（应用化学专业论文）带有连接臂的微泡超声造影剂的制备研究.pdf

摘要研究生；高彩霞签名：壹玺蒸指导教师：姚秉华教授签名：么堕髯杜永峰副教授签名：禾鱼箜摘要超声造影剂( u l t r a s o u n dc o n t r a s ta g e n t s ，u c a ) 的出现，开创了无创伤超声医学的一个崭新领域，除了作为超声诊断药剂之外，近年来还发现微泡超声造影剂具有分子成像、促进血栓溶解、促进基因转染及药物体内运输定点释放等作用。而这些作用的实现，需要制备出能够高效携带靶向因子、抗体、基因等的新型微泡超声造影剂。本文通过在微泡膜材料中加入聚乙二醇的方法，制备出了一种带有连接臂的新型具备靶向能力的微泡超声造影剂，并对该造影剂进行了体外心肌重构模型靶向实验研究及体内成像研究，本文主要工作如下：( 1 ) 实验在考虑聚合物微泡造影剂组分的无毒性、生物相容性、溶血性等问题的基础上，确定了聚合物超声造影剂微泡主要膜材料、乳化剂、稳定剂等其它辅助材料及用量。即：膜材料聚乙二醇6 0 0 0 ( t 5 o ) ，吐温8 0 ( 3 5 ) ，葡萄糖( 1 o ) ，连接臂聚乙二醇4 0 0 ( 1 o ) ，水相：油相= 7 9 ：2 1 。( 2 ) 研究了微泡的制备及保存。通过观察超声声振膜溶液所得微泡性质及所需声振时间，确定徼泡最佳制备条件，即：超声功率6 0 0 w ，声振时间3 m i n 。对微泡室温保存方法进行了初步探讨，发现聚乙烯醇可以延长微泡室温保存时间。( 3 ) 借助i m a g e p r op l u s5 0 2 ，p h o t o s h o p 软件及其它辅助工具，对实验制备的带连接臂聚合物微泡造影剂的粒径分布及浓度进行了分析测定。测得实验制备出的包裹空气的造影剂平均粒径为3 4 3l lm ，浓度为3 5 6 x1 0 + 个m l ；包裹六氟化硫气体的造影剂平均粒径为2 8 7 p m ，浓度为7 6 5 x 1 0 + 个i l l l 。同时，对微泡进行分级，得到卜7 p m 不同粒径段的分布更为集中造影剂微泡。( 4 ) 通过连接抗体明胶酶a ( 删p 一2 ) 和明胶酶b ( m m p 一9 ) ，测定了自制超声造影剂的靶向性能，微泡连接抗体的实验条件为4 0 c 孵育3 0 m i n ，结合后稳定时间在2 h 以上。荧光显微镜下观察，抗体与微泡紧密结合，牢固性良好，组织切片特异性抗原结合体外实验进一步表明微泡与抗体结合能力极佳。( 5 ) 对带有连接臂聚合物超声造影剂行动物实验，测定了造影剂超声显影情况。分别西安理工大学硕七学位论文采用实验犬和大白鼠作为实验对象，动物犬超声显影实验过程中，可观察到实验犬左右心室、心肌均有明显显影增强。实验中同时发现空气微泡显影时间相对于六氟化硫微泡要短，说明低弥散度的气体有利于微泡稳定。取犬血气分析，未见异常现象，说明本造影剂有左右心室造影的功能，造影安全。大白鼠静脉注射造影剂后，左右心室显影增强，可观测到心肌成像。实验中，未发现大白鼠有异常现象，造影剂对大自鼠短期内未产生不良后果。关键词：超声造影剂：微泡；连接臂；靶向u摘要t i t l e ：as t u d yo np r e p a r a t i o no fm i c r o l b u b b l eu l - t r as o u n dc o n t r a s ta g e n tw l t hj o i n ta r m sm a j o r ：a p p l i e dc h e m i s t r yn a m e ：c a i x i ag a os u p e r v i s o r ：p r o f b i n g h u ay a oa s s o c i a t ep r o f y o n g f e n gd ua b s t r a c ts i g n a t u r e ： 五五f ；幽s l g n a t u 怕! 垂型啦s i g n a t ur e - ! 区盔t h ea p p e a r a n c eo ft h eu l t r a s o u n dc o n l a a s ta g e n t sb e g a n san e wf i e l di nn o n - i n t r u s i v eu l t r a s o u n dm e d i c i n e b e s i d e su s e da su l t r a s o u n dd i a g n o s i sm e d i c a m e n t , c o n t r a s ta g e n t se a r la l s ob eu s e di no t h e rf i e l d ss u c ha sm o l e c u l a ri m a g i n g ，t h r o m b u sd i s s o l v i n g ，g e n et r a n s p o r t a t i o n ,m e d i c i n et r a n s p o r t a t i o ni n - v i v oa n d8 1 ) o n b u tt h e s en e wf u n c t i o n sn e e dp e r f e c tu