（水产养殖专业论文）17αmethyltestosterone和letrozole对尼罗罗非鱼性转化影响及其性别决定机制的初步研究.pdf

卜 l u l lli lll li l i l i ；：! i l l i l 哪i y 18 0 4 7 d 6 c i a s s i f i e di n d e x ： s 9 1 7 s e c u r i t yc l a s s i f i c a t i o n ： u d c 一6 鹚s e c u r i t yp e r i o d ： d i s s e r t a t i o nf o rt h em a s t e r sd e g r e e i n f l u e n c eo f17 仅 m e t h y l t e s t o s t e r o n ea n d l e t r o z o l e o ns e xr e v e r s a la n d m e c h a n i s mf o rs e x d e t e r m i n a t i o ni nn i l et i l a p i a c a n d i d a t e ： s up e r v i s o r ： s p e c i a l i t y ： m oy u a n y u a n p r o f l um a i x i n ，p r o f c h e ng a n g a g r i c u l t u r e r e s e a r c hf i e l d ： b i o l o g ya n db r e e d i n ge n g i n e e r i n g u n i v e r s i t y ： s u b m i s s i o nd a t e ： o ff i s h e r t ye c o n o m i ca m i m a l s g u a n g d o n go c e a nu n i v e r s i t y a p r i l 2 0 1 0 广东海洋大学 学位论文原创性声明 本人郑重声明：所呈交的论文是本人在导师的指导下独立进行研究所取得 的研究成果。除了文中特别加以标注引用的内容外，本论文不包含任何其他个 人或集体已经发表或撰写的成果作品。对本文的研究做出重要贡献的个人和集 体，均已在文中以明确方式标明。本人完全意识到本声明的法律后果由本人承 担。 作者签名：融 2 0 。年石月肜日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同意学校 保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和 借阅。本人授权广东海洋大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数 据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。 本学位论文属于l 、保密口，在年解密后适用本授权书。 2 、不保密团。 ( 请在以上相应方框内打“4 ”) 作者签名：覃燃 导师签名： 2 0 1 0 年月肜日 2 0 1 0 年s 月唁日 j 17 仪m e t h y l t e s t o s t e r o n e 和l e t r o z o l e 对尼罗罗非鱼性 转化影响及其性别决定机制的初步研究 摘要 自然条件下，罗非鱼的繁殖周期较短，繁箔后代需消耗大量的能量而影响其生长 速度。针对罗非鱼个体在生长方面的性别二念性，生产上采用单雄性养殖以提高养殖 产量与效益。全雄罗非鱼苗种的获得主要通过种川杂交或性激素诱导获得。本文用雄 性激素1 7 a 甲基睾酮( m t ) 处理尼罗罗非鱼鱼苗，研究m t 对尼罗罗非鱼雄性率的影响 及残留情况，并通过荧光定量p c r 的方法测定激素处理后类固醇酶基因的表达情况， 同时用微卫星方法检测尼罗罗非鱼性别相关标记。尝试从分子机理上阐明影u i 匈性别决 定的基因位点及影响鱼类性别决定的分子机制，为人工控制鱼类性别、培育单性鱼以 及为生产实践中有效地提高群体生长率、控制繁殖速度、提高商品鱼的舰格和质罱提 供理论基础，对罗非鱼生产有指导意义。主要研究结果如f ： 1 、本文采用不同浓度梯度1 7 甲基睾酮( 1 7 a m e t h y l t e s t o s t e r o n e ，m t ) 饲料 ( 5 ，1 0 ，3 0 ，5 0 和6 0 m g k g 1 ) 处理孵化后1 0 天的尼罗罗非鱼鱼苗3 0 天，之后改 喂l f 常饲料继续进行养殖。经过4 个月的饲喂后，m t 处理组的绝对增长率、绝对 增重率、瞬时增长率和瞬时增重率等参数均与对照组问存在显著差异( p 0 0 5 ) 。统 计鱼苗雄性率，发现高浓度处理组( 5 0 m g k g 一和6 0m 矿k g 。) 雄性率超过9 9 ， 低浓度处理组( 5 m g k g 一和1 0 m g k g q ) 雄性率则低于8 0 。