（化学工程与技术专业论文）渤海沉积物反硝化细菌多样性研究.pdf

r e s e a r c ho nt h ed i v e r s i t yo f d e n i t r i f y i n gb a c t e r i a f r o ms e d i m e n t so fb o h a iseaome d l 1 1 a ie a at h e s i ss u b m i r e df o rt h ed e g r e eo fm a s t e r c a n d i d a t e ：s h a o z h e n gl i s u p e r v i s o r ：p r o f j i a n r e nl v & p r o f h o n g y u ed a n g c o l l e g eo f c h e m i c a le n g i n e e r i n g c h i n au n i v e r s i t yo fp e t r o l e u m ( e a s t c h i n a ) 关于学位论文的独创性声明 本人郑重声明：所呈交的论文是本人在指导教师指导下独立进行研究工作所取得的 成果，论文中有关资料和数据是实事求是的。尽我所知，除文中已经加以标注和致谢外， 本论文不包含其他人已经发表或撰写的研究成果，也不包含本人或他人为获得中国石油 大学( 华东) 或其它教育机构的学位或学历证书而使用过的材料。与我一同工作的同志 对研究所做的任何贡献均已在论文中作出了明确的说明。 若有不实之处，本人愿意承担相关法律责任。 学位论文作者签名：巷少匠日期：明f 年 占月 i oe l 学位论文使用授权书 ， 本人完全同意中国石油大学( 华东) 有权使用本学位论文( 包括但不限于其印刷版 和电子版) ，使用方式包括但不限于：保留学位论文，按规定向国家有关部门( 机构) 送交学位论文，以学术交流为目的赠送和交换学位论文，允许学位论文被查阅、借阅和 复印，将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，采用影印、缩印或其他 复制手段保存学位论文。 保密学位论文在解密后的使用授权同上。 学位论文作者签名：李- y 酝 指导教师签名：主幺翻 三历u u 日期 伽1 1 年易月1 0e 1 日期：少年月。e l 摘要 为了解渤海沉积环境反硝化细菌的群落结构与组成，应用p c r 技术为基础的基因 文库方法对渤海沉积物反硝化细菌n o s z 基因的分子多样性进行了研究。所研究的6 个 站位共筛选了4 2 7 个n o s z 基因克隆，分别属于3 2 0 个分类操作单元( o p e r a t i o n a l t a x o n o m i cu n i t s ，o t u s ) 。各站位o t u s 数4 1 - - 6 2 不等，显示了比较高的多样性。n o s z 基因序列与g e n b a n k 数据库中最相似序列的相似度在7 9 0 o - 10 0 。分子系统学分析表 明，系统进化树包括胶州湾、大西洋大陆架的沉积物以及以色列荷霍沃特海洋水产养殖 水体的n o s z 基因序列，将其划分为5 个簇( 簇i 至簇v ) 。基于o t u s 在各站位的分配 和n o s z 基因序列系统进化关系，对各站位反硝化细菌群落结构进行u n i f r a c 聚类分析， 结果表明b 0 0 3 和b 0 0 7 ，b 0 0 5 和b 0 11 站位分别两两聚在一起，b 0 0 1 、b 0 1 5 两站位与 其它站位关系较远。结合环境因子聚类分析结果，揭示渤海沉积物反硝化细菌群落结构 是沉积物间隙水中n i - h + _ n 浓度、溶解氧等多种环境因子共同作用的结果。陆源污染、 河流输入以及水动力条件是影响样地反硝化基因多样性的重要因素。 关键词：渤海，反硝化细菌，n o s z 基因，多样性 r e s e a r c ho nt h ed i v e r s i t yo fd e n i t r i f y i n gb a c t e r i a f r o ms e d i m e n t so fb o h a isealrome 0 t soa s h a o z h e n gl i ( c h e m i c a le n g i n e e r i n ga n dt e c h n o l o g y ) d i r e c t e db yp r o f j i a n r e nl v & p r o f h o n g y u ed a n g a b s t r a c t t ou n d e r s t a n dt h ec o m p o s i t i o na n ds t r u c t u r eo fd e n i t r i f y i n gb a c t e r i a lc o m m u n i t i e si n s e d i