l l r a s o u n dc o n t r a s ta g e n t sw h i c hc a l le f f e c t i v e l yt r a n s p o r tm e d i c a m e n t , i m m u n eb o d y , g e n ea n ds oo i lb yi n t r o d u c i n gt h ep o l y e t h y l e n eg l y c o li n t ot h em i e r o b u b b l em e m b r a n e , an e wk i n do ft a r g e t e du l t r a s o u n dc o n t r a s ta g e n tw i t ha nj o i n ta r mw a sp r e p a r e di nt h i sp a p e r t h et a r g e t i n ge f f e c ta n dt h ec o n t r a s ti m a g i n ge f f e c to ft h ep r e p a r e da g e n tw e r ei n v e s t i g a t e db yu s i n gc a r d i a cm u s c l er e b u i l d i n gm o d e la n da n i m a le x p e r i m e n t ，r e s p e c t i v e l y t h em a i nr e s e a r c h e sa r ea sf o l l o w s ( 1 ) u n d e rt h ec o n s i d e r a t i o no ft o x i c i t y , b i o l o g i c a lc o m p a t i b i l i t ya n dh e m o l y t i ce f f e c t ，t h em a i nm e m b r a n em a t e r i a l s ，t h ee m u l s i f ) r i n ga g e n t sa n dt h es t a b i l i z i n ga g e n t sw e r es e l e c t e da n dt h e i rd o s a g e sw e r et e s t e d t h ed e t e r m i n e dd o s a g e so fe a c hm a t e r i a l sw e r ep o l y e t h y l e n eg l y c o l6 0 0 0a s3 0 ，t w e e n8 0a s1 0 ，t h eg l u c o s ea s1 0 ，p o l y e t h y l e n eg l y c o l4 0 0 豳1 o t h er a t i ob e t w e e nt h ea q u e o u sp h a s ea n dt h eo i lp h a s ei s7 9t o2 1 ( 2 ) t h ep r e p a r a t i o na n dt h ep r e s e r v a t i o no ft h em i e r o b u b b l e sw e l ei n v e s t i g a t e d t h eo p t i m a i np r e p a r a t i o nc o n d i t i o n sw e r eo b t a i n e df r o mt h ec h a r a c t e ro ft h em i c r o b u b b l e sa su l t r a s o u n dp o w e r6 0 0 wa n ds o n i c a t i o nt i m e3r a i n t h ep r e s e r v a t i o no ft h ec o n t r a s ta g e n ta tr o o mt e m p e r a t u r ew a st e s t e d ，a n dt h ep o l y v i n y la l c o h o lw a sf o u n dt op r o l o n gt h el i f et i m eo ft h em i c r o b u b b l e s ( 3 ) w i t ht h ea i do fl m a g e p r op l u s5 0 2 ，p h o t o s h o ps o f t w a r e sa n do t h e ra u x i l i a r ym e a n s ，t h es i z ed i s t r i b u t i o na n dt h ec o n c e n t r a t i o no ft h ep r e p a r e dm i c m b u b b l e sw e r ea n a l y s e d t h ea i r - c o n t a i n e dc o n t r a s ta g