白胨0 17 ，n a ：h p o 0 1 5 ： 以上培养基各配5 0 0 m l ，分装于4 个2 5 0 m l 的三角瓶中。 另外，配3 0 的蔗糖溶液1 0 0 0 m 1 分装于8 个2 5 0 m l 的三角瓶中 包扎移液管2 0 m 1 2 0 支：1 0 m 1 2 0 支：5 m l ，2 0 支。空三角瓶2 5 0 m 1 ， l5 个。做好标记与记录，在12 1 。c 灭菌2 0 m in 。 菌种培养2 4 h 后，分离出湿菌与培养液分别加底物( 3 0 蔗糖) 进行反应，反应中止后，醇沉得产品、烘干后称重，实验结果如表3 6 所示。 表3 6 不同碳源培养基右旋糖酐产量表 l 培养基配方 l 右旋糖酐产量3 2 9无无 无 由表3 6 可以得到：不同碳源的培养基对于右旋糖酐蔗糖酶的生 成有很大的影响。只有含蔗糖的培养基生成了右旋糖酐说明仅有含 蔗糖的培养基能诱导产出右旋糖酐蔗糖酶而其它碳源的培养基不适 合右旋糖酐蔗糖酶的生长 3 3 6 不同氮源对产酶条件的影响 配制不同氮源培养基配方如下： 蛋白胨0 17 蔗糖l o ，n a 。h p o 。0 15 ： 牛肉青0 17 ，蔗糖l o ，n a ：h p o 。0 ，15 ： 酵母浸膏o 17 ，蔗糖l o ，n a ：h p o 。0 ，l j 【| b ： 以上培养基各配5 0 0 m l ，分装于4 个2 5 0 m l 的三角瓶中。做好标记 与记录，在1 2 lo c ，灭菌2 0 m in 。 菌种培养2 4h 后，分离出湿菌体与培养液分别加底物( 3 0 蔗糖) 进行反应，反应中止后醇沉得产品、烘干后称重，实验结果如表3 7 所示。 表3 7 不同氮源培养基右旋糖酐产鼙表 培养基配方 | 右旋糖酐产量 3 22 9 4 0 由表3 6 可以得到：不同氮源的培养基对于右旋糖酐蔗糖酶的生成 影响很大其中号牛肉膏培养基生成的右旋糖酐最低，号酵母浸 膏培养基生成的右旋糖酐最高。说明酵母浸青培养基最有利于诱导产 第三章右旋糖酐蔗糖船产酶条件的研究张7 妊斌 台肥丁业人学坝i ：学位论文 出右旋糖酐蔗糖酶，且酶的活性高，但酵母浸膏丰富的成分会其右旋 糖酐产品杂质多，更难分离故我们选用蛋白胨培养基。 3 4 结论： 对右旋糖酐蔗糖酶产生菌肠膜状明串珠菌l m 一0 3 2 6 产酶的相关 因素进行了研究，结果表明：含5 篙左右蔗糖的培养基适宜产酶且产 品易分离：3 5 时产酶量最大： t a h 8 0 酶活较高；m n2 和c a ” 的协同作用可使酶活有较大提高；含蔗糖的培养基能诱导产出右旋 糖酐蔗糖酶，其它碳源的培养基不适合右旋糖酐蔗糖酶的生长：酵 母浸青培养基最有利于诱导产出右旋糖酐蔗糖酶。其酶的活性商，但 酵母浸膏丰富的成分致使产品右旋糖酐杂质多。 第四章海藻艘钠同定化酶制蔷右旋糖酐的研究张洪斌台肥t 业人学硕i ：学位论文 第四章海藻酸钠固定化酶制备右旋糖酐的研究 4 1 引言 固定化酶或细胞技术是七十年代发展起来的一项新技术，以其一 系列独特的优点，在食品工业、化学合成工业、医疗诊断、环境净化、 能源开发各个领域得到广泛的应用 6 0 , 6 9 】。在众多的固定化技术中包埋 法应用最广。已成功地用于微生物细胞的包埋材料有琼脂、琼脂糖、 k 一卡拉胶、明胶、海藻酸钠、聚丙烯酰胺、纤维素等7 5 , 8 0 其中海 藻酸钠包埋法简单、无毒、安全、价格低廉，材料易得，是最常用的 方法。经过分析比较我们首选海藻酸钠作为固定化右旋糖酐蔗糖酶载 体进行研究。 国内外关于固定化酶连续反应的研究主要有：对螺旋纤维床固定 化生物反应器同时产酶降解壳聚塘的研究【76 | ”i ，采用多孔聚酯泡沫固 定晕式木酶，在鼓泡柱固定化反应器【7 7 i 中同时产酶降解壳聚糖的耦合 过程通过控制降解时间可以得 到不同平均聚合度的降解产物。 