（应用化学专业论文）L酪氨酸印迹分子的制备及性能研究.pdf

摘要 分子印迹技术是利用受体一抗体作用机理，制备对某一特定的目标分子( 模 板分子，印迹分子) 具有特异选择吸附性的聚合物的过程。 本论文采用两种方法优化制备出l 一酪氨酸( l t y r ) 分子印迹聚合物，并进 行了结构分析以及性能研究。为了得到最优合成条件，首先采取本体聚合法制备 l 一酪氨酸分子印迹聚合物( m i p s ) ，通过单因素实验和正交实验，研究了功能单 体、交联剂、引发剂及反应条件对制备m l p s 及其性能的影响，得出最优条件为： q 一甲基丙烯酸( m a a ) 为功能单体，二甲基丙烯酸l - - - - 醇酯( e d m a ) 为交联剂，其 物质的量之比为1 ：4 ：2 0 ，以氯仿作为溶剂，偶氮二异丁腈( a i b n ) 作为引发剂，用 量为6 0 m g 时采用6 0 1 2 加热聚合的方法，制备吸附性能良好的l 一酪氨酸的印迹分 子聚合物m l p s ，其萃取效率高达8 6 5 7 ，饱和吸附量高达7 7 6 6 um o l g 。 然后对比研究了水溶液中悬浮聚合法制备分子印迹聚合物，其最优反应条件 为：搅拌速度2 0 0 r m i n ，l - t y r 、m a a 、e d m a 的物质的量之比为1 ：4 ：2 0 ，a i b n 用量为6 0 9 时，采用6 0 水浴聚合，能制备出平均粒径较小( 6 1i lm ) 的l _ 酪 氨酸的印迹聚合物微球( m i m s ) 。 此外，探讨了l _ t y r 分子印迹聚合物中模板分子的萃取效率及其影响因素， 最后进一步探讨了聚合物的选择性吸附性能及影响因素，并进行了表征，得出 m l p s 、m i m s 的吸附性能在p h = 2 0 ，6 0 i sm o l l l 的l - t y r 的标准溶液中。2 5 温度下吸附2 4 h 后，吸附量达到最大，分别为9 1 6 4um o l g 、9 9 6 2um o l g ， m l p s 、m i m s 表面具有均一选择性的吸附位点，其最大吸附量分别为1 2 3 5 9 3 4u m o l l g ，1 4 0 0 7 1 4pm o l g 。 关键词：分子印迹技术；分子印迹聚合物；l - 酪氨酸；分离；吸附；结构分析 a b s t r a c t t h em o l e c u l a rs i g n a t u r et e c h n o l o g yu s e sa c t i o n m ec h a n i s mo fa c c e p t o ra n d i l l l m n l a eb o d y ，i ti st h ep r o c e s so fp r e p a r i n gt h es p e c i a lc h o i c em s o r b a b i l i t yp o l y m e r t os o m es p e c i f i cg o a lm e m b e r ( t e m p l a t e m o l e c u l a r , i m p r i n t i n gm o l e c u l a r ) t w ok i n d so f m e t h o d sa r eo p t i m i z e dt om a k em o l e c u l a r l yi m p r i n t e dp o l y m e r so f l - t y ri nt h i st h e s i s i no r d e rt oo b t a i nt h eb e s tc o n d i t i o n , b u l kp o l y m e r i z a t i o ni s f i r s t l yc a r r i e do nt h es t u d yo ft h ef u n c t i o n a lm o n o m e r , c r o s s l i n k e r ，i n i t i a t o ra n d r e a c t i o nc o n d i t i o n so i lt h ep r e p a r a t i o na n dp e r f o r m a n e 4 。o fm i p sb yt h es i n g l ef a c t o r a n do r t h o g o n a le x p e r i m e n t , t h es u p e r i o rc o n d i t i o ni st h a tt h e 廿m e t h y la c r y l i ca c i d i su s e da saf u n c t i o n a lm o n o m e r , e t h y l e n eg l y c o ld i m e t l m e r y l a t ei su s e d 船 c r o s s l i n k i n ga g e n t , t h e r a t i oi s1 ：4 ：2 0 ，c h l o r o f o r mi su s e d 髂as o l v