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细胞培养基本知识新乡医学院生命科学技术系生物技术教研室,李延兰,一、什么是细胞培养？(cellculture),概念,体外培养（Invitro）,*细胞培养(cellculture)：是把取得之组织用机械或消化的方法分散成单个细胞悬液，然后进行培养生长。,*组织培养(Tissueculture)：把活体的一小片组织置于底物上孵育，细胞自其周围移出并生长。,*器官培养(Organculture)：系将活体中器官或一部分器官取出，置于体外生存、生长并同时保持其一定的结构和功能特征。,是指从体内取出组织、细胞在体外模拟体内生理环境，在无菌、适当温度和一定的营养条件下，使之生存和生长，并维持其结构和功能特性。,细胞培养,概,念,二、细胞培养技术的主要优点,研究的对象是活的细胞。,研究的条件可以人为的控制。,研究的样本，可以达到比较均一性。,研究的内容便于观察、检测和记录。,研究的范围比较广泛。,研究的费用相对较经济。,在实验过程中，根据要求可始终保持细胞的活力，并可长时期的监控、检测甚至定量评估一部分活细胞的情况，包括其形态、结构和生命活动等。这点是其他方法所无法取代的。,进行体外的细胞培养实验时，可以根据需要，控制包括PH、温度、O2张力、CO2张力等物理化学的条件进行实验、观察。,通过细胞培养所得到的细胞系属同一类型的细胞，可以达到均一性。需要时并可采用克隆化等方法使细胞达到纯化。,通过倒置相差显微镜外接照相,摄影等直接观察活的细胞；电子显微镜分析细胞的超微结构；同位素标记、放射免疫等方法检测细胞内物质的合成、代谢的变化等。,活细胞相差摄影,2510,1610箭头所示分裂相细胞。,BGC-823细胞,多种学科均可利用细胞培养进行研究，如：细胞学、免疫学、肿瘤学、生化学、遗传学、分子生物学等。可供实验的组织来源众多，包括各种动物的各类组织，可以是动物的胚胎或成体，可以是正常组织或肿瘤组织等。,细胞培养可以大量提供在同一时期、条件相同、性状相似的实验样本，因此有时可比体内实验经济的多。例如，一个需要100只鼠才能得出结论的实验可能用100片盖玻片或几个多孔培养板而获得具有相同统计学意义的结果。,贴附生长型细胞必须贴附于底物才能生长的细胞。从形态上大体分为上皮细胞型及成纤维细胞型，还有一些难以确定其稳定形态的细胞。悬浮生长型细胞不需要附着于底物而于悬浮状态下即可生长。,三、培养细胞的生长方式及类型,贴附生长型细胞,细胞培养常用的培养瓶、培养皿、6孔板、96孔板,+,+,细胞的贴附过程,贴附物质带正电荷,细胞带负电荷,成纤维细胞：梭形、三角形、2-3个突起,上皮细胞：扁平、多角形、园核,可连成单层,懸浮生长型細胞,四、培养细胞的生长过程,单个细胞的生长过程,细胞系的生长过程,细胞周期,间期,M期（有丝分裂期）,G1期（DNA合成前期）,S期（DNA合成期）,G2期（DNA合成后期）,细胞系的生长过程,原代培养期,传代期,衰退期,为新鲜组织自体内取出并在体外培养生长至第一次传代的时期。,原代培养的细胞生长一定时间之后，如贴附型细胞即融合成片而逐渐铺满底物的表面，此时，便应将原代细胞分开接种至2个或更多的新的培养器皿中，即传代，此即成细胞系。,一般有限细胞系在此期的细胞开始时虽仍然存活，但增殖已很缓慢并逐渐完全停止，进而细胞发生衰退死亡。,消化传代的步骤,五、,培养细胞生长的条件,合适的环境和必需的条件,1,营养需要,2,环境要求,3,无毒及无污染,营养需要,基本营养物质：包括氨基酸、维生素、碳水化合物及一些无机离子。,促生长因子：体外培养细胞既需要上述基本营养物质，还需要促细胞生长因子等物质才能正常生长、繁殖。血清中含有多种这类物质，有利于多数细胞的存活和生长。,RPMI-1640培养液,1020%FBS,生存环境,温度,气相,PH,体外培养的细胞需在保持一定恒温的环境中才能生长。哺乳动物包括人类体外培养细胞的理想温度是3537。培养温度如不适当，将会影响细胞的代谢及生长，甚至发生死亡。一般说，高温比低温对细胞的影响更为明显。,体外培养细胞采用开放培养时，其气体环境一般应为95%空气加5%CO2的混合气体。CO2为细胞生长所需要，同时又是细胞代谢的产物，并与维持培养基的PH有关,大多数细胞适于在PH7.27.4条件下生长。一般来说，细胞对碱性不如对酸性的变化耐受，偏酸的条件比偏碱的环境对生长有利。,日本三洋CO2培养箱,倒置像差生物显微镜,超净工作台,无毒：无毒是培养细胞的必需条件。凡与细胞直接或间接接触的东西都必须是无毒的。,无污染,微生物的污染,不同细胞类型的交叉污染,细菌,霉菌,支原体等,细菌污染:能改变培养液的pH值，使培养液变混浊。细菌生长迅速，能消耗营养液和产生毒素。抑制细胞的生长