（生物化学与分子生物学专业论文）蛋白质的电喷雾串联质谱法分析和鉴定.pdf

摘要 利用反相高效液相色谱( r p h p l c ) 和电喷雾串联质谱 ( e s i m s m s ) 联用技术直接对模式蛋白分子( 牛血清白蛋白，b s a ) 的胰蛋白酶酶解产物进行分离和测定。获得的一系列b s a 酶解片段 的+ 级( m s ) 和二级( m s m s ) 质谱数据经分析软件处理后，分别 在不同处理和不同参数条件下，用3 种不同的方法通过网上蛋白质 数据库进行蛋白质搜寻鉴定。结果显示，三种搜寻法都能正确地鉴 定该蛋白质，其中以利用m s 数据的肽质量指纹谱搜寻法( p m f 法) 较为快捷方便，但鉴定结果易受数据处理和数据库搜寻鉴定时参数 设置等因素的影响：利用未解折m s m s 数据( r a wm s m sd a t a ) 的 搜寻法町在较宽的搜寻参数变化范围内获得明确的鉴定结果；而借 助从头测序( d en o l os e q u e n c i n g ) 结果的序列搜寻法( s e q u e n c eq u e r y ) 则显示出更高的专一性，利用较少酶解片段数据就能得到稳定和明 确的鉴定结果，搜寻参数变化的影响很小。我们就酶解条件、数据 处理和搜寻参数设置对蛋白质鉴定结果的影响展开了较详细的讨 论，为蛋白质组学研究中的数据处理和库搜寻鉴定积累了可借鉴的 资料。 为建立质谱从头测序( d e n o v o s e q u e n c i n g ) 方法学平台，我们利用 从虎纹捕鸟蛛( s e l e n o c o s m i ah u w e n e n a ) 年h 敬钊缨毛蛛( c h i l o b r a c h y s i n g z h a o ) 粗毒中分离纯化出的虎纹捕鸟蛛毒素v i ( h w t x ，v i ) 和敬钊 缨毛蛛毒素v i i i ( j z t x v i i i ) 两种多肽类神经毒素进行研究。两种毒 素分子的大部分氨基酸序列已由e d m a n 降解法测出，但仍有部分序 列因故未能确定。为了鉴定未知部分的序列，利用电喷雾四极杆一 飞行时间质谱( e s i q t o f ) 质谱仪对两种蜘蛛毒素的酶解产物进行 分析，获得其酶解片段的一级( m s ) 和二级( m s m s ) 蛋谱，在用软件 和手工的方式对含有未知序列的肽段进行解析后，得到未知部分确 切氨基酸序列。研究证明：利用质谱的从头测序( d e h o v os e q u e n c i n g ) 方法在蛋白质和多肽的结构分析和鉴定具有传统方法无可比拟的优 势，是对传统e d m a n 化学降解法的一个很好的补充。 i l l 在前面研究的基础上，我们进行了鼻咽癌细胞系膜蛋白的功能蛋 白质组学研究。鼻咽癌( n a s o p h a r y n g e a lc a r c i n o m a ，n p c ) 是高发于 我国南方的一种恶性肿瘤，其发病率和死亡率均居世界首位。本研 究以鼻咽癌细胞系h n e i 为材料，将培养细胞收集以低渗破膜的方 法分离纯化得到质膜，然后以裂解液抽提出质膜的全蛋白，用2 d p a g e 对膜蛋白进行分离，并以银染显色，得到了清晰的h n e l 膜 蛋白图谱。经p d q u e s t 软件进行图象分析，检测到6 0 0 个左右的 蛋白质点。选取了胶上的2 0 0 个左右蛋白质点切下经脱色，还原和 烷基化处理后，以胰蛋白酶进行酶解，再用e s i q t o f 分析，得到 了质量较好的m s m s 数据，然后在m a s c o t 的s w i s s p r o t 中进行 搜索从而对蛋白质点进行鉴定。其中有1 2 0 个蛋白点得到了归属， 这些蛋白质中大部分为质膜蛋白质如n a + k 十一a t p 酶，热休克蛋白 2 7 ，i n t e g r i n b e t a - 8s u b u n r ，g p r o t e i n c o u p l e dr e c e p t o r ， s e r i n e t h r e o n i n es p e c i f i cp r o t e i np h o s p h a t a s e ，r e c e p t o rp r o t e i nt y r o s i n e k i n a s e ，i n t - 1p r o t e i n 和载脂蛋白受体2 前体等重要的膜上标志性蛋 白。其中的c y s t i cf i b r o s i st r a n s m e m b r a n ec o n d u c t a n c er e g u l a t o r , 属于 i n t e g r a l m e m b r a n ep r o t e i n ，与膜上的氯离子的转运密切相关；而 r e c e p t o rp r o t e i nt y r o s i n ek i n a s e ，则是一种重要的t y p e im e m b r a n e p r o t e i n 与细胞和细胞之间的识别有着密切的联系。 