e n t ， 2 ，2 - a z o b i s i s o b u t y r o n i t r i l e i su s e da s i n i t i a t o r , t h ea m o u n t i s6 0 r a g ，r e a c t i v e t e m p e r a t u r ei s6 0 c ，l t y r o s i n em o l e c u l a r l yi m p r i n t e dp o l y m e r s ( m 1 p s ) o f9 0 0 d a d s o r p t i o np r o p e r t i e sc a nb ep r o d u c e d ，t h ee x t r a c t i o ne f f i c i e n c i e si sa sh i g ha s8 6 5 7 ， s a t u r a t i o na d s o r p t i o ni sa sh i g ha s7 7 6 6um o l g t h e nm o l e c u l a r l yi m p r i n t e dp o l y m e ri n t h ea q u e o u ss u s p e n s i o ns y s t e mi s c o m p a r a t i v e l ys t u d i e d , i t so p t i m a lr e a c t i o ac o n d i t i o n s ：m i x i n gs p o e d i s2 0 0 r r a i n ，t h e r a t i oo fa m o u n to fs u b s t a n c ea m o n gl t y r , m a a , e d m ai s1 ：4 ：2 0 ，t h ea m o u n to f a i b ni s 6 0 9 , 6 0 w a t e rb a t l i n g ，b y t h i s ，l - t y r o s i n ei m p r i n t e dp o l y m e r m i c r o s p h e r e s ( m i m s ) p o l y m e r i z a t i o ni nr e l a t i v e l ys m a l la v e r a g es i z e ( 6 1p 哪! c a l l b ep r o d u c e d i na d d i t i o n , m o l e c u l a ri m p r i n t e dp o l y m e rt e m p l a t em o l e c u l ea n dt h ee x t o l l e f f i c i e n c yf a c t o r so ft h el - t y ri se x p l o r e d f i n a l l yf l l r t h e re x p l o r et h es e l e c t i v e a d s o r p t i o no ft h ep o l y m e rp r o p e r t i e sa n df a c t o r s , a n dt h ec h a r a c t e r i z a t i o n , i m p r i n t e d p o l y m e r sd e r i v e dm i p s ，t h em i m si na q u e o u sa d s o r p t i o n , i nt h es t a n d a r ds o l u t i o no f p h = 2 0 ，l - t y r6 0m o l m l ，a d s o r p t i o nf o r2 4h o u r si n2 5 c ，a d s o r p t i o ni sm a x i m u m ， r e s p e c t i v e l y9 1 6 4t tm o l g 、9 9 6 21 1m o l g ，u n i f o r ms u r f a c ew i t h t h es e l e c t i v e a d s o r p t i o ns i t e si so b t a i n e di nm i p s ，m m s i t sm a x 曲l l 1 a d s o r p t i o ni s1 2 3 5 9 3 4 m o 垤，1 4 0 0 7 1 4l im o i g k e y w o r d s ：m o l e c u l a ri m p r i n t i n gt e c h n i q u e ；m o l e c u l a r l yi m p r i n t e dp o l y m e r s ； l - t y r o s i o n e ；s e p a r a t i o n ；a d s o r p t i o n ；s t r u c t u r ea n a l y s i s l i 湖南农业大学硕士学位论文 缩写词 m i