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两种纳米体系的构建与抑菌性能初探 两种纳米体系的构建与抑菌性能初探 摘要 本论文以壳聚糖为基础，制备了两种壳聚糖衍生复合物一油酰季铵盐壳聚糖 ( q c s ) 和油酸壳寡糖( o a o c s ) ，研究了两种复合物在水溶液中的白组装行 为并对纳米球性质进行了检测，以革兰氏阴性大肠杆菌( 西c 向p ，f 幽砌c d ，f ) 和革 兰氏阳性金黄色葡萄球菌( & 印矗) ，f d c d 淞口“比“s ) 为实验菌种，对两种壳聚糖 衍生物纳米体系的抑菌性能进行了测定。 将壳聚糖进行酸降解得到分子量为5 2 k d a ，脱乙酰度为8 7 4 5 的小分子量壳 聚糖。然后将其进行修饰制备得到不同取代度的油酰季铵盐壳聚糖。f t i r 检测 证实了修饰的成功。同时水溶性实验证明，油酰季铵盐壳聚糖具有良好的溶解性 且随p h 的变化溶解性变化不大。通过乳化均质法制备q c s 纳米球，利用荧光 探针检测了纳米球自聚集性质，发现q c s 纳米球的临界聚集浓度( c a c ) 随着 取代度的增加而降低，三种不同取代度样品的c a c 值分别是o 0 6 1 6 m g m l 、 0 0 4 3 6 m g m l 和0 0 3 2 3 m 幽：i l l 。利用动态激光散射和透射电子显微镜技术对纳米球 的形态进行表征，所制备的纳米球呈圆形，形态完整。纳米球的大小随取代度增 加而减小，因为其在高取代度溶液中能够形成更加紧密的疏水内核。三种取代度 的平均粒径分别是3 0 3 m ，2 6 4 m 和2 0 5 n m 。实验结果证明所制备得到的q c s 纳 米球的稳定性较好。 采用乙酰丙酮法测得壳寡糖样品的分子量为3 7 k d a 。利用碳二亚胺( e d c ) 作为交联剂，将长链油酸( o l e i ca c i d ，o a ) 与壳寡糖( c h i t o s a i lo l i g o s a c c h a r i d e ，o c s ) 共价结合得到油酸壳寡糖复合物，改变油酸与壳寡糖的反应摩尔比制成三种不同 取代度的样品。利用红外光谱检测对复合物进行结构确证，利用电位滴定法测定 了复合物的氨基取代度，分别为6 0 、1 1 1 和2 1 3 。该复合物具有两亲性， 在水性介质中自发形成以疏水链为内核、亲水链为外壳的纳米球。通过超声破碎 法制备o a o c s 纳米球溶液，芘荧光法测定了复合物的临界聚集浓度，三个不 同取代度样品c a c 值分别是0 0 5 6 m g m i 、0 0 3 8 m g m l 和o 0 2 8 m g m l 。用动态激 光散射和透射电镜技术检测o a o c s 纳米球的成球性质。实验结果显示纳米球 两种纳米体系的构建与抑菌性能初探 分布均匀，表面光滑呈圆形，当纳米球的浓度为1 m g i i l l 时，数均粒径小于l o o l l i i l ， 且随着氨基取代度的增大而减小。 抑菌实验研究了两种纳米体系对e c d ，f 和s 缈p 螂生长的抑制作用。采用 普通的浊度法进行测定。q c s 纳米体系和o a o c s 纳米体系对e c d ，f 和 s 日”r p 淞的生长均具有抑制作用。而q c s 纳米球中由于季铵盐的存在，其抑菌 活性普遍高于o a o c s 纳米球。结果显示q c s 纳米球对e f f 和s 口缈p 螂的 最低抑菌浓度分别为3 1 2 5 m l 和6 2 5 m l ，o a o c s 纳米球对e ，f 和口“陀螂 的最低抑菌浓度分别为1 2 5 m 1 和2 5 0 m l ，并且随着纳米球溶液浓度的提高，抑 菌活性是逐渐增强的。不同取代度条件下，q c s 纳米球和o a o c s 纳米球对 e 厅的抑制作用随取代度的增大而增强，而其对口舭螂几乎没有影响，这 主要是由于两种菌体结构上的不同引起的。同时，随着p h 的增加，q c s 纳米球 对e c d 疗和口“比淞的抑制效果逐渐增强，而o a o c s 纳米球对e c d ，f 和 s 口w p 淞的抑制作用在中性条件下最强。 关键词：壳聚糖；壳寡糖；纳米球；抑菌作用 i i 两种纳米体系的构建与抑菌性能初探 p r e d a r a t i o n so ft w on a n o d a n i c a ls y s t e m sa n dr e s e a c h e sr r e d a r a n o n s0 lt w 0n a n 0 d a r t l c a is y s t e m sa n di e s e a c n e s o nt h e i ra n t i b a c t e r i a la c t i 啊t i e s a b s t r a c t t w oc 1 1 i t o s a nd e d v a t i v e s o l e o y