m e n t a r ye n v i r o n m e n to fb o h a is e a , t h ed i v e r s i t yo fn i t r o u so x i d er e d u c t a s eg e n en o s z f r o mt h es e d i m e n t so fb o h a is e aw a si n v e s t i g a t e db yu s i n gap c r - b a s e dg e n ec l o n i n g a p p r o a c h at o t a l o f4 2 7n o s zg e n ec l o n e sw e r eo b t a i n e df r o m6s a m p l i n gs t a t i o n s r e s t r i c t i o na n a l y s i so fc l o n e dn o s zs e q u e n c e ss h o w e dat o t a lo f3 2 0o p e r a t i o n a lt a x o n o m i c u n i t s ( o t u s ) w e r eo b t a i n e df r o ma l ls a m p l e s t h en u m b e ro fo t u si ne v e r ys t a t i o nw a s r a n g e df r o m4 1t o6 2i ne a c hs t a t i o n ，s h o w i n gh i 曲d i v e r s i t y t h el e v e l so fi d e n t i t yo ft h e n o s zs e q u e n c e st ot h e i rb e s t m a t c hk n o w ns e q u e n c e sr e t r i e v e df r o mt h eg e n b a n kd a t a b a s e v a r i e df r o m7 9 t o10 0 m o l e c u l a rp h y l o g e n e t i ea n a l y s i so f n o s zs e q u e n c e sr e t r i e v e df r o m t h es e d i m e n t so rm a r i n ea q u a c u l t u r eb i o f i l t e ro fj i a o z h o ub a y ，a t l a n t i cc o n t i n e n t a ls h e l fa n d r e h o v o ti ni s r a e la s s i g n e dt h en o s zs e q u e n c e si n t o5m a j o rc l u s t e r s ( c l u s t e r si - v ) c l u s t e r e n v i r o n m e n t ，j a c k k n i f ec l u s t e ra n dp r i n c i p a lc o o r d i n a t e sa n a l y s i s ( p c o a ) i n d i c a t e dt h a tt h e d e n i t r i f y i n gb a c t e r i a lc o m m u n i t i e so fb 0 0 3a n db 0 0 7 ，b 0 0 5a n db 0 11w e r em o r es i m i l a r ， r e s p e c t i v e l y ；h o w e v e r , b 0 0 1a n db 0 1 5w e r en o t t h ec o r r e l a t i o na n a l y s i sb e t w e e ng e o g r a p h i c l o c a t i o n sa n di t s b i o g e o c h e m i c a ld a t ai n d i c a t e d t h a tm u l t i - e n v i r o n m e n tf a c t o r s ，m a i n l y s e d i m e n tp o r e w a t e rc o n c e n t r a t i o no fn h 4 + _ na n dd i s s o l v e d0 2c o n t e n tc o n t r o l l e dt h e c o m m u n i t y 栅c 骶o fd e n i t r i f y i n g b a c t e r i a t e r r e s t