（生物化学与分子生物学专业论文）尿激酶受体介导的基因转移研究.pdf

英文缩略词表 a b b r e v i a t i o n 英文缩写英文全称中文名称 a da d e n o v i r u s腺病毒 a t fa m i n ot e r m i n a lf r a g m e n t氨基末端片段 b db a s ep a i r 碱基对 b s ab o v i n es e r u ma l b u m i n 牛血清白蛋白 c p e c y t o p a t h i ce f f e c t 细胞病变效应 d a bd i a m i n o b e r m i d i n et e t r a h y d r o c h l o r i d e 二氨基联苯胺 d e p c d i e t h y lp y r o c a r b o n a t e焦碳酸二乙酯 e d t a e t h y l e n ed i a m i n e t e t r a a c e t i ca c i d乙二胺四乙酸 0 s s g g l u t a t h i o n e ( o x i d i z e df o r m )氧化型谷胱甘肽 h a h e m a g g l u t i n i n血凝素 h e k 2 9 3h u m a n e m b r y o n i ck i d n e y2 9 3c e l l人胚肾2 9 3 细胞 i p t g i s o p r o p y l t h l o d d g a l a c t e s i d e异丙基b - d - 硫代半乳糖 l m w - u f l al o wm o l e c u l a r w e i g h ti j r o k i n a s e低分子量尿激酶 l y sl y s i n e 赖氨酸 m 0 f m u l t i p l i c i t yo f i n f e c t i o n ( v i r u s c e l l )病毒感染指数 o d o p t i c a ld e n s i t y光密度 p a g e p o l y a c r y l a m i d eg e le l e c t r o p h o r e s i s聚丙烯酰胺凝胶电泳 p b s p h o s p h a t e - 1 3 u f f e r e ds a l i n e磷酸缓冲盐溶液 p e g p o l y e t h y l e n eg l y c o l聚乙二醇 p e i p o l y e t h y l e n i m i n e聚乙亚胺 p f u p l a q u ef o r m i n g u n i t 噬蚀斑形成单位 p l b p a s s i v eh s i sb u f f e r 被动裂解缓冲液 p l l p o l y - r l l y s i n e多聚赖氦酸 p r o u e ap r o u r o k i n a s e 尿激酶原 r l u m g r e l a t i v el u e i f e r a s eu n i t m i l l i g r a m 相对荧光素单位，每毫克蛋白 s d s s o d i u md o d e c y ls u l f a t e 十二烷基硫酸钠 t b s t r i s b u f r e r e ds a l i n e t r i s 一缓冲盐溶液 t f n a n s f e r r i n 转铁蛋白 u p a u r o k i n a s e t y p ep l a s m i n o g e n a c t i v a t o r 尿激酶型纤溶酶原激活物 u i a r u r o k i n a s er e c e p t o r 尿激酶受体 2 尿激酶受体介导的基因转移研究 摘要 基因治疗的载体可以分为病毒载体和非病毒载体两大类。病毒载体是目前基 因治疗的主要载体，但是病毒载体具有携带外源基因片段大小受到限制( 7 k b 左 右) 、易引起机体免疫反应以及制备、贮存、质量控制比较困难等固有缺点，这 促进了人们对非病毒载体的研究。在过去的十多年里，人们对受体介导的基因转 移进行了广泛的研究，并取得了较大的进展。受体介导的基因转移有安全、低免 疫原性、相对靶向性、载体制备简单、易规模化等许多优点。常用的受体有去唾 液酸糖蛋白受体、胰岛素受体、血管内皮细胞生长因子受体、转铁蛋白受体、甘 露糖受体、表皮生长因子受体、叶酸受体等。 肿瘤转移是肿瘤患者死亡的重要原因，尿激酶( u r o k i n a s e ，u p a ) 以及尿激酶受 体( u r o k i n a s er e c e p t o r , u p a r ) 在肿瘤转移过程中发挥着重要的作用。尿激酶受 体以及纤溶系统中某些其它成员成为抑制肿瘤转移的靶标。靶向u p a 和u p a r 的 单克隆抗体、可溶性u p a r 、能阻断u p a 和u p a r 相互作用的u p a 衍生肽都可以 抑制肿瘤细胞的侵袭和转移，u p a r 反义核酸表达质粒对肿瘤细胞的侵袭和转移 也有明显的抑制作用。 