（生物物理学专业论文）产木聚糖酶菌株的诱变及酶学特性的研究.pdf

产木聚糖酶菌株的诱变及酶学特性的研究 摘要 木聚糖酶是一类可降解木聚糖的酶系。木聚糖( x y l a n ) 是一类分子结构变化范围 很大的多糖，其主链由d - 木糖以b 一1 ，4 一糖苷键连接而成，侧链是由许多短的取代基， 如l 一阿拉伯糖残基、4 - 0 一甲基一d 一葡萄糖醛酸残基、o 一乙酰基等组成。木聚糖是自然界 中仅次于纤维素的一类多糖，分布广泛，是一种重要的可再生资源。木聚糖酶是人类利 用木聚糖的重要工具，它在造纸、食品、饲料、生物质转化以及果汁、酒类、咖啡、香 料和色素生产等方面有着广泛的应用前景，已经引起越来越多研究者的重视。米曲霉 ( a s p e r g i l l u so r y z a e ) 在传统发酵食品中应用历史悠久，已被用于工业酶制剂的生产 之中，且是美国f d a 认可的安全微生物菌种。 本论文通过初步筛选，确定米曲霉( a s p e r g i l l u so r y z a ec o h n ，a s3 4 3 8 2 ) 为最 适合诱变菌种，并对其进行诱变，获得一株产木聚糖酶量较高且遗传稳定的突变菌株。 对该突变菌株的产酶条件进行优化，利用双水相法研究了木聚糖酶提取纯化工艺，通过 分析比较酶的产生和细胞生长的关系，确定了该菌株产酶的模式为同步合成型，并由此 建立了该突变菌株的生长模型。试验结果如下： 1 米曲霉的诱变。论文采用紫外诱变和亚硝酸诱变结合的方法对米曲霉进行菌种诱变。 用f 9 目果红平板染色法筛选突变菌株，根据死亡率确定最佳诱变条件为：菌悬液浓度为1 0 x 1 0 5 个，亚硝酸诱变6 0 s ，紫外照射l o s 。经诱变处理后，获得3 株酶活较高的诱变菌 株，其中两株遗传性能稳定。本文选取酶活较高的一株作为后续研究的对象。 2 突变菌株产酶条件的优化。本文采用单因素( o n et i m eo n ef a c t o r ) 实验确定产酶 最优条件为：种龄7 2 h ，接种量5 ，装液量5 0 m l 2 5 0 m l ，转速1 5 0 r m i n ，温度2 8 6 c ，初 始p h 值为5 0 ，发酵周期3 天。通过p l a c k e t t b u r m a n 设计和响应面法( r e s p o n s es u r f a c e m e t h o d o l o g y ，r s m ) 获得突变菌株的最佳培养基配方：麸皮，2 ；酵母膏，1 ；吐温 8 0 ，0 2 5 m i ；磷酸氢二钾，2 6 ；氯化钙，0 5 ；硫酸镁，1 ；硫酸亚铁，0 0 1 6 ； 硫酸锌，0 0 0 6 。 3 利用双水相法提取木聚糖酶。本文利用双水相法对木聚糖酶粗酶进行提纯，确定最 佳纯化条件为：p e g8 0 0 0 、p e g8 0 0 0 浓度为1 9 ( w w ) 、磷酸氢二钾浓度为1 3 ( w w ) 、 氯化钠浓度为0 ( w w ) ，木聚糖酶提取量达到9 7 5 8 。 4 木聚糖酶酶学性质的研究。木聚糖酶的最适反应温度为5 0 ，最适p h 值为5 0 ，在 4 。0 6 。5 之间，酶活可保持在最高酶活的8 0 左右，此酶在酸性条件下较稳定。c o “ 和f e 2 + 对酶有强烈的激活作用，而f e “和b a 2 + 酶活有一定的激活作用。除了c a 2 + 和z n “离 子有较强烈的抑制作用外，p b 2 + 、m 9 2 、c u ：+ 、m n “、l i 2 + 各离子也均有不同程度的抑制作 用，但抑制程度都不大，其残余酶活性均在5 0 以上。 测得该酶在各个温度下的半衰期分别为：5 0 。c 时为1 0 5 m i n ，5 5 。c 时为4 5 m i n ，6 0 时为 1 5 m i n ，4 0 c 时约为3 3 d 。 5 米曲霉生长模型的建立。本文通过比较米曲霉突变菌株的生长曲线和产酶曲线，确 定此突变米曲霉菌株产酶是属于同步合成型，并对米曲霉的生长模型进行了探讨，得到 数学模型式为 n ：1 3 9 3 3 8 8 1 1 + 2 8 7 9 2 2 e “) 。 此模型与实验数据有着较好的拟合性。菌体极限值为1 3 9x1 0 个m l ，最大 比生长速率为0 0 5 9 3 h ，拐点时问值为5 6 6 6 1 h 。 关键词：木聚糖酶。米曲霉，发酵工艺。响应面。双水相 s t u d y o nm u t a g e n e s i ss t r a i nf o rp r o d u c i n gx y l a n a s e a n dp r o p e r t yo fx y l a n a s e a b s t r a c t t h ex y l a n a s ei so n ek i n do fe n z y m ew h i c hm a yd e g r a d et h ex y l a n t h ex y l a ni sp o l y s a c e h a r i d ew h i c h v a r i e sm o l e c u l a rs t r u c t u r ei naw i d er a n g e ，i t sm a i nc h a i nw a sc o m p o s e do fd - x y l o s ew i t hp l ，4 - g l y c o s i d e l i n k a g e 。