m t 处理3 0 天后，对 照组与处理组m t 残留量分别为0 9 9 k g 一( 对照组) 2 3 1 9 9 9 k g 叫( 5 m g k g 叫) 3 0 8 2 “g k g 叫( 10m g k g q ) 3 7 7 6 9 9 k g 叫( 3 0m g k g 叫) 4 4 7 5 9 9 k g “( 5 0 m g k g “) 6 8 4 1p g k g 叫( 6 0 m g k g 一1 。残留量与m t 添加量呈现正相关。继续投喂萨常钉4 料3 0 天后，在 各浓度处理组均未检测到m t 残留。以上研究结果表明：m t 处理3 0 天可提高罗非 鱼苗雄性率，促进生长；m t 处理后6 0 天，均检测不出m t 残留。 2 、本实验用浓度为1 0 m g k g 。的m t 、l e t r o z o l e 分别腹腔注射尼罗罗非鱼，在 注射后1 2 h 、2 4 h 、4 8 h 、7 d 、1 4 d 、2 1 d 时检测p 4 5 0 a r o m 、1l i b - h s d 2 、p 4 5 0 s c c 基因 表达量。发现三个基因初始表达量均下降，而后回升。在用m t 注射尼罗罗非鱼后， 检测发现p 4 5 0 s c c 基因最先受到抑制，p 4 5 0 a r o m 和11 1 3 - h s d 2 次之；而用芳香化酶 抑制剂l e t r o z o l e 注射尼罗罗非鱼后，检测发现p 4 5 0 a r o m 和p 4 5 0 s c c 较先受到抑制， 而l l i b - h s d 2 次之。这表明：m t 可能是通过调节p 4 5 0 s c c 基因水平进而降低了 p 4 5 0 a r o m 的表达量，而芳香化酶抑制剂l e t r o z o l e 为直接调节p 4 5 0 a r o m 基因进而对 鱼类的性别造成影响。 3 、从g e n b a n k 上选取1 0 对( u n h l 0 4 ，g m 0 4 1 ，g m 6 6 3 ，u n h l 6 8 ，u n h 8 4 6 ， u n h 9 3 1 ，u n h l 4 8 ，u n h 9 8 5 ，u n h 9 9 5 ，g m 2 5 8 ) 微卫星引物，分别对雌雄尼罗罗罗 非鱼基因组进行扩增。结果表明：雌性尼罗罗非鱼群体各位点的多态信息含量在 o 3 4 1 6 0 6 7 4 1 之间，雄性尼罗罗非鱼群体各位点的多态信息含量在0 2 6 4 1 0 6 7 6 9 之 间，均为中度多念性位点或高度多念位点。雌鱼群体中平均观测杂合度为0 4 4 4 2 ，平 均期望杂合度为0 5 9 1 3 。雄鱼群体中平均观测杂合度为0 5 5 0 0 ，平均期望杂合度为 0 5 6 6 0 。这两个群体遗传多样性均比较丰富。另外，经检测发现这1 0 个位点在雌雄尼 罗罗非鱼群体之间并未有不同。 关键词：尼罗罗非鱼，微卫星，性别连锁，r e a l t i m ep c r ，类固醇激素，l e t r o z o l e ， 1 7 c 【甲基睾丸酮 i i i n f l u e n c eo f1 7 a - - m e t h y l t e s t o s t e r o n ea n dl e t r o z o l eo n s e xr e v e r s a la n dm e c h a n i s mf o rs e xd e t e r m i n a t i o ni n n i l et i l a p i a a b s t a c t n a t u r a l y , o n eo fb i o l o g i c a lc o n s t r a i n t st ot h ed e v e l o p m e n to fc o m m e r c i a lf a r m i n go f t i l a p i ai si t se a r l ys e x u a lm a t u r i t yt h a tr e s u l ti ns p a w i n gb e f o r ef i s hr e a c hm a r k e ts i z e t h e r e f o r e ，c o m m e r c i a lp r o d u c t i o no ft i l a p i ao f t e nr e l i e so nm o n o s e xc u l t u r eo fm a l e s a l l - m a l et i l a p i ap o p u l a t i o n sa r ed e s i r a b l eb e c a u s em a l e sa c h i e v eal a r g e rf i n a ls i z et h a n f e m a l e s t h em o s tc o m m o nt e c h n i q u e sf o rp r o d u c i n gm a l ef i n g e r l i n g sa r es