e n t sw e r em e a s u r e dw i t ht h ea v e r a g es i z eo f3 4 3 岫a n dt h ec o n c e n t r a t i o no f3 5 6 x10 9 m l t h es u l f u rh e x a f l u o d d e c o n t a i n e dc o n t r a s ta g e n t sw e r ei l l西安理工大学硕士学位论文m e a s u r e dw i t ht h ea v e r a g es i z eo f 2 8 7i n na n dt h e c o n c e n t r a t i o no f 7 6 5 x 1 0 9 m l a tt h es a r n et i m e ，t h ep r e p a r e du l t r a s o u n dc o n t r a s ta g e n t sw e r ec l a s s i f i e db a s e do nt h ed i f f e r e n ts i z et oo b t a i nm o r ec e n t r a l i z e dc o n t f a s ta g e n t 、v i t i ll 7 岬d i f f e r e n tp a r t i c l es e c t i o n ( 4 ) t h et a r g e t i n ga b i l i t yo ft h ep r e p a r e dc o n l x a s ta g e n t sw a st e s t e dt h r o u g hc o n n e c t i n gm i c r o b u b b l e s 、i t i it h ei n l r f l t m eb o d ym m p 2a n dm m p 9 t h ec o n n e c t i o nw a sc a r r i e da t4 0 a n dt h ec o r m e e t e dp r o d u nw a sf o u n ds t a b l ew i t h i n2h o u r s t h ea n t i b o d y sw e r ef o u n dt i g h t l yc o n n e c t e d 砸t ht h em i c r o b u b b l e sb yt h ef l u o r e s c e n c em i c r o s c o p e 1 n h ei n - v i t r oe x p e r i m e n to fr e b u i l d i n gt i s s u es l i c e 句呲h 盯m d i e a t e dt h a tt h em i e r o b u b b l e sh a st h ee x c e l l e n ta b i l i t yt oj o i n t、撕t ha n t i b o d y s ( 5 ) t h ei n v i v oc o n t r a s te f f e c t so ft h ep r e p a r e dm i e r o b u b b l e sw i t hj o i n ta n i l sw e r et e s t e dt h r o u g ht h ea n i m a le x p e r i m e n t s 1 1 h ee x p e r i m e n t a ld o 擎a n db i gw h i t er a t sw 讯u s e da st h eo 协e e t s t h eo b v i o u sc o n t r a s te f f e c t si nt h ei m a g i n go ft h ed o g sl e f ta n dr i g h tv e n t r i c l e 豁w e l l笛c a r d i a cm u s c l ew e r eo b s e r v e d 1 1 l ec o n t r a s tt i m eo ft h ea i r - c o n t a i n e dm i e r o l m b b l e sw a sf o u n ds h o r t e rt h a nt h es u l f u rh e x a f l u o r i d e - c o n t a i n e dm i c r o b u b b l e s ，t h i si n d i e m e dt h a th i g i ld i s p e r t i o ng a si sp r o p i t i o u st ot h es t a b i n t yo fc o n t r a s ta g e n t b e c a u s eo ft h ed o g ss a pw a sn o tf o u n da b n o r m a ld u r i n gt h ee x p e r i m e n t , t h ec o n l x