也有对几丁质固定化纤维素酶降 解壳聚糖的研究1 7 8 , 8 7 l ，在通过超 滤膜装置进行分离经h p l c 分 析，流程见图4 1 。对固定化嗜 热脂肪芽孢杆菌连续合成半乳糖 寡糖的研究“。，利用固定了的产 b 一半乳糖酐酶的嗜热脂肪芽孢 杆菌，以乳糖为底物。在纤维床 反应器中连续合成半乳糖寡糖 ( g o s ) ，最高得率为j 0 7 。在 固定化细胞纤维床反应器中央 套中用j o 恒温水循环，45 0 9 l | 芏| 4 i ，l 间定化酶生物反应器 f 督定化酶反应柱2 水浴锅 3 蠕动泵4 容器 的乳糖溶液用恒流泵连续泵入填充柱定时取样h p l c 分析，在此连续 反应体系中，研究了底物浓度，p h 反应温度和停留时i b 】对半乳糖寡 糖合成的影响。有对氧化亚铁硫杆菌固定化技术研究1 8 9 1 ，在生物脱硫 过程中，以h 2 软性填料作为氧化亚铁硫丰下菌的固定化载体构建了 固定床生化反应器见图4 2 ，考察了不同稀释率固定下床生化反应器 讹p u 葶海凛艘钠川定化酶制备右旋糖酐的侧坑张洪斌合艇t 业人学坝1 学位论史 氧化f e ”的情况。有对壳聚糖 固定化纤维素酶在填充床式反 应器中反应条件的研究7 8 79 1 。 而国外有对生产右旋糖酐的生 物反j 迎一分离耦合反应器的设 训的研究报道 8 0 j 。 综合国内外的研究现状我 们提出酶固定化连续反应制备 右旋糖酐，将固定化酶技术与 酶连续化反应器的有机结合， 以此术控制右旋糖酐的制备。 采用酶固定化技术连续化反应1 在定程度上保持了酶特有的 催化活性，又能回收，并能多 幽4 2 生物反应器示意幽 高位槽2 生物反应器3 恒温水槽 4 气泵5 流量计6 低位槽 次反复使用，使整个生产工艺可以连续化，自动化成为可能。 4 2 实验试剂、仪器及方法 4 2 1 实验试剂 表d l 试剂览表 f 试剂名称生产厂家 蔗糖市售 篮门腺巴海化学试荆采购供麻站中心化t 厂 瞵酸氢_ 二钠合肥t 业火学化学试剂厂 琼脂粉天津市福晨化学试剂厂 海濒酸钠中国医药( 集团) ：海化学试剂公司 氯化钙j 。尔汕头市两陇化r 厂 氧氧化钠含肥医约站化玻部 乙醇台肥l ：业人学化r 厂 甲先素天津市博迪化【：有限公司 i 冰醋酸 圜鲥集团化学试剂有限公司 戊一：醛( 2 5 水溶液)中国上海五联化1 一厂 蚺叫前j f 唾燕艘钠定化嘶制需右旋糖酐的研究张洪斌含肥t 业大学蛳1 学位论叟 4 2 ，2 实验仪器 表4 2 仪器设备一览表 设备名称型号生产厂家 电热恒温培养箱 d h p - 9 0 5 2 上海一恒科技有限公 司 恒温冷冻摇床h q l 3 0 0 a 中国科学院武汉科学 仪器厂 立式圆形压力蒸汽灭 l s b 5 0 l 张家港市华菱医疗设 菌器 备有限公司 手提式压力蒸汽灭菌 y x q s g 4 1 2 8 0 b 上海医用核子仪器厂 器 7 2 3 分光光度计 v is 一7 2 3 上海精密科学仪器有 限公司 酸度计 p h s 一4 c t 上海大中分折仪器厂 发酵罐c b j s 一5 b 1镇江东方生物工程设 备技术公司 蠕动泵 b t o o l0 0 m保定兰格恒流泵公司 玻璃仪器气流烘干器 b 河南巩县英峪仪器厂 超级恒温水浴锅 数显恒温水淹锅 h h l 常州国华电器有限公 司 快速恒温数显水箱 h h 一6 0 常州国华电器有限公 司 旋转蒸发器 r 一2 0 l上海申生科技有限公 司 调温万用电炉 w i 通州市泸通实验仪器 厂 乌式粘度计毛细管内径0 4 一上海申立玻璃仪器有 o ，5 m m 限公司 干燥箱 2 0 2 3 中华人民共和国上海 市实验仪器总厂 循环水真空泵 s b 一9 5巩义市杜龠仪器厂 第叫常海藻艘钠| 同定化酶制需右旋糖酐的l i