（生物化学与分子生物学专业论文）木薯耐寒相关microrna的差异表达分析.pdf

海南大学学位论文原创性声明和使用授权说明 原创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进行研究工作所取得的成果。 除文中已经注明引用的内容外，本论文不含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品或成果。 对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本声明的法律结果由本人 承担。 论文作者签名： 荡准夸 日期：加f p 年f 月q - = 学位论文版权使用授权说明 本人完全了解海南大学关于收集、保存、使用学位论文的规定，即：学校有权保留并向国家有 关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。本人授权海南大学可以将本学 位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和 汇编本学位论文。本人在导师指导下完成的论文成果。知识产权归属海南大学和中国热带农业科学 院 保密论文在解密后遵守此规定。 论文作者躲侄伟备 日期：泸扣年占月妒日。 翩躲犯 x 。 导师签名：一 一 日期：j o ( o 年6 月乒日 本人已经认真阅读“c a l l s 高校学位论文全文数据库发布章程”，同意将本人的学位论文提交 c a l l s 高校学位论文全文数据库，中全文发布，并可按“章程”中规定享受相关权益。i 虽童逾塞逞銮 做作者躲荡；饽冬 日期：加p 年占月矽日 。新躲j 导牡 日期汐矿声年月2 日 摘要 m i c r o r n a ( m i r n a ) 是一类 - 一2 2 n t 的非编码小分子r n a ，通过转录后水平上抑制 或降解靶基因m r n a 来调节基因表达。m i r n a 涉及几乎所有重要的生物学过程，包括 对发育、细胞增殖和凋亡、胁迫响应等方面的调控。木薯为典型的热带能源作物，研究 其耐低温的分子机制是进行木薯抗寒性遗传改良的重要的基础性工作。 本研究利用实时定量p c r ( q u a n t i t a t i v er e a lt i m e p c r ) 分析2 3 个抗寒候选m i r n a 在木薯品种c 4 和k u 5 0 正常生长下及低温胁迫处理下的表达差异，并对这些m i r n a 进行相应的靶基因预测。具体结果如下： 1 系统建立并完成了木薯低温适应的生物学过程，摸索出表达分析的时间序列点和 取样方法，为木薯9 7 3 项目抗寒机制研究部分建立了物质基础。 2 对2 3 个抗寒候选m i r n a ( 1 9 条引物) 的表达分析表明，在未处理对照下相对 于内参u 6 除m i r 5 1 7 8 0 2 8 ，m i r l 0 4 5 1 2 5 和m i r l 7 1 7 2 9 0 低表达或不表达外，其余2 0 个 m i r n a 均表达，且在不同器官中有表达差异。 3 2 3 个抗寒候选m i r n a 中，低温诱导a t 下上调表达有：m i l 5 6 a , 3 9 9 e ，1 0 4 5 1 2 5 ， 4 3 6 7 2 1 3 ，1 7 1 7 2 9 0 ，6 9 1 5 2 0 2 等6 个m i r n a ；下调表达有：m i r l 6 6 a , 1 7 1a ，b ，1 5 7 b ，3 9 0 b ， 1 6 6 b ，c ，d ，e ，6 9 1 5 2 0 2 等1 0 个m i r n a 。这些m i r n a 将是进一步发掘木薯耐低温调节机 制的重要基因资源。此外，2 3 个m i r n a 中，在诱导后寒害a h 下，有9 个m i r n a 上 调6 个下调表达；非诱导寒害n a h 下，有6 个m i r n a 上调4 个下调表达。预示着它 们在木薯中蕴含不同耐寒调节机制，后续研究中值得关注。 4 低温诱导a t 下有2 0 个m i r n a 在木薯c 4 叶和根中表现出不同的表达模式，1 7 个m i r n a 在木薯k u 5 0 不同器官中表现出不同的表达模式；诱导后寒害a h 下，2 3 个 抗寒候选m i r n a 中有1 9 个m i r n a 在c 4 叶和根中表现出不同的表达模式，k u 5 0 中有 1 9 个；而在非诱导直接寒害n a i l 下，2 3 个抗寒候选m i r n a 中有1 7 个m i r n a 在c 4 的不同器官中表现出不同的表达模式，有1 9 个m i r n a 在k u 5 0 中表达不同。