t e r o i d i n d u c e d s e xi n v e r s i o na n di n t e r s p e c i f i ch y b r i d i z a t i o n t os t u d yt h em a s c u l i n i z a t i o na n d17 c t m e t h y l t e s t o s t e r o n e ( m t ) r e s i d u e s ，t h en i l et i l a p i af r yw e r et r e a t e db ym t h o w e v e r ，t h e m o l e c u l a rm e c h a n i s m si n v o l v e di nt h e s ec h a n g e sa n dt h es e x - l i n k e dl o c u sr e m a i nu n c l e a r s s r ，r t - p c ra n dl i q u i dc h r o m a t o g r a p h ym e t h o dw e r eu s e di n t h i ss t u d y t h em a i n a c h i e v e m e n t so fi n v e s t i g a t i o nw e r ea sf o l l o w s ： 1 a t10d a y sp o s t - f e r t i l i z a t i o n ( d p f ) ，n i l et i l a p i a ( o r e o c h r o m i sn i l o t i c u s ) f r yw e r ef e d b y17 c t m e t h y l t e s t o s t e r o n e ( m t ) 一t r e a t e dd i e t ( 0 ，5 ，10 ，3 0 ，5 0a n d6 0m g k g 。1 ) f o r3 0d a y s ， t h e nt h em t - t r e a t e dd i e tw e r er e p l a c e db ym t - f r e ec o m m e r c i a lf e e d a f t e rf o u rm o n t h s e x p e r i m e n t ，t h ea b s o l u t eg r o w t hr a t eo fl e n g t h ( a g r l ) ，a b s o l u t eg r o w t hr a t eo fw e i g h t ( a g r w ) ，s p e c i f i cg r o w t hr a t eo fl e n g t h ( s g r l ) a n ds p e c i f i cg r o w t hr a t eo fw e i g h t ( s g r w ) h a das i g n i f i c a n td i f f e r e n c ea m o n gm tt r e a t e dg r o u p sa n dc o n t r o lg r o u p r e s p e c t i v e l y i n5 0m g k g a n d6 0m g k g m t - t r e a t e dg r o u p s t h em a l ep o p u l a t i o nw a s m o r et h a n9 9 ，w h i l ei n5m g k g 。a n d10 m g k g 。m t - t r e a t e dg r o u p s t h em a l e p o p u l a t i o nw a sl e s st h a n8 0 t h er e s i d u eo fm ti nm u s c l et i s s u ea t3 0d a y si ne a c h g r o u p w a sr a n k e da so l a g k g 。1 ( c o n t r o lg r o u p ) 2 3 19p g k g 。( 5 m g k g 。) 3 0 8 2l a g k g 。 ( 1 0 m g k g ) 3 7 7 6l a g k g 1 ( 3 0 m g k g 1 ) 5 5 1g ( 3 0 m g k g 叫) 4 3 7g ( 5 r a g k g q ) 4 1 2g ( 1 0 m g k g 叫) 2 4 4g ( 对照组，0 m g k g 一) ，其中，五个m t 处理组体质量均与对照组存在显著差异 ( p 1 0 0 ( 3 0 m g k g 一) 6 6 6 7 ( 5 m g k g 叫) 3 3 3 3 ( 1 0 m g k g ) ( 见表2 1 ) 。 2 2 2 不同m t 浓度对雄性率的影响 对照组雄性率为4 9 8 。