l q u a t e m i z e dc h i t o s a n ( q c s ) a i l do l e i ca c i d g r a r e d c l l i t o s a n0 1 i g o s a c c h a r i d e ( o a o c s ) a r es y n t h e s i z e d n l e i r 咖c t i 鹏sa r e c h a r a c t e r i z e db yf t i r a n d 恤s e l f - a u s s e m b l e d b e h a v i o ro fm ec o p o l 皿e r si nw a t e r s o l u t i o ni si n v e s t i g a t e d t w on a n o p a r t i c l es y s t e m sa r ep r e p a r e da 1 1 dt h ec h a r a c t e r i s t i c s a r ee v a l u a t e d g r a 加- n e g a t i v e 上弧c 办p r 纪，z 砌厅a n dg f 锄- p o s i t i v e 脚砂肠c d c c 淞 口甜彤珊a r ec h o s e na sm o d e l st 0e s t i m a t et h ea i l t i b a c t e r i a la c t i v i t i e so ft h en a j l o p a n i c l e s 锄p l e s c l l i t o s a i l ( m 、= 5 2 k d 如d d = 8 7 4 5 ) i sd e g r a d e d 晰t hh c lf i r s t a n dq c s c o p 0 1 y m e r sw i t hd i 虢r e n td e 舀e e so f 锄i n os u b s t i t u t i o n ( d s ) a r es y n t h e s i z e d 1 1 1 e s u c c e s s 如1m o d i f l c a t i o ni sc o n f i m e db yt l l er e s u l t so ff t i r q c se x h i b i t eg o o d s o l u b i l i t ) ri na q u e o u ss o l u t i o n s t h es o l u b i l i 够o fq c sh a sn oc h a n g ea st h ei n c r e a l s e o fp hv 2 l l u e q c sn a n o p a n i c l e sa r eo b t a i n e db yu s i n ga i le m u l s i f i c a t i o nm e t h o da 1 1 d m es e l f - a s s e m b l i n gp r o p e n i e sa r ea n a l y z e db yu s i n gt l l en u o r e s c e n c ep r o b et e s t w i t l l m ei n c r e a s i n go fd s ，m ec r i t i c a l a g 铲e g a t i o nc o n c e i l 仃a t i o n ( c a c ) o fq c s n a n o p a r t i c l e sd e c r e a s e 雅dt h ec a cd e t e 衄i n e df o rq c sc o p o l y m e r sw i t hd i 旋r e n t d sa r eo 0 6 16 m g m l ，o 0 4 3 6 m g m la i l d0 0 3 2 3 m g m lr e s p e c t i v e l y t h ef o 姗a t i o no f q c sn a i l o p a n i c l e sa r ec h a r a c t e r i z e db yt r a l l s m i s s i o ne l e c 们nm i c r o s c o p y ( t e m ) a n d d y n 锄i cl a s e r1 i 出s c a n e m g t 1 1 ep a n i c l es i z ed e c r e a s e sa sd si n c r e a s e da 1 1 dt h e m e a i ld i 锄e t e r so fq c sn a i l o p a n i c l e s 谢t l ld i 仃e r