a n dt h ec h a i ni sc o m p o s e do fm a n ys h o r t 矾删n l c n _ b s u c ha sl - a r a b i n o s u g a r 矗爆i i u e s 4 - m e t h y l - d - g l u e u r o n i ca c i dr e s i d u e s o - a c e t y la n d8 00 1 lt h ex y l a ni sa l li m p o r t a n tr e n e w a b l e 瞄帕i 撇a s s e c o n do n l yt on a n l x mc e l l u l o s et y p eo fap o l y s a e e h a r i d e t h ex y l a n a s ew h i c hi st h eu s eo f x y l a ni m p o r t a n t t o o li np a p e r , f o o d , f o d d e r , b i o m a s sc o n v e r s i o n ，a sw e l la sf r u i tj u i c e s ，w i n e s ，c o f f e e ，s p i c e sa n dp i g m e n t p r o d u c t i o nh a v eaw i d er a n g eo fp o t e n t i a la p p l i c a t i o n s a s p e r g i l l u so r y z a ei nt h et r a d i t i o n a lf e r m e n t e df o o d a p p l i c a t i o nf o rl o n gh i s t o r y , h a sb e e nu s e df o ri n d u s t r i a le n z y m ep r o d u c t i o n ，w h i c hi sr e c o g n i z e ds a f e t y b a c t e r i ab yf d a a s p e r g i l l u so r y z a ec o h n ( a s3 4 3 8 2 ) w a se h o s e da st h em o s ts u i t a b l es p e c i m u t a t i o nw i t ht h ei n i t i a l s c r e e n i n gf o rt h eg e n e t i cs t a b i l i t yo ft h em u t a n t sa n dt h em g h 口p r e d u c t i o no fx y l a n a s e t h ep r o d u c i n g c o n d i t i o no fm u t a n ts u a i nw a so p t i m i z e d t h eu s eo fa q u e o u st w o - p h a s ef o rx y l a n e s ee x t r a c t i o na n d p u r i f i c a t i o nw a ss t u d i e d t h es t r a i n sp r o d u c e dm o d e lw a si d e n t i f i e da ss y n c h r o n i z et y p ea n de s t a b l i s h e d b y a n a l y z i n g t h e t u l l e s o f e n z y m e p r o d u c t i o na n d t h e g r o w t h o f c e l l s t h e r e s u l t sa r e a s f o h o w s ： 1 m u t a t i o no f a s p e r g i l l u so r y z a e u vi n d u c e dm u t a g e n e s i sa n dn i t r o u sa c i di n d u c e dm u t a g e n e s i sw o r o u s e df o rm u t a g e n e s i so fa s p e r g i l l u so r y 嬲e w i t hc o n g or e ds t a i n i n gp l a t es c r e e n i n gm u t a n t s ，m o r t a l i t y r a t e sd e t e r m i n e dt h eo p t i m u mc o n d i t i o