t m i p s m i m s l - t y r m a a e d m a a i b n 4 v p h e m a g m g 嵋 m m o l p m o l h m 1 1 1 r 缩写词( a b b r e v i a ti o n ) 英文名 m o l e c u l a ri m p r i n t i n gt e c h n i q u e m o l e c u l a r l yi m p r i n t e dp o l y m e r s m o l e c u l a r l yi m p r i n t e dm i c r o s p h e r e s l - t y r o s i o n e a - m e t h y la c r y l i ca c i d e t h y l e n eg l y c o ld i m e t h a c r y l a t e 2 , 2 - a z o b i s i s o b u t y r o n i t r i l e 4 - v i n y lp 州d i n e h y d r o x y e t h y lm e t h a e r y l a t e g r a m m i l l i g r a m m i c r o g r a m m i l l i m o l e m i c r o m o l e h o l l l m i n u t e r e v o l u t i o n s 中文名 分子印迹技术 分子印迹聚合物 分子印迹微球 l 一酪氨酸 a 一甲基丙烯酸 二甲基丙烯酸乙二醇酯 偶氮二异丁腈 4 一乙烯基吡啶 甲基丙烯酸羟乙酯 克 毫克 微克 毫摩尔 微摩尔 小时 分钟 转速 独创性声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研 究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他 人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得湖南农业大学或其它教育机构 的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均 已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。 研究生签名： 立锦 帆唧年洲日 关于论文使用授权的说明 本人完全了解湖南农业大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权 保留送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或 扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同意湖南农业大学可以用不同方式在不同 媒体上发表、传播学位论文的全部或部分内容。 ( 保密的学位论文在解密后应遵守此协议) 研究生签名： 导师签 王锦武阃：曩年6 只| | b 时间 年月 日 占t 2 一 湖南农业大学硕士学位论文 弟一早日i j苗 分子印迹技术( m o l e c u l a ri m p r i n t i n gt e c h n i q u e ，m i t ) 是利用受体一抗体 作用机理，结合生物化学、结构化学、材料化学等学科发展起来的新兴交叉学科。 2 0 世纪4 0 年代，著名的诺贝尔奖获得者p a u l i n g “1 在研究抗原和抗体的相互作用 时，提出了以抗原为模板来制各抗体的设想。虽然这种想法后来被认为是行不通 的，但他所提出的“生物体所释放的物质与外来物质有相应的结合点位，且空间 上相互匹配”的思想，成为分子印迹最初的思想萌芽。2 0 世纪7 0 年代初期w u l f f 嘲 和m o s b a c h0 1 等创立了现代分子印迹技术( m i t ) ，并陆续进行了一系列开拓性的 研究工作。 分子印迹技术是指制备对某一特定的目标分子( 模板分子，印迹分子) 具有 特异选择性的聚合物的过程“1 。它可以被形象地描绘为制造识别“分子钥匙”的 。人工锁”的技术嘲。分子印迹聚合物( m o l e c u l a r l yi i i l 田m c dp o l y m e r s ，m i p s ) 就是利用分子印迹技术制备的聚合物。作为一种制备具有亲和性和选择性高、稳 定性好的分子印迹聚合物的技术，分子印迹以其简便、通用和高效等特点吸引了 研究者的广泛兴趣。分子印迹聚合物( m i p s ) 在分离分析m 、仿生传感器睁和模 拟酶催化o “”等方面将具有重要的应用前景。 1 分子印迹聚合物( m i p s ) 制备及识别原理 m i p s 是以某种化合物的分子结构为模板( 模板分子或印迹分子) 制备的聚合 物。在适当介质中，将印迹分子与一定数目的功能单体分子( f u n c t i o n a lm o n o m e r ) 混合，两者间发生某种相互作用，如共价或分子间作用力，这些单体在印迹分子 周围作一定取向和排列形成分子聚集体( 也称为“超分子复合物”) ；加入交联剂 ( c r o s s l i n k e r ) ，通过本体聚合反应将单体分子交联固定，印迹分子与功能单体 间的作用被保留；提取除去印迹分子，聚合物中形成与原印迹分子空间结构互补 并且具有多重作用点的。