（化学工艺专业论文）磁性纳米颗粒的制备和表征及在脂肪酶固定化方面的研究.pdf

摘要 磁性四氧化三铁纳米颗粒具有粒径小、灵敏度高、毒性低、磁响应性强、原料易得 等优点。脂肪酶能够催化酯的生成和水解，但是由于脂肪酶是在游离的状态下应用的， 所以很难实现对脂肪酶的回收，不能很好的起到催化的作用。将脂肪酶固定到修饰的磁 性四氧化三铁纳米颗粒表面既便于回收脂肪酶，又可以提高固定后脂肪酶的活性。 本文采用共沉淀法合成f e 3 0 4 纳米颗粒。分别考察了r i f e 2 + n f e 3 + 的比值、铁的浓度、 p h 值、反应温度、氨水浓度、搅拌速度、氨水滴加速度等影响因素对f e 3 0 4 纳米颗粒生 成的影响，得出最适宜制备f e 3 0 4 纳米颗粒的实验条件。结果表明：当n ( f e 2 + ) n ( f e ”) = 1 ：2 、 铁总浓度为0 9 m o l l 、反应的p h 值在9 1 0 之间、反应温度为4 0 、c ( 氨水) = 3 m o l l 、 搅拌速度为8 0 0 r p m 、氨水滴加速度为1 0 m l m i n 时，得到的f e 3 0 4 样品的粒径分布均匀， 粒径较小。用3 氨丙基三乙氧基硅烷和不同烷基链长度的硅烷作为表面修饰剂，修饰合 成的f e 3 0 4 纳米颗粒。通过透射电子显微镜( t e m ) 、动态光散射仪( d l s ) 、傅立叶转变红 外光谱仪( f t i r ) 分析表面修饰的四氧化三铁纳米颗粒得出：表面修饰后的磁性纳米颗粒 粒径分布均匀、单分散性好、表面具有所要修饰的官能团、磁性没有发生明显的改变。 此外，采用化学共价法将脂肪酶固定于戊二醛修饰的f e 3 0 4 纳米颗粒表面上，采用 物理吸附法将脂肪酶固定于不同碳链长度的疏水性f e 3 0 4 纳米颗粒表面上。测定了固定 脂肪酶的质量和脂肪酶的活性及反复使用活性。采用紫外吸收法测定脂肪酶的浓度。采 用脂肪酶催化对硝基苯乙酸酯分解的方法测定固定脂肪酶的活性，通过紫外可见分光光 度计( u v - v i s ) n 定对硝基苯基乙酸酯分解生成的对硝基苯酚的量，来计算固定脂肪酶的 催化活性。由实验可以得出：表面修饰后的磁性f e 3 0 4 纳米颗粒固定脂肪酶的质量明显 多于没有经过表面修饰的f e 3 0 4 。纳米颗粒固定脂肪酶饱和时，在亲水性和疏水性f e 3 0 4 纳米颗粒表面固定脂肪酶的活性分别为0 2 5 1 0 一m o l m i n m g 和2 1 1 0 一m o l m i n m g 。 并且疏水性的f e 3 0 4 纳米颗粒表面固定脂肪酶的反复使用活性能够长期维持不变。 金由于具有化学性质稳定、无毒、制备过程简单等特点，特别是金被含巯基的有机 物修饰后，其表面表现出的有机物的多样性，使之成为了理想的包覆材料之一。制备的 核壳f e 3 0 4 ( 园a u 磁性纳米颗粒通过用巯基十一烷酸进行表面修饰，在n 一( 3 二甲基氨丙 基) - n 乙基碳二亚胺卦酸盐的活化作用下，实现对脂肪酶的固定。并且也测定了固定脂 肪酶的活性及反复使用活性。在核壳f e 3 0 4 a u 磁性纳米颗粒表面固定脂肪酶的活性 为0 8 1 0 - 6 m o f m i n m g 。固定的脂肪酶能够长期反复使用。 关键词：四氧化三铁纳米颗粒；脂肪酶；固定；活性； p r e p a r a t i o na n dc h a r a c t e r i z a t i o no fm a g n e t i cn a n o p a r t i c l e sa n d a1 j a n l t sa d d j l c a t l o ni nt l l el m m o b i l l z a t i o no in d a s e m e n gg a n g ( c h e m i c a lt e c h n o l o g y ) d i r e c t e db yp r o f e s s o rx uh a i a b s t r a c t m a g n e t i cf e 3 0 4n a n o p a r t i c l e sh a v et h ea d v a n t a g e so fs m a l lp a r t i c l es i z e ，h i g hs e n s i t i v i t y , l o wt o x i c i t y , s t r o n gm a g n e t i cr e s p o n s e i ti se a s yt og e tt h er a wm a t e r i a l l i p a s e sc a nb eu s e d t oc a t a l y z et h eg e n e r a t i o na n d h y d r o l y s i so fe s t e r w h e nt h ef r e el i p a s e si su s e dt oc a t a l y z e ，i t i sd i f f i c u l tt or e c y c l e ，i tc a n tc a t a l y