为了观察尿激酶受体反义核酸对肿瘤细胞的作用以及探讨尿激酶受体介导 的基因转移的可能性，我们先利用重组腺病毒技术，在人肺巨细胞癌高转移株 9 5 d 细胞中表达了尿激酶受体的反义基因，并观察其作用；同时表达纯化了尿激 酶氨基末端的突变体，与报告基因表达质粒组装成复合物，观察该基因转移系统 的基因转移效率，并介导尿激酶受体反义核酸靶向尿激酶受体的基因转移。 一重组腺病毒介导的u p a r 反义基因转移 为了观察u p a r 反义核酸对肿瘤细胞体外侵袭的抑制作用，用p c r 方法扩 增u p a rc d n a5 端- 4 6 b p 至+ 4 5 4 b p 段长5 0 0 b p 的序列，克隆到病毒载体 p a d e n o x 中，构建出重组腺病毒载体p a d e n o - x u p a r ( - ) 和p a d e n o x u p a r ( + ) 。 p a c i 限制性内切酶线性化重组腺病毒载体，转染h e k 2 9 3 细胞，7 天后可以获得 滴度( p f u m 1 ) 分别为1 5 1 0 8 和0 5 1 0 8 的u p a r 反义和正义核酸表达重组腺 病毒，分别命名为a d u p a r ( 一) 和a d - u p a r ( + ) 。以不同的病毒感染指数( m o i ) 感染人肺巨细胞癌高转移株9 5 d 肿瘤细胞，3 天后用r n a 印迹法可以检测到肿 瘤细胞中u p a r 正义和反义核酸表达，随着m o i 的升高，在a d u p a r ( ) 感染的 肿瘤细胞中u p a r 蛋白质水平逐渐下降肿瘤细胞的体外侵袭能力也明显下降， 而感染a d u 队r ( + ) 的肿瘤细胞无明显变化。结果表明重组腺病毒可以表达u p a r f 义和反义核酸，u p a r 反义核酸可以下调9 5 d 肿瘤细胞u p a r 蛋白质水平，并 明显抑制人肺巨细胞癌高转移株9 5 d 肿瘤细胞在体外的侵袭能力。 二尿激酶受体介导的报告基因转移 利用能够被细胞内吞的重组蛋白发展靶向性非病毒载体系统，并进行基因转 移是一个很有希望的研究方向。融合蛋白a t f l y s l 0 的氨基末端是尿激酶氨基末 端1 3 5 个氨基酸，起结合尿激酶受体的作用：羧基末端是1 0 个赖氨酸，起结合 质粒d n a 的作用。在大肠杆菌中表达的a t f - l y s l 0 主要以可溶形式存在，并具 有人尿激酶的抗原性。纯化后的a t f 1 y s l 0 可以阻滞质粒d n a 的迁移，并具有 和细胞表面的尿激酶受体结合的能力。质粒d n a 与a t f 1 y s l 0 以及多聚赖氨酸 组装的基因转移复合物可以介导报告基因的转移，氯喹可以明显提高基因转移的 效率，流感病毒血凝素融合肽的重组蛋白不能提高基因转移的效率。实验结果表 明：以a t f l y s l 0 重组融合蛋白组装的基因转移系统可以介导基因的转移具 有d n a 结合能力和细胞靶向性的重组蛋白质a t f l y s l 0 为非病毒基因转移系统 提供了一种新的途径。 三尿激酶受体介导的u p a r 反义基因转移 将u p a r 反义核酸表达质粒与a t f l y s l 0 以及多聚赖氨酸组装成基因转移复 合物，并转染9 5 d 细胞。结果发现，a t f - l y s l 0 介导的u p a r 反义核酸基因转移 可以下调细胞u p a r 蛋白水平，并降低细胞与纤连蛋白的粘附能力。r t - p c r 可 以检测到u p a r 反义核酸的表达，但u p a rm r n a 水平没有明显下降。 a t f - l y s l 0 介导的基因转移具有u p a r 靶向性，而且基因转移复合物制各相 对比较简单。其主要缺点有：基因转移效率低：基因转移复合物不够稳定， 体内实验比较困难：基因转移复合物存在非特异性结合细胞的可能。 关键词：腺病毒，尿激酶受体，基因转移， 肿瘤，侵袭与转移 中图分类号：q 7 8 s t u d y o fu r o k i n a s er e c e p t o 卜m e d i a t e dg e n ed e l i v e r y a b s t r a c t g r e a tp r o g r e s s e sh a v eb e e nm a d ei ng e n et h e r a p yi nr e c e n ty e a r s ，a n dv i r u s v e c t o r sb e c o m et h el e a d i n gv e c t o rf o rg e n ed e l i v e r y b u tv i r u sv e c t o r sh a v em a n y d i s a d v a n t a g e ss u c ha sl i m i t e dc a p a c i t yf o rf o r e i g ng e n e s ，i m m u n o g e n i c i t y , d i f f i c u l t y i nm a n u f a c