5 m g k g 。1 和1 0 m g k g 1 低浓度处理组雄性率分别为 6 8 0 和7 6 0 。3 0 - 6 0 m g k 蛋1 浓度处理后雄性率达到9 0 以上。其中，3 0 m g k g 一 处理组雄性率为9 0 8 。5 0 m g k g 一和6 0 m g k g 一高浓度处理组雄性率分别为9 9 1 和9 9 4 ，但未达到l o o ( 见图2 1 ) 。可见，低浓度处理对雄性化率的影响力相对 较小。m t 处理浓度与雄性率的p e a r s o n 相关系数为0 9 2 2 。 1 4 广东海洋大学颀士学位论文 表2 1 尼罗罗非鱼不同m t 浓度处理下的绝对增长率、绝对增质量率、瞬时增长率和瞬时增质 量率 t a b 2 - lt h ea b s o l u t eg r o w t hr a t eo f l e n g t h ( a g r l ) ，a b s o l u t eg r o w t hr a t eo f w e i g h t ( a g r w ) ，s p e c i f i c g r o w t hr a t eo fl e n g t h ( s g r l i ) a n ds p e c i f i cg r o w t hr a t eo fw e i g h t ( s g r w ) i nm t t r e a t e dg r o u p sa n d c o n t r o lg r o u p 汴：i j 列数，腑标小川，母表，j 差异址酱( p o 0 5 ) 。 n o t e ：d i f f e r e n ts u p e r s c r i p t sd e n o t es i g n i f i c a n td i l k r e n c e s ( p o 0 5 ) ，s a m es u p e r s c r i p t sd on o td e n o t es i g n i f i c a n t d i f f e r e n c e s 2 2 3 不同m t 浓度对激素残留的影响 m t 处理3 0 天后，通过液桐色谱法检测肌肉组织中m t 残留情况，发现对照组 无残留，随着m t 添加量的增加，残留量逐渐增加，其中最低浓度组( 5 m g k g 一) 残留量仅为2 3 1 9 9 9 k g 一，最高浓度组( 6 0 m g k g 。) 残留量最高，为6 8 4 1 l a g k g _ ( 见图2 2 ) 。在1 0 m g k g 一，3 0 m g k g l 和5 0 m g k g 1m t 处理组中，残留量分别为 3 0 8 2 p g k g ”，3 7 7 6 1 a g k g j 和4 4 7 5 p g k g 。m t 处理浓度与m t 残留量的p e a r s o n 相关性系数为0 9 1 5 ，钱留量与m t 添加量呈现f 相关。经过投喂萨常饲料3 0 天后， 在各实验组肌肉组织中均未检测到m t 残留。 1 5 17 c 【m e t h y l t e s t o s t e r o n e 干l e t r o z o l e 对尼罗罗1 卜鱼性转化影响及其性别控制机制的初步研究 1 2 0 0 0 l o o 0 0 8 0 0 0 婪6 0 0 0 封4 0 0 0 2 0 0 0 0 0 0 8 0 7 0 6 0 j 塑5 0 蚓4 0 姜3 0 宝2 0 l o o o51 03 05 06 0 m t 浓度( m g k g ) + 雄性率 图2 1m t 处理组与对照组罗非鱼雄性率 f i g 2 - lt h es e xr a t i oo fm a l ei nm tt r e a t e dg r o u p sa n dc o n t r o lg r o u p 1 03 05 06 0 m t 浓度( m g k g ) + 残留量 图2 2m t 处理3 0 天后各处理组m t 残留量 f i g 2 - 2t h eq u a n t i t yo f17 0 - m e t h y l t e s t o s t e r o n er e s i d u eo f n i l et i l a p i at r e a t e db yad i f f e r e n tm td o s e f o r 3 0 d 2 3 讨论 2 3 1m t 处理对罗非鱼鱼苗性逆转与生长速度的影响 利用激素处理罗非鱼苗的技术在上世纪6 0 年代术就获得成功1 7 2 1 。激素类药物 通过蛋白质的同化作用，能提高饲料转化率并促进水产动物生长，提高水产动物的 1 6 广东海洋大学硕士学位论文 繁殖和生产能力【7 3 j 。同时对于生长性状具有明显性别二念性的鱼类，激素类药物还 可以用来获得单性鱼1 7 4 1 。m t 诱导罗非龟雄性化报道较多，主要使用的m t 处理浓 度在3 0 5 0 m g k g 。【7 2 7 4 7 5 1 。