（运动人体科学专业论文）4周有氧运动对心房肌蛋白质组及基因差异表达的影响.pdf

摘要删舢舢删洲m 洲y 2 14 9 3 3 3目的：本研究探讨4 周有氧运动对大鼠心房肌蛋白质组差异表达的影响，筛选出心房肌中与有氧运动适应密切相关的目标蛋白质点，并对部分目标蛋白质点的n 1 r n a 表达水平进行研究，为深入研究长期规律的有氧运动促进心脏健康；为全民健身运动及慢性心血管疾病的运动康复研究提供新的思路及理论依据与实验基础。方法：2 0 只s d 雄性大鼠按体重和运动能力随机配对分为运动组和对照组( n = 1 0 ) 。采用跑台运动的方式，适应性训练后，复制2 4 m i n i n 。1 4 0 n 血运动强度负荷持续训练4 周的有氧运动实验动物模型( 负荷强度相当于6 0 7 0 v 0 2 m a x ) 。最后一次训练后6 小时，运动与对照组的大鼠同时麻醉处死，提取心房肌组织的全蛋白，采用双向凝胶电泳技术对蛋白质进行分离，运用b i op dq u e s t 图像分析软件对2 - d e 图谱进行分析，并应用串联飞行时间质谱仪对其中表达量变化上调5 倍以上及下调至1 5 以下的1 3 个目标蛋白质点进行质谱鉴定，用逆转录聚合酶链式反应( i m p c r ) 技术检测对7 个目标蛋白质的基因表达水平检测。结果：经4 周有氧运动后，与对照组相比，大鼠的心脏重量的百分率增加了1 7 ，心重指数增加了3 2 ( p o 0 5 ) ；在2 d e 电泳图谱上运动组检测到蛋白质点3 7 0 士3 5 个，安静对照组检测到4 2 2 土7个，运动后差异表达的蛋白质点共有5 3 个，未见新增或缺失的蛋白质点，其中表达量上调5 倍以上的点有5 个，下调5 倍的点8 个，对筛选出的1 3 个蛋白质点进行质谱分析，成功鉴定出1 1 种蛋白质和一个分子量为5 4 k d a 的未知蛋白，如丙酮酸脱氢酶e lql 、甲基丙二酸半醛脱氢酶 酰基 、丝裂素活化蛋白激酶3 。r t - p c r 检测结果：运动组大鼠心房肌中甲基丙二酸半醛脱氢酶、细胞质苹果酸脱氢酶的m r n a 相对净光密度值低于对照组( p o 0 5 ) ；异戊烯辅酶a 脱氢酶m r n a 相对净光密度值高于对照组( p o 0 5 ) 。结论：( 1 ) 经过4 周有氧运动后，大鼠心房肌蛋白质组差异表达显著，包括蛋白质点数目的差异变化和蛋白质点表达强度的大幅度上调或下调。( 2 ) 质谱鉴定出来的丙酮酸脱氢酶e 1q1 、线粒体乌头酸水合酶等目标蛋白的上调与提高心肌细胞能量代谢水平有关。丝裂素活性蛋白激酶3 的上调与促使心肌细胞肥大增殖有关，表明中等强度有氧运动也能像大强度运动一样，导致运动心脏重塑，改善心脏的收。缩泵血功能。( 3 ) 发现了在运动医学研究领域尚未涉足的甲基丙二酸半醛脱氢酶【酰基】，可能与运动过程中心肌细胞的能量代谢有关，深入其研究将为运动心脏的研究带来新的内容。( 4 ) 4 周有氧运动后心房肌中大多数目标蛋白质的表达可能不受其基因转录水平的调控。关键词：运动蛋白质组；心房肌；有氧运动；2 一d e ；u 1 ，g raf i f i ，e ：x t o f t o f ：i 姆一p c ri ia b s t r a c to b j e c t i v e ：t l l i sr e s e a r c hd i s c u s s e st 1 1 ei n n u e n c eo ft h e4w e e k sa e r o b i ce x e r c i s et om ed i f 陀r e m i a le x p r e s s i o no ft h er a th e a nm u s c l ep r o t e i ng r o u p ，t os c r e e nt a r g e tp r o t e 矗lp o i i l ti i lt h ea 仃i a ln m s c l ew h i c hi sc l o s e l yr e l a t e dt oa e r o b i ce x e r c i s es 仃e s sa n ds t u d yt h en 氓n ae x p r e s s i o nl e v e lo fp a r to ft h et a 玛e tp r o t e i np o i n t 7 f op r o v i d et h e o 珂b a s i sa n dn e wi d e a sf b r 翕】n h e rr e v e a l i n gm eo c c u i t e n c ea n dd e v e l o p m e n to ft h em o v e l e n to fh e a r ta n dt l l ee x e r c i s ef e h a b i l i t a t i o nr e s e a r c ho ft h en a t i o n w i d e 丘t n e s sc a 印a i g na l l dc l l r o n i ch e a nd i s e a s e t op r o v i d et h e o 巧b a s i sa l l de x p e r i i n e mb