n s ：b a c t e r i as u s p e n s i o nc o n c e n l r a t i o nw a s1 0 1 0 lt h et i m eo f n i n i t en m t a g e n e s i sw a s6 0 s ，t h et i m eo f u vi r r a d i a t i o nw a s1 0 s t h em u t a n ts l r a i nw i t hh i g h e ra c t i v i t ya n d g e n e t i cs t a b l ep e r f o r m a n c ew a so b t a i n e db yt r e a t m e n t 2 t h eo p t i m i z a t i o nf o re n z y m ep r o d u c t i o n t h es i n g l ef a c t o r ( o n et i m eo n ef a c t o r ) e x p e r i m e n tw a st o d e t e r m i n et h eo p t i m a lc o n d i t i o n sf o re n z y m ep r e d u e t i o n ：a g e s7 2h o u r s ，t h ei n o c u l u ms i z e5 ，】j q i l i d l o a d i n g5 0 m l 2 5 0 m l ，s p e e d1 2 0 r r a i n ，t e m p e i _ a t o r e2 8o c 。i n i t i a lp ho f5 o t h ef e r m e n t a t i o np e r i o dt h r e e d a y s p l a c k e t x - b u r m a nd e s i g na n ds u r f a c er e s p o n s em e t h o d o l o g y ( r s m ) w 雠a p p l i e df o ro p a n a z i n gt h e n l e d i u m ：b r a n ，2 ；y e a s te x t r a c t , l ：t w e e n8 0 ，0 2 5 m l ；k 2 h p o , ，2 6 ；c a l c i u mc h l o r i d e ，0 5 ； m a g n i u ms u l f a t e ，l ；f e r r o u ss u l f a t e 。0 0 1 6 ；z i n cs u l f a t e 。0 0 0 6 3 t h ee x t r a c t i o no fx y l a n a s ew i t ha q u e o u st w o - p h a s e t h ea q u e o u st w o - p h a s es y s t e mw a sa p p l i e df o r e x t r a c t i o no fx y l a n a s e 。a n dt h eo p t i m u mc o n d i t i o n sf o rt h e p u r i f i c a t i o n ：p e g8 0 0 0 ，p e g8 0 0 0 m c o n c e n t r a t i o no f1 9 xk d t p 0 4a 咖曲即血锄i o f x y l a n a s ey i e l dm o u n t e dt o9 7 5 8 4 x y l a n a s ee n z y m ep r o p e r t i e s t h eo p t i m u mr e a c t i o nt e 雌a t u r eo fx y l a n a s ew a s5 0o c t h eo p t i m a l p hw a g5 o b e t w e e n4 0 - 6 5t h ea c t i v i t i e sc a l lb em a i n t a i n e da tt h eh i g h e s ta c t i v i t yo f8 0 t h i se n z y m ei n a c i d i cc o n d i t i o n sw a sr e l a t i v e l ys t a b l e t h ee n z y m ew a ss t r o n g l ya c t i v a t e db yc 0 2 + a n d 莳+ a n dn o r m a l l y a c t i v a t e db yf e 3 + a n db a 2 + i na d d i t i o nt oc 矿a n dz n “w a sas t r o n gi n h i b i t i o n ，p m 9 2 + , c u 2 + m n 2 + ， l i “ma l lh a v ed i f f e r e n tl e v e l so fi n h i b i t i o n , b u tt h er e s i d u a la c t i v i t y 哪a b o v e5 0 t h ee n z y l n e w a gm e a s u r e di nv a r i o u st e m p e r a t u r ef o rt h eh a l f - l i f e ：5 0o cf o r1 0 5m i l l 5 5o cf o r4 5 r a i n 6 0 1 5 r a i n , 4 。