关键词：蛋白质组，e s i q t o f ，b s a ，虎纹捕鸟蛛毒素一v i ，敬 钊缨毛蛛毒素一v i i i ，鼻咽癌，质谱 a b s t r _ a c t a b s t r a c t t h e e n z y m a t i cd i g e s to f b o v i n es e r u m a l b u m i n ( b s a ) ，u s e da sam o d e l p r o t e i n ，w a sd i r e c t l ya n a l y z e db yr e v e r s e d p h a s e h i g h p e r f o r m a n c e l i q u i dc h r o m a t o g r a p h y( r p h p l c ) e l e c t r o s p r a y t a n d e mm a s s s p e c t r o m e t r y ( e s i m s m s ) t h er e s u l t i n gm s a n dm s m sd a t a ，a f t e r b e i n gp r o c e s s e dw i t ha n a l y t i c a l s o f t w a r eu n d e rd i f f e r e n t p a r a m e t e r s ， w e r eu s e df o rt h ep r o t e i ni d e n t i f i c a t i o nt h r o u g hd a t a b a s es e a r c hw f t h t h r e ed i f f e r e n t m e t h o d s a l l t h et h r e em e t h o d sc o u l d i d e n t i f y t h e p r o t e i nc o r r e c t l y p e p t i d em a s sf i n g e r p r i n t ( p m f ) w a st h es i m p l e s ta n d m o s t d i r e c t ，w i t h i t ss e a r c hr e s u l t s b e i n ge a s i l y i n f l u e n c e d b y p a r a m e t e rc h a n g e sd u r i n gt h e d a t ap r o c e s sa n dd a t a b a s es e a r c h u s i n g r a wm s m sd a t ac o u l do b t a i nc o r r e c ti d e n t i f i c a t i o nr e s u l ti nw i d e r c h a n g er a n g eo f d a t a b a s es e a r c hp a r a m e t e r s t h es e q u e n c e q u e r y ( s q ， u t i l i z i n gt h ed ef i o v os e q u e n c i n gr e s u l t sc o u l dm a k es t e a d ya n dd e f i n i t e i d e n t i f i c a t i o nb a s e do nt h ed a t ao faf e wo f p e p t i d e s ，w h i c hw a sh a r d l y i n f l u e n c e db yt h em a i nd a t a b a s es e a r c hp a r a m e t e rc h a n g e s t h ee f f e c t s o f e n z y m a t i cd i g e s t i o n ，d a t ap r o c e s sa n d d a t a b a s es e a r c hp a r a m e t e r so n t h ei d e n t i f i c a t i o no fp r o t e i n sw e r ed i s c u s s e di nd e t a i l ，w h i c hp r o v i d e d r e f e r e n c e sf o rt h e p r o t e o m i c s r e s e a r c h e s j i n g z h a o t o x i n - v i i i a n dh u w e n t o x i n - v ia r e p e p t i d e n e u r o t o x i n s p u r i f i e df r o m v e n o mo f s p i d e r ss e l e n o c o s m i ah u w e n a a n dc h i l o b r a c h y s j i n g z