空穴”( 图1 1 ) 。这种具有“记忆”功能的m i p s 可以选 择性地吸附印迹分子，成为建立各种选择性分离或检测方法的基础“”。 m i p s 是分子印迹技术的核心，它对模板分子有高度的选择识别能力，具备以 下性质“”：( 1 ) 预定性( p r e d e t e r m i n a t i o n ) ，指m i p s 可以根据不同的目的制备不 同的m i p s 以满足各种不同的需要；( 2 ) 识别性( r e c o g n i t i o n ) ，指m i p s 是按照模板 分子定做的，可专一地识别印迹分子；( 3 ) 实用性( p r a c t i c a b i l i t y ) ，指m i p s 既 可以与天然的生物分子识别系统如酶与底物、抗原与抗体、受体与激素相比拟。 又具有天然分子识别系统所不具备的抗恶劣环境的能力，显示出高度的稳定性和 较长的使用寿命。 m i p s 是一种具有三维网格的聚合物，在局部存在由印迹分子。烙印”留下的 湖南农业大学硕士学位论文 “空穴”。显然，。空穴”中作用位点越多，作用性质越广泛，则m i p s 与印迹分 子间的亲和性和选择性越高。借助色谱学、光谱学方法( i r 、n m r 、x 射线衍射) 、 热力学或量子力学的原理和方法可对m i p s 与印迹分子间的作用力进行定性或定 量研究o “” 根据模板分子和功能单体形成聚合物时作用力的性质，分子印迹可分为共价 型和非共价型。 1 1 共价印迹法 共价印迹法也称为预组装制备法，其在制备前首先让模板分子与功能单体 发生反应生成模板复合功能单体，再在合适的条件下反应生成聚合物，研磨聚合 物为粉末，用适当溶剂除去模板分子，制得所需要的分子印迹聚合物。共价结合 型m i p s 最早于1 9 7 2 年由德国的g w u l f f 教授及其同事提出o ”。聚合前印迹分子与 功能单体反应，形成硼酸酯、西夫碱、亚胺、缩醛等衍生物，再通过交联剂聚合 产生高分子聚合物，用水解等方法除去印迹分子即得到共价结合型分子印迹聚合 物。由于共价键存在一定的方向性和饱和性，因此以共价方式得到的印迹聚合物 通常含有数量确定的、空间排列精确的功能基团，使得其在发生吸附作用时的限 制性较强，作用专一，容易形成一对一的识别点位，结合比较牢固。因此这种共 价方式适用于高选择性、高识别能力的研究与应用领域，如催化剂的制备、模拟 酶等领域。共价键法需进行繁琐的模板复合功能单体的制备，这对众多的模板分 子并不是总能找到合适的方法来制得该模板复合功能单体。其次，模板分子与其 印迹聚合物之问的结合力强，印迹分子自组装和识别过程中结合和解离的速度较 慢，难以达到热力学平衡，不适宜快速识别。因此目前其在固相萃取中很少使用。 共价法主要应用于制备各种具有特异识别功能的聚合物，如糖类及其衍生物、甘 油酸及其衍生物、氨基酸及其衍生物、扁桃酸、芳香酮、二醛、三醛、铁转移蛋 白、联辅酶及甾醇类物质。 1 2 非共价印迹法 非共价印迹法又称自组装法( s e l f - a s s e m b l i n g ) ，瑞典的m o s b a c h 及其同事在 2 0 世纪8 0 年代后期首次制备了非共价结合型m i p s 嘲。聚合前印迹分子通过分子间 作用力，如氢键、偶极、静电、电荷转移、金属配位、疏水作用等，与功能单体 形成超分子复合物，再进一步聚合交联和除去印迹分子，得到非共价结合型m i p s 这种类型的m i p s 的制备或应用报道较多，包括一些染料、二胺类、维生素、氨基 酸及其衍生物、多肽、苄脒、激素、肾上腺素阻滞剂、三嗪类除草剂，金 属、核酸和蛋白质等嗍剖。非共价结合型m i p s 的优点较多：非共价作用具有多 2 湖南农业大学硕士学位论文 样性和普遍性，故对印迹分子的类型没有太多限制；可使用多种功能单体；印迹 分子易除去；m i p s 形成和识别机制机理类似抗体等生物大分子配体，专一性好。 近年来非共价结合型m i p s 已成为分子印迹研究的主要方向。 图1 1 分子印迹聚合物的制备过程 f i g u r e1 1s c h e m a t i cr e p r e s e n t a t i o no fam o l e c u l a ri m p r i n t i n gp r o c e s s 2 分子印迹聚合物的制备方法研究进展 2 1 主要制备方法 2 1 1 本体聚合方法 本体聚合方法将印迹分子、功能单体、交联剂和引发剂按一定比例溶解在惰 性溶剂中，然后移入一玻璃安培瓶中，采用超声脱气，通氮气除氧，在真空下密 封安培瓶，经热引发或紫外光照射( 在室温下波长通常为3 6 6 n m ) 引发聚合得到块 状聚合物，再经粉碎、研磨和筛分，得到适当大小的粒子，洗脱除去印迹分子， 经真空干燥后即成。此方法制备的m i p s 具有满意的“记忆功能”对印迹分子有良 好的选择性和识别特性，而且制备操作条件易于控制，实验装置简单，便于普及。 徐伟箭等。”