r i a l p o l l u t i o n ，r i v e r i n em p u ta n d h y d r o d y n a m i cf a c t o r sm a yb et h ek e yf a c t o r st oa f f e c tt h ed i v e r s i t yo fd e n i t r i f y i n gb a c t e r i ai n t h es e d i m e n t a r ye n v i r o n m e n to fb o h a is e a k e yw o r d ：b o h a is e a ，d e n i t r i f y i n gb a c t e r i a ，n o s zg e n e s ，d i v e r s i t y 1 3 2 反硝化细菌及其作用机理9 1 4 氮循环的研究进展1 l 1 5 反硝化细菌多样性的研究现状1 2 第二章实验材料及方法1 4 2 1 实验材料及仪器设备1 4 2 1 1 沉积物样品的采集1 4 2 1 2 环境因子的测定1 5 2 1 3 主要试剂1 6 2 1 4 主要试剂的配置1 6 2 1 5 主要仪器1 8 2 1 6 相关试剂盒1 9 2 2 实验方法一1 9 2 2 1n o s z 基因文库的建立1 9 2 2 2n o s z 基因文库克隆及序列测定2 6 2 2 3n o s z 基因序列的统计学及系统进化分析2 8 第三章结果分析3 l 3 1 样品的环境因子- 3 l 3 2n o s z 基因文库的建立一3 2 3 3n o s z 基因多样性分析一3 4 3 4 基因文库丰度分析3 5 3 5 多样性指数分析。3 5 3 6 聚类分析。3 6 i i i 3 6 1u n i f r a c 聚类分析3 6 3 6 2 环境因子聚类分析3 8 3 7n o s z 基因序列的系统进化分析4 2 第四章讨论一4 7 4 1 基因文库方法的优缺点4 7 4 2 渤海沉积物n o s z 基因的系统进化分析4 7 4 3 渤海反硝化细菌群落结构与环境关系分析4 8 第五章结论一5 0 参考文献5 1 攻读硕士学位期间取得的学术成果5 6 致谢5 7 i v 中国石油大学( 华东) 硕士学位论文 第一章前言 1 1 渤海海域生态与环境特点 渤海位于中国大陆东部的最北端，是一个接近于封闭的内海。渤海及其临近海 域的水文、地貌、生物等因素直接或者间接地影响着环渤海地区的经济发展，也对 我国其它海域乃至整个西太平样的物质循环有着重要影响。 1 1 1 渤海位置与生态特点 渤海西面与河北、天津，北面与辽宁，南面与山东分别毗邻，东面经渤海海峡 与黄海相通。渤海位于北温带，平均温度1 0 7 ，每年降水量5 0 0 - - - 6 0 0 m m ，海水盐度 为3 0 o t l l 。渤海是近乎封闭的浅海，其海水交换能力较差；在较弱海流的物质输送作用 下，大部分受污染区域靠近以上沿海地区，而河口地区尤为严重1 2 。渤海沉积物类型大 部分为泥沙和软泥质，底部地势平坦呈由三湾( 辽东湾、渤海湾、莱州湾) 向渤海海峡 倾斜的态势 3 1 。大量的河流泥沙入海使渤海湾不断淤浅，滩面面积增大【1 1 。 1 1 2 渤海氮污染状况 近海区域海水富营养化是当今世界都需要面对的一个重要环境问题，国际科委环境 委员会( s c o p e ) 已经将全球氮超载作为一个潜在的环境问题提出【4 j 。渤海海域氮营养 状况的控制在我国海域乃至全球氮循环过程扮演着十分重要的角色。 环渤海区域城市为我国经济建设做出了很大贡献，海洋资源的开发也成为该区域经 济发展重要的领域之一。然而，随着发展经济的同时，环渤海地区的环境问题也日益严 重。渤海近岸海域污染主要是由陆源污染物引起的，陆源污染物约占排入渤海污染物总 量的8 7 ，而陆源污染物中由入海河口排入的约占9 5 ，污染物进入水体后，将会在水 沙之间发生迁移，或随泥沙进入近岸海域，从而对渤海近岸海域造成污染，尤其在辽东 湾、渤海湾和莱州湾区域2 1 。大量含氮废弃物排入渤海沿海海域，造成了严重的环境污 染，引发附近海域富营养化现象，并随着潮汐和海流运动不断扩散，对渤海水体和沉积 环境产生了不可忽视的影响。 大量含有氮、磷的物质排入渤海，使海水富营养化，从而导致赤潮频频发生。近年 来渤海海域每年发生赤潮的次数就有十几次，1 9 8 9 年8 1 0 月，河北唐海县发生面积达 1 3 0 0 k m 2 的赤潮，直接以及间接经济损失达3 亿多元；1 9 9 0 年老铁山水道发生了面积达 第一章前言 10 0 0 k i n 2 的赤潮，也造成巨大经济损失；2 0 0 5 年6 月2 101 t ，在渤海湾天津至滨州海域赤 潮面积约3 0 0 0 k m 2 ；6 月1 乒1 8 日，营口鲅鱼圈附近海域，赤潮面积约2 0 0 0 k i n 2 s l 。 渤海海域发生赤潮的主要类型是甲藻类赤潮，近年来氮磷比失衡、海水富营养化加 剧以及赤潮生物适宜的气候环境条件等原因造成大面积甲藻类赤潮的频频发生。