h a o ，r e s p e c t i v e l y t h e m o s to fa m i n oa c i d s e q u e n c e s w e r e d e t e r m i n e db ye d m a n d e g r a d a t i o n ，w i t ha f e wo f s e q u e n c e su n c e r t a i n e d d u et ot h ea m b i g u o u s s i g n a l s i no r d e r t oi d e n t i f yt h eu n c e r t a i n p a r t s ，t h e t w ot o x i n sw e r e d i g e s t e db yt r y p s i n a n dt h e n a n a l y z e db yu s i n g e s i q t o fm a s ss p e c t r o m e t r y b y i n t e r p r e t i n gt h er e s u l t i n gm sa n d m s m s s p e c t r a r e l a t e dt ot h eu n c e r t a i n s e q u e n c e s w i t h a n a l y t i c a l s o f t w a r ea n db yh a n d ，t h ea m i n oa c i ds e q u e n c e so fu n c e r t a i np a r t sw e r e c l e a r l yi d e n t i f i e d t h er e s e a r c hs h o w st h a t ，c o m p a r e dw i t h c o n t r a d i t i o n a l m e t h o d s ，t h ed ef o v os e q u e n c i n gu s i n gm a s ss p e c t r o m e t r yh a sp a r t i c u l a r v 竺! ! 坠塑 a d v a n t a g e s i ns t r u c t u r a l a n a l y s i s a n di d e n t i f i c a t i o no fp r o t e i n sa n d p e p t i d e s ，a n d c a nb eu s e da sa g o o dc o m p l e m e n t f o re d m a n d e g r a d a t i o n m e m b r a n e p r o t e i n sp e r f o r ms o m eo f t h em o s ti m p o r t a n tf u n c t i o n si n t h ec e l l 。t h ep r o t e o m i cd e f i n i t i o no f p l a s m am e m b r a n ep r o t e i n si s a n i m p o r t a n t i n i t i a l s t e p i n s e a r c h i n g f o rn o v e lt u m o rm a r k e rp r o t e i n s e x p r e s s e dd u r i n g t h ed i f f e r e n t s t a g e s o fc a n c e r p r o g r e s s i o n n a s o p h a r y n g e a lc a r c i n o m af n p oi s ac o m m o n l yo c c u r r i n gt u m o ri n s o u t h e r nc h i n aa n ds o u t he a s ta s i a w ep u r i f i e dt h ec r u d ep l a s m a m e m b r a n ef r o mah u m a n n a s o p h a r y n g e a lc a r c i n o m a c e l li i n e 。