采用本体聚合法制备了l - 苯丙氨酸分子印迹聚合物，对l 一苯丙氨酸 最大饱和吸附量为3 3 8 9 m g g ；徐莉等1 采用本体聚合方法制备了印迹奎宁的聚 合物，最大结合量0 , = 1 3 4 9 0i lm o l g ，是理论值的8 4 8 7 。 2 1 2 水溶液悬浮聚合法 2 1 1 中本体聚合方法以有机溶剂为分散介质，所得的m i p s 一般不宣在水 性环境中应用。但随着聚合物m i p s 应用领域的不断扩大，许多聚合物的制备和 识别过程在水环境中进行的，目前解决水性体系中的印迹问题己迫在眉睫。悬浮 聚合法是其中的方法之一。 悬浮聚合法是将模板分子、功能单体、交联剂和引发剂溶于有机溶剂中，然 后将溶液移入水中，搅拌，乳化( 图1 2 所示) ；最后通氮气、抽真空、搅拌 6 0 c 水浴聚合，直接制备出粒径较均一的球形印迹分子。该方法相对于其它方法 比较，操作简单，制备的分子印迹聚合物微球( m i m s ) 可以直接用于高效液相色 谱，有机溶剂使用少。但对于分子印迹聚合物的制各，这些溶剂是不适宜的，因 湖南农业大学硕士学位论文 为分子印迹聚合物能成功制备的先决条件是功能单体和模板之间必须能够相互 识别和相互作用，并且自动地组装成超分子，超分子体系的作用力主要靠功能单 体和模板之间形成的弱的非共价键，如氢键、离子键和疏水作用等，水或高极性 有机溶剂的存在将影响功能单体和模板之间的作用力，高极性溶剂会极大地降低 功能单体与印迹分子问相互作用的数量与强度，从而影响聚合物对印迹分子的识 别能力，并且水溶性印迹分子会在水相中损失。所以很难用水溶液悬浮聚合制备 分子印迹聚合物。为了克服水或高极性有机溶剂的干扰问题，为了不破坏这种非 共价键作用力，继续探讨在水环境中制备和识别的印迹聚合物具有重要的科学意 义和实用价值。 于是，m a y e s 等嘲1 提出了悬浮聚合法的方法，用与一般有机溶剂皆不互溶的 全氟烃为分散介质，加入特制的聚合物表面活性剂使印迹混合物形成乳液，聚合 后得到粒度范围分布窄，形态规则的m i p s 颗粒。这种方法虽然可以控制微孔的 大小和粒径分布，制得了具有一定大小的球状分子印迹聚合物”蚓，是一种有益 的尝试，采用全氟化碳液体作为悬浮介质，代替传统的有机溶剂一水悬浮介质， 根除了非共价印迹中存在的不稳定的预组织制备物。但全氟代烷烃价格昂贵，最 近赖家平m 1 等应用聚乙烯醇4 0 0 作为分散剂，利用印迹分子与功能单体、聚合物 残基之间的离子键相互作用形成复合物，用水溶液微悬浮聚合法制备分子印迹聚 合物微球。其原理是：含有印迹分子、功能单体、交联剂、引发剂和致孔剂的有 机相加入到含有聚乙烯醇的水相后被分散成小液滴，聚乙烯醇4 0 0 其亲水羟基向 外、疏水亚甲基向里，在小液滴表面上排列有序，使小液滴受到保护作用而很难 受水分子的影响；如果水分子扩散到小液滴表面，由于小液滴的疏水性，也会将 其拒之于液滴表面；即使少数水分子扩散到液滴内部，由于印迹分子与功能单体 之间以离子键相互作用形成复合物，由于通常离子键作用力大于氢键作用力，因 此水难以破坏这种识别作用。只有当水溶液中离子浓度增大到一定程度时，这种 破坏作用才显示出来嘲。因此，水溶液微悬浮聚合法是目前印迹聚合物在水溶液 中制备和识别最适合的一种方法。 图1 2 悬浮聚合法制备分子印迹聚合物微球过程 f i g u r e1 2 t h er e p a r a t i v ep r o c e s so f m o l e c u l a r l yi m p r i n t e dp o l y m e r m i c r o s p h e r c s 嗵t h ew a yo f s u s p e n s i o np o l y m e r i z a t i o n 湖南农业大学硕士学位论文 2 1 3 多步溶胀聚合法 多步溶胀聚合法的原理是第一步先在水中进行乳液聚合制得聚苯乙烯单分 散纳米粒子，粒径为5 0 一5 0 0 m a 。以此粒子为种子在含印迹分子、单体甲基丙烯酸、 交联剂及致孔剂的混合物中溶胀，然后引发自由基聚合，得到的粒子是包含印迹 分子、单体及交联剂的连续相聚合物。将此材料用于分离与印迹分子结构相似的 分子时，分离效果与无水条件下制备的块状和棒状聚合物的结果相似，而柱容量 要比后者大许多。近年来，h o s a y a 等9 ”用多步溶胀聚合法制得粒径为8p9 1 、能印 迹萘普生( s n a pr o x e n ) 的m i p s 。这法虽有较好的单分散性和识别能力，但制 备工艺繁琐，周期太长等缺点。亲水性较强的印迹分子或仍依靠氢键作用识别印 迹分子的材料来说，在溶胀过程中水相仍会对分子识别产生较大影响，仍有水 油悬浮聚合法的缺点。 2 1 4 表面模板聚合法 表面模板聚合法是近年出现的一种全新的方法，g o t 0 1 ”- ”等人首先将此法用 于分子印迹技术中。其制备过程为：首先将含有印迹分子( 或离子) 的水相w 与 含有交联剂、乳化剂、功能单体的油相( o ) 混合，经过超声处理形成w 0 乳液， 再将该乳液分散在外部水相( w 。) 中形成w 0 w 2 复合乳液，然后加入引发剂引 发聚合，即可得到聚合物微球，微球的粒径可控制在1 0 1 0 0 i lm 。制备过程中， 功能单体与印迹分子在乳液界面处结合，形成的结合物就留在反应界面。交联剂 单体聚合后，这种结合物结构就印在了聚合物的表面。