a s ta g e n ti ss a f e t h e r ew a sa l s on oa b n o r m a lp h e n o m e n o nh a p p e n e do i lt h er a t sd u r i n gt h ei m a g i n g ，t h ec o n t r a s te f f e c t si nt h ei m a g i n go f t h er a t sl e f ta n dr i g h tv e n t r i c l ea sw e l la sc a r d i a cm u s c l ec o u l db ea l s oo b s e r v e d k e yw o r d su l t r a s o u n dc o n t r a s ta g e n t ；m i e r o b u b b l e ：j o i n ta l t l l ；t a r g e t i n gl v独创性声明秉承祖国优良道德传统和学校的严谨学风郑重申明：本人所呈交的学位论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的成果。尽我所知，除特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人的研究成果。与我一同工作的同志对本文所论述的工作和成果的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并已致谢。本论文及其相关资料若有不实之处，由本人承担一切相关责任论文作者签名：叠丝霾绷年3 月枷日学位论文使用授权声明本人i 易每辗在导师的指导下创作完成毕业论文。本人已通过论文的答辩，并已经在西安理工大学申请博士硕士学位。本人作为学位论文著作权拥有者，同意授权西安理工大学拥有学位论文的部分使用权，即：1 ) 已获学位的研究生按学校规定提交印刷版和电子版学位论文，学校可以采用影印、缩印或其他复制手段保存研究生上交的学位论文，可以将学位论文的全部或部分内容编人有关数据库进行检索；2 ) 为教学和科研目的，学校可以将公开的学位论文或解密后的学位论文作为资料在图书馆、资料室等场所或在校园网上供校内师生阅读、浏览。本人学位论文全部或部分内容的公布( 包括刊登) 授权西安理工大学研究生部办理。( 保密的学位论文在解密后，适用本授权说明)论文作者签名：i 复丞逮导师签名：锄7 年月仞日第一章文献综述1 文献综述1 1 研究背景1 。1 1 国外发展状况1 9 6 8 年o r a m i a k 型4 人将用手振后的靛青篮绿注入犬心腔后，发现超声回波信号增强。1 9 7 2 年z i s k i n 报道了该现象的机理是由于靛青篮绿液体包裹了气体而形成的气泡所致，并认为超声显影效果取决于液体的性质。因此，人们寻找各种较为理想的液体进行超声成像，生理盐水、右旋糖酐、山梨醇、泛影葡胺、葡萄糖溶液、蔗糖溶液、甘露醇都是当时研究的对象。此时的超声造影剂为游离气泡，靠液体包裹稳定，稳定性差，经静脉注射仅能使右心腔产生短暂的显影，而且，气泡直径在2 0 - 4 0 p m 之问，无法通过肺部毛细管进入左心室实现心室、心肌显影。1 9 8 4 年f e i n s t e i n 首次采用声振方法制作了种膜包裹气体型的显影剂m b u n e x 。该微泡平均直径为4 - - - 6 i _ t m ( 9 5 1 0 1 a m ) ，室温下可稳定保存一个月，可通过肺部毛细管循环抵达左心室，实现了真正意义上的声学造影剂。( 1 ) 第一代包裹空气的超声造影剂第一代超声造影剂的显著特点是气泡被一较牢固的膜包裹，从而增加了微泡的稳定性，可在体内稳定一定的时间。当时，人们还没有认识到气体材料对造影剂稳定性的影响，认为微泡性质取决于膜材料的性质及制备方法。代表产品有a l b u n e x 、l c v o v l g t 等。a l b u n e x ：美国m b i 公司生产1 1 , 2 | 首个被美国f d a 批准用于临床增强左心室显影的声学造影剂，1 9 9 3 年上市。由5 的人血白蛋白通过声振作用而制得，内充空气。微泡的平均直径为3 5 t t m ( 9 2 s o 的微泡直径 1 0 p m ) ，浓度为3 5 x 1 0 8 个m l 。白蛋白外壳使微泡比较稳定，在血液中的半衰期接近l m i n 。临床研究表明静脉注射a l b u n e xo 0 8 m l k g ，8 1 的病人左室显影明显，8 3 病人左室内膜边界得以增强，但心肌显影不明显，通过冠脉内注射可实现心肌超声显影。显影时不会对人体产生不良反应，显影安全。l e v o v i s t ( 利声显1 ：德国先灵( s h e r i n g ) 公司生产。由9 9 9 的半乳糖和0 1 棕榈酸溶入无菌水中所制。半乳糖在溶于无菌水的过程中其晶体上小空隙中的气体形成气体微泡。棕榈酸起稳定微泡的作用，造影完成之后被溶解吸收。l e v o v i s t 是经我国卫生部批准临床应用的唯一的左心系统声学造影剂”。第一代超声造影剂，由于成膜物质的存在，大大提高了稳定性，在血液中的持续时间明显延长。同时微泡直径也明显缩小( 1 0 “m ) ，实现了经外周静脉注射行左心室超声显影的无刨医疗诊断的跨越。