细菌学检验4细菌的分型及其检测技术.ppt

第四章细菌的分型及其检测技术,细菌噬菌体分型技术细菌素分型技术细菌的药物敏感试验与分型分子生物学分型技术（略）色谱和质谱技术在细菌学检验中的应用（略）细菌的自动化鉴定技术,致病菌的检验程序,标本,生化试验,血清学试验,动物试验,药敏试验,直接涂片检查(并非所有标本),分离培养,分子生物学技术（核酸杂交、PCR）,其它(HPLC),形态学检查,第一节细菌噬菌体分型技术,噬菌体是一类能感染细菌、放线菌、真菌、螺旋体的病毒。噬菌体的感染具有高度特异性，一种噬菌体只能裂解一种或与该种相近的细菌，故可用于细菌的分类鉴定。具种的特异性和型的特异性。,在液体培养基中，噬菌体和相应细菌混合培养，可使浑浊的菌液变为澄清。噬菌斑(plaque)：在固体培养基上，噬菌体对宿主菌细胞的裂解作用可使菌落溶解，导致在带菌琼脂平板上产空斑，易于观察。不同噬菌体产生噬菌斑的形状、大小和透亮度不同，依此将同一种细菌分为不同的噬菌体型。,噬菌斑,噬菌体分型的优缺点,优点特异性强方法简单快速结果直观、容易判断重复性好对细菌性传染病的流行病学研究具有重要意义。,缺点假阳性现象要求操作标准化,第二节细菌素分型,细菌素是某些细菌产生的蛋白质类抗菌物质，抗菌范围很窄，只对产生菌亲缘关系近的细菌有作用。根据敏感谱或产生谱可进行细菌分型和流行病学调查。其作用的特异性不如噬菌体严格。,对某细菌素敏感的细菌，遇细菌素时，在平板上的生长会受到抑制。通过观察是否形成抑菌斑（抑菌区域），对实验菌进一步分型鉴定。,第三节细菌的药物敏感性试验与分型,一、概述细菌的药物敏感试验(drugsusceptibilitytest)：是指在体外测定抗菌药物抑制或杀死细菌的能力试验，简称药敏试验。抗菌药物是指具有杀菌或抑菌活性的抗生素和化学合成药物。前者是真菌、放线菌、细菌等的代谢物，后者是经化学改造的半合成抗生素和化学合成药物。,意义可预测抗菌治疗的效果，“敏感”治疗可能有效；“耐药”肯定失败；指导医生选择使用抗生素，AST的结果为“耐药”，即应更换药物；提供所选择药物的依据；监测耐药性，分析耐药菌变迁，掌握耐药菌感染病流行病学，控制和预防耐药菌感染发生和流行。,常用方法：纸片扩散法稀释法E-TEST法联合药敏试验自动化检测法分子生物学方法,原理：将含有定量抗菌药物的纸片贴在已接种测试菌的琼脂平板上，纸片中所含的药物吸收琼脂中水分溶解后不断向纸片周围扩散形成递减的梯度浓度，在纸片周围抑菌浓度范围内测试菌的生长被抑制，从而形成无菌生长的透明圈即为抑菌圈。抑菌圈的大小反映测试菌对测定药物的敏感程度，并与该药对测试菌的MIC（最小抑菌浓度）呈负相关。,二、纸片扩散法（Kirby-Bauer法）,操作方法：1.将在约56恒温的无菌M-H琼脂倾注直径为90mm的平板，其厚度4mm。,2.无菌挑取孵育1624h的血平板上45个菌落。,3.待检菌置于无菌生理盐水中，校正其浊度（菌液浓度）至0.5麦氏比浊标准（McFarlandstandard）。,4.涂布接种：用无菌棉签浸入细菌悬液中，将拭子在试管上壁轻轻挤压以挤去过多的菌液。棉签在三个方向均匀抹琼脂表面（每次转60）使菌液均匀分布，最后沿平板内缘涂抹一周。,5.盖上平板的盖子，放置培养箱内孵育，放置310分钟干燥后贴上标准抗生素纸片。,6.根据选择的菌株挑选相应的抗菌纸片。肠杆菌科：氨苄西林、阿米卡星、哌拉西林/他唑巴坦、头孢噻肟、环丙沙星、亚胺培南、氨曲南、庆大霉素；铜绿假单胞菌：头孢他啶、庆大霉素、哌拉西林、阿米卡星、环丙沙星、头孢吡肟、亚胺培南；葡萄球菌属：头孢西丁、青霉素、红霉素、万古霉素、环丙沙星、庆大霉素、利福平；,7.用无菌镊子或纸片分配器将抗菌纸片粘贴于M-H琼脂的表面，一旦纸片贴上，不能移动；各抗菌纸片中心距离应大于24mm，纸片距平板内缘应大于15mm。