表明这些 m i r n a 表达存在基因型和器官的差异性，说明不同品种( 组织) 中可能存在不同m i r n a 调节的耐低温基因。 5 通过h i t s e n s o r 软件预测出2 3 个m i r n a 在木薯中所作用的相关靶基因，建立 1 8 0 对m i r n a 与靶基因的互作对。其中低温诱导下表达的1 5 个m i r n a 靶向的靶基因 非常有意义，将是后续研究的重点。 本研究在木薯中进一步收集与低温胁迫相关的m i r n a 及其靶基因，这些研究成果 为今后木薯耐寒育种研究提供了重要的基因资源。 关键词：m i r n a 木薯低温胁迫q r t - p c r 差异表达 i a b s t r a c t m i c r o r n a ( m i r n a ) i sac l a s so f - 2 2 n tn o n - c o d i n gr n a st h a tc a l lp l a yi m p o r t a n t r e g u l a t o r yr o l e s i n p l a n t sb yt a r g e t i n gm r n a sf o rc l e a v a g eo rt r a n s l a t i o n a lr e p r e s s i o n m i c r o r n a sa r ck e yr e g u l a t o r so fn e a r l ya l le s s e n t i a lb i o l o g i c a lp r o c e s s e s ，i n c l u d i n g d e v e l o p m e n t ，c e l lp r o l i f e r a t i o na n da p o p t o s i sa n ds t r e s sr e s p o n s e s m a n i h o te s c u l e n t ac r a n t z i so n et y p i c a lt r o p i c a lc r o p ，t h er e s e a r c ha b o u tc o l ds t r e s si st h em o s ti m p o r t a n tp r o g r a mf o r c o l dm e c h a n i s mr e s e a r c ha n dg e n e t i ci m p r o v e m e n t i nt h ep r e s e n ts t u d y , w eu s e dq r t - p c r ( q u a n t i t a t i v er e a lt i m e - p e r ) t ov a l i d a t et h e d i f f e r e n te x p r e s s i o no f2 3m i r n ai nc a s s a v ac 4a n dk u 5 0b e t w e e nn o r m a ld e v e l o p m e n ta n d c o l ds t r e s s b e s i d e s ，an e wa p p r o a c hw a su s e dt om a k ec o m p u t a t i o n a lp r e d i c t i o no ft a r g e t m r n a s t h em a i nr e s u l t sw e r es u m m a r i z e d 舔f o l l o w s ： 1 t l l i sp r e s e n ts t u d yc o m p l e t e l yc o n s t r u c t e dt h eb i o l o g i c a lp r o c e s st h a tc a s s a v ar e s p o n e d t oc o l ds t r e s s b e s i d e s ，w e9 0 印e dt h es a m p l i n gm e t h e d sa n dc o l ds t r e s st i m e sf o rm i r n a e x p r e s s i o na n a l y s i s i tp r o v i d e dm a t e r i a lb a s i sf o rc o l dm e c h a n i s mr e s e a r c ho fc a s s a v a p r o g r a