a s i st om ec o n t i i l u es t l l d yo ft h em o v e m e n to f h e a no f p r o t e o 1 i c s m e t h o d s ：2 0s d 呦l er a t sa r ed i v i d e di i l t os p o n sg r o u pa n dc o n 仃o lg r o u pr a n d o n d ya c c o r d i i l gt ot h e i rw e i g h tw e i g h ta n de x e r c i s ea b i l i t y ( n= 1o ) u s i l l gm ew a yo f 仃e a d l i l i l le x e f c i s ea n da r e ra d a p t i v e 打a i n i i l g ，c o p y i i l g2 4m 。m i i l 一1x4 0m i i la m l e t i ci i l t e n s i t yl o a dac o n t i 】1 u o u s缸a i l l i i l g4w e e k sa e r o b i ce x e r c i s ee x p e r i i n e n t a la n i i l l a lm o d e l ( 1 0 a di i l t e n s i t yi se q u i v a l e mt o6 0t o7 0 v 0 2 m a x ) s i xh o u r sa r e rm el a s tt i m eo f m e 缸i l i n g ，m er a t so f m ee 冲e r m m a ja n dc o n t r o l 伊o u po fm o v e m e n te x e c u t e dw i t ha n e s t h e s i a ，a i l de ) ( t r a c t i o no ft h e 姗s c l et i s s u ep r o t e i nt h eh e a 心m et w o 。d i m e n s i o n a lg e le l e c 仃o p h o r e s i st e c h n o l o g y( 2 - d e ) o nt h ep r o t e i ns 印a r a t i o 玛o n2 一d ea t l a st oc a r 巧o nt h ea n a l y s i s ，i i ia n da p p l i c a t i o ns e r i e st o 壬i n s ( u l g r a f l f l e x - t o f t o f ) o no n eo ft h e mt oe x p r e s sq u a n t i 够c h a n g er a i s e dm o r et h a n5t i m e sa n dd o w nt ob e l o wl 513g o a l sp r o t e i np o i m sm a s ss p e c n l l mi d e n t i 丘c a t i o n ，w i t hd r u g t h ep 0 1 y i n e r a s ec h a i nr e a c t i o n ( r r r - p c rd e t e c t i o nt e c h n 0 1 0 9 yt os e v e ng o a l so fp r o t e i i lg e n ee x p r e s s i o nl e v e lf o rt r a n s c r i p t i o no ft h e珈r n ad e t e c t i o n r e s u h s ：( 1 ) a f t e r 南1 l rw e e k s a e r o b i ce x e r c i s e ，c o i l l p a r e dt ot h eq u i e tc o n 仃o lg r o u p ，t 1 1 eh e a nw e i g h to fr a t si i l c r e a s e d1 7 ，h e a nh e a v yi i l d e xi n c r e a s e d3 2 ( p o 0 5 ) ；( 2 ) i 1 12 - d ee l e c 缸o p h o r e s i s ，t l l ec a n l p a i g ng r o u pd e t e c t e d37 0 + 35p r o t e i np o i n t s ，q u i e tc o n 仃o lg r o u pd e t e c t e d4 2 2 + 7p r o t e i np o i n t s a 矗e re x e r c i s e ，t h e r ea r e5 3d i 丘b r e n t i a l邑x p r e s s i o np r o t e i i lp o i i l t s ，i i l c l u d e d2 9w h o s ee 印r e s s i o nr a i s em o r et h a n铆ot i i n e s ，2 3w h o s ee x p r e s s i o nd o w nt om o r et h a n 觚。