,8.经过351624h孵育。,9.量取抑菌环直径（mm)，根据CLSI（clinicalandlaboratorystandardsinstitute）标准，报告细菌对该抗生素：敏感(susceptible,S)、耐药(resistant,R)、中介(intermediate,I)。,注：NCCLS是美国临床实验室标准化委员会的英文缩写，推荐的抗微生物药物敏感性试验操作方法和判断标准被世界上许多国家和地区所采用。2005年该委员会更名为临床实验室标准化协会CLSI,敏感（susceptible,S）：表示测试菌能被测定药物常规剂量给药后在体内达到的血药浓度所抑制或杀灭。中介（intermediate,I）：指最小抑菌浓度（MIC）接近药物的血液浓度或组织浓度，疗效低于敏感菌。中介还可作为敏感和耐药的缓冲区，以减少实验条件的失控而导致较大的错误结果。对于K-B纸片法结果表现为“中介”的药物，应做定量药敏试验来确证其敏感性。耐药（resistant,R）：表示测试菌不能被测定药物常规给药后在体内能够达到的浓度所抑制。,质量控制培养基菌液浓度含药纸片采用标准菌株作对照。,三、稀释法,是体外定量测定抗菌药物抑制待检菌生长活性的方法。将抗菌药物在液体或固体培养基中稀释。肉汤稀释法琼脂稀释法测MIC（最小抑菌浓度）：某抗菌药物抑制待测菌生长的最低浓度。测MBC（最小杀菌浓度）：是指能杀灭999以上测试菌量的最低药物浓度。,原理：聚乙烯板内含有各种稀释度的抗菌药物，实验时加入100l浓度为105CFU/ml的菌液，盖上盖板，351620h观察结果。孔底部清晰不出现细菌沉淀的最低抗菌药物浓度即为该抗菌药物对细菌的最小抑菌浓度，通过CLSI标准判断其敏感和耐药。再取0.01ml容量接种环取肉眼观察无菌生长的液体接种于血琼脂平板作次代培养，经35过夜培养后观察最低抗菌药物浓度能杀死99.9原始种入的细菌即为该菌的最低杀菌浓度(MBC)。,微量液体稀释法(microdilutiontest),操作方法：1.抗菌药物的稀释和融解,2.抗菌药物母液的稀释,3.在微量聚乙烯微板孔中加入各种不同浓度的抗生素100l，从低浓度往高浓度加样，不需要更换吸管。,4.挑选1824小时的菌落置M-H肉汤增菌46小时。,5.制备0.5麦氏比浊管，然后1:200稀释，使之最终浓度105CFU/ml。,6.用微量加样器接种100l到96孔中，盖上盖板。同时作阳性、阴性对照。,7.手工看浊度或仪器自动判读。按照CLSI标准报告细菌对某抗菌药物为敏感、耐药和中介。,质量控制培养基菌液浓度药液浓度采用标准菌株作对照。,四、几种细菌的特殊药敏试验,（一）厌氧菌药敏试验非常规试验。基本原理和方法与需氧菌相同，只是在培养基、操作环境和培养条件等应根据厌氧菌的特定需要变动。培养基为布氏血琼脂再加人补充剂：5g/ml氯化血红素,5脱纤维羊,1g/mlVitK。厌氧孵育条件。质控菌株为脆弱类杆菌ATCC25285。扩散法、稀释法、E试验。,原理：E试条是一条5mm50mm无孔试剂载体，一面固定有一系列预先制备的浓度呈连续指数增长稀释抗菌药物，另一面有读数和判别的刻度。抗菌药物的梯度可覆盖有20个MIC对倍稀释浓度的宽度范围。将E试条放在细菌接种过的琼脂平板上，经孵育过夜，围绕试条明显可见椭圆形抑菌圈，圈的边缘与试条交点的刻度浓度即为抗菌药物抑制细菌的最小抑菌浓度，对照CLSI标准判断其敏感、耐药、中介。,E-TEST,1.挑取1620h的菌落2.用无菌生理盐水制备成0.5麦氏比浊管浊度的菌液。,操作方法：,3.用无菌棉签浸入细菌悬液中，将拭子在试管上壁轻轻挤压以挤去过多的菌液。棉签在三个方向平均涂抹琼脂表面（每次转60）使菌液均匀分布，最后沿平板内缘涂抹一周。,4.用镊子将E-TEST试条的抗菌药物的一面贴向琼脂表面，有刻度的一面向外，直径140mm的平板可放置6条，9mm平板只能放置12试条。