t u r ea n ds t o r a g e ，w h i c hr e s u l ti nt h ed e v e l o p m e n to fn o n v i r u sv e c t o r s i n r e c e n ty e a r s ，m o r ea n dm o r er e s e a r c h e r sf o c u so nr e c e p t o r - m e d i a t e dg e n et r a n s f e r , w h i c hh a v em a n ya d v a n t a g e ss u c ha sv e r yl o wi m m u n o g e n i c i t y , r e l a t i v e l ys i m p l e m a n u f a c t u r i n g a n d s t o r a g e ，s a f e t y a n d r e l a t i v e l yt a r g e t i n g a s i a l o g l y c o p r o t e i n r e c e p t o r , t r a n s f e r r i nr e c e p t o ra n dr e c e p t o r sf o rl a c t o f e r r i n ，i n s u l i n ，e p i d e r m a lg r o w t h f a c t o r , f o l i ca c i da n dm a n n o s eh a v eb e e nu s e di nr e c e p t o r - m e d i a t e dg e n ed e l i v e r y t u m o rm e t a s t a s i si st h e i m p o r t a n tc a u s e f o rd e a t ho fm o s tc a n c e r p a t i e n t s u r o k i n a s e r e c e p t o r a n ds o m em e m b e r si n p l a s m i n o g e na c t i v a t i o ns y s t e mp l a y i m p o r t a n tr o l e si nt u m o rm e t a s t a s i s ，a n dt h e yh a v eb e c o m et h em a i nt a r g e tf o rt u m o r t h e r a p y s e v e r a lt e c h n i c a lm e t h o d sa f f e c t i n gt u m o rg r o w t ha n dm e t a s t a s i sb yt a r g e t i n g t h eu p a s y s t e mh a v eb e e ne x p l o r e d ，w h i c ha r em o n o c l o n ma n t i b o d i e sd i r e c t e dt ou p a o r u p a r ，s o l u b l er e c o m b i n a n tu p a r ，u p a d e r i v e dp e p t i d e st ob l o c ku p a u p a r i n t e r a c t i o na n da n t i s e n s eg e n eo f u p a r t oo b s e r v et h ee f f e c to fa n t i s e n s eg e n eo fu p a ro nt u m o rc e l l sa n di n v e s t i g a t e t h e p o s s i b i l i t y o fr e c e p t o r - i n e d i a t e d g e n ed e l i v e r ) t a r g e t i n gu p a r ，w ee x p r e s s e d a n t i s e n s eg e n eo fu p a ri nh u m a n l u n gg i a n tc a n e rc e l ll i n e s9 5 du s i n gr e c o m b i n a n t a d e n o v i r u sa n d l i g a n d c o n j u g a t e dp o l y l l y s i n e d n ac o m p l e x e s a sv e c t o rt om e d i a t e u p a ra n t i s e n s eg e n ed e l i v e r yf o ri n h i b i t i n gi n v a s i v ea b i l i t yo f9 5 d c e l l si nv i