缸m e sa i l d5w h o s ee 冲r e s s i o nr a i s et om o r et h a i l 矗v et i m e sa n d8w h o s ee x p r e s s i o nd o w nt om o r et h a n 缸v et i i i l e s a f t e re x e r c i s e ，t l l ee x p r e s s i o no fa t r i a lm u s c l ep r o t e i i l 铲o u po fr a t so c c e dd i 疵姗t i a lc h a n g e so b v i o u s l y t 1 1 em a s ss p e c 仇l ma n a l y s i so ft h e13p r o t e i i lp o i i l t sw h o s ee 碘e s s i o nr a i s et om o r et h a n 丘v et 曲e so rd o w nt on l o r et h a n2 0 i d e n t i f i e ds u c c e s s 血1 l y1 1l ( i n d so fp r o t e i i la n da nu i l l ( n o w np r o t e i i lw h o s em o l e c u l a rw e i 出w a s5 4i 钆t h e s ep r o t e i i l sw e r es i 砌a r 住a n s c r i p t i o nc a t a m i cp r o t e i i la l p h 4p y n l v a t ed e h y d r o g e n a s e e 1c ll ，1 1 1 i t o c h o n d r i a lm o i l l ( s h o o da c i dh y d r a t i o ne i l z ) r m e ，m e t h y lm a l o n i ch a l fa l d e h y d ed e h y d r o g e n a s e 【a c y l 】，w h e r e a sh y p e l l h e r 瓶aa c c e l e r a t e dt h eb a s e ，l i l i t o c h o n 血a lp r o t e i l ln a v i n 研oh y d r o g e nl i p o i ca c i dd e h y d r o g e n a s e ，d i s u l 6 d ep r o t e i i li s o m e r a s ea na 3 ，g l u t a c l l i o n es y n t h a s e ，i s o a m y lu s i o n sc o e n z y m ead e h y d r o g e n a s e ，c ”o p l a s mm a l a t ad e h y d r o g e n a s e ，s i l l ( p r o t e i l lk i n a s ea c t i v i t yc r a c ke l e m e n t3 ( 3 ) i 灌p c rd e t e c t i o nr e s u l t s ：t h em r n ar e l a t i v e l yb a r ed e n s i t yv a l u e so fm e t h y lm a l o i l i ch a l fa l d e h y d e d e h y d r o g e n a s ea n dc y t o p l a s mm a l a t ad e h y d r o g e n a s eo fr a t sa r t r i a l1 n u s l e si i lt h ee x e r c i s eg r o u pw a sl o w e r l a nt h o s ei nt h ec o n t r o lg r o u p ( po 0 5 ) ；m em r n ar e l a t i v e l yb a r ed e n s i t yv a l u e so fi s o a i l l y le n ec o e n z y m ead e h y d r o g e n a s ew a sl l i g h e rt h a nt l l a ti i lc o n t r 0 1g r o u p ( po 0 5 ) t h ee x p r e s s i o nl e v e lo fi n r n ao ft h ei i l i t o c h o n 嘶a l铆oh y d r o g e nl i p o i