m9 7 3 2 c o m p a r e dw i t hu 6g e n e2 0o f t h e2 3c o l dc a n d i d a t em i r n a sw e r eh i 曲l ye x p r e s s e d u n d e rn o r m a lc o n d i t i o n t h er e s u l ti n d i d a t e dt h e s em i r n a sh a dd i f f e r e n te x p r e s s i o ni n c a s s a v al e a fa n dr o o t 3 at o t a lo f15m i r n a sh i g h l ye x p r e s s e du n d e ra tc o l ds t r e s s ，i n c l u d i n g6u p r e g u l a t e d ： m i r l 5 6 a , 3 9 9 e ，1 0 4 5 1 2 5 ，4 3 6 7 2 1 3 ，1 7 1 7 2 9 0 ，6 9 1 5 2 0 2 ，a n d1 0d o w n r e g u l a t e d ：1 6 6 a , 1 7 1 a , b ， 1 5 7 b ，3 9 0 b ，1 6 6 b ，c ，d ，e ，6 9 1 5 2 0 2 t h e yw e r et h ei m p o r t a n tt a r g e tm i r n a sf o rs t u d yc a s s a v a c o l dm e c h a n i s mr e s e a r c ha n dg e n e sr e s o u r c e b e s i d e s ，t h e r ew e r e9u p r e g u l a t e dm i r n a s a n d6d o w n r e g u l a t e dm i r n a su n d e ra hc o l ds t r e s sa sw e l la s6u p - r e g u l a t e da n d6 d o w n r e g u l a t e dm i r n a su n d e rn a h ，i n d i c a t e dt h a tt h e yr e g u l a t e dd i f f e r e n tc o l dm e c h a n i s m i nc a s s a v a 4 t l l i ss t u d ya n a l y z e dt h o r o u g h l ya b o u te x p r e s s i o np a t t e r n si nt w oc a s s a v av a r i e t i e s u n d e rd i f f e r e n tt r e a t m e n t s ，r e v e a l e dt h a t2 0 2 3m i r n ah a dd i f f e r e n te x p r e s s i o np a t t e r n si n c a s s a v ac 4a sw e l ia s1 7 2 3i nk u 5 0u n d e ra tc o l ds t r e s s ，1 9 2 3m i r n ah a dd i f f e r e n t p a t t e r n si nc 4a sw e l l 嬲1 7 2 3i nk u 5 0u n d e ra h a n d1 7 2 3m i r n ai nc 4 弱w e l la s1 7 2 3 i nk u 5 0u n d e rn a hc o l ds t r e s s t h er e s u l t si n d i c a t e dt h a t t h e r ew e r es o m ed i f f e r e n t c o l d - t o l e r a n c er e l a t e dg e n e st a r g e t e db yt h e s em i c r o r n a s 5 h i t s e n s o rs o f t w a r ew a su s e dt op r e d i c tm i r n at a r g e t s ，a n dg o t18 0m i r n a ：t a r g e t b i n d i n gp a i r s t h em r n at a r g e t