z ee f f e c t i v e l y i ti se a s yt os e p a r a t ea n dr e c y c l et h el i p a s e ， w h i c hi si m m o b i l i z e do nt h es u r f a c eo fm a g n e t i cf e 3 0 4n a n o p a r t i c l e s ，w h i l et h ea c t i v i t yo ft h e l i p a s e si sa l s oi m p r o v e d t h em a g n e t i cf e 3 0 4n a n o p a r t i c l e sw e r es y n t h e s i z e db yc o p r e c i p i t a t i o nm e t h o di nt h i s a r t i c l e s e v e r a l f a c t o r s ，i n c l u d i n gm o l a rr a t i o o ff e r r o u st of e r r i c i o n s ，t o t a l f e r r i c c o n c e n t r a t i o n ，p hv a l u e ，t e m p e r a t u r eo fr e a c t i o n ，a m m o n i ac o n c e n t r a t i o n ，a n dp hv a l u eo f t h es o l u t i o n ，s t i r r i n gr a t e ，a d d i n gr a t eo fa m m o n i a ，w e r es t u d i e dt oi n v e s t i g a t et h e i ri n f l u e n c e o nt h ef o r m a t i o no ff e 3 0 4 t h eo p t i m a lr e a c t i o nc o n d i t i o n sw e r ea sf o l l o w s ，m o l a rr a t i oo f f e r r o u st of e r r i ci o n sa t 1 ：2 ，t o t a lf e r r i cc o n c e n t r a t i o na t0 9 m o l l ，p hv a l u ea t9 - 10 ， t e m p e r a t u r eo fr e a c t i o na t4 0 。c ，a m m o n i ac o n c e n t r a t i o na t3 m o l l ，s t i r r i n gr a t ea t8 0 0 r p m ， a n da d d i n gr a t eo fa m m o n i aa t10 m l m i n u n d e rt h eo p t i m a lc o n d i t i o n ，s m a l ls i z e da n d m o n o d i s p e r s e df e 3 0 4n a n o p a r t i c l e sc o u l db eo b t a i n e d 3 - a m i n o p r o p y l t r i e t h o x y s i l a n ea n d h y d r o p h o b i cs i l a n eo fd i f f e r e n tc a r b o nc h a i nl e n g t hw e r eu s e dt om o d i f yt h es y n t h e s i z e d f e 3 0 4n a n o p a r t i c l e s ，w h i c hw e r eo b t a i n e du n d e rt h eo p t i m u mc o n d i t i o n t h es u r f a c em o d i f i e d f e 3 0 4n a n o p a r t i c l e sw e r ec h a r a c t e r i z e db yt e m 、a f m 、d l sa n df t i r a f t e rm o d i f i c a t i o n ， p a r t i c l e s i z eo fm a g n e t i c f e 3 0 4n a n o p a r t i c l e sw a sw e l l d i s t r i b u t e da n ds h o wg o o d m o n o d i s p e r s i t y , t h ef u n c t i o n a lg r o u p sc a na l s ob ef o u n da n dt h em a g n e t i cd i d n tc h a n g e o b v i o