a f t e rt w o d i m e n s i o n a lg e le l e c t r o p h o r e s i ss e p a r a t i o n ，s i l v e rs t a i n i n g ，e s i q t o f a n a l y s e s ，t r y p t i cp e p t i d e m s m sw e r es e a r c h e df o rm a t c h e si nt h e s w i s s p r o t , n c b ia n d m a s c o td a t a b a s e s o v e r1 2 0 s p o t s w e r e i d e n t i f i e du s i n gt h i sa p p r o a c h ( i n c l u d i n g9 2m e m b r a n e p r o t e i n s ) t h e s e p r o t e i n s i n c l u d et h o s ei n v o l v e di n r e g u l a t i o n o f g e n ee x p r e s s i o n ， a f f e c t e dt h e s i g n a lp a t h w a y ，a l t e r e d t h ec e l l m e t a b o l i s m ，i n h i b i t o r a c c e l e r a t ec e l lp r o l i f e r a t i o n ，i n d u c et h ec e l la p o p t o s i sa n di n t e r v e n e dt h e t u m o ri n v a s i o n t h i ss t u d yo ft h en p c p r o t e o m e ，c o u p l e dw i t hs i m i l a r p r o t e o m ea n a l y s e so f t h ew h o l ec e l l ，t h en o r m a ln a s o p h a r y n g e a lt i s s u e s ， a n do t h e r n a s o p h a r y n g e a l c a r c i n o m ac e l l l i n e s ，n o to n l yd e f i n e st h e p r o t e o m e o ft h en p cm e m b r a n ef o rt h ef i r s tt i m e ，b u ta l s or e p r e s e n t st h e f i r s t s t e p t o w a r d st h ee s t a b l i s h m e n to fp l a s m am e m b r a n e p r o t e i n d a t a b a s e s w h i c ha r ev a l u a b l er e s o u r c e si ns t u d i e so nt h ed i f f e r e n t i a l p r o t e i ne x p r e s s i o n s o fh u m a n n a s o p h a r y n g e a t c a r c i n o m a 。 k e yw o r d s ：p r o t e o m i c s ，b o v i n e s e r u m a l b u m i n ( b s a ) ，h w t x - v i ， j z t x v i i i ，e s i q t o f , n a s o p h a r y n g e a lc a r c i n o m a ，m a s ss p e c t r o m e t r y v i 缩与表 e s i - - q - - t o f 缩写表( 中英文对照) 电喷雾一四极杆一飞行时间质谱f e l e c t r o s p r a y i o n i z a t i o n q u a d r o p o l e - - t i m e o f f l i g h t m a s s s p e c t r o m e t r y ) e s i i t - m s 电喷雾离子阱质潜( e l e c t r o s p a yi o n i z a t i o ni o n t r a p m a s s s p e c t r o m e t r y ) m a l d i t o f m s 基质辅助激光解析电离飞行时间质谱 (m a t r i x a s s i s t e d l a s e r d e s o r p t i o r d i o n i z a t i o n t i m e - o f - f l i g h tm a s ss p e c t r o m e t r y ) c i d 碰撞诱导解离( c o l l i s i o ni n d u c e dd i s s o c i a t i o n l p s d 源后衰减( p o s t s o u r c ed e c a y ) a a氨基酸( a m i n oa c i d ) a c n 乙腈( a c e t o n i t r i l 0 b s a 牛血清白蛋白( b o v i n e s e r u ma l b u m i n ) c c a 0 l 一氰基一羟基肉桂酸( a 。