f 究张洪埙台；b r 2 7 t d k 人学硕i ：学位论文 4 2 3 培养基配方 表4 3 不同培养基配比一览表 培养基种类 蔗 糖蛋 白 腺磷酸二氢钠琼脂( w v ) ( w v )( w v )( w v ) 固体培养基 1 0 o 17 o 15 2 斜面培养基 l o o 17 o 15 2 1 0 液体培养1 0 0 17 o 1 5 基 5 液体培养基 5 0 17 0 15 4 2 4 菌种培养 2 5 5 ，2 4 h2 j 5 斜面培养基+ 液体培养基+ 酶液 接种量5 接种量5 。1 2 0 转分 4 2 5 灭菌操作 本实验要求将反应器( 印反应柱和c b j s 5 b 1 型发酵罐等) 特别 是各接口用报纸包好，连同反应中需要的各种软管接头等凡是与料 液直接接触的地方均需用报纸包好灭菌。均在1 1k g f c m2 的蒸汽压力 下灭菌2 0 分钟。 4 2 6 检测方法 p h 值用p h s 一4 c t 型酸度计测定； 产品粘度用乌式粘度计具体见1 2 2 中右旋糖酐特性粘度的 测定。 产品吸光度是7 2 3 分光光度计在5 4 6 n m 下测定 4 2 7 海藻酸钠固定化右旋糖酐蔗糖酶一般性程序 取u m l 培养好的细菌悬浮培养液，加入到v m l 的3 藻元酸钠溶 液中混匀，缓慢滴入到5 ( u + v ) m l2 c a c l 2 溶液中并让其交联1 小时，即得固定化珠粒。 4 3 海藻酸钠固定化右旋糖酐蔗糖酶工艺技术的研究 第四帝海藻艘钠问定化酶制备右旋糖酐的研究张洪艟台肥t 业人学硕i j 学位论文 4 3 1 菌液与海藻酸钠的不同体积比( u ：v ) 对固定化效果的影 响： 取培养温度为2 5 ，时阳j2 4 小时的菌液三份各3 0 m l ，在5 4 6 n m 处测得其吸光度 = o 6 5 ，在无菌条件下加入到3 瓶冷却好的3 海藻 酸钠溶液中并混合均匀，形成体积比为l ：l 、1 ：2 、l ：3 的混合液。 然后分别滴入到3 瓶2 c a c l 2 溶液中，用磁力搅拌器搅拌，并让其交 联l 小时，得到菌液与海藻酸钠体积比为l ：1 、l ：2 、l ：3 固定化珠 粒。 将上述固定化珠粒分别接入到2 0 的l o o m l 蔗糖底物溶液中。于 恒温摇床2 5 5 培养，进行酶反应，反应完毕后，用乙醇沉析其产品 并称重。将反应产物在无菌条件下取出后，将珠粒再加入2 0 的l o o m l 蔗糖底物溶液中继续酶反应考察其利用次数。以上过程概括为以 下流程： 2 5 培养2 4 h2 j 培养2 4 h 固体培养基一一一一一一一接种到液体培养基一一一一一一制作珠粒 一一一一接种到底物并反应一一一一一重复回收利用固定化酶。 反应过程中的取样及实验结果图4 3 所示： 反应批次 图4 3 不同体静! 比的菌波与海藻酸钠珠子产量幽 从图4 3 分析可知，在第一批次的反应中，菌液与海藻酸钠体积 比为l ：1 的固定化珠粒得到的右旋糖酐产量最高，这是因为体积比为 1 ：l 的固定化珠粒其单位体积的酶量多，也即包埋在珠粒表层的酶量 第四章海藻酸钠嘲定化酶制器右旋糖酐的研究强洪斌 合肥t 业人学碗 学位论文 多底物的进入和产物的逸出均较1 ：2 、l ：3 的珠粒快，表现的右 旋糖酐产量最高。 随着反应批次的增多各反应体系的右旋糖酐产量先升后降到第 三批次达到最大。其中菌液与海藻酸钠体积比为1 ：3 的增加最快，而 且有效利用次数达到5 次。反应体系的右旋糖酐产量在前三批反应中 上升的原因可能是由于右旋糖酐在固定化珠粒内部富积后再逐渐捧出 有关，后在前三批反应中右旋糖酐产量下降与酶的慢慢失活有关。 当第5 批次取样完毕，l ：l ，l ：2 配比所产固定化珠粒已有破损， 而l ：3 珠粒还很完好，说明其稳定性较好。 