u s l y i na d d i t i o n ，l i p a s e sw e r ei m m o b i l i z e do nt h es u r f a c eo fg l u t a r a l d e h y d em o d i f i e df e 3 0 4 n a n o p a r t i c l e sb yc h e m i c a lc o v a l e n t p h y s i c a la d s o r p t i o nm e t h o dw a su s e dt oi m m o b i l i z et h e l i p a s e so nt h es u r f a c eo ft h ef e 3 0 4n a n o p a r t i c l e sa n dt h eh y d r o p h o b i cf e 3 0 4n a n o p a r t i c l e s w i t hd i f f e r e n tc a r b o nc h a i nl e n g t h t h ea m o u n to fi m m o b i l i z e dl i p a s e s ，t h ei n i t i a la c t i v i t ya n d t h e a c t i v i t y o ft h er e c y c l ew e r em e a s u r e d c o n c e n t r a t i o no fl i p a s e sw a sm e a s u r e db y u l t r a v i o l e ta b s o r p t i o nm e t h o d t h ea c t i v i t yo ft h ei m m o b i l i z e dl i p a s e sw a sd e t e r m i n e db y c a t a l y z i n gd e c o m p o s i t i o nr e a c t i o no fp - n i t r o p h e n y la c e t a t e t h ea m o u n to ft h ep - n i t r o p h e n o l d e c o m p o s e db yp - n i t r o p h e n y la c e t a t ec a nb eo b t a i n e db yu v - v i s ，w h i c hc a nb eu s e d t o c a l c u l a t et h ea c t i v i t yo fi m m o b i l i z e dl i p a s e s s o m ec o n c l u s i o n sc a nb ed r a w nf r o mt h ee x p e r i m e n t ：t h el o a d i n ga m o u n to fl i p a s e so n m o d i f i e df e 3 0 4w a sm o r et h a nt h o s ei m m o b i l i z e do nt h eu n m o d i f i e dn a n o p a r t i c l e so b v i o u s l y w h e nt h ei m m o b i l i z e dl i p a s ei ss a t u r a t e d ，t h ea c t i v i t yo ft h ei m m o b i l i z e dl i p a s e o nt h e h y d r o p h i l i ca n dh y d r o p h o b i ca r e0 2 5 x10 - 6 m o l m i n m ga n d2 1xl0 。6 m o l m i n m g m o r e o v e r , t h ea c t i v i t yo fi m m o b i l i z e dl i p a s eo nf e 3 0 4n a n o p a r t i c l e sw i t hh y d r o p h o b i cs u r f a c ec a n m a i n t a i nf o ral o n gt i m et h o u g ht h el i p a s e sw e r eu s e dr e p e a t e d l y g o l dh a st h ea d v a n t a g e so fs t a b l ec h e m i c a lp r o p e r t i e s ，n o n - t o x i c i t ya n das i m p l e p r e p a r a t i o np r o c e s s ，e s p e c i a l l ys h o ws u r f a c eo r g a n i cd i v e r s i t yw h e nm o d i