c y a n o 一4 一h y d r o x y c i n n a m i c a c i d ) d t t 二硫苏糖醇( d i t h i o t h r e i t 0 1 ) i a a 碘乙酰胺( i o d o a c e t a m i d e ) d d h 2 0双蒸水( d o u b l l y d i s t i l l e dw a t e r ) r p h p l c 反相高效液相色谱( r e v e r s ep h a s eh i g hp e r f o r m a n c e l i q u i dp h a s ec h r o m a t o g r a p h y ) s d s 十二烷基硫酸钠( s o d i u md o d e c y l s u l f a t e ) h w t x i 虎纹捕鸟蛛毒素i ( h u w e n t o x i n i ) h w t x v i 虎纹捕鸟蛛毒素v i ( h u w e n t o x i n - v i ) j z t x v i i i 敬钊缨毛蛛毒素一v i i i ( j i n g z h a o t o x i n v i i i ) f t i c r - m s傅立叶变换离子回旋共振质谱仪( f o u r i e rt r a n s f o r m i c a t 2 d p a g e i o n c y c l o t r o nr e s o n a n c e m a s s s p e c t r o m e t r y ) 同位素亲和标i g ( i s o t o p e c o d e a f f i n i t yt a g s ) 双向聚丙烯酰胺凝胶电泳( t w od i m e n s i o n a l p o l y a c r y l a m i d eg e le l e c t r o p h o r e s i s ) 缩写衰 f a b m s d e c e ( c z e ) a p s b i s c h a p s e d t a i p g n p 一4 0 t b p t e 【e d t f a t r i s 快原子轰击质谱( f a s ta t o mb o m b a r d m e n tm a s s s p e c t r o m e t r y ) 离子延迟引出( i o nd e l a y e de x t r a c t i o n ) 毛细管区带电泳( c a p i l l a r y z o n e e l e c t r o p h o r e s i s ) 过硫酸胺( a m m o n i u m p e r s u l f a t e ) 甲叉双丙烯酰胺 n ，n7 一m e t h y l e n e b i s 一( a c r y l a m i d e ) 3 一 ( 胆酰胺丙基) 二乙胺卜丙磺酸 乙二胺四乙酸( e t h y l e n e d i a m i n et e t r aa c e t i ca c i d ， e d i t i ca c i d ) 固相p h 梯度( i m m o b i l i z e dp hg r a d i e n t ) 非离子去垢剂( n o n i d e tp 4 0 ) 三丁基磷( t r i b u t y lp h o s p h i n e ) 四甲基, 2 2 胺( n ，n ，n ，n - t e t r a m e t h y l - e t h l e n ed i a m i n e ) 三氟乙酸( t r i f l u o r o a c e t i ca c i d ) 三羟基甲基氨基甲烷 t r i s - ( h y d r o x y m e t h y l ) a m i n o m e t h a n e 】 i i 第一章前言 电喷雾质谱技术在蛋白质组学的应用 随着人类第一张基因序列草图的完成和发展，生命科学的研究 也进入一个崭新的后基因组学时代，即蛋白质组学时代，蛋白质组 学从一出现开始即成为2 1 世纪的最前沿科学之。正如基因草图的 提前绘制得益于大规模全自动毛细管测序技术样，后基因组研究 也将会借助于现代生物质谱技术等得到迅猛发展。质谱技术作为蛋 白质组研究的三大支撑技术之一，除了用于多肽、蛋白质的质量测 定外，还广泛地应用于肽指纹图谱测定以及氨基酸序列测定等。 1 蛋白质组学研究的背景和意义 1 1 蛋白质组学的产生 2 0 世纪9 0 年代开始的人类基因组计划( i u m a ng e n o m ep r o j e c t ， h g p ) 是人类有史以来最伟大的认识自身的世纪工程，旨在阐明人类 基因组d n a 3 1 0 9 核苷酸序列，希望在分子水平上破译人类所有的遗 传信息。经过各国科学家十几年的努力，h g p 已取得了巨大的成绩。 在揭示基因组精细结构的同时，也凸现了基因数量有限性和基因结 构的相对稳定性，这与生命现象的复杂性和多交性之间存在着巨大 的反差。这种反差促使人们认识到：基因只是遗传信息的载体。要 研究生命现象，阐释生命活动的规律，只了解基因组的结构是远远 不够的。