因此，这种方法被称为表 面模板聚合。其最大特点是由于结合位点在聚合物表面，所以印迹聚合物与印迹 分子结合的速度比较快。同时，制备过程也是在水溶液中进行，且制备方法较为 简单。 y o s h i d a 【”用此方法以二_ 9 一十八烯基磷酸( d i o l e yp h o s p h o r i ca c i d ) 为功能 单体，二乙烯基苯为交联剂，聚乙烯醇为乳化剂，印迹t z n ( i i ) ，所得微球对 z n ( ) 的选择性大大高于对c u ( i i ) 的选择性 2 1 5 表面印迹法 先将模板分子与功能单体在有机溶剂中反应形成加合物，然后将此加合物与 表面活化后的硅胶、聚t r i m 粒子和玻璃介质反应嫁接，这样获得的分子印迹聚合 物解决了传统方法中对模板分子包埋过深或过紧而无法洗脱下来的问题。通 过对粒子表面进行修饰制备分子印迹聚合物材料是一个较好的方法，这种方法最 大的优点是可以利用粒子的机械稳定性，并且可以通过对粒子本身性能的调节来 适应应用的需要。第一例有关印迹硅胶的报道是1 9 4 9 年d i c k e y l 咖 用沉淀法制备 了印迹硅胶。m o r i h a r a 等“”使用另一种不同的方法在硅胶和铝表面进行印迹。由 于载体具有较高的孔度和表面积，因而选择表面印迹方法可以使底物较易接近活 湖南农业大学硕士学位论文 性位点，这是表面印迹技术优于沉淀聚合的一个方面。除此之外，这种方法还可 以单独改变载体树脂的交联度或对孔结构进行调整，通过制备可以容易地得到小 粒径及窄分布的载体。这类材料应用于色谱柱中具有低压、高流速的特点。但该 法由于聚合体系中有水的介入，所以目前还只能局限于共价键型m i p s 制备。 2 1 6 原位聚合法 采用模板分子、功能单体、交联剂和引发剂及溶剂在柱内直接聚合，形成整 体柱，是另外一种步骤较为简单的方法。在原位聚合法中，需要选择合适的溶剂 以制备有一定通透性的聚合物，因此对溶剂的条件多了一些限制，目前这种方法 的应用还很少。 2 1 7 电聚合法 对m i p s 传感器而言，m i p s 与传感器界面之间的接触是一个重要的方面。采用 电聚合方法制备m i p s ，为m i p s 与传感器界面接触提供了一种简单有效的方法，而 且有利于传感器的集成微型化。姚守拙课题组魄1 以原位电聚合邻苯二胺m i p s 作为 厚度剪切式声波传感器( t h i c k n e s ss h e a rm o d ea c o u s t i cs e n s o r ) 的识别元件， 其对印迹分子有良好的识别性。 2 1 8 计算机辅助设计在m i p s 韦l j 备中的应用( g l p - c a d ) 主要利用微机手段建立模型，设计并优化m i p s 的制备方案、实验参数等。 l v a c h i a n e l l a 呻1 等人通过计算机建模设计出海藻毒素的m i p s ，该m i p s 对海藻毒素 的亲和力与天然抗体相当，选择性有所改善，稳定性则优于天然抗体。s u b r a h m - a n y a m “1 等也利用计算机模型设计出符合理想目标的肌氨酸酐印迹聚合物。 2 2 影响分子印迹聚合物的制备主要因素 m i p s 的制备方法与普通高分子材料的制备方法相似，影响m i p s 选择性和亲和 性的主要因素有印迹分子、功能单体、交联剂、模板分子一功能单体一交联剂比例、 反应溶剂( 致孔剂) 和反应条件等。以下主要介绍非共价型m i p s 的制备过程”删 中的一些关键因素。 2 2 1 印迹分子 制备非共价型m i p s 对印迹分子的结构和性质几乎不存在限制，如碳水化合 物、有机胺类、羧酸类、甾类、氨基酸、核酸、蛋白质乃至金属离子均作为印迹 分子用于制备m i p s 。一般地，分子中含强极性基团的化合物易于制备高效能的 m i p s 。由于氢键具有方向性和饱和性，作用力较强，因此能与功能单体间形成氢 键的印迹分子往往能产生选择性高、亲和性强的m i p s 。 6 湖南农业大学硕士学位论文 2 2 2 功能单体 在自组装分子印迹聚合物中，功能单体与模板分子之间主要靠氢键、离子作 用、金属配基结合作用、疏水作用以及静电作用等作用力结合。目前在分子印迹 聚合物中应用最广泛的功能单体是羧酸类( 如丙烯酸、甲基丙烯酸、三氯甲基丙 烯酸、甲基丙烯酸甲酯、及乙烯基苯甲酸等) 、丙烯酰胺类、磺酸类以及杂环弱 碱类( 如2 一或4 一乙烯基吡啶、乙烯基咪唑) 等，其中最常用的是丙烯酸类和杂环 弱碱类。 在以上这些单体中甲基丙烯酸( m a a ) 是目前在m i p s c o j 备中最通用的功能单 体m a a 的羧基能与许多官能团发生较强的分子间作用，如与羟基、醚、羧基、 酰胺、脲等形成氢键以及与氨基发生离子交换作用，从而与许多模板分子相结合， 其模板聚合物有高选择性和结合能力，可以和抗体相媲美。其它较常用的单体， 如磺酸类、含氮杂环类( 乙烯基吡啶、乙烯基咪唑等) ，它们能与酸性基团发生作 用。实际中也可以将不同类型的功能单体混合使用，如m 从与2 一乙烯基吡啶使 用混合单体时。印迹分子与单体间形成复合物作用力的种类和数量增加，所以 m i p s 的选择性可能比仅一种单体生成的m i p s 更高。