f i e db ys u l f h y d r y l o r g a n i cg r o u p ，i tb e c o m e sa ni d e a lc o a t i n gm a t e r i a l t h ep r e p a r e dc o r e s h e l lf e 3 0 4 a u m a g n e t i cn a n o p a r t i c l e sw e r em o d i f i e db y 11 一m e r c a p t o u n d e c a n o i ca c i da n da c t i v a t e db y n - ( 3 d i m e t h y l a m i n o p r o p y l ) 一n e t h y l c a r b o d i i m i d e t h e nt h e i m m o b i l i z a t i o no fl i p a s e sw a s c a r r i e do u t t h ei n i t i a la c t i v i t ya n dr e u s e da c t i v i t yw e r em e a s u r e d t h ea c t i v i t yo fm e i m m o b i l i z e dl i p a s eo nc o r e s h e l lf e 3 0 4 a um a g n e t i cn a n o p a r t i c l e si s0 8 10 。0 m o l m i n m g t h ea c t i v i t yo fi m m o b i l i z e dl i p a s ec a nk e e pc o n s t a n tf o ral o n gt i m et h o u g ht h el i p a s e sw e r e u s e dr e p e a t e d l y k e y w o r d s ：i r o no x i d en a n o p a r t i c l e s ，l i p a s e s ，i m m o b i l i z a t i o n ，a c t i v i t y 关于学位论文的独创性声明 本人郑重声明：所呈交的论文是本人在指导教师指导下独立进行研究工作所取得的 成果，论文中有关资料和数据是实事求是的。尽我所知，除文中已经加以标注和致谢外， 本论文不包含其他人已经发表或撰写的研究成果，也不包含本人或他人为获得中国石油 大学( 华东) 或其它教育机构的学位或学历证书而使用过的材料。与我一同工作的同志 对研究所做的任何贡献均已在论文中作出了明确的说明。 若有不实之处，本人愿意承担相关法律责任。 学位论文作者签名：盅p j日期：2 u 。夕年月午日 学位论文使用授权书 本人完全同意中国石油大学( 华东) 有权使用本学位论文( 包括但不限于其印刷版 和电子版) ，使用方式包括但不限于：保留学位论文，按规定向国家有关部门( 机构) 送交学位论文，以学术交流为目的赠送和交换学位论文，允许学位论文被查阅、借阅和 复印，将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，采用影印、缩印或其他 复制手段保存学位论文。 保密学位论文在解密后的使用授权同上。 学位论文作者签名：垂旦 指导教师签名： 日期：力弦夕年j l 午同 日期：2 护7 年石月争日 中国石油大学( 华东) 硕士学位论文 1 1 研究的背景与意义 第一章前言帚一早目| j 苗 2 0 世纪8 0 年代后期，纳米科技的诞生引起了科学家们的极大兴趣，纳米材料的出 现丰富了材料科学的内涵，成为材料科学研究的热点。1 9 8 4 年g l e i t e r 1 j 等首次将纳米粉 末压制成纳米固体材料。此后，纳米材料的制备、性质和结构的研究成为国际热点。1 9 9 0 年7 月，在美国巴尔基摩召开了第一届纳米材料科学技术会议( n a n os c i e n c ea n d t e c h n o l o g y ，简称n s t ) 正式把纳米材料科学作为材料科学的一个分支【2 】。它标志着- - f - j 崭新的科学技术。纳米材料科学的正式诞生。从此，纳米科技在世界范围内引起了人们 极大的兴趣和广泛的关注。 纵观纳米科技的发展历程，纳米科技将成为未来科技发展的重要基础。纳米科技的 进步将带动整个科学技术的进步。在我国，磁性能是较早研究的物质性能之一。古人利 用物质的磁性能发明了指南针，成为四大发明之一。纳米科学技术与磁学相结合产生的 磁性纳米材料出现了很多新的性质与现象，己引起国内外的广泛研究。磁性纳米材料的 特性不同于常规的磁性材料，其原因是与磁性相关的特征物理长度恰好处于纳米数量 级，而当磁体的尺寸与这些特征物理长度相当时，就会呈现出反常的磁性质。超顺磁性 就是磁性纳米材料所特有的性质。所谓超顺磁性，即在磁场中有较强的磁性，没有磁场 时，磁性很快消失，而不会被永久磁化【3 1 。磁性四氧化三铁纳米颗粒由于具有粒径小、 灵敏度高、毒性低、磁响应性强、原料易得到等优点，被选为最佳的磁性材料。 