e md sa r e3 0 3 1 1 i i l ，2 6 4 啪a i l d 2 0 5 m n ，r e s p e c t i v e l y t h et e mo b s e a t i o nd e m o n s t r a t e t 1 1 e s p h e r i c a ls h a p eo f s e l f _ a g 伊e g a t e sw i t hai n t e g r a t e df o m w eg e tt h em o l e c u l a rw e i g h to fc h i t o s a no l i g o s a c c h 撕d e ( o c s ，3 7k d a ) b y a c e t y l - a c c i t o n em e t h o d 1 1 1 eo l e i ca c i di s 伊a t f e dt oap o n i o no ft h e 锄i n o e so fc s o b y1 e t h y l - 3 - ( 3 - d i m e t h y l 锄i n o p r o p y l ) c a r b o d i i m i d e ( e d c )m e d i a t e d r e a c t i o n i i i 两种纳米体系的构建与抑菌性能初探 v 撕o u sq c sc o p o l y m e r sw i t hd i f f e r e n td sa r ep r e p 2 l r e db yc h a n g i n gt h ef r e em o l e r a t i o so fo l e i ca c i dt oo c sa i l dm ed si sd e t e 珊i n e db yat i t r a t i o nm e t h o d t 1 1 e s t m c t u r eo fo a - o c sc o p o l y m e r si si d e n t i f i e d b yf t i r t h e 锄p h i p h i l i cc o p o l y m e r s i sf o u n dt ob ef o 胁m i c e l l e ss p o n t a n e o u s l yb ys e l f ：a s s e m b l e di na q u e o u ss o l u t i o n t h es e l f 二a s s e m b l e do a - o c sn a n o p a r t i c l e ss o l u t i o ni so b t a i n e db ys o n i c a t i o n b ya n u o r o m e t 巧i nt h ep r e s e n c eo fp y r e n ea san u o r e s c e n tp r o b e ，t h ec a c i sm e a s u r e d t h ec a cd e t e n n i n e df o ro a o c sc o p o l y m e r sw i t hd s6 o 、1 1 1 a n d2 1 3 a r e 0 0 5 6 m g m l ，o 0 3 8 m m la r l d0 0 2 8 m g l t l lr e s p e c t i v e l y t h ep r o p e r t i e so fo a o c s n a l l o p a j t i c l e sa r ea u l a l y z e du s i n gt l l et e ma n dd y n 锄i c1 a s e r1 i g h ts c a n e 血g t h e n a n o p a r t i c l e sa r es p h e r i c a ls h a p e ，a i l da t 1m m lo fc o p o l y m e rc o n c e n t r a t i o n ，t l l e p a r t i c l es i z eo fm i c e l l e si s1 e s s t h a nl0 0n mo fn u m b e ra v e r a g eh y d r o d y n 锄i c d i 锄e t e r n ea n t i b a c t e r i a la c t i v i t i e so fn a i l o p a n i c l e sa g a i n s te ，f 锄ds 口“比淞a r e m e a s u r e d t h en a i l o p 抓i c l e ss h o wi i l l l i b i t o 巧e 僚c ta g a i n