c f o r a b o u t 3 3d a y s 5 t h eg r o w t hm o d e lo fa s p e r g i u u so t y z a e t h eg r o w 血m o d e lo fa s p e r g i l l u so r y z a # w a si m 倘e da s p r o d u c i n gs y n c h r o n i z et y p eb yc o m p a r i s o nt h eo l i v eo fg r o w t ha n de n z y m ep r o d u c t i o n ，a sw e l la st h e g r o w t h m o d e l o f m u t a n t w a s e s t a b l i s h e d t o m a t h e m a t i c a l m o d e l ： n = 1 3 9 3 3 8 8 ( 1 + 2 8 7 9 2 2 c 4 ”、 t h i sm o d e lw a sf i tb e t t e rw i t ht h ee x p e r i m e n t a ld a t a t h el i m i tv a l u eo fb a c t e r i a lw a s1 3 9x1 0 6 m l ，t h e 8 p e c 墒cg r o w t hr a t ew a so 0 5 9 3 h 1 t h ei n f l e c t i o np o i n tf o rt h et i m ew a s5 6 6 6 1 h k e yw o r d s ：x y l a n a s e ，a s p e r g i u u s t w o - p h a s es y s t e m i v 独创性声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研 究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他 人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得吉林农业大学或其它教育机构 的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均 已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。 学位论文作者签名 移掌签字隅哼年步月踟 关于论文使用授权的说明 本人完全了解吉林农业大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权 保留送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或 扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同意吉林农业大学可以用不同方式在不同 媒体上发表、传播学位论文的全部或部分内容。 学位论文作者躲铆糸 签字慨h7 年多月庸 导师签名： 竹、勃 签字隅 心7 年多月口同 吉林农业大学硕士学位论文产木聚糖酶菌株的诱变爱酶学特性的研究 1 1 木聚糖的结构及分类 第一章前言 植物细胞壁主要是由纤维素，半纤维紊和木质素等物质组成。其中半纤维素是仅次 于纤维索，地球上第二丰富的可再生生物资源，约占植物细胞干重的1 5 一3 5 u ，它 的主要成分是木聚糖。木聚糖主要存在于植物细胞的次生壁中，处于木质素及其它多聚 糖之间，起着连接作用，但在有些植物的初生壁中也有发现，如在一些单子叶植物中， 主要起到保护作用吲。 木聚糖是一种杂合多聚分子，主链上由多个吡哺木糖基通过p 一1 , 4 一木糖苷键相连 而成。也有报道指出海藻中含有由b 一1 , 3 一糖苷键连接的木聚糖例，另外在海草类植物 如掌形禾状骨针草中发现了混合有b 一1 , 4 一糖苷键与p 一1 , 3 一糖苷键的木聚糖【4 】。木聚 糖是异源多糖，依来源不同它的侧链取代基也有多种，如0 一乙酰基，l 一阿拉伯呋嘀 糖基，4 0 一甲基葡萄糖醛酸残基等i 习，在木聚糖中还有少量通过l 一阿拉伯糖残基连 接的阿魏酸和香豆酸。另外，无取代基的同型木聚糖也有存在，但仅见于茅草，烟草， 和某些种子的外壳中嘲一般依来源不同可将木聚糖分为以下两类p l ： 1 1 1 硬术木聚糖 硬木植物中的木聚糖含量较高，约占植物细胞于重的1 5 一3 5 ，一般含7 0 个以 上的吡喃型木糖残基，聚合度为1 5 0 2 0 0 。