人们对酶的认识来源于生产实践，春秋战国时期，就已经知道用酒曲可以医治消化 不良。1 8 5 7 年微生物学家巴斯德等人提出酵母细胞活动可以使酒精发酵。1 8 7 8 年，“酶” 的概念被提出，l i e b i g 等人发现发酵现象是由溶解在细胞液中的酶引起的。1 9 1 3 年， m i c h a e l i s 和m e n t e n 提出酶促动力学原理米氏学说，这是研究酶反应机理的一个突破。 酶的催化作用与普通的催化不同，酶能在温和的条件下，进行高效率地催化。酶在生命 活动中具有十分重要的作用【4 】。研究酶的化学性质及其作用机理，对指导有关的医学实 践及工农业生产也具有重要的意义。 大多数的酶都是蛋白质。有的是结合蛋白质，有的是简单蛋白质。酶与其他的蛋白 质一样，都是由氨基酸组成的。酶作为催化剂的一种，与一般的催化剂相比具有以下共 性【4 】： 第一章前言 ( 1 ) 催化效率高而用量少，能够加快反应的进行。 ( 2 ) 酶与一般的催化剂一样，仅能够改变化学反应的速度，不会改变化学反应的平衡点。 在反应前后，化学性质不会发生变化。 ( 3 ) 反应的活化能降低，在催化反应中，催化剂能够与反应分子相结合，使反应的能垒 降低，这样只需较少的能量就能使反应物进入“活化态”，活化的分子数量大大增加， 反应速度也加快。 酶作为生物催化剂，又具有与一般催化剂不同的特殊的性质： ( 1 ) 可以在常温常压下操作，并且催化效率极高。酶催化反应的反应速度比非催化反应 高1 0 8 1 0 2 0 倍，比其他的催化反应高1 0 7 1 0 1 3 倍。 ( 2 ) 反应专一性强，一种酶只能作用于某一类或某一种特定的物质。 ( 3 ) 易失活，一般催化剂也会因为条件的改变而失去催化能力，酶比一般的催化剂更容 易失去活性。酶对化学品、温度、p h 都很敏感。 酶作为生物催化剂，能够高效专一得催化许多反应。然而，与一般的工业催化剂相 比，酶用作工业催化剂，存在一些缺陷。游离的酶在水溶液中不稳定，一般只能起一次 催化作用，在反应结束后，不能回收，增加了产物提纯的难度。由于酶的本质是蛋白质， 一般在高温、高离子浓度、强酸、强碱、有机溶剂等情况下，均不能稳定存在，在反应 中容易失活。这些都限制了酶促反应的广泛应用。近几十年，固定化酶技术的发展，既 克服了游离酶的不足之处，又可以实现酶的回收利用，保持了酶特有的催化活性，使酶 的应用领域更广，应用前景更加美好。 磁性四氧化三铁纳米颗粒作为酶固定化载体1 5 1 ，具有以下优点：( a ) 能够与底物、产 物分开，简单、易行；( b ) 可以反复使用，从而降低成本；( c ) 可以提高酶的稳定性；( d ) 可以改善酶的生物相容性、免疫活性、亲疏水性；( e ) 若将多种酶结合在磁性纳米颗粒上， 还可以进行多种酶反应。由于磁性四氧化三铁纳米颗粒作为酶固定化载体具有以上的优 点，所以它作为一种理想的固定化酶的载体被广泛地研究和应用。 1 2 磁学性质 1 2 1 磁滞现象 铁磁性物质的一个重要的特征就是磁滞回现象，图1 1 就是典型的磁滞回线。从图 中可以看到，o a 段表示铁磁质从开始磁化到磁化达到饱和状态的过程。这条曲线叫做 起始磁化曲线。它的显著特点就是它是非直线型的，这与非铁磁质明显不同。具体来说， 2 中国石油大学( 华东) 硕士学位论文 起始磁化曲线可以分为几个阶段。开始时，磁化强度b 随磁场强度h 增长缓慢，继而b 随h 迅速增长，其后b 的增长又缓慢。从某点a 开始，b 几乎不随h 的增大而增大。 从a 点开始磁化达到饱和，则a 点的h 值叫做饱和磁化强度。铁磁质的起始磁化曲线 与非铁磁质的磁化曲线的区别不仅是非直线与直线的区别，还体现于铁磁质起始磁化曲 线的平均斜率比非铁磁质磁化曲线的斜率大得多，这一点是铁磁质用途广泛的原因之 一。如果是磁场强度h 减小，则b 也要减小，但b 并不沿着o a 曲线下降，而是沿着 另一条曲线a c 下降，与起始磁化曲线不重合。这一事实说明，铁磁质中b 与h 不存在 单值关系。虽然h 值减小b 值也减小，当h = 0 时，磁化强度并不完全消失，磁介质中 仍保留着剩余的磁化强度b r ，说明铁磁质在没有磁场时，也可以有磁性，这种磁性叫做 剩磁。剩磁的成度可以由剩余磁感应强度值b r 的大小描述。由曲线a c a 可以看出，当 b = 0 时，而h 6 5 时，四氧化三铁纳米颗粒表面带负电：在p h 6 5 时，四氧化 三铁纳米颗粒表面带正电。油酸钠是阴离子表面活性剂，故可以在酸性不太高的情况下， 通过静电作用实现油酸钠对四氧化三铁纳米颗粒的修饰。表面化学修饰法是指通过纳 米表面与修饰剂之间进行化学反应，改变纳米微粒的表面结构和状态，以达到表面修饰 的目的。m i n gm a 5 0 1 等通过磁性四氧化三铁纳米颗粒表面的羟基与3 氨丙基三乙氧基硅 烷的脱水作用实现了对四氧化三铁纳米颗粒的表面氨基修饰。四氧化三铁纳米颗粒表面 的铁与氧原子能够吸附o h 。这些表面的羟基能够与3 氨丙基三乙氧基硅烷发生脱水作 用，实现了对四氧化三铁纳米颗粒表面的氨基修饰。 1 5 2 酶的固定化技术 1 5 2 1固定化酶的优点 固定化酶一般是指通过物理或者化学处理的方法，使原来的水溶性的酶与固态的不 溶物性载体相结合或被载体包埋。