ca c i dd e h y d r o g e n a s e ，百u t a t h i o n es y m h a s ea l l dc y t o p l a s mm a l a t ad e h y d r o g e n a s ew a sc o r r e s p o n d i l l gw i t hm a s ss p e c 仃o m e 旬哆a p p r a i s a lo ft h ep r o t e i i le x p r e s s i o nl e v e lc o n s i s t e 鸸a l ld o w i l r e g u l a t i o n c o n c l u s i o n ：( 1 ) a f t e rf o u rw e e k sa e r o b i ce x e r c i s e ，a t r i a lm u s c l ep r o t e i n 乒o u po fr a t sh a sas i g n i 丘c a n td i l 琵r e n t i a le x p r e s s i o n ( 2 ) t h es e l e c t e dt a r g e tp r o t e i i lp o i i l t s ，s u c ha sp y m v a t ed e h y d r o g e n a s ee10 【1 ，1 1 1 i t o c h o n d r i a lm o i l l 【s h o o da c i dh y d r a t i o ne n z y m ea n ds i 墩p r o t e i i lk i n a s eva r er e l a t e dt or a i s et h e1 e v e lo fm y o c a r d i a lc e l le n e r g ym e t a b o l i s ma n ds p o r t sp f o m p t e di i 】y o c a r d i a lc e l lh y p e r t r o p h y p r 0 1 i f 色r a t i o n ( 3 ) a f 【e r4w e e k sa e r o b i ce x e r c i s e ，t l l eg e n ee x p r e s s i o nl e v e la n dp r o t e i i le x p r e s s i o nl e v e lo ft a r g e tp r o t e i ni sn o ti d e n t i c a l k e yw o r d s ：a t r i a lm u s c l e ；a e r o b i ce x e r c i s e ；p r o t e o l i l i c s ；2 一d e ；u l g r a f l f l e x t o f t o f ：i u - p c r4 周有氧运动对心房肌蛋白质组及其基因差异表达的影响 l l月i j吾运动心脏是运动员所特有的高功能、高储备的大心脏。迄今为止，运动心脏已经历了一个多世纪的研究与探讨，取得了不少的研究成果。国内以常芸等为代表的科研工作者从细胞学的研究角度开始逐渐深入到分子生物学角度，对运动心脏的重塑、运动心脏结构与功能的发生与及转归有了新的认识。大量的研究结果表明【1 10 1 ，心钠素、脑钠素、胰岛素样生长因子、内皮素、血管紧张素i i 、降钙素基因相关肽，儿茶酚胺及其相应受体等在运动心脏重塑过程中起重要调节作用。这些调节因素经过一系列信息传递过程，引起初始应答基因和次级应答基因以及各类细胞功能与代谢因子在转录和蛋白水平的表达，最终诱导运动心脏结构与功能的重塑。国外的研究更多的集中在运动心脏与病理心脏的区别，从诊断上及诊断方法上进行了更多的研究。如m c m u l l e nj r ，r e n n i n g sg l 等正在试图寻找运动心脏中的信号分子和分子通路来治疗病理性心肌肥大，并指出，运动心脏肥大的基因确定将会为治疗心力衰竭提供新的手段【l l _ 13 1 。竞技运动实践中人们多采用大强度运动训练，因此，由竞技运动员心脏获得的研究成果不能直接诠释运动健身或运动康复过程中心脏发生的适应性变化及其规律的机制。而在以增强体质健康为目标的运动锻炼或慢性心血管疾病的运动康复中，专家们一致推荐的安全有硕士学位论文效的中等强度或中小强度的有氧运动。如周勇1 4 1 研究显示，长期参加有氧健身操锻炼，可以降低体脂、静态心率及血压，提高台阶指数和肺容量，对预防中年女性心血管疾病具有重要作用。而b u m i s t o n f l 5 l的研究亦证实h s p 一2 0 在运动大鼠心肌中表达上调，并发现h s p 2 0第1 6 位丝氨酸发生了磷酸化修饰，该磷酸化修饰发生与心肌收缩力改善及抗凋亡等自我保护作用有关，表明心血管病人进行耐力训练是有益的。b a n s a l 【1 q 等研究了运动对心肌梗死大鼠左心室肌蛋白质组差异表达，认为心肌梗死后进行运动康复训练能提高心肌的抗氧化能力与降低离子通道水平，可能能提高心肌梗死后心脏的功能，促进心脏的康复。