每隔l o 个木糖残基就有1 个4 0 一甲基葡 萄糖醛酸基位于其c 一2 位。硬木木聚糖高度乙酰化，约2 t o o l 木糖残基就含1 m o l 的乙 酰基，乙酰化发生在木糖残基的c 一3 位上，而在c 一2 位取代的情况较少，也有两个 位置均被乙酰化的。乙酰基团的存在与木聚糖的部分溶解性有关，丽在碱抽提时乙酰基 团很容易被除去。 1 1 2 软木及禾本科植物木聚糖 软木植物中的木聚糖含量较低，约占植物细胞干重的7 一1 0 ，禾本科植物中的 木聚糖含量约占2 0 一3 5 。二者的聚合度为7 0 1 3 0 ，平均长度短于硬木木聚糖，分 吉林农韭大学硕士学位论文 产木聚耱毒菌株的谤麦及鹰学特性的研究 支也少于硬木木聚糖。一般在木糖残基的c 一2 位上连接有4 一。一甲基葡萄糖醛酸基或 葡萄糖醛酸基支链。软木木聚糖是非乙酰化的，约1 3 的木糖残基被n l 一呋喃型阿 拉伯糖残基取代，通过一1 , 3 一糖苷键与木糖残基的c 一3 位相连。 瞰傀 f 釜垡蜓i 璺_ 鲑! d 盟 l e r u l i ea c i de 【e 瞄e 图l 木聚糖的结构及蕊的作用位点 f i g 1 ( a ) s t r u c t u r eo fx y l a na n dt h es i t e so fi t sa t t a c kb yx y l a n o l y t i ce n z y m e s t h eb a c k b o n eo ft h e s u b s t r a t ei sc o m p o s e do f1 ，4 - b - l i 玎k e dx y l o s er e s i d u e s ( b ) h y d r o l y s i so f x y l o - o l i g o s a c c h a t i d eb y 3 - x y l o s i d a s e a c , a r a f , m e o l e u a , f e r , p c o u 分别代表乙酰基团、l 一阿拉伯呋哺糖、4 一o 一甲基一d 一葡糖黼、阿魏酸以 及香豆酸 1 2 木聚糖酶产生菌的多态性及木聚糖酶的理化性质 木聚糖酶( x y l a n a s e ) 是降解半纤维素木聚糖的一组酶的总称，从来源上讲有真菌性的 木聚糖酶和细菌性的木聚糖酶，从酶的生产方式来说，又可分为固体发酵和液体发酵， 从作用方式来看，又可大致分为三类：( 1 ) 阱，4 - d 内切木聚糖酶( e c 3 2 1 8 ) ，其作 用是切开木聚糖主链，降低基质聚合度，使木聚糖溶液浓度降低。内切木聚糖酶作用前 期所形成主要产物是聚合度较大的低聚木糖，随着水解的深入，最后生成木二糖、木三 糖，但一般不会生成木糖单糖；( 2 ) b 1 ，4 - d - 夕l , 切木聚糖酶( e c 3 2 1 9 2 ) ，以单个木糖 为切割单位作用于木聚糖的非还原性末端，使反应体系的还原性不断增加；( 3 ) p 一木糖 苷酶( e c 3 2 1 3 7 ) ，切割低聚木糖和木二糖，有助于木聚糖彻底降解为木糖。 2 吉林农生大学硕士学位论文产木豪糖酶菌株的诱变及酶学特性的研究 产木聚糖酶的微生物分布很广，有几十个属、一百多个种，其中包括细菌、放线菌、 真菌以及某些酵母。多数细菌和真菌分泌胞外木聚糖酶，将木聚糖水解成单糖，单糖再 进入微生物细胞供代谢利用。也有一些微生物，如瘤胃细菌、嗜袍粘菌、粘液球菌及黑 曲霉中的一些种类，也产生胞内酶【删 木聚糖酶的分子量范围在8 1 4 5 k d a 之间，等电点分布在p h 3 一1 0 之间，不同微 生物来源木聚糖酶的酶学性质有所不同。细菌木聚糖酶蛋白质亚基比较单一，可大体分 为两类：高分子量的耐酸木聚糖酶和低分子量的耐碱木聚糖酶。一般细菌所产木聚糖酶热 稳定性好，最适作用温度6 5 左右，如b a c i l l u ss p w - 1 的最适p h = 6 ，最适温度6 5 。c u ”。 而真菌产生的木聚糖酶蛋白质亚基较复杂，分子量大小变化也较大，一般情况下多数真 菌产生的木聚搪酶的最适p h 在3 5 5 5 之间，热稳定性较细菌木聚糖酶差，最适温度 在5 0 。c 左右，如a s p e r g i l l u sn i g e r 1 习和t r i c h o d e r m ar f e s e ：1 3 的最适p h 为5 左右，最适 温度4 5 。 极端温度和p h 等环境因素对酶的稳定性有影响，使酶极易失活，这限定了许多酶 的应用。因此，从嗜极性微生物的酶中寻找适合工业应用的木聚糖酶具有广阔的前景。 嗜热性微生物所产木聚糖酶具有较高的最适作用温度，如栖热袍菌( t h e r m o t o g a 够) 木聚 糖酶在p h 5 5 时的最适作用温度为1 0 5 1 3 ，9 5 t 3 时的半衰期为8 0 m i n l l 4 1 ；t h e r m o a $ c 1 4 哼 a u r a n t i a c u s 的木聚糖酶在7 0 时可稳定存在2 4 h ，8 0 时的半衰期为5 4 m i n “”； c e r a t o c y s t i s p a r a d o x a 的木聚糖酶可在8 0 下稳定存在1h f l 国；放线菌中的柔曲小四孢菌 ( m i c r o t e t r a s p o r af l e x u o s as n x ) 内切木聚糖酶在p h 6 0 时的最适作用温度为8 0 0 c u ”。