通过固定化的酶与水溶性的酶相比具有以下优点【5 l 】： ( 1 ) 酶经过固定化处理一般稳定性有较大提高，对热、p h 等的稳定性提高，对抑制 剂的敏感性降低，有的酶具有抗蛋白酶分解的特性。 ( 2 ) 反应完成后经过简单的过滤、离心或磁分离，酶就可以回收，并且酶活力降低 较少，这样就降低了生产成本。 ( 3 ) 固定化体系适合于连续化、自动化生产，催化过程容易控制，且生产中不会带 进酶蛋白或细胞，改善了后处理过程，提高了酶的利用率，降低了生产成本。 1 5 2 2 载体性能的要求 载体是指作为固定相或支持固定相的固体材料，将用于连接、吸附或包埋生物分子 使其在水溶液中以不溶态行使功能的固体材料统称为载体【5 2 1 。对于作为载体的材料也有 以下要求： ( 1 ) 载体表面具有化学活性基团，这些基团能够直接或者间接的与生物分子偶联。 ( 2 ) 载体具有一定的容量，能够偶联足够量的分子，能提高试验效率和节省成本。 ( 3 ) 载体应具有惰性，载体只起固定生物分子的作用，不会干扰生物分子的功能。 ( 4 ) 载体应具有良好的稳定性，包括机械、物理、化学稳定性。 ( 5 ) 载体应该廉价易得。 1 4 中国石油大学( 华东) 硕士学位论文 1 5 2 3 酶的固定化方法 酶的固定化方法有很多类，一般可以分为物理法和化学法两大类【5 3 - 5 5 1 。物理法包括 吸附法、包埋法等。化学法是通过化学作用将酶固定到载体的表面，主要有交联法和共 价结合法。 吸附法：载体与酶之间通过氢键、疏水键、电子亲和力等作用力实现对酶的固定。 如图1 7 所示，为通过吸附法固定酶的示意图。这种方法具有工艺比较简单、吸附条件 温和、酶活力回收率高、载体选择范围较大的特点。但这种方法的不足之处是酶与载体 之间的结合力弱，受外界因素影响，酶很容易与载体发生分离【5 4 】。 e 图1 7 吸附法固定酶示意图 f i g l 一7 t h es c h e m eo fe n z y m ei m m o b i l i z a t i o nv i aa d s o r p t i o n 包埋法：是通过物理作用将酶分子包埋于载体的一定空间，实现对酶的固定化。如 图1 8 所示。为通过包埋法实现对酶的固定。包埋法不需要酶蛋白氨基酸残基进行结合 反应，很少改变酶的高级结构，可以得到活性较高的固定化酶。包埋法工艺简单、使用 范围较广。但包埋法只适用于催化底物为小分子的反应。因为酶分子包裹住，大分子很 难通过包裹酶分子的层，而与酶分子接触，这样酶分子就起不到催化的作用。 第一章前言 图1 8 包埋法固定酶示意图 f i 9 1 - 8 t h e s c h e m eo fe n z y m ei m m o b i l i z a t i o nv i ae n t r a p m e n t 交联法：利用双功能试剂或多功能试剂，使酶分子之间发生交联，实现对酶分子的 固定化。如图1 - 9 ，为通过交联法实现对酶的固定。应用最广的双功能试剂是戊二醛， 它能够与游离的酶分子所带的氨基形成吸附碱，从而实现对酶的固定。这种方法固定的 酶能够牢固的固定在载体，不易脱离。由于交联需要酶分子参加化学反应，所以酶的失 活比较严重。 图1 - 9 交联法固定酶示意图 f i g l - 9 t h es c h e m eo fe n z y m ei m m o b i l i z a t i o nv i ac r o s s l i n k i n gw i t hr e a g e n t 共价结合法：固相载体表面的官能团与酶分子上的官能团发生化学反应，形成共价 键，酶分子与载体之间通过共价键的作用将实现对酶分子的固定。如图1 1 0 ，为通过共 价结合法实现对酶的固定。共价键结合法固定的酶比较牢固，并且不宜脱落，具有很好 1 6 中国石油大学( 华东) 硕士学位论文 的稳定性和可以实现反复使用。共价结合酶的载体表面的官能团一般有羧基、氨基、羟 基、羰基等56 1 。由于反应条件比较剧烈，酶活力有所降低，工艺比较复杂。对上述几种 固定化酶的优缺点可以总结如表1 2 所示1 5 4 , 5 5 。 图l l o 共价结固定脂肪酶示意图 f i g l 一1 0t h es c h e m eo fe n z y m ei m m o b i l i z a t i o nv i ac o v a l e n ta t t a c h m e n t 表1 2 各种固定化方法的比较 t a b l e l - 2 c o m p a r i s o nb e t w e e nd i f f e r e n tm e t h o d so fe n z y m e i m m o b i l i z a t i o n 1 5 3 固定化酶的应用 1 5 3 1固定化酶在工业生产中的应用 固定化酶的最早应用是在工业生产方面，主要应用领域是食品和制药工业【5 1 ，5 4 1 。例 如，工业生产半合成青霉素类和头孢霉素类抗生素的主要问题是制备母核，即6 氨基青 霉素烷酸和7 氨基头孢霉烷酸。随着固定化技术的出现，人们利用固定化青霉素酰胺酶 可以用来生产6 一氨基青霉素烷酸。