5.孵育，置平板于35孵育1624h。,6.孵育后形成一椭圆形抑菌圈，抑菌圈和试条的相交处的刻度即为抗菌药物对该菌的最低抑菌浓度(MIC)。,（二）结核分枝杆菌药敏试验抗分枝杆菌药物：第一线药物为：异烟肼、利福平、吡酸胺、乙胺丁醇和链霉素；第二线药物包括：对氨基水杨酸、乙硫异烟胺、环丝氨酸、卷曲霉素、卡那霉素、丁胺卡那霉素和利福布丁。,首次分离的分枝杆菌需做药敏试验。三个月正规治疗，标本分离培养仍为阳性患者，或感染的严重疾患（如播散性结核病和结核性脑膜炎）以及来自高耐药流行区的患者，均须做体外药敏试验。方法：比例法、放射同位素法、绝对浓度法等。所使用的培养基、质控菌株与其他菌不同。,第四节分子生物学分型技术,核糖体分型（RT）：16SrRNA脉冲凝胶电泳分型（PFGE）：序列分型：多位点序列分型技术（MLST）：,第五节色谱和质谱技术在细菌学检验中的应用,对多组分混合物进行分离分析以及鉴定的重要方法，可用于细菌细胞成分、代谢产物等进行分析。气相色谱方法在细菌学研究中的应用液相色谱方法在细菌学研究中的应用毛细管电泳在细菌学研究中的应用飞行质谱技术,第六节细菌的自动化鉴定技术,微生物数码分类鉴定技术集数学、电子、信息及自动分析技术于一体，采用标准化、商品化和配套的生化反应试验条（板），可将细菌鉴定到属、群、种和亚种或生物型，并可对不同来源临床标本进行针对性的鉴定。,微生物自动化鉴定系统基本结构与性能微生物数码分类鉴定系统+读数仪(人工、自动)+电脑分析软件=半自动化或自动化微生物分析系统,1、API细菌数值鉴定系统,菌种,基本培养基（液体）,菌悬液,检测、编码、查表、鉴定,适用于API鉴定细菌有700多种,AnalyticaProductsINC的简称。法国生物-梅里埃公司生产的细菌数值分类分析鉴定系统。约有1000种生化反应,可鉴定的细菌大于550种。目前中国各级疾病预防控制机构在细菌学检验中比较多地应用了此项技术,2、Enterotube系统,不同培养基分装不同小槽中，同步接种，培养后检测、查表、鉴定。,3、Biolog全自动或手动细菌鉴定系统,在96孔的细菌培养板上检测微生物对不同发酵性碳源利用情况进行的分类鉴定。,自动化、快速,可鉴定细菌有1140多种、酵母菌267种、目前已经可用于丝状真菌。,每个孔中含有不同的底物,菌悬液或无菌水,第七节菌种的保藏及保管,菌种保藏的目的：存活，不丢失，不污染防止优良性状丧失随时为生产、科研提供优良菌种,第七节菌种的保藏及保管,原理：选用优良的纯种（最好是休眠体，如分生孢子、芽胞等），创造降低微生物代谢活动强度，生长繁殖受抑制，难以发生突变的环境条件。其环境要素是干燥、低温、缺氧、缺营养以及添加保护剂等）,一、菌种保藏的注意事项,一般应保藏于低温、清洁和干燥处。无菌操作。根据菌种状况及时转接。控制传代次数。选择典型菌落，防止盲目传代。受损、衰退、变异细菌需复壮。用培养基保藏菌种时，应保藏两套。,二、菌种的保藏方法,（一）培养基保藏法使用普遍而又简易的保藏方法。往往需要定期传代，保存时间相对较短。4保存。方法：琼脂斜面保藏法：保存期36个月。半固体穿刺法：保存期612个月。石蜡油封存法：在斜面上覆盖一层无菌液体石蜡，保存期1年。,（二）载体干燥保藏法使生长合适的微生物吸附在一定的载体上进行干燥。常用的载体有土壤、砂土、硅胶、明胶、麸皮、磁珠和滤纸片等。适用于放线菌、芽孢菌和某些真菌保藏，保藏时间几至十几年。,（三）真空冷冻干燥保藏法是将要保藏的微生物样品先经低温预冻，然后在低温状态下进行减压干燥。加有保护剂的菌悬液在冻结状态下予以真空干燥。适用于各种微生物，便于大量保藏，菌种存活时间长，是目前常用的保藏方法。保藏时间几至几十年。,（四）低温及超低温保藏法（超）低温冰箱、液氮超低温保藏法将菌种置