但此时的造影剂并不能使心肌明显显影，心肌显影仍需将造影剂注入左心房、左心室或主动脉根部，这是因为膜内包含的空气具有高的扩散性和外溢性( 尤其在血液中) ，加上微泡承受外压力商，内部气体压力高于外部血液气体压力，从而导致泡内空气很快扩散到泡外血液中，微泡发生皱缩，声学特性减退，心肌显影效果变差。后来，人们发现，气体扩散性与气体的分子量成反比，气体的溶解度和弥散度与气体分子量西安理工大学硕士学位论文的平方根成反比。因此。在造影剂的制备过程中引进了高分子量、低弥散度的气体，这就诞生了第二代超声造影剂，即包裹高分子量气体的微泡造影剂。( 2 ) 第二代超声造影剂第二代超声造影剂显著的特点是引进了高分子量的气体。如六氟化硫、氟碳化合物，从而延缓了微泡消亡速度。同时，膜材料不再局限于白蛋白及糖类物质，产生了脂质体类微泡造影剂。代表产品有f s 0 6 9 、s o n o v u e 、i m a g e n t 等。f s 0 6 9 ：商品名o p t i s o n ，膜材料是白蛋白，内填充全氟丙烷( c a f s ) 气体，微泡平均直径3 6 耻m ，平均浓度8 x 1 0 8 一i m l 。静脉注射后右心室、左心室及心肌皆可明显显影，且显影时间长，被f d a 批准用于左心室心腔超声显影9 4 l od e f m i t y ；i m a r xp h a r m a c e u t i c a l 公司生产，原名m r x - 1 1 5 或d m p l l 5 商品名d e f m i t y 。包膜是脂质微体，内填充气体是全氟丙烷气体。膜厚约0 2 2 p m ，直径2 3 p m ，平均浓度1 2 x 1 0 9 - 个 m l 。2 0 0 1 年被f d a 批准用于左心室造影及增强心内膜的分辨率。另外，该造影剂用于靶向性携带特定药物的效果也很好，m r x - 4 0 8 a i “是在微泡表面连接上一血栓特异性配体，该配体能与活化的血小板上表达的g p i i i a 受体特异性结合，使新鲜血栓显影增强，而对于陈旧血栓则不能结合。用此现象可医学检测心腔内或血管内的新血栓，也可用于鉴别新、旧性血栓。结合抗体后的微泡平均直径2 2 5 岬平均浓度为l x l 0 9 4 m l 。动物实验过程中未发现明显副作用。s o n o v u e ：b r a c c 公司研制，膜材料由聚已二醇40 0 0 ( p e g 40 0 0 ) 和磷脂组成，内填充六氟化硫( s f 6 ) 气体，采用冻干干燥法制得。使用时，于密封的盛有造影剂的小瓶中注入少量的生理盐水，手动振荡。微泡平均直径2 5 岫l ，平均浓度2 x 1 0 3 个m l 。在欧洲被批准用于腹部及心脏造影。临床与动物实验表明也可用于评价心肌灌注，无副作用“i m a g e n t ：a l l i a n c e 公司生产，2 0 0 2 年被美国f d a 批准用于临床增强左心室显影主要膜材料为半合成的磷脂和表面活性剂，另外有氯化钠和碳酸盐作为稳定剂，内填充c 6 f 1 4 ，呈粉末状，使用时加入无菌生理盐水稀释。微泡直径小于3 “m 。平均浓度5 1 0 8 个m l 。静脉注射后大约4 0 秒后心腔出现声学显影，持续时间可达2 6 m i n ，心肌显影效果明显，声衰减较弱”1 e c h o g ：e n ( q w 3 6 0 0 ) ：s n o u t s 公司生产微泡内填充低沸点的氟碳化合物全氟戊烷( c 5 f 1 2 ) 。微泡注射到体内，全氟戊烷液体转变成气体，形成气体微泡进行超声显影。造影剂微粒直径o 2 p t m ，注入体内后膨胀至2 - 5 1 i m 动物实验时，不仅心腔显影明显，同时，心肌也明显显影，持续时间可至左室腔内的造影剂清除之后。这类填充低沸点的氟碳类化合物的造影剂，其缺陷是注射到体志微泡扩张可能会引起毛细血管阻塞，造成血流动力学障碍。为避免这类现象发生，有人n 建议在注射前将造影剂用密闭的注射器来回抽吸，使其在低压下活化，则可得到满意的超声显影效果而不发生血管被阻塞的现象。第二代超声造影剂在制备的过程中，引进了低溶解性低弥散性的高分子量气体如氟碳化合物及含硫物质，从而延长了微泡在血液中的稳定时间，得到良好的超声显影信号。但2第一章丈献综述是，所用的主要膜材料人血白蛋白及脂类物质，由于自身性质限制，在制各过程中，无法通过工艺条件有效控制微泡的声学特性。另外，这类造影剂粒径分布宽，造影时，声衰减现象难于预测和控制。近年来，高分子材料制备技术大幅度提高，医用可生物降解聚合物材料相继出现，为超声造影剂的制备提供了一个新的研究领域。聚合物材料弥补了以往造影剂微泡外壳材料的不足，所制得的造影剂微泡大小分布均一性好，抗压力性能及体内稳定性也明显提高，同时可以通过改变材料的聚合条件，改变微泡的声学特性。( 3 ) 第三代超声造影剂由合成的可生物降解的聚合物材料制各而成，制备工艺不同于以往的声学造影剂，可以通过改变聚合物材料的聚合条件而调节声学造影剂的声学特性。代表性的造影剂有b p l 2 7 和a i 7 0 0 。s c h n e i d e rm 等“1 以叔丁基甲基碳酞多聚谷氨酸为膜材料制备了一种空气填充的微泡造影剂。