由于固定化酶的性能稳定，可以长期反复使用，有利 1 7 第一章前言 于提高6 氨基青霉素烷酸的产率和质量。在工业上、经济上与传统的生产方法相比都具 有很大优势。固定化酶生产6 氨基青霉素烷酸已经实现工业化。 1 5 3 2 固定化酶在临床医疗方面的应用 用于治疗目的的酶，一般活性比较低，酶本身也不太稳定，容易被蛋白酶水解。这 是因为酶进入人体后，会产生抗体，由于抗体反应，严重的可以导致患者过敏性休克。 而通过包埋的方法将酶固定，然后再注入人体，这样可以增强稳定性，避免了酶与人体 体液的接触。例如，l 一天门冬酰胺酸具有治疗白血病的作用，但它进入人体会产生抗体。 通过包埋的方法将它固定之后，可以降低毒副作用。达到了理想的治疗效果【57 1 。 1 5 3 3固定化酶在化学分析方面的应用 酶的专一性可以使酶在复杂的体系中不受其他物质的干扰，这样通过酶的催化作 用，就可以对反应物或者产物进行准确的定量。但是游离的酶不够稳定并且价格昂贵， 从而限制了它的应用范围。而固定化酶的应用对将酶用于化学检测，开辟了新的途径。 例如，葡萄糖的检测。葡萄糖在葡萄糖氧化酶的作用下，可以分解为葡萄糖酸和过氧化 氢。而过氧化氢在过氧化物酶的作用下，可以将无色的邻联甲苯胺，氧化成蓝色化合物。 将葡萄糖氧化酶、过氧化物酶和邻联甲苯胺等还原性色素固定到纸片上，就可以成为检 验糖试纸。根据试纸颜色的变化，就可以判断出糖的含量。 1 5 3 4 固定化酶在环境保护方面的应用 固定化酶在环境保护方面也有很广泛的应用【58 1 。首先，可以用来进行环境监测。固 定化酶可以测定有毒物质的含量，进行环境监测。美国宾夕法尼亚大学利用多酚氧化酶 制成固定化酶柱，可以检测出水中微量的酚。另外，酶还可以用来处理三废。固定化的 酶可以组成快速、高效、连续处理的系统，使处理废水的成本降低，速度加快。例如， 生活废水和工业污水中的主要危害成分是氯酚，将辣根过氧化物酶通过吸附固定，可以 保证其1 0 0 的活力，可基本清除废水中的氯酚。 1 5 4 固定化酶存在的问题 固定化酶技术已经成为酶工程的研究重点，固定化酶有游离酶所没有的优点，但也 存在一些问题。首先，制备固定化酶需要经过许多复杂的分离和纯化的过程，而且一种 固定化酶只能用于特定的反应。此外，生物催化是在单一系统或者混合系统将底物转换 成有用的产物，从混合物中，分离产物和酶的再利用是很重要的步骤，往往这一步骤是 工业生产中消耗最多的。因此，探索新的酶固定技术、提高固定化酶的活性收率、延长 1 8 中国石油大学( 华东) 硕上学位论文 半衰期、降低成本将会是固定化酶研究的主要内容。选择具有适宜生物相容性及亲水性 的天然载体，运用新技术对天然载体进行修饰和制备性能良好的新的酶固定化载体材料 及无机物的复合材料将会是固定化酶载体材料的发展方向。 1 6 本论文研究的主要内容 用化学共沉淀法合成f e 3 0 4 纳米颗粒。考察不同的实验条件对生成的磁性f e 3 0 4 纳 米颗粒粒径和形状的影响。得出制备磁性纳米颗粒的最佳实验条件，为后继实验提供依 据。选择合适的表面修饰剂对磁性f e 3 0 4 纳米颗粒表面进行修饰。本实验选用的修饰剂 有3 氨丙基三乙氧基硅烷、丙基三甲基硅烷、辛基三甲氧基硅烷、十八烷基三甲氧基硅 烷。 磁性四氧化三铁纳米颗粒修饰后，表面带有氨基的磁性纳米颗粒可以通过静电作用 固定游离的脂肪酶，表面带有醛基的磁性纳米颗粒可以通过化学作用固定脂肪酶，表面 被烷基链包裹的纳米颗粒可以通过疏水作用实现对脂肪酶的固定。由紫外一可见分光光 度计可以确定脂肪酶的固定量。由于脂肪酶能够促进酯的水解，所以通过测定酯的水解 进度，确定固定后的脂肪酶的活性，并与游离的脂肪酶的活性进行比较。由于制备的纳 米颗粒具有磁性，可以通过外加磁场进行回收，用于测定固定的脂肪酶的反复使用活性。 用柠檬酸钠作为还原剂，将氯金酸进行还原，使合成的四氧化三铁纳米颗粒表面包 裹一层金，生成核一壳f e 3 0 4 a u 纳米颗粒。用1 1 一巯基十一烷基酸对合成的f e 3 0 4 a u 的核一壳纳米颗粒进行表面修饰，由于巯基与金的特异性作用，使合成的纳米颗粒表面 带有羧基，可以通过共价键实现对脂肪酶的固定。由紫外一可见分光光度计可以确定脂 肪酶的固定量。由于脂肪酶能够促进酯的水解，所以通过测定酯的水解进度，确定固定 后的脂肪酶的活性，并与游离的脂肪酶的活性进行比较。由于制备的纳米颗粒具有磁性， 可以通过外加磁场进行回收，用于测定固定的脂肪酶的反复使用活性。 1 9 第二章磁性四氧化三铁纳米颗粒的制备及表面修饰 第二章磁性四氧化三铁纳米颗粒的制备及表面修饰 2 1前言 纵观世界纳米科技的发展历程，纳米科技将成为未来高科技发展的一个重要基础，它 的进步将带动整个科学技术的进步，同时也是知识和技术创新的源泉。新理论、新规律的 建立和发现必将推动基础科学的发展。纳米技术与磁学的结合，磁性纳米材料出现了很多 新的性质与现象，已引起人们极大的研究兴趣。可以制备的磁性纳米材料有很多，四氧化 三铁纳米粒子由于具有粒径小、灵敏度高、毒性低、磁响应性强、原料易得到等优点，因 而被选为最佳磁性材料。制备的磁性纳米颗粒直径一般为1 0 - 3 0 n m 。