t r o s e c t i o n lr e c o m b i n a n ta d e n o v i r u sm e d i a t e da n t i s e n s eu p a r g e n ed e l i v e r y i no r d e rt o s t u d yt h ee f f e c to fu p a ra n t i s e n s eg e n eo ni n h i b i t i o no fi n v a s i v e a b i l i t yo fh u m a nl u n gg i a n tc a n e rc e l ll i n e s9 5 d ，5 0 0 b pf r a g m e n to fu p a re d n a b e t w e e n 一4 6 b p 斗4 5 4 b pw a sa m p l i f i e d ，a n dr e c o m b i n e di n t op l a s m i dp a d e n o x t h e r e c o m b i n a n tv e c t o r sw e r en a m e d p a d e n o - x - u p a r ( 一) a n dp a d e n o x u p a r ( + ) r e s p e c t i v e l y 7d a y sa f t e rt r a n s f e c t i n gh e k 2 9 3c e l lw i t hl i n e a r i z e dp a d e n o - x u p a r ( 一) a n dp a d e n o x - u p a r ( + ) ，t h er e c o m b i n a n ta d e n o v i r u sc a nb eo b t a i n e d w h i c hw e r e n a m e d a d u p a r ( ) a n da d 。u p a r ( + ) r e s p e c t i v e l y t h ev i r u s t i t r e ( p f u m 1 ) o f 6 a d u p a r ( 一) w a s1 5 1 0 8 ，a n dt h ev i r u st i t r eo f a d - u p a r ( + ) w a s 0 5 1 0 5 9 5 dc e l l s w e r ei n f e c t e dw i t ha d u p a r ( ) i nd i f f e r e n tm u l t i p l i c i t yo fi n f e c t i o n ( m o i ) n o r t h e r n b l o t a n a l y s i s c o u l dd e t e c tt h ee x p r e s s i o no fa n t i s e n s ea n ds e n s er n a f o r 5 0 0 b p f r a g m e n to f u p a rg e n e w i t ht h ei n c r e a s eo fm o i ，w e s t e r nb l o ta n a l y s i si n d i c a t e d t h a tt h eu p a rp r o t e i nl e v e ld e c r e a s e d ，a n dm o d i f i e db o y d e n s c h a m b e ra s s a y s u g g e s t e dt h a tt h ei n v a s i v ea b i l i t yo f9 5 d c e l l sa l s od e c r e a s e do b v i o u s l y t h er e s u l t s i n d i c a t e dt h a ta d e n o v i r u sm e d i a t e du p a ra n t i s e n s eg e n ed e l i v e r yc o u l dd o w n r e g u l a t e u p a r p r o t e i nl e v e la n di n h i b i tt h ei n v a s i v ea b i l i t yo f 9 5 dh u m a n l u n gc a n c e r c e l l s s e c t i o n 2u r o k i n a s e r e c e p t o r m e d i a t e dr e p o r t e rg e n ed e l i v e r y r e c o m b i n a n tf u s i o np r o t e i n st h a tc o m b i n ed i f f e r e n tf u n c t i o n sr e q u i r e df u rc e l l t y p e