s te 以a i l ds 口”彤硼 b e c a u s eo f 恤q 嘣e m i z e d ，t h e 趾t i b a c t e r i a la c t i v i t i e so fq c sn 觚o p a n i c l e sa r e h i g h e rt h a no a - o c sn a n o p a n i c l e s t h em i n i m u mi n l l i b i t o 巧c o n c e n t r a t i o n s ( m i c ) o f q c sa n do a - o c sn 觚o p a n i c l es 锄p l e sa r e6 2 5m 朗a n d2 5 0m la g a i n s t 口缈p 淞 r e s p e c t i v e l y ，a i l dt h em i co f t h es 锄p l e sa r e3 1 2 5m la i l d 1 2 5m 酊a g a i n s te 疗 r e s p e c t i v e l y t h ea n t i b a c t 甜a la c t i v i t i e si n c r e a s e 弱t h ec o n c e n t r a t i o no fn a n o p a r t i c l e s 锄p l e si n c r e a s e d n om a r k e dd i f f 色r e n c ei sf o u n d 锄o n 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授权学校可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用 影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同时授权中国科学技术信息 研究所将本学位论文收录到中国学位论文全文数据库，并通过网络向社会公 众提供信息服务。( 保密的学位论文在解密后适用本授权书) 学位论文作者签名： 签字日期：汐节年岁月夕日 导师签字： 签字嗍叫年s 月岁日 两种纳米体系的构建与抑菌性能初探 o 前言 o 1 纳米生物技术概况 纳米粒子是指直径在1 1 0 0 m 之间的粒子，它的直径近于电子的德布罗意波 长，属于物质由宏观世界向微观世界的过渡区域，即介观领域。用于生物学领域 的聚合物纳米粒子大小通常在1 1 0 0 0 m n 范围内。 纳米粒子结构的特殊性导致它具有传统材料不具备的特征( 张志琨，2 0 0 0 ) ， 即四大效应： ( 1 ) 小尺寸效应( 又称体积效应) 由于颗粒尺寸变小而引起的宏观物理性质的变化称为小尺寸效应。当超细微 粒的尺寸与光波波长、德布罗意波长，以及超导态的相干长度或透射深度等物理 特征尺寸相当或更小时，晶体周期性的边界条件将被破坏，非晶态纳米微粒的颗 粒表面层附近原子密度减小，导致声、光、电磁、热力学等特性呈现新的小尺寸 效应。 ( 2 ) 表面与界面效应 纳米微粒的表面积很大，在表面的原子数目所占比例很高，大大增加了纳米 粒子的表面活性。表面粒子的活性不但引起微粒表面原子输运和构型的变化，同 时也引起表面电子自旋构象和电子能谱的变化。 ( 3 ) 量子尺寸效应 当粒子尺寸降低到某一值时，费米能级附近的电子能级由准连续能级变为分 立的能级，能级间的间距随颗粒尺寸减小而增大。当能级间距大于热能、磁能、 静磁能、静电能、光子能量或超导态的凝聚能时，就会呈现出一系列与宏观物体 截然不同的反常特性，这种现象称为量子尺寸效应。 ( 4 ) 宏观量子隧道效应 微观粒子具有贯穿势垒的能力，称为隧道效应。 纳米科学与技术，有时简称为纳米技术( n a l l o t e c h n o l o g y ) ，是研究结构尺 寸在1 至1 0 0 纳米范围内材料的性质和应用。它是具有前沿性和交叉性的新型学科 领域，从8 0 年代末9 0 年代初逐渐发展起来。纳米科学与科技在纳米尺度上研究包 两种纳米体系的构建与抑菌性能初探 括原子、分子等物质在内的特性和相互作用，还研究利用这些特性形成的多学科 交叉的科学与技术，是研究电子、原子和分子内的运动规律和特性的一项崭新技 术。科学家们在研究物质构成的过程中，发现在纳米尺度下隔离出来的几个、几 十个可数原子或分子，显著地表现出许多新的特性，而利用这些特性制造具有特 定功能设备的技术，就称为纳米技术。当物质到纳米尺度以后，物质的性能就会 发生突变，出现特殊性能。纳米技术是一门交叉性很强的综合学科，研究的内容 涉及现代科技的广阔领域。纳米科学与技术主要包括：纳米体系物理学、纳米化 学、纳米材料学、纳米生物学、纳米电子学、纳米加工学、纳米力学等。 纳米生物技术是从纳米技术衍生出来的新兴学科，是纳米技术与生物技术相 结合的产物，纳米尺度的细胞器、生物大分子等的结构、功能以及生物反应机理 等是纳米生物学的主要研究对象。