因此本研究选择了5 ，1 0 ，3 0 ，5 0 ，6 0 m g k g 处理尼罗 罗非鱼，拟探讨m t 不同投喂剂量与雄性率及残留量问的关系。 在本实验中，在0 - 6 0 m g k g 。1m t 处理范围内，尼罗罗非鱼体质量随着m t 浓 度的增加而增加，体长的变化趋势与体质量相似。绝对增长率、绝对增质量率以及 瞬时增长率、瞬时增质量率也均与对照组存在显著差异( p 0 0 5 ) ( 见表2 1 ) 。但低浓 度处理组( 5 m g k g 一和10 m g k g 。) 雄性率不高，仪为6 8 0 和7 6 0 。低浓度组虽 然对尼罗罗非鱼生长有促进作用，但是对性逆转的作用相对较小。3 0 6 0 m g k g 一处 理组生长指标较高，雄性率也较高。3 0 、5 0 、6 0 m g k g 一处理组雄性率分别达到9 0 8 、 9 9 1 和9 9 4 ，可以明显提高罗非鱼雄性率。柏关性分析显示，罗非鱼雄性率与 m t 浓度的相关性较好，p e a r s o n 相关系数为o 9 2 2 。在其它鱼类中，m t 诱导雄性化 得到的雄性率与该研究类似。其中，2 5 m g k g 。m t 饲料投喂上浮2 周的虹鳟稚鱼4 5 天，雄性率达到8 3 3 列7 6 l 。3 0 m g k g 一的m t 饲料处理孔雀鱼4 0 天，雄性率为1 0 0 ； 处理玛丽鱼8 0 天，雄性率达到9 6 4 1 7 7 1 。 性别转化的分子机制目前还不清楚。k i t a n o l 7 8 - 7 9 等用雌核发育所得f = 1 本比目鱼 伊o l i v a c e u s ) 经雄激素诱导性逆转为雄鱼，再与一常雌鱼受精，所得为全雌子代，把 这些鱼在孵化后3 0 1 0 0 d 分别戗4 养在1 8 或2 7 。c ，结果d ，j 者所得为雌鱼，后者为雄鱼， 同时用r t p c r 检i l ) 1 0 p 4 5 0m r n a ，发现在性腺未分化时( 孵化后5 0d ) 无差异，但性分化 丌始后( 6 0 d ) ，雌性个体p 4 5 0 芳香化酶m r n a 明显增加，而雄性个体变化不大。他们认 为，可能是温度影响了染色体结构而使表达有差异。用芳香化酶抑制剂f a d r o z o l e 或 1 7 a 甲基睾丸酮同样也出现抑制芳香化酶的表达，与高温( 2 7 ) 作用相同，但作用机 制可能不一样。而同时给予f a d r o z o l e 与1 7 1 3 雌二醇，则两者有抵消作用。他们为此得 出在性分化过程中保持p 4 5 0 芳香化酶基因低表达是精巢分化所必需的。芳香化酶抑制 剂导致的性逆转是由于阻止了芳香化酶基冈的表达，导致雌激素量减少所引起的， p 4 5 0 芳香化酶基因是影响性腺分化的较直接因素。 2 3 2m t 在鱼体内的代谢 甲基睾酮作为激素类药物对人或动物存在较大的潜在危害。目前在欧盟和中国 被列为禁用激素类兽药。在美国，其同类的丙酸睾酮在肌肉中的最高残留限量 ( m r l ) 为0 6 4 9 k g 。中国规定在所有食用动物的所有可食组织中不得检出1 8 0 8 。 水产品中激素残留量分析方法主要有高效液相色谱法1 8 2 1 、气相色谱法、固相萃 取高效液相色谱 ! 去【8 3 1 、液相色谱一质谱测定洲8 4 1 、放射免疫分析i ! 去【8 5 i 等。目日仃应用 较为广泛的是高效液相色谱法，其灵敏度较高，能较准确地定性定量，并可以同时 进行激素的多组分分析且具有较高的灵敏度和准确度【86 1 。 本研究采用高效液相色谱法测定了甲基睾酮残留量。m t 处理3 0 天后，检测肌 1 7 1 7 c 【m e t h y l t e s t o s t e r o n e 和l e t r o z o l e 对尼罗罗1 卜鱼性转化影响及其性”0 控制机制的初步研究 肉组织中m t 贱留情况，发现对照组无钱留，随着m t 添加量的增加，残留量逐渐 增加，其中最低浓度组( 5 m g k g 一) 残留量仅为2 3 19 9 9 k g ，最高浓度组( 6 0 m g k g 一) 残留量最高，为6 8 4 l 嵋k g o ( 见图2 ) 。m t 处理浓度与m t 残留量的p e a r s o n 相关 性系数为0 9 1 5 ，残留量与m t 添加量呈现正相关。经过投喂正常饲料3 0 天后，在 各实验组肌肉组织中均未检测到m t 残留。停喂m t 饲料一个月之后，并未检测到 m t 残留。持续喂药3 0 天时测定尼罗罗非鱼肌肉组织中的m t 残留量与处理浓度呈 现明显的相关性，而经过3 0 天f 常饲料喂养，未检测出m t 残留。显示，m t 处理 过的罗非鱼鱼苗早期存在m t 钱留，经过后续币常养贿过程，m t 药物逐渐被代谢 掉。 激素类药物在鱼体内代诩 较快，撤除放射性激素饲料1 2 小时后，鱼体内总放 射性下降到3 5 ，且其中9 0 位于内脏中| 8 7 i 。高艳丽1 8 8 1 等也发现1 7 b 。雌_ ：醇诱导 施氏鲟全雌化后，激素在肌肉和胃肠道中的残留量低且钱留时| 日j 短。虹鳟经 4 0 m g k g 。