s p e c i f i cu p t a k ea n di n t r a c e l l u l a rd e l i v e r yo f d n a p r e s e n ta na t t r a c t i v ea p p r o a c h f o rt h ed e v e l o p m e n to f n o n v i r a lv e c t o r sf o rt a r g e t e dg e n ed e l i v e r y h e r e ，w ed e s c r i b e d an o v e lp r o t e i nt e r m e da t f l y s l ow h i c hc o m p o s e do fa m i n o t e r m i n a lf r a g m e n to f u r o k i n a s ea n dt e nl y s i n e sa tt h ec a r b o x y lt e r m i n u sa n df a c i l i t a t e dc e l l - s p e c i f i cg e n e t r a n s f e rv i ar e c e p t o r - m e d i a t e de n d o c y t o s i s b a c t e r i a l l ye x p r e s s e da t f - l y s l0p r o t e i n s e x i s t e di ns o l u b l ef o r m ，a n dh a da n t i g e n i c i t yo f h u m a nu r o k i n a s e p u r i f i e da t f l y s l 0 s p e c i f i c a l l yb o u n d t ou p a r - e x p r e s s i n gc e l l sa n df o r m e dp r o t e i n - d n a c o m p l e x e s w i t h p l a s m i dp g l 3 一c o n t r 0 1 t h e s ec o m p l e x e s a f t e r c o m p e n s a t i o n o fe x c e s s n e g a t i v e c h a r g e w i t h p o l y - l l y s i n e ，s e r v e d a sa s p e c i f i cg e n ed e l i v e r y v e c t o rf o r u p a r e x p r e s s i n gc e l l s l y s o s o m o t r o p i cc o m p o u n d ss u c ha sc h l o r o q u i n ed r a s t i c a l l y i n c r e a s e da t f l y s l0m e d i a t e d g e n ed e l i v e r y , b u tn o tf u s i o np e p t i d eo fh e m a g g l u t i n i n o u rr e s u l t ss u g g e s tt h a tf u s i o np r o t e i nw i t ht h ep r o p e r t i e so fd n a b i n d i n ga n dc e l l t y p et a r g e t i n gr e p r e s e n t s ap r o m i s i n ga p p r o a c hf o rt h e d e s i g n o fn o n v i r a ld n a t r a n s f e rv e c t o r s s e c t i o n 3u r o k i n a s e r e c e p t o rm e d i a t e du p a r a n t i s e n s eg e n ed e l i v e r y u p a ra n t i s e n s e g e n ee x p r e s s i o np l a s m i dp c d n a u p a r 0 ，a t f l y s l 0a n d p o l y l - l y s i n ew e r ea s s e m b l e di n t og e n ed e l i v e r yc o m p l e x 9 5 dc e l l sw e r es e e d e di n t o s i xw e l lp l a t e s ，a n dc u l t u r e df o r2 4 hf o l l o w e db yb e i n gt r e a t e dw i t hg e n ed e l i v e r y c o m p l e x w