海水富 营养化为赤潮的频发提供了适宜的物质条件；氮磷比失衡会改变浮游植物本来的群落结 构，造成其生态系统失衡，从而使在浮游植物群落中具有光合性和非光合性两种营养方 式的甲藻类所占的比例大幅升高，最后形成甲藻类赤潮【6 】。 1 2 微生物多样性研究 虽然微生物的发现以及研究时间比动植物方面迟得多，但是随着分离培养方法的改 进和分子生物学方面研究工作的不断深入，微生物的物种数量必定要大大超过动植物界 物种数量之和。首先，每年发现微生物新物种的速度非常迅速，正在急剧地增长着；其 次，土壤是微生物生长的主要场所，但是目前在土壤中有9 0 以上的微生物在实验室中 无法进行培养。微生物不仅种数繁多，且个体数量也非常多，微生物繁殖速度之快、数 量之大也是其应用于实际工业生产的巨大优势【7 j 。因此，微生物作为巨大的基因资源库， 必定蕴藏着非常丰富的基因信息。我国地域广阔，地形复杂，气候多样，为研究微生物 物种与遗传多样性提供了很好的客观条件，许多相关微生物又是研究分子遗传学的极好 对象【g j 。我们了解、研究和应用微生物多样性，将给人类带来巨大的社会效益，对解决 现实社会中存在的诸多问题也具有重要意义。 1 2 1 传统方法 传统的微生物多样性的研究方法比较适用于分离具有一定功能的特殊目标物种，该 方法以培养为基础【9 】。但是由于微生物的生理形态过于简单，并不能提供太多的信息， 这样进行有效检测的难度较大；同时传统方法具有很强的选择性，对培养条件要求很高， 导致了该法仅能反映极少数微生物的信息。对于海洋中的多样微生物来说，9 9 9 以上 的成员还是没有办法通过实验室培养出来，因此使用传统方法很难进行研究【1 0 1 。科学家 们很早就开始探索新的研究方法，为了能够在培养的基础上进一步研究微生物，并将这 些方法有效的应用到实际当中去。对微生物从数量上进行分析可以通过荧光染色的方 法。此外，根据微生物不同种群对不同底物的反应特性建立了b i o l o g 等方法，b i o l o g 方法的优点是不需要分离培养纯种微生物，即可获得有关微生物群落代谢功能以及总体 2 中国石油大学( 华东) 硕士学位论文 活性的信息，从而很好地保留了微生物群落原始的代谢特钳】。 对环境微生物依赖于培养的传统研究方法原理简单，对性状研究直接有效，但是由 于其对培养的依赖性局限了研究对象的范围，限制了人类对不可培养微生物多样性的研 究。基于分子生物学技术的多样性研究方法由于打破了传统培养方法的局限性，而逐渐 成为人类研究微生物分子多样性的重要方法。 1 2 2 分子生物学研究方法 2 0 世纪8 0 年代末9 0 年代初，在核酸水平上以基因为研究基础的分子生物学技术得 到了很好的发展，并迅速地在微生物群落结构分析方面得到广泛应用【1 2 】。2 0 世纪8 0 年 代中期开始用这种方法对环境微生物多样性、群落结构以及变化规律进行研究，近年来 在海洋生态系统的研究中也得到快速的发展。 琼脂糖凝胶电泳是用琼脂糖作支持介质的一种电泳方法【1 3 1 。琼脂糖是从琼脂中分离 制得的，它不含有带电基团，其结构是有p d 吡喃半乳糖和3 , 6 脱水l 吡喃半乳糖相结 合的链状多糖。琼脂糖凝胶约可区分片段大小相差1 0 0b p 的d n a 片段，其分辨率虽比 聚丙烯酰胺凝胶低，但其配制比较容易，分离范围广，尤其适用于分离大片段d n a 。 d n a 分子在琼脂糖凝胶中泳动时必然会产生分子筛效应与电荷效应。当d n a 分子p h 值高于等电点的缓冲液时带负电荷，在电场中向正极移动。由于糖磷酸骨架在结构上 的重复性质，相同数量的双链d n a 几乎具有等量的静电荷，因此它们能以同样的速度 向正极方向移动【1 3 1 。观察d n a 分子片段位置需要利用一种染色染料溴化乙锭( e t h i d i u m b r o m i d e ，e b ) 。在制作凝胶时就加入一定量的e b ，它可以嵌入核酸双链的配对碱基之 间，形成e b d n a 复合物，在紫外线照射下显示荧光，从而可以对d n a 分子进行定性 检测。 微生物多样性基本的分子生物学研究方法及策略见图1 1 ，其方法大致是：首先对 环境样品在实验室进行分离培养，再通过p c r 扩增目标基因进行克隆基因文库：或者 从环境样品中提取r n a 或d n a 直接进行斑点杂交或基因芯片；最后用系统发育分析、 d n a 序列分析等方法进行下一步的分析【1 4 1 。常用的分子生物学方法可分为克隆基因文 库分析法、基因指纹图谱法、定量p c r 法和基因序列系统发育分析法等几大类。 3 第一章前言 图1 - 1 微生物分子多样性分析的基本方法与技术路线1 1 4 1 f i g l - it e c h n i q u ef l o wc h a r t o fa n a l y s eo nm i c r o b i a l p c r 技术是分子生物学的重要技术，配合其他分子生物学的手段在微生物多样性、 系统进化研究方面具有重要的应用。