DNA的重组与鉴定ppt课件

实验九DNA的重组与鉴定,1,一.实验目的,通过本实验学会重组DNA的原理与方法。,2,基因重组：不同的DNA分子间发生共价连接形成重组DNA分子。,3,二、实验原理,外源DNA片段和线状质粒载体的连接，也就是在双链DNA5磷酸和相邻的3羟基之间形成的新的共价键，如质粒载体的两条链都带有5磷酸，可生成4个新的磷酸二酯键，但如果质粒DNA已经去磷酸化，则只能行成2个新的磷酸二脂键，在这种情况下产生的杂交体分子带有2个单链切口，当杂交体分子导入感受态细胞后可被修复。,4,实验原理,相邻的5磷酸和3羟基间磷酸二酯键的形成可在体外由两种不同的DNA连接酶催化，这两种酶就是大肠杆菌DNA连接酶和T4噬菌体DNA连接酶。,5,重组DNA技术基本原理：切、接、转、筛,6,7,限制性内切酶酶切,切,酶切,8,9,磷酸二酯键的形成,DNA连接酶,DNA连接酶,DNA连接酶,目的基因与载体的连接,接,10,T4-DNA连接酶：T4-噬菌体连接温度：不高于粘性末端熔点温度（Tm）15：15/6h；12/8h；8/12h；,11,连接方式：相同粘性末端的连接平头末端的连接不同粘性末端的连接人工粘性末端的连接,12,粘端连接,CCGGCCGG,GGCCGGCC,CGGC,CGGC,CGGC,CGGC,CCGG,GGCC,Hap,T4-DNA连接酶,13,平端连接,AGCT,TCGA,Alu,DNA连接酶,AGCTAGCT,TCGATCGA,14,重组体的转化,受体细胞,转,15,JM109感受态,含氨苄平板,Am,重组质粒,感受态,16,原核细胞的转化（细菌转化）,1)受体细胞的选择,限制缺陷型:避免修饰和降解重组缺陷型：避免重组整合转化亲和型：较高的可转化性遗传互补型：利于筛选感染缺陷型：防止感染,17,2）转化方法,CaCl2诱导转化电穿孔PEG介导转化人工体外包装,特殊处理,受体细胞,细胞膜特性改变,18,CaCl2处理,受体细菌,50-100mmol/L,CaCl2,感受态细菌,重组体转入细菌,19,重组体克隆的筛选与鉴定,筛,宿主细胞,20,转化后的克隆群体：,21,1.遗传检测法,1）抗药性标志的选择,pBR322,Amp,Tet,插入片段,Amp平板,Tet平板,22,2）标志补救（-半乳糖苷酶法）,23,24,（LacZ基因N端序列）,插入片段,（LacZ基因失活）,LacZ基因N端序列,LacZ酶,25,2电泳检测法,凝胶电泳检测,加样孔,DNAMarker,空质粒,重组质粒,重组质粒酶切,重组质粒的PCR扩增片段,26,原位杂交,3菌落杂交筛选法,27,三、实验仪器,28,超净工作台,29,台式高速冷冻离心机,30,恒温空气摇床,31,恒温培养箱,培养皿,32,恒温水浴锅,33,四、材料及试剂,E.coliDH5pUC19orT载体DNA,34,四、材料及试剂,1.T4DNA连接酶210T4DNA连接酶缓冲液:400mmol/LTris-ClpH7.5100mmol/LMgCl2100mmol/LDTT,500g/mlBSA5-10mmol/LATP,35,试剂,灭菌去离子水,Kac(3mol/L，pH5.2)Xgal(20mg/ml)IPTG(200mg/ml),36,五、实验步骤,1.混合以下溶液于一个无菌离心管中xlpUC19质粒(0.1-4g)2l10酶切缓冲液15U限制性内切酶（EcoRI）yl去离子水终体积为20l2.在推荐温度下育温1小时（一般为37）加入5l电泳缓冲液终止反应，电泳检测结果。,酶切,37,实验步骤,1混合以下试剂PCRDNA6lpUC19酶切回收DNA1.0l5T4DNA连接酶缓冲液2.0lT4DNA连接酶(10u/l)1l10l混合液于16培养12小时,连接,