对于生命活动的主要体现者蛋白质进行更全面和深入 的研究是目前生命科学研究的迫切需要和重要任务【l 2 l 。后基因组时 代中功能基因组( f u n c t i o n a lg e n o m i c s ) 的研究采用一些新的技术，如 微阵列，d n a 芯片，可对成千上万的基因表达进行分析比较，并从基因 整体水平上对基因的活动规律进行阐述。它摒弃了经典分子生物学 零敲碎打地研究个别基因的习惯，力求从细胞水平上解决基因组问题 以建立对生命现象的整体认识【3 】。但是，生命现象的主要体现者是蛋 第一章前言 白质，而蛋白质有其自身的特定活动规律，仅仅从基因的角度来研究 是远远不够的l3 1 。因此，产生了一门在整体水平上研究细胞内蛋白质 的组成及其活动规律的新兴学科蛋白质组学( p r o t e o m i c s ) 1 2 蛋白质组学的概念 “蛋白质组”是澳大利亚m a c q u a r i e 大学的w i l k i n s 和w i l l i a m s 等 于1 9 9 4 年在意大利的一次学术会议上首次提出的，最早见诸于文献 是在1 9 9 5 年7 月的( e l e c t r o p h o r e s i s j ) 杂志上【4 1 。指的是基因组编码 的全部蛋白质。4 一义上来讲，蛋白质组( p r o t e o m e ) 是指：“一个细 胞或一个组织基因组所表达的全部蛋白质”。蛋白质组是一个动态的 概念，它是对应于一个基因组的所以蛋白质构成的整体，而不是局限 于一个或几个蛋白质。它不仅在同一个机体的不同组织和细胞中表 达情况不同，在同一机体的不同发育阶段、直至消亡的全过程中也不 断变化；机体处于不同生理状态下不同，在不同外界环境下也是不同 的。实际上每一种生命运动形式，都是特定蛋白质群体在不同时间和 空间出现并发挥功能的不同组合的结果。蛋白质组的研究是从整体 水平上研究细胞或有机体内蛋白质的组成及其活动规律，包括细胞 内所有蛋白质的分离、蛋白质表达模式的识别、蛋白质的鉴定、蛋 白质翻译后修饰的分析及蛋白质组数据库的构建【4 l 。这一术语一经提 出，很快得到国际生物学界的广泛关注。第次国际性的“蛋白质组 学”会议于1 9 9 7 年召开，同年出版了第一部蛋白质组学专著。2 0 0 0 年 三月首次发表了一个生物体的完整蛋白质组。2 0 0 1 年二月和同年六 月分别公布了人类基因组框架图和序列图谱，极大地促进了蛋白质 组学的兴起，成为后基因组计划的重要组成部分。 1 3 蛋白质组学研究的主要手段 蛋白质组研究包括对蛋白质的表达模式的研究和对蛋白质功能 模式研究的两个方面。它的核心实验工具是双向凝胶电泳和以质谱 为代表的蛋白质鉴定技术及生物信息学。蛋白质组分析首先要求分 离亚细胞结构、细胞或组织等不同生命结构层次的蛋白质，目前一般 采用1 9 7 5 年由o f a r r e l l 等创立的双向聚丙烯酰胺凝胶电泳技术p j 。 第一章前言 双向电泳图谱通过扫描仪扫描并数字化，通过分析软件( 如 p d q u e s t ) 可对数字化的图谱进行各种图像分析，包括分析蛋白质在 图谱上的定位，分离蛋白质的计数，图谱间蛋白质差异表达的检测等。 对分离出的蛋白质进行鉴定是蛋白质表达模式的又一重要内容。为 适应大规模蛋白质组分析，质谱已成为蛋白质鉴定的核心技术。除此 之外，还有e d m a n 降解法测n 端序列，氨基酸组成分析等。由这些技 术测得的完整蛋白质分子量、蛋白质的肽指纹图谱以及部分肽序列 等数据，通过相应的数据库的搜寻来鉴定蛋白质。生物信息学是蛋白 质组学中的一个重要的技术平台，它研究生物信息的采集、加工、 分析、存储和传播等各个方面，它通过综合应用数学、计算机科学、 工程科学以及生物学的技术、方法分析大量而复杂的生物学数据来 揭示生物学的奥秘，是蛋白质组学中的不可或缺的一部分，其在蛋 白质组学中的研究有两个重要应用：是构建和分析双向凝胶电泳 图谱，二是数据库的搜索与构建【l l 。 1 4 蛋白质组学研究的意义 蛋白质组学这一崭新的研究领域的建立，为我们进行蛋白质结构 的测定，研究蛋白质的修饰加工、转运定位，蛋白质与蛋白质的相互作 用，蛋白质与其它生物分子的相互作用等活动提供了一个思考问题的 新的角度。现在蛋白质组的研究与分析的范围迅速扩展，涉及到蛋白 质组数据库的构建，基因调控机制的分析，细胞分化与发育，肿瘤发生 与发展，医药靶分子的寻找与分析等方面。不难看出，蛋白质组研究与 分析己涉及生命科学中的一系列热点领域。世界上已经有许多公司 看准了它的巨大潜力，争先恐后地投入大量的人力物力到这个新兴的 领域来。目前，澳大利亚、欧洲、日本和美国等已纷纷成立了有关的 研究机构和公司，美国各主要大学和药厂均迅速启动了蛋白质组研 究。蛋白质组研究成果将在医学和工业上得到广泛应用。对人类基 因组在不同病理条件下所表达的蛋白质组的比较研究，和对一些致病 细菌蛋白质组的研究，对了解疾病的原因和防治起到决定性的作用。 现在肺结核杆菌的基因全序列已测定，蛋白质组的研究也已开始运 行。心肌肥大症的蛋白质组研究也早已启动。病原体基因组和蛋白 第漳前言 质组的研究，将发展新的抗菌素。可以预期，蛋白质组研究必将对人类 生活质量的提高和人类寿命的延长起到巨大作用。