氨基二乙酸衍生物可作为制备 金属离子m i p s 的功能单体。另外，可以采用天然聚合物如蛋白质替代功能单体制 备m i p s ，称为蛋白质印迹技术( m o l e c u l a ri m p r i n t i n go fp r o t e i n s ) 。 2 2 3 交联剂的选择 交联剂的作用是使模板分子和功能单体形成高度交联、刚性的聚合物，。固 化”单体的功能基团在模板分子周围的特定位置，并保持对印迹分子起识别作用 的位点在使用过程中空间形状不发生变化，使特异性得以保留。为使生成的m i p s 具有一定的硬度( 特别是用于h p l c 的m i p s ) 和形成稳定的结合位点。m i p s 往往需要 很高的交联度( 7 0 9 0 ) ，但预聚溶液的溶解性限制了对交联剂种类和浓度的选 择，为了得到高度交联的聚合物，目前最有效的交联剂是乙二醇二甲基丙烯酸酯 ( e t h y l e n eg l y c o ld i m e t h a c r y l a t e ，e d m a ) 、三羟甲基丙烷三甲基丙烯酸酯 ( t r i m ) 、季戊四醇三丙烯酸酯( p e t r a ) 等嘲】。应用最多的是e d m a ，制备的m i p s 选 择性较高，非特异性吸附低。近年来发现采用含3 个或3 个以上乙烯基的交联剂， 如：季戊四醇三丙烯酸酯和季戊四醇四丙烯酸酯时能获得较高的柱容量、选择性 和柱效度。交联剂的使用量不同，将影响聚合物的吸附性、选择性等性质。目前， 出于性能、价格等综合考虑，e d m a 仍为使用最为广泛的一种交联剂。 2 2 4 模板分子一功能单体一交联剂比例 在制备m i p s 时，模板分子、功能单体和交联剂三者之间的比例对于制得的 m i p s 的性能有很大的影响，对于模板分子和功能单体的比例，一般来说，增大功 能单体的比例可以使模板分子与功能单体之间的预组装进行得更加充分，但并不 7 湖南农业大学硕士学位论文 是功能单体的比例越大越好，因为一方面大大过量的功能单体可能引起自身的缔 合，致使选择性结合位点数反而减少，所以模板分子和功能单体之间的比例在大 部分的文献中都是1 ：4 ，而采用复合型功能单体则模板分子和复合型功能单体总 量也保持1 ：4 比例，功能单体与交联剂的比例要视所采用的交联剂中乙烯基数目 的多少，对于目前广泛采用的二元交联剂，如e d m a ，为了保证有足够高的交联度 以维持m i p s 的刚性结构又不会因交联剂过多造成结合容量小，一般为1 ：5 比例嘲， 而对于最近几年发展较快的三元交联剂，如t g a t m a ，有研究表明最佳的比例为 l ：1 ，这个比例目前已被广泛应用呻1 。 2 2 5 聚合反应溶剂 非共价型m i p s 中，反应溶剂对分子间作用力和m i p s 的形态影响很大。溶剂还 起着致孔剂的作用。所用溶剂不但对印迹分子等应具有较高的溶解性，最好还能 够促进印迹分子与功能分子间的相互作用，至少不干扰这种效应。需依据印迹分 子与功能单体间可能的作用力类型选择适宜极性的溶剂。在极性溶剂中，印迹分 子主要靠疏水作用与功能单体结合；在非极性溶剂中则主要靠氢键等作用与功能 单体结合。一般地，极性强的溶剂会降低印迹分子与功能单体间的结合，特别是 干扰氢键的形成，生成的n i i p s 识别性能较差，故应尽可能采用介电常数低的溶剂， 如甲苯、氯仿、二氯甲烷等。 此外，引发剂种类及用量、引发条件、搅拌速度等1 都会影响聚合物的制备。 3 分子印迹技术的应用 分子印迹技术的这一特性受到人们越来越多的关注，并且对它的研究和应用 获得了迅猛的发展。我国国内主要在异构体色谱分离、固相萃取、化学反应、临 床药物分析、膜分离技术等领域都取得了一定的进展。 3 1 在化学反应中的应用 将分子印迹聚合物应用于有机化学反应中，作为催化剂( 模拟酶) 催化有机化 学反应，是当前研究的热点。 催化剂在化工生产中起着至关重要的作用，酶是自然界中催化活性最高的一 类催化剂。自然界中的酶以其高效、专一、反应条件温和的特点成为一类重要的 催化剂。但天然酶催化的有机化学反应以及能用于酶促反应的酶和底物较少：且 酶促反应的操作参数窄，许多酶无法在有机介质中使用，天然酶提取困难、难以 回收，这些缺点严重制约了它的生产和应用。化学模拟酶催化剂与天然的生物酶 催化剂相比，具有抗恶劣环境的能力，表现出高度的稳定性和长的使用寿命，将 天然酶的催化原理运用到制备高效的新型催化剂一模拟酶，是目前分子印迹技术 8 湖南农业大学硕士学位论文 领域中最困难和最具挑战性的研究。目前，研究较多的m i p s 模拟酶催化反应主要 有水解反应、制备反应、氧化还原反应、转移反应、脱h f 反应、异构化反应等。 这些反应都是化学领域的基础，是制备有机原料及生物产品的关键。 印迹所用的模板分子主要有底物类似物( s u b s t r a t ea n a l o g u e ，简写为s a ) 、 过渡态类似物( t r a n s i t i o ns t a t ea n a l o g u e ，简写为t s a ) 和产物类似物( p r o d u c t a n a - l o g u e ，简写为p a ) 。底物类似物是指与底物聚合物基质复合体相类似的化合 物。通过印迹聚合物与实际底物的“咬合”起到催化作用。