p c r 反应的基本路线是先从样品中提取d n a ，以 此为模板通过聚合酶链式反应扩增目的基因序列，最后对p c r 目的基因产物进行分析。 应用比较多的p c r 技术有以下几种1 1 5 】： ( 1 ) 克隆基因文库分析法基因组文库是指将基因组d n a 通过限制性内切酶部分 酶解后所产生的基因组d n a 片段随机的载体重组、克隆，当足够的克隆数目可以把某 种生物基因组的全部基因都包括在内时，这一克隆总体成为该生物的基因组文库【1 6 1 。而 c d n a 文库是包括在特定组织或细胞类型中已经被转录成m r n a 的所有的基因序列。基 因文库比基因组文库复杂性要更高，它可用于研究基因的结构、功能和筛选基因工程的 目的基因。基因文库作为重组d n a 技术的应用已经显示了它在分子生物学研究上的重 大潜力。微生物多样性研究经常选取核糖体小亚基r n a 基因作为克隆的基因，细菌和 古菌的核糖体r n a 的类型分为1 6 s 、2 3 s 、5 sr r n a3 种，其中最适合作为生物系统发 育指标的是1 6 sr r n a 的基因序列，因其在遗传进化上的保守性，已成为系统发育分析 和分类鉴定的重要依据【l 7 j 4 中国石油大学( 华东) 硕士学位论文 ( 2 ) 限制性片段长度多态性分析( r e s t r i c t i o nf r a g m e n tl e n g t hp o l y m o r p h i s m ，r f l p ) 是通过限制性内切酶酶切得到长度不同的d n a 片段，再用放射性标志的探针与其相结 合，从而分析d n a 的多态性。通常用聚丙烯酰胺凝胶电泳来分离，并利用荧光染料显色， 得到数量与长度不同的d n a 片段以及特异性的电泳图谱。对条带不同的序列进行序列的 测定，然后将测序得到的序列信息进行处理就可获得环境样品中微生物种类以及功能基 因等情况。r f l p 方法己经在遗传育种以及新物种鉴定等方面得到了广泛应用【l s l 。 ( 3 ) 末端限制性片段长度多态性分析( t e r m i n a lr e s t r i c t i o nf r a g m e n tl e n g t h p o l y m o r p h i s m ，t r f l p ) 由w e n t a o 等1 9 9 7 年在l u l p 的基础上建立的，该方法可以从数 据库中直接获取信息，它的灵敏度高，可以用计算机对结果进行处理，从而实现操作的 数字化，已经在微生物群落结构的比较以及同一微生物群落在不同条件下的比较等方面 得到广泛应用，从而可以对微生物群落的结构、微生物系统发育及其菌种鉴定等进行研 究【1 8 1 。 ( 4 ) 扩增片段长度多态性( a m p l i f i e df r a g m e n tl e n g t hp o l y m o r p h i s m ，a f l p ) 是 1 9 9 3 年由荷兰科学家v o s 和z a b e a u 两人发展起来的，是一种用于检测d n a 片段多态性的 新方法。该方法的特别之处在于已知d n a 信息的前提下所用的专用引物可对酶切片 段进行p c r 扩增。为使酶切浓度的大小分布均匀，一般采用两个限制性内切酶，一 种酶为多切点，另一种酶切点数较少，因而a f l p 分析产生的主要是由两种酶共同 酶切的片段。扩增片段长度多态性已经被列为当前研究海洋环境微生物群落多样性的 重点技术之一【1 8 】。 ( 5 ) 单链构象多态性( s i n g l e - s t r a n d e dc o n f o r m a t i o np o l y m o r p h i s m ，s s c p ) 是一种 简便的点突变检测技术，此技术由o r i t a 等首先于1 9 8 9 年使用，随后逐渐较为广泛地应用 于分子生态学等研究领域【1 9 1 。p c r 扩增产物变性形成单链后，其构象及电泳迁移速度可 因单个碱基突变而出现差异并形成多态性。在低温条件下，单链d n a 呈现一种由内 部分子相互作用形成的三维构象，它影响了d n a 在非变性凝胶中的迁移率，相同 长度但具有不同核苷酸序列的d n a 在凝胶中的由于迁移率不同而被分离。被分离 的条带可被银染或者荧光标志引物检测，然后用d n a 自动测序进行分析。用 p c r s s c p 技术可以进行序列差异的测定，而其敏感度会随着片段长度的增加而降 低，但是只要条带被凝胶电泳分离开就可以进行系统发育的研究【1 8 】。 5 第一章前言 ( 6 ) 变性梯度凝胶电泳( d e n a t u r i n gg r a d i e n tg e le l e c t r o p h o r e s i s t e m p e m t u r eg r a d i e n t g e le l e c t r o p h o r e s i s ，d g g e t g g e ) 是目前微生物多样性研究的比较常用的方法。