ef o u n dt h a ta t f l y s l 0m e d i a t e du p a ra n t i s e n s eg e n ed e l i v e r yc o u l d d o w n r e g u l a t eu p a rp r o t e i nl e v e la sw e l la sa d h e s i o na b i l i t yt of i b r o n e c t i n r t - p c r a n a l y s i sc o u l dd e t e c tt h ee x p r e s s i o no fu p a ra n t i s e n s eg e n e ，b u tn o tt h ed e c r e a s eo f 7 u p a rm r n a a t f 1 y s l 0m e d i a t e dg e n ed e l i v e r y i su p a r t a r g e t i n g ，a n dt h ep r e p a r a t i o no f g e n e d e l i v e r yc o m p l e xi sr e l a t i v e l ys i m p l e t h em a i nd i s a d v a n t a g e so f t h i sg e n ed e l i v e r y s y s t e ma r e ： g e n e t r a n s f e re f f i c i e n c yi sl o w ；t h e p h y s i c a la n d c h e m i c a ls t a b i l i t yo f d n aa n di t sd e l i v e r yv e h i c l ei nt h ee x t r a c e l l u l a rs p a c ei sn o ts a t i s f i e d ，w h i c hm a k ei t d i f f i c u l tt ob eu s e di nv i v o ； g e n ed e l i v e r yc o m p l e xh a st h ep o t e n t i a lt ob i n dc e l l s u n s p e c i f i c l y k e yw o r d s ：a d e n o v i r u s ，u r o k i n a s er e c e p t o gg e n ed e l i v e r y , t m n o li n v a s i o n a n d m e t a s t a s i s 8 前言 基因治疗( g e n et h e r a p y ) 是指将外源证常基因导入靶细胞，纠正或补偿基 因缺陷和异常引起的疾病，以达到治疗目的。1 9 9 0 年科学家成功地用基因治疗 手段尝试治疗腺苷酸脱氨酶缺乏症( a d e n o s i n ed e a m i n a s ed e f i c i e n c y ) 。迄今，基 因治疗的方案已有9 1 8 种，涉及到的疾病有单基因遗传病、肿瘤、感染性疾病、 血管性疾病以及其它一些疾病。基因转移的载体有逆转录病毒( 2 8 ) 、腺病毒 ( 2 6 ) 、脂质体( 9 3 ) 、裸质粒( 1 4 ) 、腺病毒相关病毒f 2 1 ) 、单纯疱疹病 毒f 2 8 1 以及其它非病毒性基因转移载体。 n d i c a t i o n sa d d r e s s e db yg e n et h e r a p yc l i n i c a lt r i a l s c a l l c e rd i s e a s e 6 6 6 0 8 1 m o n o g e n e l ed i s e a s e s98 0 0f n n 9 0 v a s c u l a rd i s e a s e s83 f n ”】 j n h c l l o u sd i s e a s e s6 ，5 ( n = 6 0 o t h e rd i s e a s e s2 。6 ( n = 2 4 g e n em a r k i n g58 n = 5 3 h e a l t h yr o t u n e e 08 l n = 7 v e c t o r su s e di ng e n et h e r a p yg n i c a lt r i a l s r e t r o v i r us2 8 n = 2 5 4 1 a d e n o v l r u s2 6 i n = 2 4 0 n a k e d p l a s m l dd n a1 4 ( n 一1 3 2 ) l i p o f e c l i o n9 + 3 ( n = 8 5j p o xv i r u s57 f n m 5 2 v a c d n i av i r u 33 f n m 3 0 j h e r p e li i m p l e xv i r u s28 f n = 2 6 a d e n o - a s s o c i a t e dv i r u s2 j f n c l 9 r n ai r o n i e f1 1f n t l o j or h e r s3 n = 2 3 j n c5 ，1 f n = 4 7 i 逆转录病毒载体有基因组小并且简单、可稳定整合于宿主基因组、生物学特 性清楚等优点，也有仅感染分裂细胞、随机整合可导致突变、病毒滴度低以及插 入容量有限等缺点。