随着近年来分子生物学的发展，在分子和基因水平上研究心脏在运动中的变化机制及心脏康复中运动的作用日益突出。目前，蛋白质组学在国内外运动医学领域的研究还处于一个起始阶段，研究的数量和研究的对象正在逐渐增多，国外，最早r o g e r s f l 7 】等对安静和运动大鼠左心室肌蛋白进行了差异蛋白质组的研究，发现热休克蛋白和3q 一羟基类固醇脱氢酶等2 6 个蛋白质点的表达量发生显著性变化。b a j l 等【1 翻等研究发现运动训练组蛋白质组有显著性差异的是一组m r2 00 0 0 的热休克蛋白和3 阶羟基类固醇脱氢酶。b 0 1 u y c 等发现，与安静对照组相比，经过6 周的递增运动负荷的耐力运动后诱导的肥大心肌中，有2 6 个蛋白质点的表达量发生了改变，有1 2 个点属于新增的蛋白质。且其中的h s p 2 0 明显表达并持续存在于实验组大鼠心脏组织中。4 周有氧运动对心房肌蛋白质组及其基因差异表达的影响国内则有沙继斌、张松江、史绍蓉、马继政。2 3 1 等人先后将蛋白质组的技术与方法应用到运动医学研究领域，刘明斟1 从心脏猝死的角度出发，研究了力竭性运动对病毒性心肌炎小鼠的影响及蛋白质组学研究。马继政2 2 1 研究观察到长期大强度运动可诱导大鼠心肌骨架蛋白、信号蛋白、应激和氧化蛋白与线粒体能力代谢相关的蛋白等发生改变，运动诱导心肌这些代谢蛋白和结构蛋白的变化可能影响心脏的代谢、应激反应和信号途径，从而整体上提高心脏的功能。+心房的主要基本功能是储蓄、管道、辅泵。除此之外，心房更多的还充当一个内分泌器官的角色。在一些生理、病理情况下，为了维持肺循环、体循环的血流量，心房在其中的作用不容忽视。在运动医学领域研究中，运动对心房肌影响的研究主要集中在运动对心钠素、内皮素的差异表达的影响，运动中心钠素能调节心血管系统对运动的适应，缓冲运动中的血压变化；也有研究发现大强度运动易导致心房肌损伤，常芸口5 。2 8 1 等发现力竭运动后心肌p p a r a 表达水平与心肌受损程度有关可能是运动性心肌微细损伤的重要发生机制；心房肌和心室肌c t i l i 基因、心房肌m b 基因在转录水平均以下调方式参与运动性心肌微损伤调控，心房肌c 砌和m b 基因显著下调是心房易损伤的机制之一。此外，史绍蓉、龚丽、刘建荣、黄思敏口9 。3 3 】等人还探讨了一次性力竭、逐级递增负荷、中等强度运动以及8 周6 0 。7 0 v 0 2 m a x 有氧运动对大鼠心房肌蛋白质组差异表达的影响，结果发现：在4 种不同运动应激下，大鼠心房肌蛋白质组均发生了显著的变化，但不同负荷硕士学位论文运动对蛋白质组差异表达的影响不同，在一次性力竭和递增负荷大强度运动下，大鼠心房肌蛋白质组出现多个缺失，而且表达量差异变化较大的蛋白质点的数量较多，在一次性力竭运动后筛选出了表达量变化在5 倍以上的蛋白质点2 0 个，递增负荷运动后表达量变化芝5 倍的蛋白质4 1 个。而在中等强度运动和8 周6 0 7 0 v 0 2 m a x 有氧运动应激下，心房肌中未发现缺失或新增的蛋白质点，8 周中等强度运动后心房肌中表达量差异在l o 倍以上的有1 3 个，8 周6 0 7 0 v 0 2 m a x有氧运动表达量变化在1 0 倍以上的只有3 个，从蛋白质组的表达特征分析，运动心脏的重塑过程中蛋白质组的表达与负荷强度密切相关。运动心脏的重塑过程不仅仅是形态、结构、生理功能上的重塑还应包括蛋白质组的重塑。而且我们课题组先后对心房肌中筛选出的差异表达明显的2 0 多个目标蛋白质点进行了质谱鉴定，鉴定出的蛋白主要涉及心肌细胞能量代谢或物质代谢相关酶、心肌细胞结构和收缩功能或收缩功能调节蛋白、心肌抗氧化蛋白、热休克蛋白、心肌损伤标志物等，并对这些蛋白的功能、所出现的部位、不同运动对其表达的影响做了详细阐述。同时还发现了不少运动医学领域尚未深入研究的目标蛋白质，如在一次性力竭运动心房肌中发现的甘露糖结合蛋白c 前体、异戊烯辅酶a脱氢酶；递增负荷大强度运动后心房肌中的心肌肌球蛋白轻链一l 。4 周有氧运动对心房肌蛋白质组及其基因差异表达的影响本研究在前期工作的基础上，拟采用4 周有氧运动实验动物模型，探讨4 周有氧运动对大鼠心房肌蛋白质组的差异表达及其规律的影响，从蛋白质组学整体、动态、定量的角度，筛选出对运动适应敏感的蛋白质点，并采用r t p c r 的方法对部分目标蛋白质的基因表达量进行定量分析，为深入揭示长期规律的有氧运动引起心脏发生适应性变化、科学指导中老年人的运动健身及慢性心血管疾病的运动康复研究提供新的思路及理论依据。1 材料与方法1 1 实验对象与分组2 0 只2 月龄雄性s d 大鼠购于湖南农业大学实验动物部，体重为2 3 2 土2 1 3 9 ，i i 级清洁实验动物( 许可证号为s c 凇( 湘) 2 0 0 8 一0 0 0 1 ) 。实验动物房内保持室温为2 0 2 4 ，湿度为4 5 5 5 ，光照时间为：7 ：0 0 1 9 ：o o ，按照国家标准啮齿类动物饲养规格进行分笼饲养，每只笼子饲养5 只，自由进食和饮水。适应性训练1 周后，2 0 只大鼠按体重和运动能力配对随机分为两组，每组1 0 只，一组为对照组，另一组为运动组。1 2 运动方案4 周有氧运动实验动物模型参考常芸3 4 1 的运动心脏模型和b e d f o r d 的运动动物模型进行建模。