许 多嗜碱性微生物都能产生碱性木聚糖酶，如芽孢杆菌n 8 1 和气单胞菌2 1 2 n 9 1 的最适生长 p h 为1 0 0 ，所产酶在p h 9 1 0 之间十分稳定；费希尔曲霉啪1 所产的耐碱性木聚糖酶 在p h 9 0 时十分稳定。 1 3 木聚糖降解酶系及协同作用 1 3 1 木聚糖降解酶系 由于不同来源的木聚糖主链的聚合度不同，支链残基的种类、数量、长度以及在主 链上结合位点的不同，彻底降解木聚糖需要多种酶的共同参与和协同，因此对应的木聚 糖降解酶系也很复杂，包括口1 0 3 ： 内切p 一1 a d 木聚糖酶( e n d o 1 3 1 a d x y l a n a s e ) 【】叵c 3 2 1 8 1 ，简称木聚糖 酶，其作用是切开木聚糖主链的糖苷键，降低基质的聚合度，主要生成木二糖和木二糖， 很少生成木糖。 吉林农生大学硕士学位论文产术秉希碡茁株曲诱变及磷学特性的研究 p d 一木糖著酶伊一d x y l o s i d a s e s ) t e c3 2 1 3 7 1 ，主要作用于寡聚木糖，从外 部切开低聚木糖或木二糖，并从还原性末端释放出木糖。 q l 一呋哺阿拉伯糠苷酶缸一l a r a b i n o f u r a n o s i d a s e s ) ，分为两种类型，一种是 外切型的i f , 一l 一呋喃阿拉伯糖苷酶i e c3 2 1 5 5 1 ，作用于p 一硝基酚一呋喃型阿拉伯糖 苷和分枝阿拉伯聚糖；另一种是内切一1 ，5 一。一l 一阿拉伯聚糖酶i e c3 2 1 9 9 1 ，只对线 形阿拉伯聚糖有活性。 旺一d 一葡萄糖醛酸苷酶m d 一# u c u r o n i d a s e s ) 【e c3 2 1 1 3 9 ，作用是水解4 一o 一甲基葡萄糖醛酸与木糖之间的n 一1 ，2 一糖苷键，在木聚搪降解过程中与木聚糖酶相互 促进，加剧低聚木糖的产生。 乙酰木聚糖酯l j ( a e e t y l x y l a ne s t e 托s 酷) 口b c3 1 1 7 2 1 ，作用于木糖残基的c 一2 和 c 一3 位上的乙酰取代基团。 酚酸酯酶( p h e n o la i de s t e r a s e s ) 主要包括阿魏酸酯酶( f i l i - u l i c a c i de s t e r a s e s ) e c 3 1 1 7 3 1 和香豆酸酯酶( p - c o u m a r i ca c i de s t e r a s e s ) 【e c3 1 1 一】，前者可切除阿魏酸与 阿拉伯糖残基之间的酯键，后者作用于香豆酸和阿拉伯糖残基之间的酯键。 1 3 2 木聚糖降解酶系的多样性及协同作用 一种微生物通常产生不止一种类型的d 一1 ，4 一内切木聚糖酶，例女 1 ：p e t e rb 从绿色 木霉( t r i c h o d e r m av i r i d e ) 的培养基中分离到了1 3 种木聚糖酶例，另外在粪堆梭菌 ( c l o s t r i d i u ms t e r c o r a r i u m ) ，脱叶链霉菌( s t r e p t o m y c e se 项o l i a m m ) m c i ，里氏木霉 ( t r i c h o d e r ma r e e s e l ) q m 9 4 1 ，气单胞菌( a e r o m o n a ss p ) 2 1 2 【1 9 】，微紫青霉( p e n i c i l h u m j a n t h i n e l l u m ) t 2 5 q 等微生物中发现都至少有3 种以上木聚糖酶存在。除了木聚糖酶以外，p 一木糖苷酶，仉一l 一阿拉伯呋喃糖苷酶，乙酰木聚糖酯酶等也具多样性现象。如瓦曼纳 氏青霉( p e n i c i l l i u mw o r t h m a n n o 产生4 种木糖苷酶；生长在麦杆上的淀粉酶链霉菌 ( s t r e p t o m y c e sd e a s t a t i c u s ) 分泌2 种不同的a l 一呋喃型阿拉伯糖苷酶；里氏木霉 ( t r i c h o d e r m ar e e s e d 产生2 种均为单体糖蛋白的乙酰木聚糖酯酶；生长在纤维素上的新 美丽丝菌n e o c a l l i m a s t i xm c 2 产生个高分子量和个低分子量的阿魏酸酯酶冽等。 t a k e n i s h i 和t s u j s a l 【a 最先在研究中发现了两种木聚糖酶之问的协同作用，其中一种 木聚糖酶负责水解木三糖，而另一种木聚糖酶负责水解阿拉伯糖残基的底物【碉。有一报 道显示在a n i g e r 钾1 和c e r a t o c y s t i s p a r a d o x a c p z 【蚓中也发现了具有协同作用的木聚糖 酶。 