在一 般的聚丙烯酰胺凝胶电泳时，双链d n a 分子大小和所带电荷量决定了其迁移速率。 不同长度的d n a 片段因速率不同能够被区分开；但同样长度的d n a 片段在凝胶中 的迁移速率一样，所以无法被区分。根据不同d n a 片段的解链区域及其浓度亦不相同 的原理，在聚丙烯酰胺凝胶梯度下解链d n a ，片段长度一样但序列不同的d n a 片段会 在凝胶中达到最低解链区域后，其d n a 片段的迁移速率会减小，从而各自在凝胶中分离 开来。目前该方法己经在微生物生态学的研究中得到广泛应用，包括环境因素变化对微 生物群落的影响以及微生物群落多样性的研究【l 引。 ( 7 ) 实时荧光定量p c r ( r e a l t i m ep c r ) 技术实现了p c r 扩增由定性向定量的过程， 通过实时监测整个扩增过程的荧光信号积累，反应结束后根据标准曲线对未知模板 进行定量分析的方法。定量p c r 可以直接测定目标基因在微生物群落中的拷贝数或相 对量，其过程操作简便、快速高效，由于是在密封体系中进行定量测定，很大程度上减 少体系被污染的可能性，提高了测定的准确性【2 0 】。定量p c r 技术作为一种高敏感性、特 异性的分子检测方法，目前已被广泛地应用于分子生物学研究的各个领域。对反硝化细 菌的定量研究来说，因为其不需要添加额外的探针，s y b rg r e e n 方法要l 匕t a q m a n t m 在 定量研究中更具有优势1 2 0 。但r t p c r 法局限于每次分析单一的基因，却不能同时快速 地分析环境样品中大量的基因种群。r e a l t i m ep c r 技术目前已应用于对海洋中不可培 养的细菌进行定量分析【1 8 】。 1 2 3d n a 的序列分析 d n a 测序之后一个非常重要的步骤就是对所测得序列的分析，只有经过准确的序列 分析才能对目标微生物很好的鉴定。在d n a 水平上的6 4 个遗传密码子，对应于蛋白质水 平上的有2 0 个不同氨基酸。众所周知，构成蛋白质的基本物质是氨基酸。因此，蛋白质 序列的灵敏度比较高，更容易发现亲缘关系较远的序列。然而，从信息学的角度来看， 由6 4 个密码子变成2 0 个氨基酸，这不仅仅是数量上的减少，因为蛋白质只是在功能上对 d n a 的遗传变化的反映，这就意味着会有一些遗传信息的丢失，而这些信息又往往与进 化过程有着直接或间接的联系。目前，可以进行d n a 序列分析的工具很多，其基本步骤 6 中国石油大学( 华东) 硕士学位论文 包括【2 1 】：序列数据的获得；数据库查询和序列的比对( a l i g n m e n t ) ；系统发育分析 ( p h y l o g e n e t i ca n a l y s i s ) 。 系统发育分析是确定微生物在发育过程中种属关系的一种手段，亲缘关系分析是对 不同物种进行家族关系分析的常用方法。系统发生非常重要，它可以确定源于共同祖先 的两个基因间的进化关系。这类分析一般以某个不同种属的基因出发，从d n a 序列或序 列片段的比对结果着手。亲缘分析结果经常以图形形式表示，如亲缘树( p h y l o g e n e t i c t r e e ) 或系统树( d e n d r o g r a m ) 等。在亲缘树中，进化距离根据水平分枝的长度决定： 而在系统树中，进化距离则由分枝线段的长度决定。 1 2 4 功能基因在微生物多样性研究中的应用 分子生物学技术冲击了传统微生物生态学理论及其研究方法，取得了显著的成果， 可以对不可培养的微生物进行研究，但也要注意分子生物学技术本身存在的缺点和不稳 定因素对实验结果的影响，要具体考虑实验方法的代表性和稳定性，作出合理的判断和 解释【2 2 】。微生物多样性的有机整体性要求表征方法既包括群落宏观水平的整体表征方 法，也包括针对分类子集功能与结构的特征技术【2 3 矧。因此，我们对微生物生态学研究 即要注重新技术新方法的应用，又要注意结合传统方法，这样才能够全面而准确地有助 于科学研究。分子生物学技术节省时间，提高检测灵敏度，而且对环境样品中的微生物 进行原位观察，充分反映样品中原有的微生物组成情况，能有效、快速地得到环境样品 的微生物信息，并检测特定微生物群落的动态变化和活性。 目前微生物多样性分析通常选用的基因是1 6 sr r n a ，这是在环境微生物学和微生物 生态学研究方面利用分子生物学研究技术的重大突破，1 6 sr r n a 基因具有高度的多样性 的优点，能够发现利用人工培养无法获得的新的微生物种类，对环境中微生物种群的研 究基本上都是以这类分子标志为基础来完成f 2 5 , 2 6 1 。同时在不同的编码区段，1 6 sr r n a 基因的差异很大，从而导致1 6 sr r n a 基因的识别灵敏度变化也非常大【2 刀。 随着分子技术在该领域的不断发展，为了进一步更好了解环境中微生物群体的代谢 活动以及功能情况，研究者们开始选用功能基因作为分子标志。