s d 大鼠购入后，首先进行5 天适应性跑台训练( 跑台坡度为0 。) ，训练方案为：第一天，1 0 m 1 0 m 曲，第二天1 0 m 1 5 m i n i n ，第三天1 8 i n i n 1 5 m 曲，第四天2 1 i n i n 2 0 m i n i n ，第五天2 4 1 i n x 2 0 m n l i i l ，此后运动组大鼠每天以速度为2 4 m n 血。训练4 0 i i l i n ( 训练负荷强度相当于6 0 7 0 v 0 2 m a x ) ，训练持续4 周。整个训练过程中，运动组大鼠周一至周六训练，周日休息一天。具体的训练计划如表l 表1 1 大鼠训练方案f 速度( i i i h l i n ) 持续时间( m i l l ) 】夏期一星期二星期三星期四星期五星期六星期日第一周第二周第三周第四周息息息材休休休取oooo ，4 叶xx444 ，2222oooo444 ，444 ，2222oooo4444444422220o004444 咔44 寸2222oo0o，i斗t-xx444422220o004444444422224 周有氧运动对心房肌蛋白质组及其基因差异表达的影响1 3 仪器设备和试剂1 3 1 主要仪器设备实验动物跑台购于杭州丽泰科技有限公司( 型号：b w b t w 7 0 3 )、蛋白质分离第一项等电聚焦电泳系统购于美国g eh e a t h c a r e 公司( 型号：e t t a n i p g p h o r3 ) 、聚丙烯酰胺凝胶电泳垂直平板电泳系统购于美国b i o r a d 公司( 型号：p o w e 印a cu n i v e r s a l ) 、基质辅助激光解析串联飞行时间质谱仪( m a l d i t o f 厂r 0 f ) 购于德国b m k e ；( 型号：u l 仃a n e x ) 、梯度p c r 仪购于德国b i o m e t r a 公司( 型号：b 1 0 m e t r at - g r a d i e n t ) 、t a i u l o n 凝胶成像及分析系统购于上海天能科技有限公司、三恒多用电泳仪购于北京六一仪器厂( 型号：d y y 1 0 c ) 、紫光图像扫描仪购于清华紫光上( 型号：u i l i s c a nd 3 0 0 0 ) 、低温冷却液循环泵购于郑州长城科工贸有限公司( 型号：d l s b 21 0 ) 切胶仪和自动酶解仪购于美国p e 公司、高速冷冻离心机购于北京兴达恒信科技有限公司( 型号：德国s i g m a ) 。1 3 2 主要试剂固相p h 梯度等电聚焦干胶条购于a m e r s h a m 公司( i m m o b i l i z e d蚵s 仃i pp h 3 1 0l 、长度1 8 c m ) 、t e m e d 购于北京中生瑞泰科技有限公司( 产地：美国、l o t ：c 7 8 - 3 3 ) 、b i s - a c 哪l 锄1 i d e 购于a m e f s h a mp h a n n a c i a 公司( l o t ：1 8 9 7 1 3 0 1 1 ) ；i a a 、d t t 、硫脲均购于s i g m a公司( l o t 分别为：4 3 2 1 4 、5 6 4 3 2 、6 7 8 9 0 ) ；a p s 、溶解酵素购于b i o r a d 公司；尿素、n p 一4 0 、载体两性电解质( p 锄a 虮e3 l o ) 、p m s f 、c h a p s 、s d s 、丙烯酰胺均购于a m e r s h 锄p h a r i l l a c i a 公司。硕士学位论文1 4 样品制备1 4 1 称重正式取大鼠心脏前，用电子秤称取对照组和运动实验组大鼠的体重。摘取心脏后，先冲洗血液并用滤纸吸干水分，然后使用电子天平称量心脏重量并计算心重指数( 心脏绝对重量大鼠体质量) 1 0 0 。1 4 2 取材在第4 周的末次训练结束后6 小时，将运动实验组和对照组大鼠用l o 水合氯醛麻醉后，将其四肢固定于手术板上，打开胸腔，暴露心脏，在主动脉升部进行插管，用o 9 的4 生理盐水对心脏进行灌流，冲洗心腔内的血液，待心脏颜色变淡后，迅速摘取心脏放入4 生理盐水中进行冲洗，小心的剔除心包膜和。心底根部的血管，按心脏正常体位摆放，用滤纸吸干，仔细辨认出环形的冠状沟，用小剪刀沿着环形冠状沟分离心房肌和心室肌，小心地把心房肌分离下来，剔除粘附在心房肌上的心外膜、心内膜和房室隔，将心房肌剪碎后，置于液氮中贮存备用。1 4 3 蛋白提取把储存在液氮中的心房肌组织取出，放入碾钵中，加入液氮碾磨成粉末，将粉末状样品准确称重后，按质量与体积比1 ：4 ( m g ：肛1 ) 加入心肌组织裂解液( 8 i n 0 1 l 1l l 】a ，4 c h a p s ，1 n p 4 0 ，2m 0 1 l 1m i o u r e a，0 5 mm 0 1 l 。1p m s f，6 5 mm 0 1 l - 1d t t，o 5 ( v 厂w ) p h a m a l a t e ( p h 3 1 0 ) ) ，于4 温度下振匀3 0 i n i i l ，在心肌组织充分裂解后，将组织悬液放入高速冷冻离心机中离心( 转速4 周有氧运动对心房肌蛋白质组及其基因差异表达的影响1 2 0 0 0 r 面n ，4 下，离心3 0 h 血) ，然后取出样品，用移液枪吸取上清液( 避免吸入上层漂浮的脂质层物质) ，分别将运动组和安静组的组内上清液合并在一起。