药敏.ppt

药物敏感性试验（比例法）,1,.,比例法原理,对照培养基(drug-free),含药培养基,所有菌落均生长,仅耐药菌生长,2,3,目的,用于诊断耐药结核病结核病治疗方案的选择用于耐药监测,药敏试验的基本步骤,含药培养基的制备-购置成品菌液制备和稀释接种培养报告结果,4,自制含药培养基,药物采购、药液制备、保存基础培养基的制备含药培养基的制备,5,*Proportion,WHO推荐DST浓度,6,含药培养基的制备,药物储存液的制备：在无菌容器内称取少量药物粉末，按不同药物出厂标定的效价精确计算其有效含量。计算每种药物应加入的溶剂体积，使得药物浓度为：INH20g/ml，SM400g/ml，RRP4000g/ml，EMB200g/ml。INH、SM和EMB用灭菌蒸馏水溶解，RFP用少量二甲基甲酰胺溶解后加灭菌蒸馏水至所需量。制成储存液，分装冻存，备用。,7,含药培养基的制备,基础培养基：无淀粉改良罗氏培养基。天门冬素3.6g(或谷氨酸钠7.2g）KH2PO42.4gMgSO4.7H2O0.24g枸橼酸镁0.6g丙三醇12ml蒸馏水600ml新鲜鸡卵液1000ml2%孔雀绿20ml,8,含药培养基的制备,基础培养基制备：盐溶液：精确称取各盐类成分，加蒸馏水600ml，沸水浴溶解，待冷后,加入丙三醇和2%孔雀绿,混匀。鸡卵液：将新鲜鸡卵洗净，用75%酒精纱布擦拭消毒后打碎，搅匀，经消毒纱布过滤，定量至1000ml。培养基基础液：将过滤后的鸡卵液加入盐溶液中，充分混匀，静置约1小时。,9,含药培养基的制备,每次制备培养基前取出1管储存液，室温融化，按实际需要量每100ml基础培养基中加入1ml药液，充分混匀。分装至螺旋盖无菌培养管,每管7ml,斜置培养基蒸汽凝固灭菌器内,85凝固50分钟，即制成含药培养基。凝固灭菌后的培养基自然冷却后，置35-37孵育24小时。检查培养基污染情况后置4保存，1个月内用毕。,10,菌悬液制备,准备磨菌瓶磨菌瓶为带有可密封螺旋盖的玻璃小瓶，装入约10个直径3mm的玻璃珠，高压灭菌后待用。,11,菌悬液制备,磨菌瓶法：在磨菌瓶中加入12滴5%吐温-80，用无菌吸管尖端或灭菌接种环刮取2-3周的新鲜菌落，置于磨菌瓶中。注意尽可能刮取多处的菌落。旋紧瓶盖，在涡旋振荡器上混旋约20-30秒。,12,取菌,13,磨菌,14,接触所有菌落,程序,SteriledistilledWater或5%吐温80,玻璃珠,涡旋,静置15min,转移上清至比浊管,15,菌悬液制备,磨菌瓶法：加入灭菌的生理盐水，直至其浊度与标准麦氏比浊管（MacFarlandNo.1）一致，即得到1mg/ml的菌液。,0.1mlof1%BaCl2+9.9mlof1%H2SO4,16,菌液稀释,菌悬液静置片刻，使其中的颗粒或菌块沉淀，用22SWG标准接种环或微量吸管无菌操作逐步稀释至10-2mg/ml和10-4mg/ml。22SWG标准接种环：金属丝直径0.7mm，接种环内径3mm，1满环移液0.01ml。,17,稀释菌,McFNo.1,DW2ml,DW2ml,0.02ml,1mg/ml,10-2,10-4,GC,H,R,S,E,0.01ml(10-4mg/10-6mg),0.02ml,18,悬浮分散菌,分散前,分散后,19,接种及培养,用22SWG标准接种环分别取1环（即0.01ml）10-2mg/ml和10-4mg/ml的菌液，用划线法均匀接种至对照及含药培养基表面，应注意使菌液尽可能均匀分散于培养基斜面。最终接种菌量为10-4mg和10-6mg。接种后的培养基置于37培养，至四周后报告结果。,20,取菌液*,21,结果报告,按以下方式记录菌落生长情况：少于50个菌落：实际菌落数50-100个菌落：1+100-200个菌落：2+大部分融合（200-500个菌落）：3+融合（大于500个菌落）：4+,22,结果报告,计算耐药百分比：含药培养基上生长的菌落数耐药百分比=-100%对照培养基上生长的菌落数若耐药百分比大于或等于1%，则认为受试菌对该抗结核药耐药。