so f15m i r n a se x p r e s s e du n d e ra t c o l ds t r e s sb e l o n g e dt o d if f e r e n tt y p e sa n dh a dd if f e r e n tf u n c t i o ni np l a n t i i t h i ss t u d yc o l l e c t e dm o r er e l a t e dc o l d - r e s i s t a n c em i r n a sa n d 廿l e i rt a r g e t s i tp r o v i d e da l o to f i m p o r t a n ti n f o r m a t i o nf o rc a s s a v ac o l dm e c h a n i s mr e s e a r c ha n dg e n e t i ci m p r o v e m e n t k e yw o r d s ：m i c r o r n a c a s s a v ac o l ds t r e s s q r t - p c r d i f f e r e n t i a le x p r e s s i o n 目录 摘要i a b s t r a c t i i 目萄之i 1 前言1 1 1 木薯是重要的能源作物1 1 2 植物的抗寒研究机理2 1 2 1 植物低温生理生化变化3 1 2 2 植物的抗寒基因的表达及调控3 1 2 3 低温信号转导4 1 2 4 低温逆境蛋白5 1 3m i r n a 研究进展6 1 3 1m i r n a 的分子机制6 1 3 1 1m i r n a 的生物合成一6 1 3 1 2m i r n a 的作用机制7 1 3 2m i r n a 的研究方法8 1 3 2 1m i r n a 的获取方法8 1 3 2 2m i r n a 的检测方法9 1 3 3 植物m i r n a 数据库1 l 1 3 4 植物m i r n a 功能o 1 2 1 3 4 1m i r n a 与植物的生长发育1 2 1 3 4 2m i r n a 与植物激素的调节及信号转导1 3 1 3 4 3m i r n a 与植物的抗逆胁迫反应1 4 1 3 4 4 植物m i r n a 与靶基因的关系及应用1 5 1 4 本研究的目的和意义1 6 2 材料与方法1 7 2 1 植物的材料及其低温处理1 7 2 2 主要仪器及试剂l8 2 2 1 主要仪器18 2 2 2 试剂与试剂盒18 2 3m i r n a 差异表达分析1 9 2 3 1m i r n a 获取2 0 2 3 1 1 计算机预测2 0 2 3 1 2 胁迫材料s o l e x a 测序2 0 2 3 2m i r n a 引物设计2 0 2 3 3m i r n a 的提取2l 2 3 4m i r n a3 末端加p o l y ( a ) 2 2 2 3 5e d n a 第一链的合成2 2 2 3 6r t - p c r 检测2 2 2 3 7 实时定量p c r 对m i r n a 进行相对定量分析2 3 2 4m i r n a 靶基因预测2 3 3 结果与分析2 4 3 1 木薯品系的低温胁迫反应2 4 3 2s m a l lr n a 检测及q r t - p c r 检测2 5 3 2 1s m a l lr n a 质控检测及p c r 反应体系优化2 5 3 2 2q r t - p c r 检测2 6 3 3m i r n a 表达水平分析2 8 3 3 1 未处理对照下m i r n a 表达水平2 8 3 3 2 低温胁迫下m i r n a 表达水平2 9 3 4 不同胁迫过程中m i r n a 的差异表达2 9 3 4 1 在未处理对照下m i r n a 的表达2 9 3 4 2 在低温胁迫下m i r n a 的表达2 9 3 4 2 1 低温诱导a t 下表达的m i r n a 3 0 3 4 2 2 诱导后寒害a h 下表达的m i r n a 3 0 3 4 2 3 非诱导直接寒害n a h 下表达的m i r n a 31 3 4 3 未处理对照和低温胁迫下m i r n a 的表达异同3 2 j 、结3 4 3 5 不同胁迫过程中m i r n a 的表达模式3 9 3 5 1m i r n a 表达模式的确定3 9 3 5 2m i r n a 表达模式3 9 3 5 2 1 未处理对照下m i r n a 的表达模式4 0 3 5 2 2 低温诱导a t 下m i r n a 的表达模式。