磁性f e 3 0 4 的晶体在直 径小于3 0 r i m 时，具有超顺磁性，即在磁场中有较强的磁性，当磁场消失时，磁性也很快 消失，不会被永久磁化【3 】。磁性纳米材料作为一种新材料，由于其独特的物理化学性质， 如量子尺寸效应、表面与界面效应和宏观量子隧道效应等，使其在物理、化学等方面表现 出与常规磁性材料不同的特殊性质。由此可见，纳米材料向我们展示了一个奇特的物质新 世界。如何制备出具有特殊性能的磁性f e 3 0 4 纳米颗粒己成为人们研究的热点。 然而，磁性f e 3 0 4 纳米颗粒很难实现对生物分子高效稳定的固定。需要对磁性f e 3 0 4 纳米颗粒表面进行修饰【20 | 。表面修饰在纳米材料的制备、分散和改性等方面受到了广泛的 重视。：纳米粒子的表面修饰一方面保护了纳米粒子，改善了纳米粒子的分散性和相容性， 为高性能纳米复合材料的制备打下了坚实的基础；另一方面改变了纳米粒子的表面活性， 颗粒的修饰使颗粒的表面完全不同于初始材质，也改变了纳米粒子的原始活性。 制备四氧化三铁纳米颗粒的方法各有差异，经过比较，考虑到制备效果、操作简便性 和在生物体内的应用等特点，本章选择用化学共沉淀法制备磁性四氧化三铁纳米颗粒。化 学共沉淀法是一种比较简便的方法【5 9 , 6 0 】，在n 2 保护下，以氯化铁、氯化亚铁为反应物，用 水浴加热，在剧烈搅拌的情况下，用氨水将反应的p h 值调节到所需的值，经磁铁回收， 冷冻干燥，最终得到目的产物。我们考察了反应物计量比、反应物浓度、p h 值、反应物温 度、氨水浓度、搅拌速度、氨水滴加速度等初始条件对反应物粒径、磁性、形貌的影响。 制备出了粒径在5 1 8 n m ，单分散性好，磁性较强的四氧化三铁纳米颗粒。通过化学共沉淀 法制备的四氧化三铁纳米颗粒表面可以吸附羟基，这样就可以和3 氨丙基三乙氧基硅烷及 疏水性的硅烷发生化学反应，实现对纳米颗粒的表面修饰，修饰后的纳米颗粒粒径没有明 显变化，仍主要分布在5 18 n m 分散性提高。 2 0 中国油大学( 华东) 硕士学位论文 2 2 实验部分 2 2 1 药品和仪器 2 2 1 1实验仪器 n i c o l e t6 7 0 0 型傅立叶红外光谱仪、n a n o s 型动态光散射仪( m a l v e r n 公司) 、d k $ 2 4 型 电热恒温水浴锅( 上海精宏实验设备有限公司) 、电动搅拌器( i k a ) 、k q 一1 0 0 k d e 型高功率数 控超声波清洗器( 昆山市超声仪器有限公司) 、移液器( e o o e n d o r f ) 、电子天平( 梅特勒- 托利多 仪器上海有限公司) 、德国c h r i s ta l p h a l 2 型冷冻干燥机、超纯水与去离子水制水机 ( m i l l i p o r e ) 、烘箱( 上海福玛实验设备有限公司) 、日本j e o l - 1 2 0 0 e x 透射电子显微镜，磁铁 ( 青岛磁钢厂) 2 2 。1 2 实验药品 具体所用药品如表2 1 所示。 表2 1 试验所用药品 t a b l e 2 - 1l i s to fe x p e r i m e n t a lm a t e r i a l s 2 2 2 磁性f e 3 0 4 纳米颗粒的制备及表面修饰方法 影响化学共沉淀法合成磁性f e 3 0 4 纳米颗粒的因素有 5 9 , 6 0 1 ：f e 2 + 与f e 3 + 的摩尔比例、总 铁浓度、p h 值、搅拌速度、氨水滴加速度、氨水浓度、反应温度等。为了制备颗粒粒径小、 具有超顺磁性、粒径均一、单分散性好的四氧化三铁纳米颗粒，我们考察了上述因素对制 备磁性纳米颗粒的影响，并优化了制各条件。 2 2 2 1 磁性四氧化三铁纳米颗粒的合成方法 2 1 第二章磁性p q 氧化三铁纳米颗粒的制备及表面修饰 采用共沉淀法合成四氧化三铁纳米颗粒【6 l ，6 2 1 。将一定质量的氯化亚铁和氯化铁溶解在 1 0 0 m l 的去氧水( 将超纯水经过加热，沸腾，去除水中的氧制得) 中。在4 0 ，氮气的保护 下，剧烈搅拌，连续滴加氨水溶液，把溶液的p h 值调至所需的值，溶液由黄褐色变为黑 色。通过滴加氨水，维持所需的p h 值，反应3 0 m i n 。在8 0 下，水浴晶化3 0 m i n ，得到四 氧化三铁纳米颗粒。用磁铁分离生成的磁性四氧化三铁纳米颗粒。用去氧水反复冲洗生成 的纳米颗粒，至中性。重新分散在去氧水中。 2 2 2 2 磁性四氧化三铁纳米颗粒的表面氨基修饰方法 如图2 1 所示，为3 氨丙基三乙氧基硅烷修饰磁性四氧化三铁纳米颗粒的示意图。四 氧化三铁表面裸露的f e 能够吸附水溶液中的o h 。，四氧化三铁表面就被o h 一包裹。通过纳 米颗粒表面的羟基与3 一氨丙基三乙氧基硅烷的乙氧基侧链发生反应，可以实现3 一氨丙基三 乙氧基硅烷对磁性四氧化三铁纳米颗粒表面修饰【5 0 , 6 3 】。 g h 3 c h ， f e 3 0 4 o h 2h 2h 2ih 2 + h 2 n c c c s i 一0 一c c h 3 + 卜。 0 c h ， c h ， 图2 - 1a p t e s 修饰磁性四氧化三铁纳米颗粒示意图 f i 9 2 - 1 t h es c h e m a t i ci l l u