酶是微生物新陈代谢活 动过程中的重要组成成分，该过程中的化学反应几乎都是在酶的催化作用下进行的，能 够编码酶特别某些关键酶的功能基因决定着微生物的特征表达。在分子多样性的基础上 7 第一章前言 对功能基因的研究，不仅可以揭示微生物进化过程中的多样性，更重要的是还描述了某 些微生物种群的功能多样性，这对于后续的应用方面研究的作用是明显的口8 捌。 1 3 氮循环 在自然界中，生物所需要的各种化学元素，一方面通过其生命活动被合成为有机物， 从而组成生物体；另一方面这些有机物又会被分解为无机物而重新返回自然界。由此可 见，元素不断从非生物物质状态转变成有生命物质状态，然后再从有生命物质状态转变 成非生命物质状态，如此循环过程组成了地球上的物质循环，即生物地球化学循环。 1 3 1 微生物参与的氮循环 氮是所有生物体所必需的营养元素，也是维持生物体组成结构和执行所有生物化学 过程的基础【3 0 1 。氮循环是描述自然界中氮单质和含氮化合物之间相互转换过程的生态系 统的物质循环【3 1 1 。构成氮循环的主要过程包括：生物体内有机氮的合成、硝化作用、反 硝化作用、氨化作用和固氮作用。氮循环过程主要是通过生物的参与，其中微生物更具 有十分重要的作用。氨、铵离子、亚硝酸盐、硝酸盐、氮气多样化的过程，许多都要依 靠微生物的参与，氮在不同形态下需要不同作用机理的微生物，可用图1 2 1 3 2 1 。 图1 2 微生物参与的氮循环过程矧 f i g l - 2 s c h e m a t i cp r o c e s s e so fn i t r o g e nc y c l ed r i v e nb ym i c r o - o r g a n i s m s 8 中国石油大学( 华东) 硕士学位论文 海洋面积占全球总表面积的7 1 ，因此海洋生态系统的氮循环的作用不可小视，其 关系着全球氮平衡。氮素在海洋生态系统内的循环过程与陆地相似，由微生物参与的海 洋氮循环的基本过程如图1 3 所示。总的来说，海洋中氮元素的循环过程是相互关联和 影响的生物地球化学过程的集合，所有的过程形成了网状的海洋生态结构3 3 州。在海洋 系统的氮元素生物地球化学循环的过程中，我们认为生物转化比非生物转化更重要。由 于微生物的参与，海洋氮循环过程才能够顺利进行下去，很好地维持着全球生态系统的 氮素平衡p 副。 一氰震的迁移 一氮震的转化 图1 - 3 海洋环境中的氮循环3 4 j f i g l - 3n i t r o g e nc y c l i n gi nm a r i n ee n v i o n m e n t 1 3 2 反硝化细菌及其作用机理 反硝化作用( d e n i t r i f i c a t i o n ) 是指细菌将硝酸盐( n 0 3 ) 逐步还原为一系列中间产 物( n 0 2 。、n o 、n 2 0 ) ，最终还原为氮气( n 2 ) 的生物化学过程。反硝化作用在整个生 物地球化学过程中具有重要意义，也是氮循环过程中不可或缺的部分，是自然界中被固 9 第一章前言 定的氮重新回到大气的主要途径【3 6 1 。此过程通常发生在厌氧环境p h 值在7 0 8 0 的条件 下。反硝化作用能够将硝酸盐还原成氮气，从而降低了土壤中农作物生长必需的氮素含 量，对农业的生产不利，农业上常常使用中耕松土的方法来防止反硝化作用；目前全世 界范围内的农业以及工业化大生产等方面的发展加重了水体中的氮负荷，导致水体污 染、水体富营养化等环境问题1 3 5 1 。同时反硝化作用也会产生温室效应气体，如n o 和n 0 2 ， 这些气体会破坏臭氧层结构并引起全球气候变耐3 7 1 。 1 3 2 1 反硝化细菌 反硝化细菌是一种能引起反硝化作用的细菌，种类大多为异养以及兼性厌氧 细菌。反硝化细菌广泛分布于土壤、厩肥和污水中，在厌氧条件下可以将硝态氮 转化为氮气而不是铵态氮，与硝化细菌的作用不完全相反；目前主要应用于污水 处理，其中在水产养殖污水处理方面应用最为广泛【3 5 】。 自然界氮循环的过程并不是孤立的，与其它营养元素的循环也具有非常密切的关 系，并受到有机化学物质以及多种金属的影响。通过微生物的新陈代谢过程，生物体内 的氧化还原反应顺利进行。在此过程中特定的酶对反应过程具有很好的催化作用，因此 我们在研究反硝化的过程中，反硝化细菌对应的酶以及编码该酶的基因应当成为重要的 研究对象【3 8 】。 1 3 2 2 反硝化细菌的作用机理 反硝化过程是对硝酸盐经过一系列酶的催化作用逐步还原的过程。硝酸盐作为电子 受体，在此过程中参与的酶( 图l _ 4 ) 主要有硝酸盐还原酶( n a r ) 、亚硝酸盐还原酶( n i r ) 、 氧化氮还原酶( n o r ) 、一氧化二氮还原酶( n o s ) 等1 3 9 删。 