4 1 3 5 2 - 3 诱导后寒害a h 下m i r n a 的表达模式4 4 3 5 2 4 非诱导直接寒害n a h 下m i r n a 的表达模式。4 4 小结4 7 3 6 木薯低温胁迫m i r n a 的靶基因预测4 8 4 讨论51 4 1 低温胁迫处理及表达模式分类的可行性评价5 1 4 2 植物耐低温m i r n a 与抗寒性关联性一5l 4 3 植物m i r n a 的组织特异性。5 2 4 4 植物m i r n a 的功能5 3 4 5 植物m i r n a 及其靶基因5 6 5 结论一5 7 参考文献。5 8 附录1 苗期培养营养液配制6 4 附录2 胁迫处理下2 3 个m i r n a 的表达水平总结6 5 附录3 预测得到的1 2 个m i r n a 在蓖麻编码区中互作的4 2 对标靶基因及主要功能6 8 附录4 测序得到的1 1 个m i r n a 在拟南芥编码区中互作的1 3 8 对标靶基因及主要功能 7 0 研究生期间发表的论文情况7 4 1 改谢7 1 ； 1 前言 1 1 木薯是重要的能源作物 木薯( m a n i h o te s c u l e n t ac r a n t z ) ，大戟科木薯属，是世界三大薯类作物之一，全 球第六大粮食作物，享有“淀粉之王 美誉，是世界6 亿人赖以生存的食粮 ( e l - s h a r k a w ym a b r o u k ，2 0 0 3 ) 。在我国，木薯作为新型能源、工业原料和潜在的粮食 作物，具有良好的发展潜力，是热带地区最重要的经济作物之一。现有种植面积5 0 余 万公顷，产量1 0 0 0 万吨，年总产值1 4 0 亿元，潜在面积1 5 0 万公顷，预计年产值在5 0 0 亿元。 木薯起源于热带美洲的巴西与哥伦比亚干湿交替的河谷，在拉丁美洲已有六千年栽 培历史。于十六世纪前由葡萄牙商人从巴西传入非洲几内亚湾和刚果盆地，其后传播至 非洲东部和亚洲地区。至十九世纪末，木薯已在全球的热带地区广泛种植。木薯主要生 长在热带和亚热带地区，广泛分布于南北纬3 0 度之间，海拔2 3 0 0 米以下地区，全世界 有9 0 多个国家种植。我国于1 9 世纪2 0 年代由广东高州引入木薯，广泛分布于华南地 区，广东和广西的栽培面积最大，福建和台湾次之，云南、贵州、四门f 、湖南、江 西等省亦有少量栽培。木薯作为新型的能源作物，其全身都是宝，块根富含淀粉，嫩 茎叶富含蛋白质，老熟茎叶富含纤维。因此，根、茎和叶均可作为人类的食物、动物饲 料和工业加工的原材料。此外，木薯有着自身独特的生物学优势，高光效、高生物量、 高淀粉量，耐瘠薄、抗旱，并且对光、热、水、肥的利用效率也相当高，是一种潜在的 最有效的栽培作物。 近年来，能源与环境压力下发展生物能源成为世界各国的战略需求。随着国际生物 能源产业竞争的日益加剧，木薯原料市场需求将呈现出巨大的潜力。据统计，木薯现阶 段产量只相当于其产量潜力的五分之一，可见其增产潜力巨大。国家科技部表示 ( h t t p ：e p a p c r x p l u s c o m p a p e r s f z x b 2 0 0 9 0 7 0 6 n 6 s h t m l ) ，到2 0 2 0 年，我国石油消费预 计将达到4 5 亿吨至6 1 亿吨，而国内可供量仅1 8 至2 0 亿吨，鉴于这样严峻的能源短 缺压力，我国必须大力发展新能源和再生能源，开发和利用可再生的生物质源能，以燃 料酒精、生物柴油部分代替汽油，以沼气代替煤和天然气。木薯因其突出的高淀粉产量 成为我国发展燃料乙醇工业的重要能源作物。目前我国以木薯为原料生产燃料乙醇的加 工能力已经超过1 0 0 万吨，加上原有较大规模的木薯淀粉产业，每年对木薯原料的需求 远超过现有的生产总量。罗培敏( 2 0 0 2 ) 提出我国未来木薯原料发展的方向应是推广新 品种和丰产栽培技术，提高木薯单产和鲜薯淀粉含量，并在转基因工程的基础上培育适 合于向较高纬度地区发展的具有抗寒性和速生性的木薯品种，在基本不占用原有粮食耕 地的条件下，扩大种植面积和生产规模，提高其能源利用价值。 近年来，关于木薯的研究已具备强大的序列资源。