1 4 4 蛋白含量测定样品蛋白质含量采用b r a d f o r d 【3 6 】法测定，以b s a 为横坐标，测得的吸光度值为纵坐标做标准曲线，然后依据标准曲线计算样品中的蛋白质含量。测得对照组蛋白质含量为3 1 5 7 p p l ，运动组蛋白质含量为3 2 8 6 p i l 。样品每管1 m g 分装后，一7 0 冰箱保存待用。1 5 固相p h 梯度s d s 双向凝胶电泳方法与图像分析i 主要参考g o 玛等【3 7 1 的方法和i p g h o r t m 等电聚焦系统操作指南进行蛋白质固相一p h 梯度聚丙烯酰胺凝胶电泳( 2 一d e ) 。1 5 1 试剂配制平衡储液的配制：3 0 1 1 1 1 甘油，t r i s h c l 缓冲液( p h6 8 1 0 f i l l ) ，3 6 9 u r e a ，s d sl g 混合，加d m 0 定容至1 0 0 础，避光保存。平衡液a 的配制：取平衡储液2 0 m ，加入4 0 m gd t t 。平衡液b 的配制：即取平衡储液2 0 i i l l ，加入6 0 0 m g 碘代乙酰胺。水化液的配制：u r e a ( 终浓度为8m 0 1 l - 1 ) 1 2 9 ，5 0 0 此i p gb u 彘r ( p h3 0 1 0 0l ) ，c h a p s o 5 9 ，5 0 此1 的溴酚蓝，加d d h 2 0 定容至2 5 1 1 1 l 。按每管7 5 0 p l 分装后，一2 0 保存。3 0 凝胶储液的配制：由7 3 9 丙烯酰胺( 心c ) ，2 9 甲叉双丙烯酰胺( b i s ) 混合，加d d h 2 0 定容至2 5 0 武，注意避光保存。分离胶b u 虢r 的配制：l gs d s ，4 5 4 2 7 5 f n jt r i s h c l 缓冲液( p h硕士学位论文8 8 ) 混合，加d d h 2 0 定容至2 5 0i n l 。浓缩胶b u 髓r 的配制：由6 0 5 7 r n lt f i s h c l 缓冲液( p h6 8 ) ，1 9s d s 混合，加d d h 2 0 定容至1 0 0i i d 。8 分离胶( 7 0 1 1 1 1 ) 的配制：分离胶b u 虢r 1 7 5 1 1 1 1 ，d d h 2 0 3 3 8 砌，l o 过硫酸铵( a p s ) 2 0 0 皿，由3 0 凝胶储液1 8 7 瑚，t e m e d5 0 旺。4 8 浓缩胶( 8 i i l l ) 的配制：浓缩胶b u 虢r2 瑚，d d h 2 0 4 6 6 4 甜，1 0 过硫酸铵( a p s ) 4 8 此，由3 0 凝胶储液1 2 8 珊，t e m e d8 p l配制而成。电极缓冲液的配制：由9 9t r i s ，3 9s d s ，4 3 2 9 甘氨酸，双蒸水定容至3 l 。o 5 琼脂糖溶液由低熔点琼脂糖o 5 9 ，加电极缓冲液定容至l o o r n l 。考马斯亮蓝g 2 5 0 染色溶液：( 1 ) 固定液：乙酸6 0 1 1 1 l ，甲醇2 4 0 r n l ，加双蒸水定容至6 0 0 i i d 。( 2 ) 染色液：o 。7 2 9 考马斯亮蓝g - 2 5 0 ，6 9 6 1 1 1 l 磷酸，6 0 9 硫酸铵，甲醇1 2 0 i i l l ( 即用即配) ，加d ( 1 h 2 0 定容至6 0 0 i i l l 。1 5 2 固相p h 梯度等电聚焦( 第一向)具体操作方法与步骤如下：( 1 ) 用棉花醮少许酒精擦拭i p gp h o r 等电聚焦仪的平板电极，以除去上面残留物或表面的氧化层，待酒精挥发完全后备用，用胶槽专用洗涤液反复擦洗胶槽，用水冲洗干净后，再用双蒸水漂洗，自然风干，胶槽的盖子用滤纸擦干，保证清洁备用。( 2 ) 取出事先准备好的储存于2 0 水化液7 5 0 肛l ，室温下恢复4 周有氧运动对心房肌蛋自质组及其基因差异表达的影响温度。( 3 ) 取出干胶条，在室温下平衡半小时后使用。( 4 ) 称取2 m gd t t 溶于7 0 0 肛l 的水化液中，振荡混匀后，1 2 0 0 0 “【血l 。离心5 曲，以去除不溶物。( 5 ) 取出事先准备好的样品液a ( 运动组) 和样品液b ( 对照组) ，每管分另i j 加入准备好的水化液，至总体积为3 5 0 p l ，振荡混匀，样品管放入高速离心机中离心( 1 2 0 0 0r i n j n 1 离心1 0 血) 。( 6 ) 把胶条盒平行地放在i p g p h o r 的平板电极上，将处理好的样品均匀加入到胶盒中，取平衡好的胶条，揭去干胶条的表层保护膜，胶面向下放入h 0 1 d e r 中，胶条的酸性端对应h o l d e r 的正极，且要与胶条盒的电极紧密接触，慢慢后压，防止胶条与样品液之间出现气泡，来回慢慢的拖动胶条，使样品在胶条盒中均匀分布，然后加上3 5 0 肛l覆盖液，加入时要均匀，以把胶条刚好盖住为宜，盖上胶条盒盖和安全盖，最后检查胶条盒下端的电极是否与i p gp h o r 的平板电极接触紧密。