另外，p r e v o t e l la r u m i n i c o l ab1 4 圆1 产生的两种木聚糖酶x y i a ，x y n b 中，单独的x y i l b 对木聚糖不作用，但两酶在一起却对该底物的分解有协同作用。zh a r z i a n u me 5 8 产生 的三种木聚糖酶同时存在时。才可以使木聚糖的水解率达到最大。这些都充分说明每一 4 吉林农业大学硕士学位论文 产未聚糖毒酋株的诱变及酶学特性的研究 种类型的木聚糖酶在木聚糖的水解过程中都不是多余的。要将木聚糖彻底分解，需要不 同的木聚糖酶之问和木聚糖酶与木糖苷酶、葡萄糖醛酸糖苷酶、乙酰酯酶等其它类型的 酶的协同作用。但应当注意的是，几种酶在一起时，有时起协同作用，但有时无协同作 用甚至起相互抑制作用，其抑制作用的机制有两种：一是一种酶与木聚糖的紧密结合遮挡 了第二种酶与之结合的位点；二是一种酶作用于底物改变了底物原有的分子构型。 1 4 木聚糖酶的分子生物学 1 4 1 木聚糖酶的分类 根据对糖苷水解酶催化结构域的氨基酸同源性，最初将纤维素酶和木聚糖酶划分为 6 个家族( f a m i l y ( a - f ) 3 1 1 ) ，到现在为止已经增加到了9 6 个家族【3 2 1 。同一家族的酶具有 类似的三维结构、分子作用机制及底物特异性。在这种分类系统中，木聚糖酶往往被分 到第1 0 家族( g 家族) 和第1 1 家族( f 家族) ，但参考最新的文献发现瞄”，第5 、7 、8 、 4 3 家族中也有酶具有内切p 一1 ，4 一木聚糖酶活性，所以木聚糖酶的分类应扩展开来， 共包含第5 、7 、8 、1 0 、1 1 和4 3 家族( 其结构及二维构象见表1 和图2 ) 。 裹1 具木聚糖酶活性的家族的折叠、反应机制和作用位点 t a b l e1g l y c o s i d eh y d r o l a s ef a m i l i e sc o n t a i n i n ge n z y m e sw i t had e m o n s t r a t e da c t i v i t y0 1 1x y l a n t h ef o l d m e c h a n i s m o f a c t i o n a n d c a 诅l y t i cr e s i d u e s c f i c t o e a c h f a m i l y a 把g i v e n a p u t a t v e c a t a l y t i c r e s i d u e s o n l y , t h e s e h a v e n o t b e e n c o n c l u s i v e l y c o n f i r m e d 第5 家族是糖苷水解酶中最大的家族，具多种酶活性，其催化区域与第l o 家族类 似，都具有圆筒形的阶筒结构。第8 家族主要是由纤维素酶组成，分子量较大，在4 5 4 6 k d a 左右，催化域由六个内向和六个外向的a 螺旋组成。第7 家族和第4 3 家族都 只发现一种酶具有木聚糖酶活性，其中第7 家族的是一个非特异性的内切葡聚糖酶，具 5 吉林农业大学硕士学位论文产本聚糖毒菌株的诱变及酶学特性的研究 高分子量和低等电点；第4 3 家族的x y n d 具有木聚糖酶和呋哺型阿拉伯糖苷酶活性，分 子量6 5 k d a ，有5 套b 折叠呈螺旋状排列，以谷氨酸和天冬氨酸为中心在表面形成了一 个长的v 字形的凹槽，这个凹槽可能就是反应的结合位点。 第l o 家族分子量在3 5 k d a 左右，由纤维素结合域及其间的连接区域组成，在n 端 具t - e n m k 的保守序列。晶体学研究显示：第1 0 家族与纤维素酶家族第1 家族具有相 似的蛋白折叠和活性位点，对对硝基苯木二糖和对硝基苯纤维二糖都起作用，其中对前 者的催化效率是后者的5 0 倍。由此说明，第1 0 家族的木聚糖酶虽表现出一定的纤维素 酶活，但该酶主要作用于木聚糖。 第1 1 家族分子量较小，在2 0 k d a 左右，由一些高度特异的低分子量的内切木聚糖 酶组成，在n 端具y g - p - e y y 的保守序列。木聚糖酶折叠成个椭圆形，含有一两个p 折叠片层和一个具有三个圈的螺旋，总的看来就像一个半张开的右手( 见图2 d ) ：两个p 折叠片层通常是由一些反向平行的链组成，有一侧扭转近9 0 度的转角，扭转部分在分 子的一侧形成个裂缝，活性中心就位于裂缝的凹侧面。 