木薯表达序列标签( e x p r e s s e d s e q u e n c et a g s ，e s t s ) 数据资源较丰富，截止2 0 1 0 年4 月2 6 日，美国国家生物技术信息中 心( n a t i o n a lc e n t e rf o rb i o t e c h n o l o g yi n f o r m a t i o n ，n c b i ) 的g e n b a n k 核酸数据库网站注 册的木薯e s t 序列已达8 3 0 2 8 条，可用于木薯m i r n a 的研究，且还在快速增长；美国能 源部( d e p a r t m e n to fe n e r g yj o i n tg e n o m ei n s t i t u t e ，j g i ) 公布的木薯编码序列( c o d i n g s e q u e n c e ，c d s ) ；还有已经释放的大戟科近缘物种蓖麻的4 倍基因组序列；中国热带 农业科学院热带生物技术研究( c h i n e s ea c a d e m yo ft r o p i c a la g r i c u l t u r a ls c i e n c e s ， c a t a s ) 所即将释放的三个木薯品种( 泰国选育高淀粉种k u 5 0 ，野生祖先种w 1 4 和糖 木薯c a s 3 6 ) 的基因组序列及转录组、表达谱数据；届时可利用所有的序列资源，为在 木薯中寻找耐低温相关m i r n a 及其靶标基因提供基础。 1 2 植物的抗寒研究机理 干旱、寒( 冻) 害、高温、盐碱和涝害等逆境条件是严重影响栽培植物生长发育的 非生物胁迫因素，对农业造成了严重的威胁，并且导致环境的日益恶化。非生物胁迫是 造成农作物产量下降的根本因素( b o y e r , 1 9 8 2 ) ，会导致一系列的诸如形态学、生理学、 生物化学、分子生物学等方面的变化从而影响植物的生长以及产量( w a n ge ta 1 ，2 0 0 1 ) 。 干旱、盐碱、高温和寒害等一系列非生物胁迫通常是相互作用的，并且会引发相似的细 胞损害。最终，这些不同的非生物胁迫会产生一些类似的细胞信号途径( s h i n o z a k ie ta 1 ， 2 0 0 0 ：k n i g h te ta 1 ，2 0 0 1 ) 和细胞响应，比如胁迫蛋白的产生，氧化合物的上调，以及溶 解物的积累( v i e r l i n ge ta 1 ，1 9 9 2 ；z h ue ta 1 ，2 0 0 1 ；c u s h m a ne ta 1 ，2 0 0 0 ) 。在植物响应复 杂的非生物胁迫的过程中，会涉及到很多的基因参与以及生物化学分子机制。这些非生 物胁迫的分子机制，在特殊的胁迫基因表达的基础上，引出了抗逆基因工程的一系列分 子研究方法。目前，人们主要通过克隆植物的抗逆基因以及其他不同来源( 如细菌) 的 抗逆基因，并转化到植物对非生物逆境的抗性。由于植物的抗逆反应是一个非常复杂的 生物学过程，其涉及到各种不同的抗逆基因的表达调控，因此，如何从作物自身的遗传 资源出发，利用抗逆基因工程技术挖掘出隐藏在植物体内的抗性调控基因资源从而提高 植物的抗逆性，是摆在生物学家面前的重要课题( 王瑞云等，2 0 0 4 ) 。 低温对植物来说是所有非生物胁迫中最为严重的自然灾害之一，是限制植物自然分 布和栽培区域的主要因素，低温影响植物的生长代谢，引起植物相关生理指标变化，导 致植物受到伤害、减产，严重时还会造成植物死亡。因此，对植物抵抗冷害胁迫方面的研 究一直备受关注。许多植物在非冻低温锻炼一段时间后，体内发生一系列生理生化变化， 对低温适应性能力明显增强，这种现象称为冷驯化( l e v i t t , 1 9 8 0 ) 。实际上，植物的正 常生长发育需要一个适宜的温度环境，低于一定的温度，植物就会受到低温的胁迫甚至 伤害。低温对植物的伤害主要包括0 * c 以上低温对植物造成的寒害，0 以下的低温对植 物造成的冻害以及在温暖期间作物遭受l o 以上的冷害。其中，寒害是热带、亚热带地 2 区最为常见的低温伤害。研究植物的抗寒机制，提高植物的抗寒能力，对于减轻作物遭 遇低温后所造成的伤害，进而改善作物的产量和品质具有重要意义( 任永波，2 0 0 1 ) 。 1 2 1 植物低温生理生化变化 植物对低温胁迫的响应并非是完全被动的反应，而是一种积极主动的应激过程。植 物在低温条件下，体内会发生相应的生理生化变化，如细胞质膜的渗透性、结构和组分 的变化，细胞质流动性的改变，酶活性的改变，光合作用、呼吸作用的变化等( 和红云等， 2 0 0 7 ) ，以最大限度去适应低温环境。植物的应激策略主要有两种，一是代谢的改变， 即胁迫介导的代谢调整：大量表达超氧化物歧化酶( s o d ) 、过氧化氢酶( c a t ) 、抗 坏血酸过氧化物酶( a p x ) 、谷胱苷肽硫一转移酶( g s t ) 等抗氧化酶系可以启动植物 细胞内的一些活性氧清除系统，从而阻止或清除活性氧对细胞结构的伤害；二是在逆境 中细胞体内平衡体系的重建：甜菜碱、脯氨酸、多胺等渗透保护剂的积累可以降低渗透 压来吸收水分，同时体内离子流量的控制和离子区域化对维持体内离子平衡是非常必要 的( 周德宝等，2 0 0 6 ) 。