蛋白质组学是研 究细胞内所有蛋白质及其动态变化规律的科学，它是从更深层次上去 认识生命活动的规律也是基因组计划由结构走向功能的必然与必须， 是生命科学由分析走向综合的必由之路。2 l 世纪生命科学领域内一 个崭新的时代蛋白质组学时代已经开始了。 2 质谱原理、发展及生物质谱技术 2 1 质谱及质谱分析的基本原理 质谱( m a s ss p e c t r o m e t r y ) 是按照化合物分子离子质荷比( m z ) 大小进行分离从而确定化合物分子量的一种分析仪器1 6 。质谱仪能使 物质粒子离子化成离子( 如：质子化或去质子化) 并通过适当的电 场、磁场将它们按空间位置、时问先后实现质荷比( m z ) 分离，并 检测强度后进行分析。质谱仪主要由离子源、离子转运系统和检测 系统三部分组成。 用于分析的样品分子( 或原子) 在离子源中离子化成具有不同 质量的单电荷或多电荷分子离子和碎片离子，这些离子在加速电场 中获得相同的动能并形成一束离子，进入由电场和磁场组成的分析 器，离子束中速度较慢的离子通过电场后偏转大，速度快的偏转小； 在磁场中离子发生角速度矢量相反的偏转，即速度慢的离子依然偏 转大，速度快的偏转小；当两个场的偏转作用彼此补偿时，它们的 轨道便相交于一点。与此同时，在磁场中还能发生质量的分离，这 样就使具有同一质荷比而速度不同的离子聚焦在同一点上，不同质 荷比的离子聚焦在不同的点上，其焦面接近于平面，在此处用检测 系统进行检测即可得到不同质荷比的谱线，即质谱【7 一 。通过质谱分 析，我们可以获得分析样品的分子量、分子式、分子中同位素构成 和分子结构等多方面的信息。 2 2 质谱技术的发展 第一章前吉 质谱的开发历史要追溯到2 0 世纪初j j t h o m s o n 创制的抛物线 质谱装置，1 9 1 9 年a s t o n 制成了第一台速度聚焦型质谱仪，成为了 质谱发展史上的里程碑1 6 1 。 最初的质谱仪主要用来测定元素或同位素的原子量，随着离子 光学理论的发展，质谱仪不断改进，其应用范围也在不断扩大，到 2 0 世纪5 0 年代后期已广泛地应用于无机化合物和有机化合物的测 定。 现今，质谱分析的足迹已遍布各个学科的技术领域，在固体物 理、冶金、电子、航天、原子能、地球和宇宙化学、生物化学及生 命科学等领域均有着广阔的应用。质谱技术在生命科学领域的应用， 更为质谱的发展注入了新的活力，形成了独特的生物质谱技术。 2 3 生物质谱技术 复杂的生化分析在几年前还只是梦想，而现在已经成为可能。研 究蛋白质的相互作用对了解生命中的信号系统是非常重要的，这种 非共价生物分子复合物如今可用e s l 分析，这一方法在速度，灵敏 度和鉴别实际的相互作用方面都优于其他方法。质谱分析方法是相 对便宜的方法，因此这一技术迅速在世界各地的实验室传播。今天， 软激光解吸( 以m a l d i 的形式) 和电喷雾已经成为多肽，蛋白质 和糖结构分析的标准方法。这使得迅速分析完整细胞和活组织中的 蛋白质成为可能。 电喷雾电离质谱技术和基质辅助激光解吸附电离质谱技术是诞 生子8 0 年代末期的两项软电离技术。这两项技术的出现使传统的主 要用于小分子物质研究的质谱技术发生了革命性的变革。它们具有 高灵敏度和高质量检测范围，使得在p m o l ( 1 0 1 2 ) 甚至f m o l ( 1 0 3 ) 的水平上准确地分析分子量高达几万到几十万的生物大分子成为可 能，从而使质谱技术真正走入了生命科学的研究领域，并得到迅速 的发展o 】。 2 3 1 电喷雾电离质谱技术( e s i ) 第一章前言 电喷雾电离质谱技术( e l e c t r o s p r a yi o n i z a t i o nm a s ss p e c t r o m e t r y e s i m s ) 是美国耶鲁大学f e n n 教授和他的同事在8 0 年代后期提出 的。他们用e s i 使一个4 0k d a 的大蛋白生成完整的多电荷气相离子 】。电喷雾技术就是在毛细管的出口处施加一高电压，作用于经喷 雾头进入离子化室的溶液，再将3 6 k v 的电压加到毛细管和相对的 电极之间，电压导致毛细管末端的液滴表面的电荷增强，高电压导致 液体表面分裂和多电荷液滴的形成，与毛细管相对的电极携带的正电 荷或负电荷以产生正电荷或负电荷液滴。随着溶剂蒸发，液滴表面 的电荷强度逐渐增大，最后液滴形成大量带一个或多个电荷的离子， 使分析物以单电荷或多电荷离子的形式进入气相【l “挖1 。对于电喷雾 的整体而言，带电液滴的形成是整个电喷雾过程的第一步，接下来的 离予化是进行电喷雾分析的关键【1 2 1 17 1 。带电液滴形成分子离子的机 理还不十分清楚。随着现代技术的发展，电喷雾与串联质谱( m s m s ) 相连，即能为化合物提供很多结构信息。 电喷雾离子化的特点是产生高电荷离子而不是碎片离子，使质 量电荷比( m z ) 降低到多数质量分析仪器都可以检测的范围，因而 大大扩展了分子量的分析范围，离子的真实分子质量也可以根据质 荷比及电荷数算出。电喷雾质谱的优势在于它可以方便地与多种分 离技术联合使用，如液一质联用( l c - - m s ) 是将液相色谱与质谱联 合而达到检测大分子物质的目的l l 7 喵j 。 