的m t 处理后，2 4 小时内m t 代谢成为游离和结合型的代谢物，肝脏和 肌肉中的残留量低于l n g g ，但胆汁中的放射能是其它组织的2 0 0 2 0 0 0 倍1 8 9 j 。因 此，m t 进入罗非鱼体内后可能很快被代谢掉，在改喂i f 常饲料3 0 天后，均未检测 出残留。 18 广东海洋大学硕士学位论文 317 a 甲基睾酮( 17 0 【。m e t h y l t e s t o s t e r o n e ，m t ) 和i 来曲唑 ( l e t r o z o l e ) 对类固醇酶基因的表达影响 3 1 材料 3 1 1 实验动物 实验所用的遗传型x x 尼罗罗非鱼( 平均体重4 3 7 1 9 ，平均体长1 3 6 9 c m ) 由 中国水产科学研究院珠江水产研究所高要水产种质工程中心提供。并于2 0 0 9 年9 月9 同至9 月2 9 卜 期间在高要水产种质工程中心进行养贿处理。 实验分为二三组，m t 处理组、l e t r o z o l e 处理组和对照组。每组3 0 尾鱼，暂养f 水泥池中3 周，每天投喂2 次，水温2 8 左右。 m t 、l e t r o z o l e 经无水乙醇溶解后用植物油稀释( 体积比1 ：1 0 ) 。腹腔注射m t 、 l e t r o z o l e 的量均为1 0 m g - k g 一。对照组注射无水乙醇：植物油( 1 ：l o ) 混合液。注射 1 2 、2 4 、4 8 h 和7 、1 4 、2 l d 后取实验鱼的卵巢组织( 每次取三条雌鱼) ，置于液氮 中保存备用。 3 1 2 实验试剂与主要仪器 实验试剂： 高纯总r n a 快速提取试剂盒购自b i o t e k ec o r p o r a t i o n ，t a q 酶、p r i m e s c r i p t t m 反 转录试剂盒，p m d l 9 - t 载体购自t a k a r a ；p l a s m i dm i n ik i t 、d n a s e 、胶回收试剂 盒为o m e g a 公司产品，s y b rg r e e nr e a l t i m ep c rm a s t e rm i x 购白a b i 公司。所有 引物均由上海生物工程公司合成。 主要仪器： 1 1 5 型台式离心机 s i g m a 公司 5 4 1 7 r 型台式离心机 s i g m a 公司 m w g b i o t e c ha g 型p r i m u sp c r 扩增仪德国 可控温烘箱长沙仪表仪器厂 m i c r o t e k3 6 0 0 凝胶扫描仪m i c r o t e k 公司 水平电泳槽北京六一仪器厂 电泳仪北京六一仪器厂 低温冰箱华凌公司 m e t t l e rt o l e d op b2 0 3 - n 电子天平 p hb 3 便携式p h 计上海伟业仪器厂 高压灭菌锅山东新华医疗器械厂 荧光定量p c r 仪 a b i 7 3 0 0 19 1 7 c 【m e t h y l t e s t o s t e r o n e 和l e t r o z o l e 对尼罗罗1 卜鱼性转化影响及其性别挖制机制的初步研究 一次性注射器，直尺等为本实验室自备。 3 1 3 培养基及缓冲液 ( 1 ) 液体l b 培养基( l i q u i dl u r i a b e r t a n im e d i u m ) 的配制： 胰蛋白胨( t r y p t o n e ) 1 0 0 9 酵母提取物( y e a s te x t r a c t ) 5 0 9 n a c l 1 0 0 9 去离子水9 0 0 r a l 待上述成分完令溶解后用l om o l ln a o h 调节p h 至7 0 ，高压灭菌2 0 m i n ，室 温保存。 ( 2 ) 普通同体l b 培养基( s o l i dl u r i a b e r t a n im e d i u m ) 的配制： 固体培养皋是在液体l b 培养基中加入1 5 ( w v ) 的琼脂粉制成。先按l b 液体培养基的配方配制液体培养基，然后加入琼脂1 5 9 l ，高压灭菌2 0 m i n 后降温 至5 0 6 0 ，在无菌状念下铺制平板，室温放置过夜后置于4 冰箱保存待用。 ( 3 ) 氨苄l b 培养基( a m ps o l i dl u r i a b e r t a n im e d i u m ) 的配制： 将灭菌好的固体培养基置室温状态下，待温度降至5 0 6 0 后，加入氨苄青霉 素( 达终浓度5 0 1 a g m l ，摇匀后，无菌状态下将其倒入预先灭菌好的平皿中铺平， 培养基2 - 3 m m 厚，室温放至固化，然后置4 冰箱保存待用。 ( 4 ) 5 0 x t a e 琼脂糖凝胶电泳缓冲液( 1 l ，使用时稀释成1 t b e ) t f i s 2 4 2 9 e d t a 3 7 2 9 冰醋酸 5 7 1 m l 调至p h 8 0 ，备用。 3 2 方法 3 2 1 组织取样 首先，焦碳酸二乙酯( d e p c ) 特殊处理取样所需塑料用具、玻璃器皿、剪刀、镊 子等，金属器具则要在洗净后1 8 0 烘烤4 小时以上。 