纳米生物技术与纳米医药是有密切联系的，前 者是后者的基础。纳米生物技术不仅可以应用于生物医学，而且还可以应用于食 品科学、化学、材料科学、电子学和其他社会需求。纳米生物技术己经被许多发 达国家作为科研优先项目给予重点发展。与发达国家相比，我国纳米生物技术的 发展起步较晚，但在“九五”期间的“8 6 3 计划”中制定了国家纳米振兴计划，后又 在“十五”期间的“8 6 3 计划”中把纳米生物技术列为专题项目给予了优先支持发 展。相信在不久的将来，纳米生物技术将对医药技术、信息技术、电子技术、环 境科学及能源科学等的发展起到大大的推动作用，并将对人类的生活产生极大的 影响。 o 2 壳聚糖的应用与纳米球制备方法研究 壳聚糖( c h i t o s a l l ) ，又称壳多糖、甲壳糖、氨基多糖、甲壳多聚糖、几丁聚 糖、脱乙酰甲壳素等，是重要的一类天然生物降解高分子材料，它是由甲壳素在 强碱条件下脱乙酰基后形成的一种重要的衍生物，属含氨基的均态直链多糖，化 学名称为p ( 1 ，4 ) 2 胺基2 脱氧d 葡萄糖( 蒋挺大，19 9 5 ) 。壳聚糖是所有天然多 糖中唯一具有碱性的多糖，同时也是少数具有荷电性的天然产物之一，它具有许 多独特的物理、化学性质和生物功能( m u z z a r e l l i ，1 9 7 7 ；r o b e r t s ，1 9 9 2 ) 。自2 0 世 纪8 0 年代以来，国外形成了甲壳素、壳聚搪等多糖类生物医用材料的开发研究热 潮。进入2 0 世纪9 0 年代，我国对甲壳素、壳聚糖资源的开发研究也越来越重视。 2 两种纳米体系的构建与抑菌性能初探 壳聚糖是白色或淡黄色的片状固体，是甲壳素的脱乙酰基产物，它来源丰富， 制备方法简单。从全世界的年产量来看，甲壳素是仅次于纤维素的最丰富的天然 聚合物，主要存在于蟹、虾等的甲壳中。甲壳素在虾、蟹的壳中与蛋白共价结合， 以蛋白聚糖的形式存在，同时伴生着碳酸钙。所以甲壳素的制备方法虽多，但是 都非常相近，脱蛋白和脱钙是主要的提取方法。而碱脱乙酰法是由甲壳素制备生 产壳聚糖的主要方法，其结构式如下图所示： i c 。o i c l l 3 甲壳素壳聚糖 壳聚糖具有低毒性、无刺激性、无免疫原性、无热源反应、无致突变性、不 溶血及可自然降解、良好的组织相容性、良好的缓释和控释作用等特点( k u m 鸥 2 0 0 0 ；s h i g e m a s a ，1 9 9 4 ；h w a i l g ，2 0 0 0 ；e u g e n e & l e e ，2 0 0 3 ) ，因此使其成为全世界 研究的热点。另外，壳聚糖分子中含有的羟基和氨基比较活泼，很容易进行化学 修饰，修饰后形成的壳聚糖衍生物，能够改善壳聚糖不溶于水的性质，使其得到 更广泛的应用。壳聚糖衍生化的反应为增强材料的生物活性与改善机械性能提供 了新的方法和途径，继而可制成各种类型的膜、凝胶、纳米球、聚电解质复合物 等材料。另外，通过在壳聚糖侧链引入功能基团，继而破坏晶区结构，增加非晶 区比例，这样不但可以改变壳聚糖的溶解性，而且可以改变其物理和化学性质。 在壳聚糖的伯胺基、伯羟基或者仲羟基上进行各种化学反应，如醚化、酯化、氧 化、磺化以及接枝共聚等反应对壳聚糖进行改性。为了提高壳聚糖的水溶性，其 衍生物制备方法主要有三种：控制甲壳素的脱乙酰化条件和脱乙酰度，可得到较 高分子量的水溶性壳聚糖；在壳聚糖分子的主链上引入亲水性基团或进行接枝， 可以得到不同结构的水溶性壳聚糖；壳聚糖在适当的条件下解聚而得到低分子量 的水溶性壳聚糖。 两种纳米体系的构建与抑菌性能初探 o 2 1 壳聚糖的应用 o 2 1 1 在医药卫生方面的应用 壳聚糖及其衍生物由于其生物降解性、低毒性、抑菌性，可以被溶菌酶和甲 壳素酶等许多酶水解，所以在医药领域具有很大的应用潜力。壳聚糖具有很好的 止血作用并能够促进伤口愈合，可以用于制造人工皮肤和愈合伤口，可以作为多 种形式的止血剂和伤口愈合剂，如液体、粉末制剂或海绵、无纺布、普通肠线等 多种再生形用品等。经溶解吸收后，壳聚糖具有较强的吸附性能，能够捕捉到存 在于人体内的自由基并与之结合，消除或减弱其毒性，可以起到延缓衰老的作用， 并且能保证放化疗的正常进行。壳聚糖可以维持血糖代谢的平衡，起到降糖的作 用，可调节血压，降低血脂，妨碍胆固醇在体内吸收，强化肝脏机能。壳聚糖能 增加肠道内有益菌群、抑制有害菌的生长，对神经、内分泌系统也能起调节作用， 还可以治疗烧伤、烫伤，并可作为药物缓释载体等。壳聚糖具有良好的亲和性和 组织相容性，不会产生排斥反应，可以将其用于制作各种手术材料，如人工血管、 手术缝合线、隐形眼镜等。使用壳聚糖制作的手术缝合线广泛用于气管手术，以 及一般外科手术，它的可操纵性强，能加速伤口愈合，并能被组织降解吸收，拥 有其它材料所无法比拟的优点。 