对水稻植株冷驯化的研究发现( k u ke ta 1 ，2 0 0 3 ) ，水稻植株 叶片内的过氧化氢酶( c a t ) 、a p x 以及根部的超氧化物歧化酶s o d 、c a t 、a p x 和 谷光甘肽还原酶( g r ) 的活性显著增强，其中c a t 和a p x 在水稻冷驯化与抗寒中起 的作用最为重要。植物叶绿体中s o d s 的超量表达可保护植物不受冷伤害( m c k e r s i ec t a 1 1 9 9 6 ) 。转基因拟南芥中蔗糖磷酸合成酶( s p s ) 的超表达可促进蔗糖水平的提高， 同时也提高了植株的耐寒程度( s 仃a n de ta 1 ，2 0 0 3 ) 。 1 2 2 植物的抗寒基因的表达及调控 植物抗寒性是植物长期适应低温环境而形成的一种潜在的遗传特性。植物抗寒基因 只是一种诱发基因，只有在特定条件( 主要是低温和短日照) 的作用下，才能启动抗寒 基因的表达，从而发展为抗寒力( 刘鸿先等，1 9 9 1 ) 。w e i s e r ( 1 9 7 9 ) 最先提出植物对低 温适应过程中基因表达改变的观点，同时他还指出多年生木本植物的低温适应可能需要 两个条件：特异基因转录的激活及在最大耐寒过程中新蛋白质的合成。支持w e i s e r 观点 的一个重要证据是g u y 等( 1 9 8 5 ) 用菠菜叶在5 c 诱导产生出的m r n a 。 近年来，人们在多种植物中均发现与低温抗性有关的基因以及其表达产物。低温诱 导基因的鉴定及在植物低温耐性中的调控作用一直是低温驯化研究的一个重要目标。低 温诱导基因表达调控的机理很复杂，迄今，已从很多植物中鉴定出大量的冷诱导基因以 及这些基因的表达产物。这些受冷诱导的基因表达产物可以分为两大类：一类是与植物 抗寒性直接相关的基因的表达产物，可以通过提高不饱和脂肪酸的含量、增a n d , 分子物 质含量、产生抗冻蛋白来提高植物的抗寒性；另一类是调控性基因的表达产物，可以调 控抗寒基因表达、寒冷信号传导，如各种编码信号转导以及调控蛋白的基因，在低温胁 迫中也同样发挥作用( 周德宝等，2 0 0 6 ) 。 3 研究发现抗寒力诱导中基因表达的变化即抗寒性特异性蛋白质的合成很可能主要 发生在转录水平上( 图1 1 ) 。m o h a p a t r a 等( 1 9 8 8 ) 从经冷驯化的苜蓿品种中确认了三 个c o r 基因，并通过构建c d n a 文库以及差异杂交筛选出与抗寒性有关的a b a 控制的 基因。此外，m o h a p a t r a ( 1 9 8 9 ) 用同样方法克隆到三个苜蓿抗寒特异性基因( p s m 7 8 4 ， p s m 2 2 0 1 ，p s m 2 3 5 8 ) ，并研究了它们在转录时的丰富度及积累进程，得出这些抗寒特异性 基因很可能在转录水平上调控，它们在协同性方面受到低温的控制，并且在4 种不同抗寒 性苜蓿中都观察到基因表达和品种的抗寒力呈正相关。迄今，已从抗寒模式植物拟南芥 及其它多种植物中分离鉴定出不少受低温诱导表达的基因。其中，有些基因是冷诱导专 一性基因，而有一些除对低温响应外，还能被a b a 、干旱、高盐等胁迫所诱导，因此， 研究者们认为抗寒作用与a b a 、干旱、高盐逆境因子诱导的抗性具有共同的基因作用 机制( g a t z ，1 9 9 7 ；k a s u g a , 1 9 9 9 ) 。 1 2 3 低温信号转导 低温信号传入细胞、启动或阻遏基因表达需要一个复杂的信号系统，其中包括 c a 2 + 、a b a 、蛋白磷酸化酶、蛋白激酶和一些转录因子等。植物低温驯化时，感受低温 信号到发生一系列生理生化反应和调节基因表达，进而产生抗寒能力，存在一个复杂的 信号网络系统。目前，仍不清楚植物如何感知低温信号并传递低温信号到核内激活转录 因子，进而调节基因转录或引起一系列生理生化反应。生理生化和遗传学实验表明低温 驯化的信号系统与其他逆境( 如干旱、高盐) 信号系统存在交叉性的信号物质和途径。 因此，可以认为植物体内存在一个平行的、多分支的信号网络调控植物抗寒性( x i ne ta 1 ， 2 0 0 0 ) 。 目前大多数研究者认为( k a n g ，2 0 0 2 ) ，c a s + 是传导植物低温信息的第二信使，通 过细胞内c a 2 + 浓度变化引起一些钙依赖型蛋白激酶( c d p k ) 的磷酸化和去磷酸化，诱 导冷调节基因的表达。有试验表明，拟南芥或苜蓿等面临低温胁迫时，细胞外储存的 c a 2 + 流入细胞内使细胞质的c a 2 + 含量水平快速增加。