其次，取样。用灭菌水冲洗尼罗罗非鱼体表，在超净工作台中迅速解剖并耿出 所需组织样品，装入经d e p c 特殊处理过的1 5 m l 离心管，并立即放入液氮中速冻 或直接用于下一步操作。 3 2 2 荧光定量r t - p c r 引物的设计与合成 参照g e n b a n k 中尼罗罗罗非鱼1 1j 3 - h s d 2 ( 1 1 p 羟基类固醇脱氢酶型2 ，1 1 p h y d r o x y s t e r o i dd e h y d r o g e n a s et y p e2 ) 、p 4 5 0 a r o m ( p 4 5 0 a r o m a t a s e ，性腺芳香化酶细 胞色素p 4 5 0 ) 、胆固醇侧健分裂细胞色素p 4 5 0 ( p 4 5 0 c h o l e s t e r 0 1 s i d e c h a i n c l e a v a g e ， p 4 5 0 s c c ) 的序列，分别设计各基因的特异性引物，同时要保证所扩增片段大小在 2 0 广东海洋大学硕士学位论文 8 0 2 5 0 b p 之间。由于需要f i - a c t i n 基凶作为内对照，所以1 3 - a c t i n 基凶也设计一套弓 物。引物序列如下： 。 表3 1 实时荧光定量p c r 分析所用引物 t a b 3 - 1p r i m e r su s e df o rr e a l t i m eq u a n t i t a t i v ep c ra n a l y s i s 引物名称引物序列 p 4 5 0 s c c - f p 4 5 0 s c c - r i i3 - h s d 2 - f ii b - h s d 2 一r p 4 5 0 a r o m - f p 4 5 0 a r o m r 1 3 - a c t i n f 1 3 - a c t i n r 5 a a g t c t g g g c t t c g g c t t t g3 5 t c g a g a a t g t g g a l a a g a a a g a g t t g3 5 g a g a a c g c a c c t g c t g a a l a c3 5 a t g a c t t t g a a g c g a t g a a c c3 5 a g g a g 芦汀a g a c g c t g t t g t g g g t3 5 t g t g t t c a g a a t g a t g t t t g t g c3 5 c a g c a a g c a g g a g t a c g a t g a g3 5 t g t g t g g t g t g t g g t t g t 丁下t g3 3 2 3 尼罗罗非鱼卵巢组织总r n a 的提取 按b i o t e k e 公司的高纯总r n a 快速提取试剂盒使用手册提取总r n a ，步骤如 下： ( 1 ) 匀浆处理：用剪刀和尖头镊子从尼罗罗非鱼卵巢组织中墩出约3 0 m g 左右，加l m l 的裂解液r l 后用匀浆器搅匀组织样品。 ( 2 ) 将匀浆样品剧烈震荡混匀，在1 5 3 0 。c 条件下孵育5 分钟以使核蛋白体完全分解。 ( 3 ) 4 c 条件下1 2 0 0 0 r p m 离心1 0 分钟，小心取l 清转入一个新的r n a s ef r e e 的离心 管中。 ( 4 ) 每l m l r l 加0 2 m l 氯仿。盖紧样品管盖，剧烈振荡1 5 秒并将其在室温下孵育3 分钟。 ( 5 ) 于40 c 1 2 0 0 0 r p m 离心1 0 分钟，样品会分成三层：下层有机相，中间层和上层无 色的水相，r n a 存在于水相中。水相层的容量大约为所加r l 体积的6 0 ，把水相 转移到新管中，进行下一步操作。 ( 6 ) j j i 入1 倍体积7 0 乙醇，颠倒混匀( 此时可能会出现沉淀) 。得到的溶液和可能 沉淀一起转入吸附柱r a 中( 吸附柱套在收集管内) 。 ( 7 ) 1 0 0 0 0 r p m 离心4 5 秒，弃掉废液，将吸附柱重新套回收集管。 ( 8 ) 加5 0 0 p 1 去蛋白液r e ，1 2 0 0 0 r p m 离心4 5 秒，弃掉废液。 ( 9 ) 加入7 0 0 肛1 漂洗液r w ，1 2 0 0 0 r p m 离心6 0 秒，弃掉废液。 ( 1 0 ) 力i e i j x 5 0 0 p l 漂洗液r w ，1 2 0 0 0 r p m 离心6 0 秒，弃掉废液。 ( 1 1 ) 将吸附柱r a 放回空收集管中，1 2 0 0 0 r p m 离心2 分钟，尽量除去漂沈液，以免 漂洗液中残留乙醇抑制下游反应。 