懿锄姆罐 f 毒m i l v s 姑锄棚蜜霏 f a m i i y1 0f a m i l y1 1 奄瓷m 国黜 f a m i 哆7 f a m i l y4 3 图2 木聚糖酶不同家族的典型立体构象 h 9 2 r e p r e s e n t a t i v es t r u c a , c c so f e n z y m e sf r o mv a d o u sg l y c o s i d eh y d r o l a s e 细幽( a ) s t r u c u w eo f t h ef a m i l y5e n z y m e ，x y n a , f r o me r w i n i ac h r y s a n t h e m i ( b ) s l r u c u n eo f t h ef a m i l y8x y l a n a s e ，p x y lf r o m p s e u d o a l t e r o m o n a s h a l o p l l d i s t a h 3 a ( c ) s a u c t u r e o f t h e s t r e p t o m y c e s l i v i d a n s x y l a n a s es h o w i n g t h e t y p i c a lf a m i l yi o - f o l d ( d ) s t r u c t u r eo ft h et f i c h o & r m ar s e if a m i l y1 1x y l a n a s es h o w i n gt h et y p i c a l f a m i l y l l - f o l d ( c ) s t r u c t u r e o f t h e t r i e h o d e r m ar e e s e i f a m i l y 7 n o n - s p e c i f i c e g i ( f ) s t r u c t u r e o f t h e c e l l v i b r i o j a p o n i e u sf a m i l y4 3 a - l - a r a b i n a n a s e 网 1 4 2 木聚糖酶的催化机理 6 吉林农韭大学硕士学位论文产木聚糖酶菌株的诱变及酶学特性的研究 木聚糖酶的水解反应是典型的酸碱和亲核水锵反应，根据产物异头物构象的不同， 木聚糖酶降解木聚糖的催化反应可分为两大类，即保持异头拘型的两步置换反应( 图3a ) 和形成倒位异头构型的一步置换反应( 图3b ) 。 保持异头构型的两步置换反应。木聚糖酶的两步置换反应作用方式与溶菌酶反应 机制相似，催化反应第一步是活性位点的g l u 羧基提供一个质子给p 一1 , 4 一糖苷键，使 之断裂，再由带负电的天冬氨酸、谷氨酸或组氨酸稳定过渡态碳。第二步由水分子提供 o h 给木糖的c 1 还原糖残基，提供i - f 给谷氨酸的羧基，使酶复原。 倒位异头构型的一步置换反应。一步置换反应与o 一淀粉酶反应机制相似，是由 酸催化剂g l u 的羧基提供一个质子给b 一1 , 4 一糖苷键，碱催化剂g l u a s p 作用于亲核试 剂h 2 0 ，使h 2 0 中o i - i - 与正碳离子作用，加入羟基，但羟基的异头构型发生倒置。另外， 产生的氢通过扩散与离子化的酸催化剂结合，恢复质子状态。 _ 恻；谢 降p 埘 毒俐二皆 图3 糖苷酶保持异头构型和异头构型倒位的作用机制 ( a ) 保持异头构型( b ) 异头构型倒位 h g 3g 口a lm e c h a n i s m sf o r ( a ) r e t a i n i n ga n d ( b ) i n v e r t i n gg l y c o s i d a s e s 。3 1 1 。4 3 木聚糖酶的分子结构 7 四 产 乎产伽 吉林农韭大学两士学位论文产术聚糖毒菌株的诱麦及酶学特性的研究 近年来，国外对木聚糖酶的结构域研究较多。在分子水平上，木聚糖酶由功能结构 域、非功能结构域和连接区组成，其中功能结构域包括催化结构域、纤维素结合结构域、 木聚糖结合结构域等。有的木聚糖酶只含有单一区域催化结构域，有的同时具备催 化结构域和多种非催化结构域。 1 4 。3 1 催化区结构域( c a t a i y t i cd o m a i n ，c d ) 木聚糖酶的催化结构域( c d ) 决定 了酶的水解特性，是该酶分类的基础。c d 在不同酶中大小上都趋向一致，与纤维素酶 的c d 几乎无同源性，表嘎两酶是从不同的祖先进化而来。木聚糖酶一般只有个c d ， 但也有些含两个c d 如n c o c a l l i m a s t i xf r o n t a l i s 的木聚糖酶和r u m i n o l o c c u sf a v c f a c i e u s 的x y l a n 等嗍。 1 4 3 2 纤维素结合区( c e l l u l o s e b i n d i n gd o m a i n ，c b d ) 纤维索结合区( 衄d ) 在许 多木聚糖酶分子中存在，其功能和氨基酸组成与纤维素酶分子中的c b d 相似。使之既 能水解纤维素，也能水解木聚糖，成为双功能酶。c b d 对木聚糖酶的催化功能不是必 需的，但它可以使木聚糖酶结合在纤维素上，更加靠近底物，调节酶对纤维素底物的特 殊活力。c b d 一般可分为5 个基本类型，其中和型( 长度为1 0 0 - 1 4 0 个氨基酸) 主 要来自细菌产生的酶，而i 型来自真菌产生的酶( 长度为3 6 个氨基酸) 。 1 4 3 3 木聚糖结合区( x y l a n b i n d i n gd o m a i n ，x b d ) 与c b d 相比，木聚糖结合区 ( x b d ) 在木聚糖酶分子中较少存在，可能是木聚糖中带有许多类型的取代