同时将其物理特性和超声特性与白蛋白空气微泡进行了比较，得出；聚合物微泡具有以下特点：粒径2 - 4 9 m ，分布集中，利于超声显影，体内稳定性高，抗压力性能强，显影时间长，外壳较硬，共振频率较高，较高的发射频率时获得理想的超声散射强度。a i 一7 0 0 ：a c u p h e r e 公司研制”，外壳由合成的可生物降解的聚丙交酯乙交酯( p l g a )组成，内包裹氟碳气体。该公司声称a i 7 0 0 克服了以往己经获得f d a 批准的造影剂的局限性，是一种理想的超声造影剂。该微泡平均直径2 2 9 i n ，浓度约为2 2 1 0 9 + m l 。外壳材料可生物降解的聚丙交酯乙交酯( p l g a ) 是被f d a 批准用于药物输送系统的物质，其特殊的性质和结构使微泡在体内不会短时间破裂，威像过程中可维持较长时间的声学特性。体外测量显示其衰减系数可持续1 0 m i n 而不发生变化。造影安全性良好，心肌灌注成像过程中监测参数无显著性变化。b p l 2 7 ：p o i n tb i o m e d i c a l 公司研制，具有双层外壳结构，内层为可生物降解的多聚体，分解产物为乳酸，外层自蛋白增加了造影剂微泡的生物相溶性，泡内包裹氮气气体。该造影剂粒径分布一致性好，声学反应强烈，声衰减轻微，具有可以包裹高溶解性气体的能力。是一种能量多普勒成像模式的理想超声造影剂。微泡平均直径为4 + 2 1 肛m ，浓度o 5 1 0 9 个m l 。动物试验表明心腔显影极为明显，声衰减微弱。临床试验表明采用谐波灰阶成像和能量多普勒成像两种成像方式均可观察到高强度的心腔显影及心肌显影，后方声衰减微弱。造影安全性良好，显影过程中未发现异常现象。能量多普勒成像过程中，采用心电图触发成像，心肌显影时间长，平均时间为2 4 6 1 6 6 m i n “。s h u 5 6 3 a ：德国s c h e r i n g 公司研制，外壳材料为聚丁基氰基丙烯酸( p o l y b u t y l - 2 e y a n o a e r y l a t e ) ，内含空气，平均直径1 - 2 p m ，所有微泡直径 7 a m ，外壳厚度1 0 0 n m ，形态为干粉状。注射前混入生理盐水轻轻振荡制成悬浊液，可稳定保持数小时。微泡膜壁薄，弹性大，超声作用下，具有强的回波反射能力，能够清晰显影微脉管床。微泡在体内可完整循环1 0 多分钟，最后被巨噬细胞吞噬，被吞噬的微泡仍具有一定的反声源性，用于虹池显像和延迟节段的斟状内皮系统细胞分靠显像的效果良好。，西安理工大学硕士学位论文另外，德国学者报道“2 了一种基于聚天冬氨酸材料的超声造影剂。内含空气，平均直径3 1 p m ，心腔显影时间可持续5 - 1 2 m i n ，可见明显的心肌内冠状动脉片段。( 4 ) 第四代超声造影剂1 9 9 8 年s k y b a 等报道，超声探头发射的声波在体内可破坏造影剂微球。因此，人们想到利用超声造影剂携载药物，在药物与靶向组织结合后，利用超声辐射破坏微泡，从而实现药物靶向运输。超声造影剂作为药物、基因靶向载体时，相对于其它载体，有一特殊的优势是造影剂在释放药物、基因的同时，可以显影成像，从而可观察到病变组织的情况。超声造影剂携栽药物，可通过将药物连接在微泡膜壁上、或将药物包裹在微泡内、或置于微泡双层壳结构中等方式实现。u n g e r 实验室1 9 9 6 年发明了组织特异性强，可用于心血管、肝、脾及肾的靶向传输药物的脂质微泡，开创了第四代超声造影剂的研究先河用于靶向的微泡造影剂主要以蛋白质、聚合物或脂质体类外壳造影剂为主。自蛋白外壳微泡稳定性好，已有部分产品商品化，但白蛋白对温度敏感，易受温度的影响。蛋白质微泡连接药物借助于其微泡表面上的初级氨基组，通过这些氨基组与配体共价结合实现靶向输送。1 9 9 9 年p o r t e r 等“”首次以纯物理亲合的方式将一种反义寡核甘酸联接到含氟碳气体的白蛋白微泡表面，经静脉注射成功地将该反义寡核甘酸靶向投放到经超声照射有冠状动脉硬化狭窄的动物心肌组织。结果表明：释放的反义寡核甘酸在冠状动脉硬化狭窄处的浓度是全身给药的8 0 1 0 0 倍。以聚合物或脂质体为膜材料制备的靶向超声造影剂温度影响因素较小，制备条件相对宽松。反应后两种材料仍具有良好的活性，为实现药物靶向运输提供了有利条件，可以桥接几种配体，如抗体和抗体f a b 段、氨基酸、多糖等物质制成特异性的靶向基因或药物。通常，脂质体( 磷脂) 以单层形式包裹微气泡，磷脂的疏水端伸向气体，亲水端伸向液体介质，以此形成屏障避免两微泡的相互融合，或者形成磷脂双分子层牢固的包裹气体微泡。以聚合物为膜材料制备超声造影剂，壳表面可根据具体需求加以修饰，直接连接药物或者通过携带配基桥接药物，方式灵活，具有广阔的应用前景和重大的l f 蠡床意义。b i s p h e r e 是由p o i n tb i o m e d i c a l 设计的一种双层结构的靶向造影剂，外层是没有生物活性的生物聚合物，内层是结构聚合物，泡内填充空气。由于外壳是双层结构，药物或基因可包覆在微泡内部、可连接在微泡表面、也可置于双层壳之间。同时，双层结构强度较高，超声束作用下不易破裂，可延长显影时间“1 微泡作为一种药物和基因的载体，为超声声学造影剂在治疗应用领域的发展提供了一个新的平台，有望建立一种无创、高效、安全的超声介导药物和基因靶向治疗体系。