j a m e e l a 等( j a m e e l a ，1 9 9 5 ) 将壳聚糖制成人造皮肤，发现这种材料具有很好的 亲和性，能够与创伤面紧实的结合，柔软度合适，还可以吸收从伤口渗出的体液， 对伤口疼痛也有缓解作用。壳聚糖是一种性能很好的体内植入性材料，这得益于 它的低毒性、良好的生物相容性和可被溶菌酶降解等优点。 c a r l o s 等( c a r l o s ，1 9 9 9 ) 用分子量3 万8 万，脱乙酰度7 2 的纤维状壳聚糖对小 犬的伤口进行处理，伤口的愈合情况用免疫组织学来评价，结果显示：与未用壳 聚糖处理的对照体相比，用壳聚糖处理过的伤口，在发炎和新组织形成两个愈合 早期的阶段，壳聚糖对它们都具有非常好的促进作用。实验表明壳聚糖有利于发 炎细胞的除去和成纤维细胞的增殖，能够加速伤口的清洁，并且促进t ) r p e 3 胶原 的生长。由于壳聚糖及其衍生物具有可生物降解性、独特的抑菌性、对伤口愈合 的促进作用和能够为细胞生长提供养分等优点，使它们作为伤口愈合材料的应用 前景更加广阔( j i a i l ，1 9 9 9 ) 。 0 2 1 2 在组织工程学方面的应用 4 两种纳米体系的构建与抑菌性能初探 组织工程学于1 9 8 7 年由美国国家科学基金委员会正式提出和确定，是应用工 程学、生物材料和细胞生物学的原理，研究开发用于改善或修复人体病损组织或 器官的结构、功能的生物活性替代物的一门科学。其目标是在体外构建出一个具 有生物活性的种植体，将其植入体内修复组织缺损，替代器官功能；或者作为一 种体外的装置暂时替代器官功能，以此达到提高生存质量，延长生命活动的目的。 它具有十分重要的科学意义，不仅为解除和减轻病人痛苦提供了一种新的治疗方 法，而且更重要的是提出了复制组织、器官的新思想，这标志着“生物科技人体 时代”的到来，是一场具有深远意义的医学革命。壳聚糖拥有无毒、生物相容性 好、易生物降解等优点，可以作为骨组织和皮肤组织的骨架材料。利用壳聚糖的 降解性质，将一种骨生长因子b m p s 与壳聚糖衍生物作用形成杂化材料，从壳聚 糖中释放出的b m p s 能够促进缺损的骨组织再生( m 唧e l l i ，1 9 7 7 ) 。由于壳聚糖 结构中含有与激发软骨细胞再生的糖胺聚糖和胶原结构相似的氨基葡萄糖单元， 因此也可以作为软骨组织细胞附着的骨架材料。将壳聚糖与4 硫酸软骨素结合制 备出水凝胶骨架材料，以聚苯乙烯骨架为参照体作用于软骨细胞，扫描电镜观察 显示壳聚糖骨架材料与软骨细胞表面发生了一种特殊的相互作用。实验结果发现 含壳聚糖骨架材料主要形成i i 型胶原，且软骨细胞形态正常，呈球形或聚多边形， 而参照体骨架材料主要形成i 型胶原，软骨细胞形态异常呈纤维状( s u l l ，2 0 0 0 ) 。 o 2 1 3 在食品工业中的应用 壳聚糖作为自然界中唯一的碱性多糖，具有无毒副作用、生物活性高、可生 物降解和抑菌性好等优点，被广泛应用于食品工业中。以壳聚糖为主要原料可生 产多种具有保健功能的食品，如减肥功能食品、调节肠道微生物群功能食品等， 这些食品能够活化细胞、提高机体的免疫力，不仅能促进肠道内有益菌的生长， 还能抑制有害菌的生成。另外，壳聚糖还被用作食品添加剂、防腐剂、饲料添加 剂等。在日本，壳聚糖作为保鲜防腐剂被用于酱油、面条、豆腐等食品中，也可 以直接加入动物饲料和药品等产品中。在加拿大，羧甲基壳聚糖作为涂膜保鲜剂 被用于鸡蛋和水果中。在欧洲，壳聚糖被允许应用于化妆品以及食品加工过程中。 韩国于1 9 9 6 年批准壳聚糖作为功能性保健食品。在我国，卫生部已于1 9 9 7 年批准 壳聚糖成为功能性保健食品。近年来，我国壳聚糖市场的需求不断加大，相信在 不久的将来，随着人们对壳聚糖研究的不断深入，其在许多功能性保健食品方面 两种纳米体系的构建与抑菌性能初探 的应用将得到更大的发展。 o 2 1 4 在化工工业中的应用 壳聚糖分子的独特结构，使其具有许多特殊的功能，其分子中较多的羟基、 氨基和乙酰氨基使壳聚糖拥有比较特殊的吸附性能。壳聚糖可以作为吸附剂和絮 凝剂应用于水处理中。相比常规的有机或无机絮凝剂，壳聚糖具有安全、无毒、 廉价、无二次污染等优点，另外其可生物降解性也为其在水处理中的应用提供了 广阔的前景。据报道，美国已使用甲克素处理城市废水，并且美国国家环保局已 经批准使用壳聚糖进行饮用水的净化。日本也将工业甲克素用于处理各种工业废 水。我国对于壳聚糖及其衍生物用于处理饮用水和工业废水的研究也越来越广 泛。壳聚糖对淀粉和蛋白质等有机物的絮凝效果很好，可以将食品加工过程产生 的废水中的淀粉和蛋白质进行回收，用作饲料。j o h n s o n 等( j o h n s o n ，1 9 9 5 ) 使用壳 聚糖对虾、蟹和鲑鱼加工过程中产生的废水进行处理，经过旋流、絮凝和脱水等 过程，对总固态物的去除率达到接近1 0 0 。 由于壳聚糖具有良好的吸湿性、保湿性、成膜性、防静电和防尘性，并且对 皮肤无刺激作用( s i l l l ，2 0 0 0 ) ，因此可用于各种香波、护发素及护肤产品中，使其 在化妆品工业上也具有非常广泛的用途。