n a p c u - n i r q n o r 图1 _ 4 反硝化过程中功能酶与基因1 4 0 l f i g l - 4d e n i t r i f y i n gf u n c t i o n a le n z y m ea n df u n c t i o n a lg e n e s ( 1 ) 硝酸盐还原酶 1 0 中国石油大学( 华东) 硕士学位论文 有研究已经发现硝酸盐还原酶分两种类型：一种位于周质空间，由n a p a 和n a p b2 个亚基组成；另一种与细胞膜相连接，由3 个亚基组成，其中a 亚基是活性位点，能够以 n a d p h 作为电子供体还原硝酸盐，低浓度的叠氮化合物可抑制其作用活性【4 1 1 。这两种 酶在基因组成、蛋白质结构和生物化学特性上都存在着许多差异。 ( 2 ) 亚硝酸盐还原酶 亚硝酸盐还原酶基因是在反硝化细菌的功能基因中研究最多的【4 2 】。亚硝酸盐还原酶 分为两种类型：一种为c u - 型亚硝酸盐还原酶( n i r k ) ；另一种为细胞色素e d l 型亚硝 酸盐还原酶( n i r s ) 。虽然这两种酶具有不同的组成结构，但是在功能方面都能够将n 0 2 还原为n o 4 0 l 。同时在一种微生物的不同菌株中刀粥和 臌因也会表现出不同的分子量 和免疫学特性。 ( 3 ) 一氧化二氮还原酶 目前对一氧化二氮还原酶的研究较少，刀d s z 基因作为反硝化过程的最后一步，作用 是不可忽略的，一氧化二氮还原酶首先发现于斯氏假单胞菌( p s e u d o m o n a ss t u t z e r i ) 【4 3 1 。 一氧化二氮还原酶在电子转移过程中有细胞色素b 和c 的参与。酶分子量为8 5k d a ，不 含有f e 和m o ，但含有c u 。c u 是反硝化细菌产碱菌在n 2 0 下厌氧生长合成一氧化二氮还 原酶的制约因子。一氧化二氮还原酶存在于其周质中，其氧化还原中心有1 个a 型铜和1 个z 型铜，这两种铜蛋白都会参与电子传递和催化【4 2 】。s c a l a 等使用引物对n o s 6 6 1 f ( 5 c g g c t g g g g g c t g a c c a a 3 ) 和n o s l 7 7 3 r ( 5 a t r t c g a t c a r c t g b t c g t i 3 ) 进行刀越因的p c r 扩增，来研究反硝化细菌的多样性【4 4 1 。 1 4 氮循环的研究进展 本项目在生物工程与技术中心微生物课题组支持下进行，实验室拥有完备的分子生 物学实验仪器和设备，基本能够满足科研项目的需求。如f a s tp r e p 2 4 核酸提取仪、p c r 仪、琼脂糖凝胶电泳仪、凝胶成像系统、超速离心机、超低温冰箱、恒温培养箱、超净 工作台等设备。实验室还与上海生工建立了长期的合作关系，能够满足对基因序列测定 的要求。 由于近年来渤海水质氮含量升高，导致海水富营养化加重；而反硝化作用是使硝酸 盐逐步还原为氮气的过程，因此研究渤海沉积物中反硝化细菌对了解渤海氮污染状况的 第一章前言 作用是明显的。一氧化二氮还原酶n o s z 基因也是目前氮循环研究过程的热点和前沿问 题。 在总体研究思路指导下，在已有文献和前期研究工作为基础的支持下，近几年来本 实验室已经发表多篇高水平研究论文，实验设计具体详细，技术方法可行，实验方法成 熟可靠。 党宏月等( 2 0 1 0 ) 对胶州湾沉积物样品h z o 基因的丰度及多样性进行研究，揭示了胶 州湾厌氧氨氧化细菌的分布及与环境作用关系，同时通过a n a m m o x1 6 sr r n a 基因分子 多样性研究证实了胶州湾大多数的厌氧氨氧化细菌是s c a l i n d u a 属；沉积物环境因子中 c n 比值、亚硝酸盐浓度、粒度等影响着厌氧氨氧化细菌的群落结构及分布，其中亚硝 酸盐浓度对胶州湾厌氧氨氧化过程起着关键的控制作用【4 5 】。 党宏月等( 2 0 1 0 ) 对鄂霍次克海深海表面沉积物中古菌群落多样性、结构以及分布， 尤其是对a e a ( a m o a e n c o d i n ga r c h a e a ) 组成进行了研究，相关分析发现古菌a m o a 基 因的丰度与沉积物中有机质含量有关；同时也发现a e a 在现代鄂霍次克海深海沉积物 中具有较大适应温度范围。通过对硝化细菌和古菌a m o a 基因定量p c r 研究，揭示了细 菌在鄂霍次克海冷泉沉积物中可能对硝化作用起到主导作用吲。 党宏月等( 2 0 0 8 ) 通过对氨氧化古菌a m o a 基因文库分析，对长江口以及邻近东海 沉积物中氨氧化古菌多样性以及群落结构进行了研究，发现氨氧化古菌的群落分布与相 关的表层海水盐度梯度、沉积物分选系数等有关 4 7 1 。 党宏月等( 2 0 0 8 ) 使用以p c r 为基础的基因文库构建的分子生物学方法对胶州湾 沉积物反硝化细菌的n i r s 基因进行了研究，发现大多数n i r s 基因序列存在于河口、沿 海和海洋环境；统计分析发现胶卅i 湾反硝化细菌的群落结构、空间分布与沉积物粉沙含 量、n h 4 + - n 浓度以及有机碳氮比等环境因素有关 4 8 1 。研究结果表明，以n i r s 基因为标 志的反硝化细菌群落对胶州湾环境