但该项研究还属于刚起步阶段，有许多问题需要解决，如如何使血管内携载基因和药物的靶向造影剂有效跨越血管壁靶向结合组织或器官，如何提高靶向药剂与靶向组织的特异性结合能力及稳定表达能力，以及如何提高靶向载体基因、药物的结合效能等。4第一章文献综述1 1 2 国内发展状况与国外相比较，国内心脏超声造影剂的研究起步较晚，七十年代后期开始用双氧水静脉注射右心显影，以后又用二氧化碳微泡使右心显影。1 9 9 2 年开始，第一军医大学南方医院研究声振5 人血白蛋白，制成我国第一个左心声学造影剂( 国药证字2 0 0 0 s - 3 2 ) 。为进一步改进该造影剂声学造影效果，南方医院声学造影研究课题组在国家新药基金的资助下开发出新一代含氟碳气体的白蛋白微泡全氟显。动物研究表明经静脉注射全氟显心肌显影效果满意“”。东冠注射液“的组成、大小及浓度类似于a l b u n e x ，临床实验表明经静脉注射后，8 0 以上的病例左心室显影信号明显增强，同时，左室内膜边界明显显影。它是我国南方医院早期研制成功的用于左心超声造影的造影剂，造影安全性良好。全氟显：是我国南方医院制备的第二代声学造影剂，组成类似于o p t i s o n ，外壳为白蛋白，内填充氟碳类气体全氟丙烷( c 3 f 8 ) 微泡。微泡直径2 o - 4 0 9 m ，其中9 8 以上的微泡直径 7 9 m 。动物和临床实验均显示良好的左室及心肌显影效果“”。赵玉英，智光等“”以可生物降解的高分子聚内酯为膜材料，采用( 水油水) 乳液溶剂蒸发法制备出一种新型的微泡超声造影剂。微泡粒径 s l z m ，可顺利通过肺部微循环抵达左心室而不造成栓塞，微循环血流动力学与红细胞相似，不影响肺脏的气体交换。超声辐射下，微泡多谱勒成像及二次谐波成像效果均较好，体外测试实验中，微泡可承载2 0 0 m m h g 的压力而不改变声学特性。单友亮等“声振5 的白蛋白制得一种含空气的蛋白质类的超声造影剂，微球球壁蛋白质占整瓶蛋白质总量的2 5 2 4 6 4 。光学显微镜、电镜均可观察到其外观形态：微球分布均匀，外观光滑，饱满规则。用库尔特颗粒计数仪方法学研究结果表明该微球浓度为3 - 5 x 1 0 8 个m l ，平均直径为4 2 o 2 l m 。新型微量气体测定仪测得该品空气含量1 0 0 - 3 5 7 。声振过程产生氧自由基使自蛋自分子的空间结构发生可逆性的变化，制得的微泡可有效用于左心靶向超声显影诊断，制备工艺稳定、安全有效、质量可控。可满足临床与病息需要。周忠江等”利用脂质体制各出一种新型的微泡造影剂，其浓度为1 2 5 x 1 07 个m l ，直径为3 7 4 - 4 7 $ t m 。该造影剂能够定向黏附血小板受体g p i l b i i i a 。实验中发现，随着脂质体溶解液中葡萄糖浓度的增高，脂质微泡稳定性明显增加。在不添加其它辅料的条件下，以2 0 葡萄糖作溶解液的微泡稳定时间明显长于5 ，1 0 的葡萄糖组，但葡萄糖浓度继续增高至3 0 ，微泡稳定时间不再继续延长。实验中同时发现，脂质体溶液中加入p e g 50 0 0后，微泡稳定时间显著延长，由不到一天延长到将近一周，低温保存微泡稳定性较好。在超声成像过程中，随着微泡剂量增加，左室显影强度、节段增强数及显影时间都会增加。中等剂量组的显影效果与全氟显极低剂量组相似，但显影时间较全氟显短。脂质微泡在极低剂量组和低剂量组右室显影好而左室显影较淡，东冠注射液只在高剂量组和极高剂量组可见左室显影，极高剂量组显影效果与脂质微泡中剂量组相似，但显影时间较脂质微泡短。西安理工大学硕士学位论文脂质微泡心肌显影只在极高剂量组较明显。于铭等”实验了一种新型超声造影剂j d 9 5 经静脉实时造影的可行性及介导血管内皮生长因子基因治疗心肌缺血的体外和体内实验，成功地构建了真核表达载基因p l r e s 2 - e g f p h v e g f l 6 5 ，采用脂质体法转染内皮细胞与心肌细胞后，经荧光显微镜观察，可观察到细胞内有绿色荧光蛋白的表达，同时经免疫组化证实有血管内皮生长因子的表达。作者成功地将外源性v e g f l 6 5 基因转染到内皮细胞与心肌细胞中，并进行表达，为今后利用v e g f 基因治疗心肌缺血等疾病提供了实验基础。重庆医科大学凌智瑜等人篮1 将1 5 只急性心肌梗塞3 天后的雄性w i s t a r 大鼠分为3组，每组5 只。第一组采用超声破坏微泡造影剂的方式将p c d 2 v e g f l 2 1 基因转染大鼠心肌约6 分钟；第二组尾静脉输入同等剂量携p c d 2 v e g f l 2 1 基因的造影剂；第三组为对照2 周后，分别行免疫组织化学检测缺血心肌中的v e g f 蛋白及毛细血管内皮细胞。结果表明采用超声微泡造影剂介导的v e g f 基因转染，明显增强v e g f 基因在大鼠心肌组织内的表达，并促进缺血心肌组织新生血管。1 2 超声造影剂的介绍1 2 1 理想的回波u c a 的基本要求( 1 ) 本身含有或进入人体后能够产生具有一定存活时间和能产生可增强超声回波信号的气泡；( 2 ) 可静脉注入血管，对人体组织不产生刺激、损伤及毒副作用，或可借助药物或仪器以消除或缓解。最理想的是由可被人体吸收、有益于健康的材料所制成：( 3 ) 尺寸规则、大小适宜，可通过肺循环、心脏循环和毛细循环而不造成栓塞；( 4 ) 稳定性良好。