壳聚糖对头发和皮肤具有良好的亲合 性，作用后能形成透明的保护层，对头发和皮肤起到保湿作用。将壳聚糖与其它 高分子物质进行复合反应，生产得到的面膜接触感柔和，与皮肤的亲和性显著增 加( 张文清，1 9 9 9 ) 。当前，许多国外化妆品牌的产品都已经对壳聚糖大量使用， 如日本的资生堂、西德等公司的壳聚糖化妆品都已经上市。日本每年用于化妆工 业的壳聚糖衍生物就有约1 0 0 吨。我国在这方面的发展尽管落后了一些，但近几 年也有一些相关的产品相继面市，如中国海洋大学研制的海洋丽姿系列产品等。 0 2 2 壳聚糖纳米球的制备方法 有关壳聚糖纳米球的制备技术有很多，常见的有离子诱导法、共价交联法、 大分子复合法、纳米沉淀法、自组装法等。 0 2 2 1 离子诱导法 这种制备壳聚糖纳米球的方法是目前研究中使用最为普遍的，也是报道最多 的种典型制备方法。由于壳聚糖分子中存在大量的阳离子，使其可以与多聚阴 6 两种纳米体系的构建与抑茵性能初探 离子化合物产生凝胶反应，进而形成纳米大小的颗粒。实验中常使用无毒副作用 的三聚磷酸钠( t p p ) 作为离子交联剂，诱导壳聚糖发生离子凝胶化。当壳聚糖与 t p p 相接触，他们分子中的n h 3 + 基团和p o 。n a + 结构产生相互作用，壳聚糖分子中 带正电荷的质子化氨基和t p p 分子中带负电荷的磷酸根离子发生分子内或分子 间的交联形成纳米球。这种方法制备得到的壳聚糖纳米球具有稳定性好、反应条 件温和、载药量大等优点。 c a l v o 等( c a l v o ，19 9 8 ) 首次报道利用离子诱导法制备壳聚糖纳米球。利用离 子间凝胶化过程，将分别含有t p p 和壳聚糖聚氧乙烯聚氧丙烯共聚物( p e 0 p p o ) 的水相相混合，使其自发形成纳米球。制备的整个过程操作简便，在室温下进行， 并且不包含任何有机试剂。s h u 等( s h u ，2 0 0 2 ) 分别利用t p p 、硫酸盐、柠檬酸盐作 为离子交联剂，应用同样的原理制备出不同性质的壳聚糖纳米球。结果发现与 t p p 交联相比，硫酸盐和柠檬酸盐交联制备的壳聚糖纳米球表面更加光滑，形态 更完整。a n g e l a 等( a n g e l a ，2 0 0 1 ) 用壳聚糖包载环孢素a ( c y a ) 制备纳米球，实验 得到的纳米球粒径为2 9 3m ，壳聚糖对c y a 的包封率为7 3 o ，而载药量达到 9 o 。结果显示，这种纳米球对于外眼球疾病的治疗具有非常显著的靶向作用。 并且利用该法得到的壳聚糖纳米球对药物的包封率较高，这是由于壳聚糖带的正 电荷与大分子药物带的负电荷之间产生了静电作用。 对于装载了基因的壳聚糖纳米球，其制备过程的各个工艺条件对基因的转染 率具有很大的影响( q u a l l ，2 0 0 5 ) ，实验中通过对壳聚糖的分子量、浓度、t p p 的使 用量和溶液的p h 值进行严格控制，最终达到了实验预期的转染效果。一般而 言，控制壳聚糖与t p p 的质量比在3 1 6 1 之间，壳聚糖就可以迅速的生成纳米球， 并且得到的纳米球产量高、结构稳定。通过调节它们之间的不同比例，可以得到 不同性质的纳米球。 综上所述，利用离子诱导法制备的壳聚糖纳米球，制备过程中条件温和，不 会对包载的药物产生破坏，并可保持药物活性，因此对包载疫苗、基因、多肽等 大分子药物特别合适。这种方法制备工艺简单、条件可控性高，可以根据需要调 整反应条件制备所需类型的纳米球。 0 2 2 2 共价交联法 在壳聚糖纳米球的制备方法中，此法是最早使用的一种方法。由于壳聚糖分 7 两种纳米体系的构建与抑菌性能初探 子链上含有较多的羟基和氨基，使其可以与一些化学交联剂发生反应，进而制备 出纳米球。例如壳聚糖中的氨基可以和交联剂中的醛羰基发生亲核加成反应制备 得到希夫碱。利用壳聚糖的这种特征，在一定条件下可以制备出壳聚糖载药纳米 球。对壳聚糖分子结构上的氨基使用戊二醛进行交联，制备包载5 氟尿嘧啶抗肿 瘤药物的壳聚糖纳米球( o h y a ，1 9 9 4 ) 。制备过程是先制备得到含有壳聚糖和药物 的w o 型乳剂，将戊二醛加入其中进行交联反应，最终制得固定药物纳米球。结 果显示，实验制备的纳米球平均粒径大约为8 0 0 衄。纳米球对药物的缓释作用较 好，释放周期较长。 用表面活性剂二( 2 乙基己基) 硫代丁二酸和正己烷反应形成反相胶束，然后 使用戊二醛等溶液交联制备得到载药的壳聚糖纳米球( t a n i m a 2 0 0 2 ) 。制备得到 的纳米球利用透射电镜观察形态完整，随着交联度的增加，纳米球自聚集更容易 发生。通过冻干技术可制备得到纳米球粉末，再次溶解后形态没有发生变化。反 应中所发生的共价交联可以从红外光谱实验得到证实。另外，结果显示纳米球的 粒径会随着复合物交联度的增大而增大。