这种c a 浓度的短暂性增加是 诱发抗寒性植物冷适应基因表达和抗寒性提高所必需的( m o n r o ye ta 1 ，1 9 9 5 ) 。拟南芥 中一些受低温调节的基因，如c r t d r e 控制的c o r 6 6 的完全表达必需依赖于c a 2 + 水 平的增加( t a h t i h a r j ue ta 1 ，1 9 9 7 ) 。此外，抗寒锻炼能使冬小麦幼苗和小偃麦质膜上的 c a 2 + - a t p a s e 保持较高的活性，以维持细胞内c a 2 + 水平的平衡( 简令成等，2 0 0 2 ) 。通过 化学和药理试剂的使用，表明c a 2 + 的上升是某些冷调节基因完全表达的必要条件 ( t a h t i h a r j ue ta 1 ，1 9 9 7 ) 。另外，钙依赖型蛋白激酶( c d p k ) 亦参与了冷胁迫应答机制 的信号途径。s a i j o 等( 2 0 0 0 ) 对水稻的研究发现，冷诱导转基因水稻超量表达o s c d p k ， 并且这些植株具有较高的抗盐胁迫和干旱胁迫的能力。除c a 2 + 外，a b a 也一直被认为 参与低温信号转导( c h e ne ta 1 ，1 9 8 3 ) 。此外，日益增加的证据表明蛋白激酶( p k ) 和 蛋白磷酸化酶( p p ) 也参与低温驯化中的信号转导过程( z h ue ta 1 ，2 0 0 7 ) ( 图1 1 ) 。 4 阉磐 ，? i 怕妇止d 1 0 n 、 l h o s u n r o n 簟x 、s o r c s i 1 | c r r n p - e l 矧n 口 a n de x ：，u 1 f h o s 9 图1 1 植物冷害响应机理( z h ujhe t l l ，2 0 0 7 ) f i g1 1c o l d - r e s p o n s i v em e c h a n i s mi np h n 臼 1 2 4 低温逆境蛋白 植物在长期的进化过程中，自身形成了一系列的耐低温机制，人们把在低温驯化下 诱导产生的一系列蛋白称为冷驯化蛋白( c 心) ，也有人将其称为冷调节蛋白( c o i 心) ， 以抗冻蛋白( a f p ) 、脱水蛋白( d 删) 、热激蛋白( h s p ) 等居多。其中植物抗冻蛋白 ( a f p ) 是植物在适应低温过程中产生的抑制冰晶生长的抗寒功能蛋白之一( 尹明安等， 2 0 0 1 ) ；脱水蛋白( d h n ) 是植物在脱水、低温、盐碱、冷冻、渗透胁迫、脱落酸处理 和种子成熟时积累的一个典型的植物蛋白家族，属于l e a d - 1 1 蛋白家族，是对多种逆境 因子响应的一类逆境诱导蛋白( c l o s ee t a n ，1 9 9 7 ) ；热激蛋白又称应激蛋白或热休克蛋白， 是细胞在应激原( 如高温) 刺激下所生成的一组糖蛋白( 陈忠等1 9 9 9 ) 。低温诱导蛋白 质一旦在体内形成，植物体就会尽快地适应外界环境，表现出很强的抗逆性。但目前针 对低温逆境蛋白的研究大多只限于其适应逆境现象的发现，对其内在的发生机制缺乏较 为深入、系统的探讨，对其生物学特性及作用仍缺乏清晰的了解。 1 3m i r n a 研究进展 m i c r o r n a ( m i r n a ) 是一类新发现的广泛存在于真核生物中，非编码的单链r n a 短序列，一般长度为2 0 - - 2 4n t ，由一段具有发卡环结构的长度为7 0 - - 8 0n t 的双链r n a 前体剪切后生成，成熟的m i r n a5 端有磷酸基团，3 端为羟基( b a r t e l ，2 0 0 4 ) ( 图 1 2 ) 。m i r n a 最早发现于秀丽新小杆线虫中( l e ee ta 1 ，1 9 9 3 ) ，随着现代生物技术的 迅速发展，m i r n a 的数量呈几何级数增长( 章文蔚等，2 0 0 6 ) 。植物m i r n a 最先由 r e i r t h a r t 等( 2 0 0 2 ) 从拟南芥小分子文库中获得，总共有1 6 个m i r n a ，其中5 个m i r n a 序列在拟南芥中为单拷贝的，其余1 1 个为多拷贝的( 拷贝数2 7 个不等) 。m i r n a 无 开放阅读框架( o r f ) ，以单拷贝、多拷贝或基因簇等多种形式存在于基因组中，而且 绝大部分定位于基因间隔区，少部分位于基因的内含子，具有自己的转录调控机制，不 翻译成蛋白质( b a r t e l ，2 0 0 4 ) 。在真核生物中，m i r n a 主要通过与靶m r n a 特异性的 碱基配对引起靶m r n a 的降解或者抑制靶m r n a 的翻译两种作用方式来实现对靶基 因的转录后表达的调控( b a