2 1 1 7 a m e t h y l t e s t o s t e r o n e 和l e t r o z o l e 对尼罗罗1 卜鱼性转化影响及其性别控制机制的初步研究 ( 1 2 ) 取出吸附柱r a ，放入一个r n a s ef r e e 的离心管中，根据预期r n a 产量在吸附 膜的中l 日j 部位加5 0 8 0 9 lr n a s ef r e ew a t e r ( 事先在6 5 7 0 c 水浴中加热效果更好) ， 室温放置2 分钟，1 2 0 0 0 r p m 离心1 分钟。 洗脱后的r n a 溶液可用于r t - p c r ，也可以保存在7 0 。抽提的r n a 浓度可 过通过紫外分光光度计测出，r n a 浓度= 4 0 9 9 m l x 稀释倍数a 2 6 0 。m 。纯度可通过 a 2 6 0 n m a 2 8 0 的比值来确定，1 8 2 0 为其正常值。r n a 提取的成功与否是r t - p c r 中 最重要的步骤。 3 2 4 尼罗罗非鱼总r n a 的反转录 ( 1 ) d n a s ei 处理，以去除基因组d n a 的污染。反应体系如下： 加样物质 r n a l0 x r e a c t i o nb u f f e r r n a s e f r e ed n a s e r n a s e f r e ed h 2 0 加样量 2 0 u g 1 0 u l 1 u u g u p t o1 0 u l ( 2 ) 3 7 ，3 0 m i n 之后，转入冰上，短暂离心，加入1 o u ld n a s es t o ps o l u t i o n 。 ( 3 ) 6 5 * ( 2 ，1 0 m i n ；冰上急冷。 ( 4 ) 继续加入t a k a r a 公司的p r i m e s c r i p t t m1s ts t r a n dc d n as y n t h e s i sk i t 中的以下试 剂，反应体系为： 二 2 2 鼍 n 山 加梢叫叫驯川蚴 _ f 脚 p 广东海洋大学硕士学位论文 3 2 5p c r 产物的分离、回收和纯化 根据p c r 电泳结果，选择最佳p c r 反应条件，扩大反应体系或增加反应管数， 然后将所有p c r 产物上样至预先制好的1 8 的琼脂糖凝胶，1 0 v c m 电压电泳分离 d n a 片段，再在紫外灯下切割所需要的片段，用e z n ag e le x t r a c t i o nk i t 进行回 收。具体操作如下： ( 1 ) 将切的胶称重，按1 0 0 m g 约等于l o o p l 换算，加入1 倍体积的b i n d i n gb u f f e r ， 于5 5 6 5 水浴约5 分钟，至凝胶完全溶解。 ( 2 ) 将凝胶溶解液转入已和收集管装配好的h i b i n dd n a 分离管中，1 0 0 0 0 9 x l m i n 室 温离心。 ( 3 ) 倒弃流出液，加入3 0 0 p lb i n d i n gb u f f e r ，1 0 0 0 0 1 r a i n 室温离心。 ( 4 ) 弃滤液，加7 0 0 p ls p ww a s hb u f f e r ，10 0 0 0 x lm i n 室温离心。 ( 5 ) 熏复( 4 ) 步骤。 ( 6 ) 弃滤液，空管离心13 0 0 0 x 2 m i n 。 ( 7 ) 将h i b i n dd n a 分离管转移至一干净1 5 m l 离心管，加3 0 5 0 p l 无菌d d h 2 0 ，窀温 放置一分钟后，离心l3 0 0 0 x 2 m i n 。 ( 8 ) 将收集液重新转移至h i b i n dd n a 分离管，1 3 0 0 0 x l m i n 重复一次，以使d n a 沈 脱彻底。 ( 9 ) 取出1 5 m l 离心管，电泳检测回收后d n a 片段大小，2 0 保存备用。 3 2 6 连接反应 由于t a q 酶扩增时，会在p c r 产物术端加上一个腺嘌呤核苷酸( d a t p ) ，冈此 p c r 产物片段可直接与t 载体( t a k a r a ：p m d l 9 tv e c t o r ) 连接，根掘其试荆盒说 明书：v e c t o rd n a 和插入片段d n a 的摩尔比一般为l ：2 1 0 ，其连接反应体系( 5 p 1 ) 如下： p m d i9 - tv e c t o r 1 o p l i n s e r td n a 0 i - - 0 3 p m o l d h 2 0 u p t o5 1 a l 加入5 p l ( 等量) 的l i g a t i o nm i x ，于1 6 。c 循环水浴连接过夜，然后置- 2 0 * ( 2 保存。 3 2 7 转化 3 2 7 1 采用c a c l 2 处理法制备大肠杆菌感受念细胞 ( 1 ) 挑取d h 5 a 单菌落接种于5 m l l b 液体培养基，3 7 。c ，2 0 0 r p m 培养过夜。 ( 2 ) 取2 m l 培养液转入5 0 m l 预热的l b 液体培养基，再继续培养至o d 6 0 0 为0 3 0 6 。 ( 3 ) 在无菌条件下将菌液转移至无菌的的用冰预冷的1 0 m l 离心管中，