z h i 等( z h i ，2 0 0 5 ) 利用相同的原理采用表 面活性剂t r i t o nx 1 0 0 与正己醇发生反应，分别以环己烷和壳聚糖的稀醋酸溶液 为油相和水相，制备得到w o 型乳剂，然后使用戊二醛进行交联固化最终得到平 均粒径仅为2 2 i m 的纳米球颗粒，这种制备方法能够显著提高壳聚糖纳米球的吸 附性能。 利用固化交联剂戊二醛制备得到的纳米球颗粒形态完整、大小均匀、粒径较 小、稳定性好。但是所采用的化学交联法制备过程较为复杂，反应条件不容易控 制，并且在制备过程中需要使用大量的有机溶剂和表面活性剂等，它们对于细胞 具有一定的毒性。而且使用的固化交联剂常常不利于某些大分子药物的完整释放 ( 郝英魁& 杨学东，2 0 0 5 ) 。所以，利用该法制备得到的壳聚糖纳米球有一定的应用 局限性。 o 2 2 3 沉淀析出法 沉淀析出法又称去溶剂化法，是由微囊化技术发展而来的，它属于微囊制备 中的单凝聚法。利用搅拌和超声波分散技术，将壳聚糖的水溶液和强亲水性的凝 聚剂进行混合，由于凝聚剂的强吸水性使壳聚糖的溶解度降低，导致分子之间形 成氢键，最终壳聚糖以纳米球形式从溶液中析出。以硫酸钠为凝聚沉淀剂制备壳 8 两种纳米体系的构建与抑菌性能初探 聚糖纳米球，首先把壳聚糖溶解，然后在搅拌条件下滴加硫酸钠，经过超声离心 后得到平均粒径大约为9 0 0 1 1 i t l 的壳聚糖纳米球。这种纳米球表面带有正电荷，可 以作为缓释剂吸附带有负电荷的药物( b e 劬o l d ，1 9 9 6 ) 。后来这一方法被进行了改 进，用戊二醛继续对制备得到的纳米球进行固化交联，制备出了粒径较小的壳聚 糖纳米球( t i a n ，1 9 9 9 ) 。另外，乳化溶剂扩散作用是去溶剂化法的另一种途径。 在实验过程中，以壳聚糖溶液作为水相，以亲水性和疏水性的有机溶剂作为油相， 在卵磷脂等乳化剂的作用下，溶液中析出包载了药物的纳米级壳聚糖 ( e i - s h a l l o u r i ，2 0 0 2 ) 。 利用沉淀析出法制备纳米球的工艺简单，但是制备的壳聚糖纳米球稳定性不 高，粒径也普遍偏大。为了提高纳米球的稳定性，对所制备得到的纳米球通常再 用戊二醛进行固化，药物常被固化在粒子表面。因此，与早期的共价交联法相似， 戊二醛对纳米球的应用产生了局限。 0 2 2 4 大分子复合法 利用静电作用使含有氨基阳离子的壳聚糖和含有阴离子的大分子聚合物产 生复合反应，以此制备得到载药的壳聚糖纳米球。实验中经常使用的大分子聚合 物有丙烯酸树脂、d n a 和蛋白质等。壳聚糖纳米球可以作为基因释放体系，在 一定条件下把壳聚糖和d n a 进行混合，通过孵化等作用能够在体系中自发的产 生纳米球，其粒径范围在1 0 0 6 0 0i l n l 。结果表明随着壳聚糖分子量的降低，粒径 相对减小。并且只有在壳聚糖的使用量大于d n a 时，形成的纳米球稳定，且随 着壳聚糖用量的增大，纳米球的稳定性逐渐增大( m u m p e r ，1 9 9 5 ) 。b r u n o 等( b m n o ， 2 0 0 6 ) 将聚阳离子壳聚糖和进行了预凝胶化的聚阴离子海藻酸钠发生反应，制备 包载胰岛素的壳聚糖纳米球。结果显示当p h 值为4 7 时，通过控制壳聚糖与海藻 酸钠的质量比为1 ：6 ，可制备得到粒径约为8 0 0m 的装载药物的壳聚糖纳米球。 采用本方法制备壳聚糖纳米球条件温和、过程简单，不会对基因、蛋白质等 大分子物质产生损坏，同时制备得到的纳米球具有稳定性高、粒径较小、细胞转 染率高等显著优点。 0 2 2 5 自聚集组装法 壳聚糖分子中含有丰富的羟基和氨基，可进行多种化学修饰，修饰后的壳聚 糖衍生物在溶液中能发生自聚集组装，通过一定反应后可以制备出载药的壳聚糖 9 两种纳米体系的构建与抑菌性能初探 纳米球。o h y a 等( o h y a ，1 9 9 9 ) 首次使用共价交联法获得壳聚糖纳米球，在碱性条 件下，经过酰氨键把聚乙二醇( p e g ) 部分连接到壳聚糖链上，从而使壳聚糖表现 出两亲性质( 疏水性和亲水性) ，交联得到的复合物通过一定作用发生胶束化从 而形成自聚集的纳米颗粒。l e e 等( l e e ，1 9 9 8 ) 将壳聚糖用脱氧胆酸进行修饰，同 样制备得到一种具有两亲性的壳聚糖衍生物，这种复合物在超声波破碎的作用下 也可以发生自聚集形成壳聚糖纳米球。c h a e 等( c h 2 u e ，2 0 0 5 ) 同样使用脱氧胆酸对 低分子量的壳聚糖进行改性修饰，制备得到的两亲性复合物在溶液中能够形成粒 径为2 0 0 2 4 0 衄的自组装纳米球，并且随着脱氧胆酸取代度的增大其临界聚集浓 度降低，利用这种复合物包载基因可得到较高的基因转导率。h u 等( h u ，2 0 0 6 ) 用 碳二亚胺( e d c ) 作为交联剂，将硬脂酸连接到壳聚糖链上形成了具有自组装特 性的硬脂酸壳聚糖复合物。 近年来，本实验室也一直在进行有关壳聚糖的化学修饰，已经先后制备了亚 油酸修饰的壳聚糖衍生物纳米球( c h e n ，2 0 0 3 ) 、亚麻酸修饰的壳聚