在治疗恶性胶质瘤的三期临床试验中，发现实验组与对照 组没有显著性差别。其原因可能是逆转录病毒在体内感染靶细胞的效率较低u 1 。 在2 0 0 0 年，f i s c h e r 等人用逆转录病毒对1 1 例严重联合免疫缺陷患者进行了治疗， 其中有两例患者在2 0 0 2 年发生自血病”j 。 腺病毒在不分裂细胞中可进行高效率的体内感染，病毒滴度高，生物学特性 清楚，但是不与宿主基因组整合( 只有短暂表达) ，病毒蛋白可能引起免疫反应 及炎症反应，插入外源基因能力有限。用腺病毒治疗卵巢癌、非小细胞肺癌、 头颈鳞状细胞癌以及心血管疾病都己经进行了三期临床试验，其中可以表达p 5 3 基因的重组腺病毒对卵巢癌患者没有治疗作用1 4 j 。但我国重组人p 5 3 腺病毒注射 液已经正式上市，用于治疗头颈部鳞癌。 腺病毒相关病毒细胞感染谱广、滴度高、可以整合到人基因组、无致病性和 毒性、基因组小，但是难以得到高纯度的病毒，需要辅助病毒进行包装，而且外 源基因容量低”j 。 非病毒载体介导的基因转移包括脂质体、裸质粒和受体介导的基因转移等。 脂质体则具有无感染能力、低毒性以及可携带较大外源基因片段等优点，但也具 有低靶向性、基因转移效率低、瞬时表达以及难以在体内应用等缺点【”。血管内 注射裸质粒是一种有效的基因转移方法，己被用于肝和肌肉的基因转移。在灵长 类动物实验中，血管内注射裸质粒可以使外源基因在肝脏获得高效的表达。用裸 质粒介导基因转移治疗外周性动脉闭塞已进入临床试验f 5 1 。 受体介导的基因转移载体主要有四个部分组成：配体、受体、含外源基因的 真核表达载体、配体与质粒的连接物。l 型多聚赖氨酸( p o l y l l y s i n e ，p l l ) 和 鱼精蛋白是两种常用的连接物。带正电的p l l 通过静电作用与带负电的质粒 d n a 结合，并将质粒d n a 浓缩折叠，形成小颗粒结构。鱼精蛋白是一种富含精 氨酸的小分子量的碱性蛋白，在精子形成过程中，取代体细胞核中的组蛋白。参 与精子核d n a 的凝集。因此，可用鱼精蛋白包裹质粒d n a 形成复合物。将阳 离子多聚物和d n a 复合物与配体共价交联，形成配体一阳离子多聚物质粒d n a 三元复合物。该三元复合物与细胞表面受体结合后，可被靶细胞内吞。利用此机 制，可将外源基因转移到细胞内【6 】。 受体介导的基因转移常用的受体有转铁蛋白受体( t r a n s f e r r i nr e c e p t o r ) 、去唾 液酸糖蛋白受体、叶酸受体( f o l i ca c i dr e c e p t o r ) 等。在高等生物，细胞内吞转铁蛋 白与铁离子的复合物是一种细胞摄取铁离子的基本方式。f e 2 十转铁蛋白。转铁蛋 o 白受体三元复合物被细胞内吞后，进入内吞小体( e n d o s o m e ) ，铁离子在内吞小体 被铁离子转运载体运送到细胞浆，而转铁蛋白与其受体的复合物则返回到细胞表 面。在1 9 9 0 年，不同课题组就利用该内吞的机制进行基因转移”1 。用双功能交 联剂将转铁蛋白与p l l 交联成复合物，然后与质粒d n a 按定比例组装成基因 转移系统。在多种肿瘤细胞系中，该系统都可以有效地介导基因的转移1 7 1 。重复 体内使用t f - p e g - - p e y d n a ( 其中质粒d n a 含有t n f - d 的编码基因) 基因转移 复合物可以促进鼠肿瘤的坏死，抑制其生长凡- f f 标记的阳离子脂质体可以有效 地介导p 5 3 基因转移，在头颈癌【9 】和前列腺癌 1 0 】的系统基因治疗中可以起到较长 时期的治疗效果。去唾液酸糖蛋白受体在肝脏特异表达，利用该受体可以对肝细 胞进行靶向性的基因转移。w u 等人u l i 靶向此受体，将h b v 病毒的反义核酸导 入己感染h b v 病毒的人肝癌h e p g 2 细胞中，可以使h b v 病毒的复制受到明显 抑制。在体内，w u 等人【1 2 】将氯霉素乙酰基转移酶基因与去唾液酸糖蛋白复合物 静脉注射到小鼠体内，发现”p 标记的d n a8 5 分布在肝脏，5 在血中。实验 结果说明去唾液酸糖蛋白受体介导的基因转移具有很高的靶向性和有效性。 a r m a k i 等人将p l l 与报告基因以及去唾液酸胎球蛋白标记的脂质体组装成基 因转移复合物，转染h e p g 2 细胞，报告基因可以被高效地转移到h e p g 2 细胞内， 在c y c l n a 基因启动子的作用下获得表达【l3 1 。叶酸受体在肿瘤细胞表面高表达， 携带叶酸的基因转移系统可以利用叶酸被肿瘤细胞内吞的机制进行基因的靶向 转移f i “。