( 7 ) 设置程序：按i p gp l l o r 操作说明执行，并按以下程序设置水化及聚焦有关参数：1 5 3 灌胶具体操作步骤：( 】) 将清洗干净并完全干燥的玻璃板按照仪器操作说明要求在支架上装好。( 2 ) 将配置好的己抽气的8 的分离胶用玻璃棒引流，倒入玻璃板的中间，液面距短玻璃板顶端上缘约5 c m 时停止，用水饱和的正丁醇封闭，并使胶面平整。约3 0 4 0 m i n 后，正丁醇和凝胶面之间出现明显界面时，即表示凝胶已经聚合完全。用注射器将正丁醇吸掉，并以滤纸吸干净：再用d d h 2 0 冲洗几次胶面。然后加入已抽气的浓缩胶至距短玻璃板上缘约l c m 处，再轻轻覆盖一层用水饱和的正丁醇，等待聚合。( 3 ) 浓缩胶聚合好之后，吸掉胶；面上的正丁醇和水层，用d d h 2 0 冲洗胶面数次，用滤纸吸干。1 5 4 平衡将聚焦好的i p g 胶条转移至平衡管中，然后在平衡管中加入l o m l 平衡缓冲液a ( 平衡母液2 0 础，用时现加d t t 4 0 m g ，d t 丁的主要作用是打开蛋白质的二硫键) ，将平衡管放在水平摇床上缓慢摇晃1 5 疵，平衡时间过短，会出现高分子量蛋白纹理现象，时间过长会导致蛋白质的丢失。第一次平衡结束后，彻底倒掉平衡管中的胶条平衡缓冲液a ，并用滤纸吸干胶条上的平衡液a 后再加入平衡缓冲液b ( 平衡母液2 0 1 1 1 l ，用时现加碘代乙酰胺6 0 0 m g ，i a a 的主要作用是封闭蛋白质的二硫键) ，继续在水平摇床上缓慢摇晃1 5 i i l i n 。1 5 5 十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳( s d s p a g e ( 第二向) )( 1 ) 将琼脂糖进行加热熔化，并把m a r k e r 用水煮沸5 分钟。将煮沸的m 破e r 用专用滤纸吸附后，从两玻璃板的最左侧加入，靠近4 周有氧运动对心房肌蛋白质组及其基因差异表达的影响隔条并紧贴胶面。( 2 ) 将平衡后的i 粥胶条从平衡管中移出，用镊子夹住胶条的一端使胶面完全浸没在电泳缓冲液中，然后将胶面朝前贴在凝胶的长玻璃板上。在凝胶的上方先加入一层低熔点琼脂糖，琼脂糖的温度不能太高，热的琼脂糖会加速平衡缓冲液中尿素的分解。( 3 ) 用压胶条轻轻将i p g 胶条下压，伎之与聚丙烯酰胺凝胶胶面相结合，注意不要在胶条下方产生任何气泡，在i p g 压胶条时，要注意推动胶条背面的支撑塑料片，不要碰到胶面，然后封上琼脂糖。( 4 ) 待琼脂糖彻底凝聚后，取下胶架转移到二项电泳的架子上，装进垂直电泳系统，并将垂直电泳系统放入电泳槽内，在玻璃板底部的缝隙的一侧缓慢的加入电极缓冲液，使其慢慢流向另一端，赶尽气泡。加满上槽液，盖好电泳槽盖，接通冷凝管，开启电源，设置电泳参数开始电泳。( 恒流：浓缩胶2 5 m a ；分离胶5 0 i i 丛) 待溴酚蓝迁移至胶底部上方约1 c m 处时，关闭电源，停止电泳。1 5 6 剥胶、染色电泳结束后，卸下玻璃板，轻轻撬开两层玻璃，取出凝胶。将剥离的凝胶置于固定液中放在小摇床上振荡1 h 后，倒掉固定液，用( 2 0 漂洗4 次，每次1 5 i i l i n 。漂洗结束后，倒掉d d h 2 0 ，加入考马斯亮蓝染色液，振摇过夜。倒掉染色液，用d d h 2 0 漂洗，直到背景比较干净为止。硕士学位论支1 5 6 图像扫描与分析运用清华紫光d 3 0 0 0 图像扫描仪对凝胶进行透射扫描。所得图谱借助图像分析软件b i o r a dp d q u e s t 进行分析，检测蛋白质点的差异。蛋白质分子的等电点和分子质量根据i p g 胶条p h 标识范围和标准蛋白质测算。实验组和对照组心房肌样品各重复电泳三次，都选取第一张胶为参考胶进行匹配( 不能相匹配的检测点被认为是杂质微粒或者由实验所带来的随机误差点) ，使各凝胶中的蛋白质点与参考胶”译的点对应起来，与参考胶中同一蛋白质点相匹配的点为同二一种蛋白质，得到了比较好的重复性。1 6 质谱分析1 6 1 切胶、酶解2 d e 图谱分析之后，从凝胶上切取所需的差异表达蛋白质点，放入消毒e p 管内，双蒸水漂洗3 次，用含5 0 乙腈的2 5 h u n 0 1 l 。n h 4 h c 0 3 浸泡胶片( 约5 0 l o o u l ) ，3 7 。c 水浴o 5 1 h 脱色。然后用5 0 乙腈溶液冲洗胶块l 2 次，每次，1 5 曲，待胶块萎缩并颜色变白且粘在一起后，去掉乙腈，将胶块在2 0 0 n 1 i n 0 1 l 。妇4 h c 0 3中吸水5 1 1 1 i n ，用纯乙腈脱水至胶块变白后。加入5 l o u l 胰蛋白酶溶液( 1 2 5 n g u l ，含2 5 i m 0 1 l 1n h 4 h c 0 3 ) ，并于4 冰箱中放置1 5 3 0m i n ，待酶液完全被吸收后补充适量的2 5 n 瑚0 1 l 的n h 4 h c 0 3 溶液，3 7 情况下保温反应1 6 h 以上。( 5 ) 酶解后肽段的提取方法如下：加入体积分数为5 t f a 溶液5 0pl ，于3 7 保温lh ，吸出上清液；再加入含有体积分数为2 5 t f a 的5 0 乙腈溶液5 0ul ，3 0 保温1h ，4 周有氧运动对心房肌蛋白