2 3 2 基质辅助激光解吸附电离质谱技术( m a l d i - t o f ) 基质辅助激光解吸附电离质谱技术( m a t r i xa s s i s t e d l a s e r d e s o r p t i o n i o n i z a t i o n ，m a l d i ) 的基本原理是将分析物分散在基质 分子中并形成晶体，当用激光照射晶体时，由于基质分子经辐射所 吸收的能量，导致能量蓄积并迅速产热，从而使基质晶体升华，致 使基质和分析物膨胀并进入气相。m a l d a i 所产生的质谱图多为单 电荷离子，因而质谱图中的离子与多肽和蛋白质的质量有一对应 关系盼1 3 1 。 m a l d i 产生的离子常用飞行时间( t i m e o f - f l i g h t ，t o f ) 检测器 来检测，理论上讲，只要飞行管的长度足够，t o f 检测器可检测分 子的质量数是没有上限的，因此m a l d i 。t o f 质谱很适合对蛋白质、 多肽、核酸和多糖等生物大分子的研究。1 9 9 5 年，m l v e s t a l 等把离子延迟引出( i o n d e l a y e de x t r a c t i o n ，d e ) 技术应用于m a l d i m s 中，不但提高了m a l d i - - m s 的分辨率，而且也开创了质谱 应用于d n a 研究领域的新局面。国内邓慧敏等也应用d e m a l d i m s 法测定了混合碱基d n a ，获得了高分辨率的d n a 质谱 图l 1 4 , 1 5 1 。 2 3 2 快原子轰击质谱技术( f a b ) 快原子轰击质谱技术是一种软电离技术，是用快速惰性原子射击 存在于底物中的样品，使样品离子溅出进入分析器，这种软电离技 术适于极性强、热不稳定的化合物的分析，特别适用于多肽和蛋白 质等的分析研究。 快原子轰击质谱( f a b m s ) 能提供有关离子的精确质量，可以 确定样品的元素组成和分子式。而f a b m s m s 串联技术的应用可 以提供样品较为详细的分子结构信息，从而使其在生物医学分析中 迅速发展起来6 1 2 1 。 2 3 4 同位素质谱 同位素质谱是一种开发和应用比较早的技术，被广泛地应用于各 个领域，但它在医学领域的应用只是近几年的事。由于某些病原菌 具有分解特定化合物的能力，该化合物又易于用同位素标示，人们 就想到用同位素质谱的方法检测其代谢物中同位素的含量以达到检 测该病原菌的目的，同时也为同位素质谱在医学领域的应用开辟了 一条思路【1 6 】。 3 电喷雾电离质谱技术( e 8 l 州s ) 在蛋白质组学研究中的应 用 7 随着电喷雾电离质谱( e s i m s ) 技术的不断改进和完善，电喷 雾电离质谱的应用范围已扩展到生命科学研究的许多领域，特别是 在蛋白质、医学检测、药物成分分析及核酸等领域的应用，不仅为 生命科学研究提供了新方法，同时也促进了质谱技术的发展。 e s i 是当今有机质谱中最软的电离技术，蛋白质在阳离子或阴离 子e s i 时，分别生成一系列 m + n h 叶或 m n i l ”的多电荷离子。 e s i m s 的最重要进展是w i l m 和m a n n 引入了纳电喷雾源( n a n o e l e c t r o s p r a yi o n i z a t i o ns o u r c e ，n a n o e s i ，纳升流速) u 生”j ，n a n o e s i 不 仪提高了分析的灵敏度，而且少至o 5 止的样品溶液，可得到3 0 多分 钟的稳定喷雾，以致有充分的机会使m s 的参数最佳化和进行许多串 联质谱分析 2 1 , 2 2 1 。e s i 源最常用的分析器是单级四极杆分析器和三级 四极分析器( t r i p l eq u a d r u p o l ea n a l y z e r ) 。e s i 源与单级四极分析器组 成的e s i m s 主要用于测定多肽和蛋白质的分子量。而e s i 源与三 级四极分析器组成的串联质谱仪( e s i m s m s ) ，在分析混合物时有高 度的号一性。在e s i m s m s 分析中，多肽混合物被e s i 源电离后，第 一级m s 选择特定m z 的多肽离子通过并进入碰撞活化室，在碰撞活 化室内肽离子与惰性气体碰撞发生碰撞诱导解离( c o l l i s i o ni n d u c e d d i s s o c i a t i o n ，c i d ) 生成碎片离子，第二级m s 对裂解生成的碎片离子 进行分析。c i d 也可在离子源内发生，但源内c i d 不能选择离子故不 适合混合物分析。e s i 产生的离子特别适合c i d ，因为多肽的高电荷 状态增加了碰撞能量【2 3 1 。多肽c i d 时的碎裂作用优先发生在酰胺键 上，生成专的序列离子。当酰胺键断裂形成离子时电荷保留在n 端 的碎片上定名为a , b ，c 离子，当电荷存在于c 端的碎片上时称之为 x , y ，z 离子 2 4 1 。通常在低能裂解条件下，c 和z 离子一般观察不到。a 离子是从相应的b 离子失去c o ( 2 8d a ) 形成的。有时也可