过渡态类似物是指与 中间产物相类似的化合物。这种印迹聚合物中的识别位对反应过渡态起稳定作 用，从而降低反应的活化能，提高反应速率。另外，过渡态类似物比底物自身更 能紧密地结合在活性位点上，是目前应用最普遍的印迹分子。表1 1 列举了几种 主要的m l p s 模拟酶在催化有机化学反应中的应用。 表1 1g i p s 模拟酶催化有机化学反应 t a b l e1 1 山er e a c t i o no f o r g a n i cc h e m i s t r yc a t a l y z e d b ym i p sm o d e le n z y m e 符号说明 k 一印迹聚合物反应速率常数k 一时无印迹聚合物反应速率常数 k i - 无催化剂反应速率常数v 。( i 耐一印迹聚合物最大反应速率 v 。一无印迹聚合物最大反应速率 3 2 用于提取分离 分子印迹技术为分析检测领域提供了一种简单、直接制备具有分子识别能力 分离材料的方法，在固相萃取、色谱和电泳为手段的分离分析中都有应用。 9 湖南农业大学硕士学位论文 3 2 1 分子印迹技术在药物领域中应用 分子印迹技术在药物的手性分离上有相当大的利用价值，我们所使用的5 0 0 多种旋光性药物中，大多数为外消旋体形式，其对映体彼此未分离，且左旋体和 右旋体药理、活性和毒性往往有很大差异，有时甚至性质相反。对药效有较大影 响。 鉴于m i p s 的特异性识别能力，可将其作为高效液相色谱的固定相来分离手性 和非手性药物。由于m i p s 和印迹分子在几何形状上互补且在分子间存在较强的相 互作用力，所以与普通的手性固定相相比，以某一对映体作印迹分子制备的m i p s ， 对此异构体的保留时间最长，最后被洗脱，因此以m i p s 作为固定相用于h p l c 拆分 手性药物，不仅可以完全分离一对异构体，同时可预测手性药物的洗脱顺序。雷 建都以s 一萘普生作为模板分子，制备了手性的m i p s 固定相，利用h p l c 分析结果 表明萘普生的外消旋混合物得到了较好的拆分，分离度达到1 0 2 ，同时也分离了 与其结构相似的布洛芬和酮洛芬分离了与其结构相似的( r ) 一酮洛芬和( r 。s ) 布洛芬。李萍等侧以混旋邻氯扁桃酸为模板，以制各的( s ) 一( 卜萘乙基) 一丙烯酰 胺作为手性功能单体，制备分子印迹聚合物液相色谱柱，对混旋邻氯扁桃酸及混 旋扁桃酸和对氯扁桃酸的进行手性拆分。赖家平等以带有羧基的酸性药物吲哚 美辛为模板分子、碱性的4 一乙烯基吡啶为功能单体，制备了用于色谱分离的微米 级分子印迹微球，分离吲哚美辛与结构类似物舒林酸。李志伟删等以m a a 为功能 单体，e i ) m a 为交联剂，制备了一种氨基安替比林分子烙印聚合物，用作高效液相 色谱固定相，分离了两种结构类似物氨基安替比林和氨基比林。隋洪艳等以氨 基酸衍生物l b o c t r p 印迹的聚合物作为固定相，分离消旋混合物d ，l - b o o t r p 。 m a r t i n ( 1 0 恻用普萘洛尔( p r o p r a - n o l 0 1 ) 作模板分子，利用m i p h p l c 技术分析临床 药物普萘洛尔。尹俊发等”“以手性药物那格列奈为模板分子，制备了具有特定识 别性能和手性拆分能力的分子印迹聚合物，并作为固定相实现了那格列奈与其对 映体的手性拆分。 由于m i p s 具有从复杂样品中选择性地吸附印迹分子或与其结构相近的某一 化合物的能力，因此它非常适合用作固相萃取剂来分离富集复杂样品中的痕量被 分析物，克服医药、生物及环境样品体系复杂、预处理繁琐等不利因素，为样品 的采集和分析提供了极大方便。胡树国“2 1 以扑热息痛为印迹分子，丙烯酰胺为功 能单体，e d m a 为交联剂制备了棒状的印迹聚合物；把其装于固相萃取柱中，通过 优化清洗、洗脱条件，使扑热息痛和与其具有相似结构的非那西丁、对叔丁基苯 酚在柱上得到了很好的分离。郭洪声”等用头孢氨苄为模板分子制备了固定相作 为固相萃取剂，监测了头孢氨苄在人体、尿液中的浓度。b h i m 。”等制备了以硅胶 键合的嗯唑酮的m i p s 作为固相萃取剂成功识别了b 一内酰氨抗生素类药头孢菌霉 l o 湖南农业大学硕士学位论文 素( c e p h a l o s p o r i n s ) 和青霉素( p e n i c i l l i n s ) 。张立永等“”以西咪替丁为印迹分 子，2 一丙烯酰胺一2 一甲基丙磺酸( a m p s ) 为功能单体，三羟甲基丙烷三甲基丙烯酸 甲酯( t r i m ) 为交联剂，制备了分子印迹聚合物微球( m i m s ) ，将其用作固相萃取剂 ( s p e ) 的测试结果表明，该m i m s 对西眯替丁有较好的特异选择性能，当以苯丙氨 酸为竞争分子时，分离因子可达1 7 5 ，且该m i m s 呈现出较好的再生性。 3 2 2 环境领域的应用 m i p s 具有特效的选择性和亲和性。用作固相萃取剂可克服环境样品体系复杂 的预处理手续，为样品的采集、富集和分析提供极大的方便。尤其是在环境领域 的痕量分析中起重要作用。毫摩尔水平下的痕量物质经这一方法预富集处理后， 在色谱中容易被检出。 卢春阳等”1 分别以m 从和4 一v p 为功能单体，制备了两种对除草剂青