在体内可多次循环；( 5 ) 微气泡大小与红细胞接近，在血液中其流体力学特征与红细胞愈接近愈好，不引起冠脉充血、栓塞及不影响心肌收缩力。1 2 2i j o a 的几种物理形态( 1 ) 含有自由气泡的液体，如二氧化碳、双氧水等；( 2 ) 含有包膜气泡的液体；( 3 ) 含悬浮颗粒的胶状体；“) 乳剂。1 2 3 超声造影剂微泡的主要材料( 1 ) 超声造影剂微泡的膜材料早期的超声造影剂微泡膜材料有生理盐水、5 的右旋糖苷、山梨醇、胶体溶液、人6第一章文献综述体蛋白等。目前研究应用的u c a 的包膜材料可以归纳为下面几类。( a ) 蛋白质类蛋白质类物质在超声作用下，可以形成具有一定机械强度的薄膜。这是由于蛋白质分子中的羧酸基与氨基之间形成了氢键，增强了分子问的相互作用力，因此由蛋白质形成的气泡液膜强度较高，形成的气泡也就较为稳定。由于存在等电点的缘故，蛋白质形成的微泡易受p h 影响。其中人血清白蛋白用于超声造影剂的研究及临床应用最多，制备中浓度取5 ，同时加入一些其它物质如葡萄糖和蔗糖，可以显著增加蛋白质形成的气泡的稳定性及改善其它一些特性。( b ) 表面活性剂类表面活性剂类物质一般都具有降低溶液表面张力的能力，因此大都具有良好的起泡性能。在形成气泡过程中，表面活性剂的疏水端伸向气体，亲水端伸向液体，形成一层牢固的膜。另外，表面活性剂的液膜一般还具有受破坏后自我修复的能力。目前，用于超声造影剂膜材料的表面活性剂主要是非离子型表面活性剂，有吐温和斯盘系列。从表面活性剂本身的特性来说，阴离子表面活性剂和阳离子表面活性剂混合形成的液膜由于阴离子和阳离子的引力会使液膜更稳定一些，但目前这方面的研究报道较少。( c ) 脂类物质脂类物质作为u c a 膜材料的研究近年来较多一些。脂类形成的u c a 膜分两种形式：一种是脂质分子形成单分子层，包裹气体微泡：另一种是脂质形成类似于细胞膜的双分子层结构，这类脂质一般具有两亲性，如磷脂分子分散在水中，能自发形成磷脂双分子包裹溶液液滴形成封闭小囊泡。脂类u c a 一般较为稳定，存放时间长，粒径在几个到几十微米之间。另外，以脂质体制成的微泡造影剂具有靶向功能，可以聚集在特定部位，实现靶向超声诊断。( d ) 高分子材料高分子类物质作为微泡u c a 的膜材料，机理与蛋白质相同，由于分子间的作用力增强，而使膜的稳定性提高。用于u c a 制备的高分子材料主要有合成的可生物降解的聚合物材料和天然的大分子体系。制备的u c a 粒径分布集中，粒径多在3 p m 左右，后方声衰减微弱，体内体外存留时问长，声学特性可通过改变聚合物聚合条件得以优化。但也有其不足，聚合物外壳较白蛋白、脂质较硬，因此需要较高的声学输出才能引起微泡的非线性振动或微泡的破裂，产生增强的对比成像，而在较高的声学输出时，微泡破裂的同时容易产生生物学效应，如引起细胞溶解、毛细血管破裂等。微血管破裂及细胞损害的数量与发放声能的机械指数呈线性相关。随着高分子化学技术的进一步发展，聚合物微泡制备工艺进7西安理y - a 学硕士学位论文一步完善，将得到品质更加优良的声学造影剂，用于不同生理和病理诊断及药物靶向传输。( 2 ) 超声造影剂微泡的气体材料超声造影剂微泡所采用的气体对于维持微泡的稳定性是至关重要的。早期人们对u c a 的制备研究多集中于寻找理想的介质作为气泡的外壳，所用气体局限于常规气体空气、氮气、氧气、二氧化碳等。1 9 9 3 年d e m a r i a 和b e p p u 等人经静脉注射2 的全氟戊烷产生心肌显影，微泡的气体材料引起人们的重视。s c h n e i d e r 汹认为显影效果好的气体应具备以下特点，即：该气体在水中的溶解性与其分子量平方根的比值小于o 0 0 3 ，氟碳化合物是目前为止最为理想的超声造影剂气体材料。近年来。将氟碳化合物和常规气体混合填充微泡造影进行超声显影也多有研究，s c h u t t “1 认为，混合的两种气体遵循以下规则，则造影效果比较理想，即：其中一种气体3 7 时蒸气压大于7 5 m m h g ，而另外一种气体在3 7 c 时蒸气压至少为( 7 6 0 - x ) m m h g ( x 为第一种气体在3 t c 对的蒸气压) 介于氟碳化合物环保因素，今后超声造影剂气体材料研究方向为常规气体新的弥散度低的环保因素佳的物质。1 2 4 超声造影剂微泡特性 h o - c h 2 - r i - c h 2 - o + 矿h o c h 2 - r 2 - c h 2 一o h + i - f - - h o c h 2 - r 2 c h 2 o h 2 +h o c i 1 2 r 1 一c h 2 一o + h o c h 2 - r 2 c h 2 0 h 2 十h o - c h 2 r l o r 2 - c h 2 o h + h 2 0由于p e g 是线性商分子，其主链在水溶液中呈柔软卷曲状，反应中分子量越大的分子空间位阻越大，而且分子量越大的分子中电子云分布越均匀，诱导效应减弱，因此，可以认为聚合主要发生在较小分子量p e g 中。( 2 ) p e g 超声降解机理p e g 的超声降解主要是通过自由基反应来完成。首先，水分子在超声波作用下形成h 自由基和o h 自由基，p e g 分子则通过醚键断裂形成两个自由基，而自由基中的醚键在超声波作用下进一步断裂，形成多个自由基。一方面，不同自由基之间可以相互聚合形成