早在1 9 9 4 年，有学者将叶酸与p l l 交联，然后与b 半乳糖苷酶按一定 比例组装成基因转移复合物，该复合物可以被肿瘤细胞以胞饮方式摄入胞内，从 而进行基因转移【l ”。从此，叶酸受体介导的基因转移又成为受体介导基因转移 的一个新途径。为了提高该系统的稳定性和基因转移效率，人们用叶酸修饰脂质 体，对叶酸受体靶向的脂质体基因转移进行了较多研究 】。 国内在1 9 9 5 年出现了有关受体介导基因转移的综述【1 8 ”】，并指出靶向性基 因治疗是一种理想的基因治疗模式。1 9 9 7 年颜子颖等人1 2 0 , 2 1 】将质粒d n a 与半乳 糖基化组蛋白组装成复合物，并用于靶向肝细胞的基因转移。隋宝全等人f 2 2 】用 该系统进行体内基因转移，发现促红细胞生成素基因在动物体内可以被有效地表 达，改善肾性贫血。从1 9 9 8 年开始，顾健人院士领导的课题组对胰岛素样生长 因子受体( i g f r ) 【2 孙、表皮细胞生长因子受体( e g f r ) 5 8 1 以及血管内皮生长因子 受体( v e g f r ) j 2 5 3 1 介导的基因转移进行了系统深入的研究。1 4 肽e 5 可以结合 i g f r ，与内吞小体释放寡肽以及多聚阳离子多肽一起组成复合多肽系统。质粒 d n a 与此多肽系统的复合物，构成了一种靶向i g f r 的基因转移系统，体内外 实验结果表明e 5 可以高效地将外源基因导入人恶性肿瘤中，并得到预期表达。 1 6 肽g e 7 可以结合e g f r ，3 2 肽g v l 和3 6 肽g v 2 可以结合v e g f r ，用g e 7 或g v l 或g v 2 取代e 5 可以得到靶向e g f r 以及v e g f r 的基因转移系统。体 内外实验结果表明，这两种基因转移系统可以将外源基因高效地导入肿瘤细胞口4 2 ”。这些非病毒载体系统的建立为受体介导的基因转移注入了新的活力，使人们 对受体介导的基因转移的发展前景充满了希望。 尿激酶受体( u r o k i n a s er e c e p t o r ) 是一种分子质量为5 5 6 0 k d 的糖蛋白，并通 过磷脂酰肌醇( g l y c o s y l p h o s p h a t i d y l i n o s i t o l ，g p i ) 锚定在细胞表面，参与血管 生成、单核细胞迁移、伤口愈合以及肿瘤细胞的侵袭和转移等多种生理病理过程。 尿激酶( u r o k i n a s e ，u p a ) 是丝氨酸蛋白酶家族的成员之一，刚分泌的u p a 以蛋 白酶原形式存在。u p a 结合u p a r 后可以被纤溶酶、血浆激肽释放酶、凝血因子 x i i 、组织蛋白酶b 和l 等活化，在肿瘤细胞表面发生纤溶系统蛋白级联反应， 大量的纤溶酶原被激活生成纤溶酶，纤溶酶又可以激活金属基质蛋白酶，形成强 大的蛋水解活性，降解细胞基底膜和细胞外基质，在肿瘤的侵袭和转移过程中发 挥着重要作用 2 6 , 2 7 】。纤溶酶原激活抑制物1 ( p l a s m i n o g e na c t i v a t o ri n h i b i t o rt y d el ， p a i 1 ) 可以与细胞表面活化u p a 结合，抑制u p a 的活性。p a l 1 与u p a 、u p a r 形成三元复合物可以被肿瘤细胞内吞，从而调节u p a r 在肿瘤细胞表面的分布。 有文献报道u p a r 在白血病、结肠癌、乳腺癌、膀胱癌、甲状腺癌、肝癌、 肺癌、胰腺癌、卵巢癌以及头颈癌等多种肿瘤细胞中高表达【2 8 1 。那么是否可以 利用细胞内吞u p a r 和u p a 的机制进行靶向肿瘤细胞的基因转移呢? w e l s h 等人 将u p a 衍生肽u 7 共价交联到腺病毒衣壳上，发现改造后的腺病毒可以靶向u p a r 进行基因转移。作者指出u p a u p a r 系统可以为呼吸道上皮细胞提供靶向性基因 转移的途径。r a j a g o p a ! 等人【3 0 】将尿激酶氨基末端( u r o k i n a s ea m i n ot e r m i n a l f r a g m e m ，a t f ) 与假单胞菌外毒素重组表达，获得重组的外毒素a t f p e 3 8 和 a t f - p e 3 8 k d e l 。实验证明它们可以与细胞表面u p a r 特异结合，并被u 9 3 7 细 胞以至少每小时每个细胞1 2 7 0 - - + 5 3 0 个分子的速度内吞。这些研究提示靶向 u p a r 进行受体介导的基因转移是一个很有潜力的研究方向。 综上所述，病毒载体是目前基因转移常用的载体，基因转移的效率较高，但 也有病毒载体本身固有的缺点；非病毒载体包括受体介导的基因转移具有相对靶 向性、无毒性、低免疫原性、制备比较简单易规模化等优点，其主要缺点是基因 转移的效率较低，质粒d n a 从细胞外进入细胞内、从胞浆内进入细胞核的过程 和质粒d n a 在溶酶体内的降解是非病载体介导基因转移的主要障碍【3 1 】。 各种基因转移载体都有自己的优点和缺点，每一种载体都有需要改善的地 方。未来的基因转移载体应该高效、特异、可调、安全，从长远来看非病毒载体 具有更好的商品化的前