由以上分析可得到：菌液与海藻酸钠体积比为1 ：3 时的固定化珠 粒其右旋糖酐产晟最大，表现出的酶活最高。有效利用次数可达到5 次。 4 3 2 不同菌浓度对固定化效果的影响： 根据4 3 1 的研究结论。本节我们选用菌液与海藻酸钠体积比为 1 ：3 进行固定化，在5 液体培养基中2 5 培养条件，分别在培养时间 1 6 h 、2 2 h 和2 6 5 h 取出3 0 m 1 菌液，测得其吸光度分别为入= o 2 2 、0 5 5 和0 8 3 。按上述程序制备固定化珠粒，将珠粒接入到2 0 的l o o m l 的 底物溶液中，然后放在恒温摇床上2 5 ，l2 0 r p m 培养，进行酶反应。 到一定时自j 后中止反应，将反应产物在无菌条件下倒出，再加入2 0 底物溶液中，重复进行酶反应。醇折得右酐旋糖产物。干燥后称重。 用来考察不同菌浓对固定化效果的影响。实验测得的结果如图4 4 所 示。 反心批次 图4 4 不同菌浓的固定化酶在不同反应批次的产餐豳 第四章海藻醴钠固定化酶制备毛f 旋塘酐的研究张洪斌 台肥t 业人学碗i ：学位论文 由图4 4 分析可知：菌浓为九= o 2 2 时所产生的右酐旋糖产量很 低，这是因为菌浓低导致所含的酶量较少造成的；虽然x = o 8 3 菌浓较 高，酶量也较多，但同时在培养过程中产生了数量较多的右酐旋糖高 分子物质，粘度最大，该高分子物质将右旋糖酐蔗糖酶部分包裹尤 其是在海藻酸钙固定化珠粒内部影响蔗糖底物与酶的接触及产物的传 质，故在酶固定化后反应时所生成的右旋糖酐较少： ：0 5 5 时产量 最大，酶活稳定且培养次数较多，这是因为该菌浓的酶量较多，所含 右酐旋糖高分子物质较少产物，此时固定化有利于酶活的发挥和产物 的传出，效果最好。 从以上讨论中我们得出：在三个吸光度分别为x = o 2 2 、0 5 5 和 0 8 3 的菌浓中，九= 0 5 5 的菌液固定化效果最好。 4 4 固定化酶连续化反应制备右旋糖酐的研究 4 4 1 实验流程与装置 4 4 1 1 工艺流程图 用肠膜状明串珠菌l h m 1 2 2 6 号菌经斜面及两次液体培养所得到 的菌液与固定化材料按照一定的方法制得固定化酶( 珠粒) ，将固定化 酶装入反应柱或发酵罐安装连续反应装置并设定参数，定时取样分 析，反应结束，用乙醇沉淀一定量的反应液，干燥沉淀出的右旋糖酐， 称重。具体参见图4 5 工艺流程图 4 4 1 2 反应装置简介及安装 4 4 1 2 1 填充床 此种反应器模型的是将中制备的珠粒填充于固定床 8 6 , 8 7 , 9 8 1 固定 床采用直立安装，底物按由上至下( 以下简称顺流) 或由下至上( 以下简 称底部给料) 以恒定的流速通过反应床。具体样式见图4 6 。本实验应 用的为内径约3 o c m ，外径约5 5 c m ，长约2 5 c m ，带循环水央套的玻 璃管。与此反应器模型配套使用的泵为兰格蠕动泵( b t 0 0 一lo o u 。d g 一2 型泵头2 4x0 8 的进料软管) 。 4 4 1 2 2 流化床 此种反应器模型 7 6 , 8 3 1 的是将3 3 3 中制备的珠粒填充于垂直柱式 反应器，底物以一定速度由下向上流过反应床使固定化酶珠粒在浮 动状态下进行反应本实验应用的有内径2 5 c m ，外径4 5 c m ，长5 0 c m ， 第p q 章姆凛酸钠同定化酶制备右旋糖酐的础f 究 合肥r 业大学坝卜学位论文 带循环水央套的玻璃管，样式如图4 7 所示。 图45 固定化酶连续化反应实验流程图 产物 图 隅p 出瓣 蚓46 填充床反廊器 底物 环水进循环水 幽4 7 环水出 第p u 章海藻酸钠剧定化酶制各右旋糖酐的研究张洪斌台肥丁业人学f i ! i i 卜学位论史 与流化床此反应器模型配套使用的泵为兰格蠕动泵( b t 0 0