,23,结果判读,对照IsoniazidEthambutolInoculum10-2+310-42690%resistant34.60.1InterpretationResistantSusceptible,24,质量控制,若高稀释度菌液（10-4mg/ml,低接种菌量）在对照培养基上生长的菌落数少于20个菌落，则应从对照管传代培养，重复试验。每批实验均需增加H37Rv标准菌株，若标准菌株生长异常，则本批实验结果全部无效。,25,注意事项,选择新鲜、生长旺盛的菌落进行药敏试验，生长不良或陈旧菌株应传代后再进行试验比浊、菌液稀释应力求精确，以保证接种菌量的准确。下列操作应严格按技术规范进行，防止产生气溶胶：挑取菌落、磨菌、菌液稀释和接种、烧灼接种环。,26,实验室安全,实验室合理布局涡旋振荡、接种时容易产生气溶胶，应注意正确操作振荡后不能立即打开瓶盖，需静置片刻接种时禁止反复吹吸操作中一旦标本溅落，立即以5%石炭酸覆盖，至少30分钟,27,比例法药敏试验流程,基础液改良L-J,对照培养基,含药培养基,药物储存液,混合、摇匀,100ml,1ml,磨菌,分装凝固,分装凝固,1mg/ml菌悬液,10-4mg/ml,10-2mg/ml,100倍稀释,100倍稀释,接种0.01ml,接种0.01ml,2-3周新鲜菌落,28,练习：结果的解释,29,初步菌种鉴定,30,.,基于培养的检测,生长速度是否产生色素生长温度典型形态选择性抑制(PNB培养基),31,生长速度,快速生长:1周内不是TB生长缓慢:通常3周,有时达到6周可能为TB,32,生长温度,孵育:36+/-1CM.tuberculosis在过低或过高的环境下均不生长42C蟾分枝杆菌,33,色素产生情况,不产生色素TB产生色素,非TB,34,菌落形态,M.tuberculosis,35,菌落形态,M.chelonae(龟型分枝杆菌),M.Phlei（草分枝杆菌）,36,PNB选择性培养基,对照培养基含PNB培养基,37C孵育，28天后报告结果,药敏试验时选择10-2稀释浓度菌液用滴管或移液器接种0.1ml(2-3滴),37,PNB选择性培养基,结果报告对照培养基和PNB培养基上均生长非结核分枝杆菌复合群NTM对照培养基上生长很好，但PNB培养基上未生长或几个菌落结核分枝杆菌复核群对照和PNB培养基上均未生长不能判读结果需重做,38,非结核分枝杆菌复合群（NTM）,非结核性分枝杆菌（NTM)系指分枝杆菌属中，除结核分枝杆菌复合群(人型、牛型、非洲型和田鼠型结核分枝杆菌)和麻风分枝杆菌以外的分枝杆菌，由NTM引起的疾病称为非结核性分枝杆菌病。近年来由于检出率逐渐增多，相应的对其引起的各种疾病的认识也在逐渐提高。非结核性分枝杆菌中大多数为腐物寄生菌，毒力低，属于条件致病菌。非结核性分枝杆菌病的症状可有肺内、肺外之分，肺外感染可涉及皮肤、骨骼和淋巴结等。,39,NTM广泛分布于自然界的土壤、尘埃、流水和生牛奶中。显微镜下NTM形态与结核杆菌相似，抗酸染色呈红色，但在培养、生化特性与结核杆菌不同。,非结核分枝杆菌特点,40,非结核分枝杆菌特点,非结核分枝杆菌是否有致病性可用抗煮沸试验加以区别。非致病株煮沸1min即失去抗酸性，而致病株能耐10min，甚至高压灭菌亦不失去抗酸性。结核分枝杆菌和非结核分枝杆菌的鉴别，除热触酶试检外，可将菌苔置含盐水小滴的玻片上研磨，前者不易乳化而后者容易乳化。,41,由于许多非结核分枝杆菌菌株对常用的异烟肼、链霉素等耐药，但对利福平有一定敏感性;现多主张用利福平、乙胺丁醇和异烟肼联合使用。溃疡分枝杆菌则仅对卡那霉素等氨基糖苷类抗结核菌药物敏感，但鸟-胞内分枝杆菌耐药性强;有报道分出的23株全部对上述药物耐药;而通过结构改造的新型红