（分析化学专业论文）基于无机纳米材料的蛋白质组学新技术研究.pdf

复旦土学硕士论文 摘要 随着人类基因组计期的完成，蛋白质组学研究日益受到人们的重视，使得蛋 白质组学成为后基因组时代的热门研究领域之一。蛋白质组学分离和分析细胞和 组织的全部蛋白并直接找到一组或几组功能蛋白，并研究它们与功能基因( 组) 的内在联系。在目前功能基因尚不很清楚的情况下，直接发现功能蛋白组具有重 要的意义。目前蛋白质组学的研究主要集中在通过蛋白质的性质、丰度的考察来 揭示它的功能，进而找到与人类重大疾病相关的差异蛋白，使之成为药物筛选的 靶分子，指导基因组的分析，而不是仅仅尾随d n a 序列分析的结果。 蛋自质组学选正在成为分析化学硬究的最前沿领域，丽蛋白质组学的科学研 究之所以能够取得蓬勃的发展，主要依赖于高通量分离和分析技术的突破性进 展。首先是双向电泳技术的不断完善，使得蛋白质的大范围、高通量分析成为可 能。其次多维色谱分离技术的不断发展大大加强了蛋白质组学分析的自动化程 度，大有替代双向电泳的趋势。再次是质谱技术尤其是软电离技术的发展，饿之 成为检测蛋白质分子的重要手段。最后是生物信息学的建立使得国际性的科学大 协作得以形成。 本论文工作包括两部分内容：第一部分主要研究s b a 一1 5 介孔分子筛在蛋白 质缀学研究中的应用。目前介孔材料由于其大的比表面积，大的孔容，均一的孔 径，可控的拓扑结构和容易修饰的表面丽在催化、吸附解吸、生物分子的分离等 方面具有重要的应用前豢。第：二部分主要研究通过控制三价铁离子的水鳃反应来 富集磷酸化蛋白，从而为磷酸化蛋白的大规模分析奠定基础。磷酸化修饰是生物 体内最重要的蛋白质翻译后修饰之，蛋白质的磷酸化与去磷酸化过程是真核细 胞生命活动最普遍的调空手段。对磷酸化蛋白的检测和磷酸化位点的确定是认识 蛋文质磷酸化在生命活动中调控机制的重要参考信息，用蛋白质组学的策略舌开究 生物体内的磷酸化修饰也是功能蛋白质组学研究的重要内容。由于磷酸化蛋白在 生物体内含量很低，对它的检测一窟是个艰难的工作，而磷酸化蛋白的规模分析 更是磷酸纯蛋自质组研究面临晌技术挑战。 论文第一部分我们研究s b a 1 5 对蛋白的富集和随后的酶解。实验表明蛋白 的富集过程很快，而且与蛋白初始浓度无关，而蛋白浓度的增加提高了蛋白酶解 的效率。相比溶液蛋白酶解，无论在质谱谱图质量还是蛋白氨基酸序列覆盖率方 面，在s 8 a1 5 上的蛋白原位酶解显现出巨大优势，同时溶液中大量的t r y p s i n 复旦土学硕士论文 在酶解过程中不断吸附在材料上，更增加了蛋白酶解效率。因此s b a 一1 5 对蛋白 的高效富集和随后的高效酶解为蛋白质组学中低丰度蛋白的检测提高了很好的 技术手段。 论文第二部分我们研究通过三价铁离子水解反应来富集磷酸化蛋白的方法。 实验发现溶液p h 在磷酸化蛋白富集和非磷酸化蛋白去除中扮演关键的角色，得 到优化的p h 条件是实验成功的关键。我们通过理论计算和实际检测得到了合适 的三价铁离子水解p h ，从而得到磷酸化蛋白。最后蛋白检测采用蛋白分子量检 测和靶上酶解来鉴定蛋白，这样的分析方法快速、简单和可靠。通过对三价铁离 子水解反应来富集磷酸化蛋白现象的研究，我们希望该技术能够为磷酸化蛋白质 组学研究做出贡献。 关键词：蛋白质组学，硅基介孔材料分子筛，蛋白富集和原位酶解 m a l d i t o f t o f ，磷酸化蛋白，三价铁离子水解。 复旦土学硕士论文 a b s t r a c t s c i e n t m ci m e r e s t sh a v e b e e n m c r e a s i n 9 1 ys h i f t i n g t o p r o t e o m i c s w i t ht h e a c c o m p l i s l l i n e n to fg e n o m i cs e q u e n c e s p m t e o m i c sr e f e r st ot h ea i l a l y s i so fa um e p r o t e i n se x p r e s s e di nac e l lo rt i s s u e t h ei n v e s t i g a t i o no ff h n c t i o n a lp r o t e o m ei so f g r e a ts i g n i f i c a n c ee s p e c i a l l yn o wt b ef u n c t i o n so fm o s to fg e n e sa r es t i l ln o tw e l l u n d e r s t o o d y e t p r e s e n t l yp r o t e o m i c s r e s e a r c hf o c u s e so nd i 饪b r e m i a lp r o t e o m e a n a l y s i so fh u m a nd i s e a s e s ，w h i c hi sd e s i g n e dt of i n dk e yp r o t e i n sw i t hp o t e n t i a l st o b e u s e da sm a r k e r sf o rd i a g n o s i so rt a r g e t sf o rm e d i t 砒i o n p r o t e o m i c si sa l s o b e c o m i n gt h es p o t l i g h to fa n a l y t i c a lc h e m i s t r y t h ef h s td e v e l o p m e n to fp r o t e o m i c s r e l i e so n b r e a k t l l r o u 曲s i n h 砂t k o u 曲p u ta i l a l y t i c a lt e c l l n o l o g i e si n c l u d i n g t w o d i m e n s i o n a l e l e c t r o p h o r e s i s ， m u l t i d i i 工l e n s i o n a l c h d m a t o g r a p h i cs e p a r a t i o n ， b i o l o g i c a lm a s ss p e c 打o m e t i ya 1 1 db i o i i l f o h n a t i c s t h i sd i s s e n a t i o nc o n s i s t so ft h r e ec h a p t c r s i nc h a p t e r2 ，协e 叩p l i c a t i o no f m e s o p o r o u s m a t e r i a ls b a l5t o p r o t e o m i c sh a s b e e ni n v e s t i g a t e d i e s o p o r o u s m a t e r i a l sh a v em a n yp o t e m i a li nc a t a l y s i s ，s o r p t i o n ，b i o m o l e c u i a re i l r i c l u n e n ta n d c o n t r 0 1 l e ds ”t h e s i s 。fn a n o s t r u c t u r e so ns i z ea n dd i m e n s i o nd u et ot h e i r l a r g e s p e c m cs u r f a c e ，l a r g ep o r ev o l u m e ，u n i f o mp o r es i z e ，c o n t r o l i a b l em o r p h o l o g y ，a 1 1 d e a s i l y 如n c t i o n a l i z e ds u r f a c e i nm es e c o n dc h a p t er ，as i m p l ea n a l y t i c a lm e t h o do f e 耐c h i n gp h o s p h o p r o t e i n sb a s e d o ni r o n ( 1 1 i ) h y d r 0 1 y s i sh a sb e e nd e m o n s 订a t e d p r o t e i np h o s p h o r y l a t i o ni so n eo ft h em o s ti m p o n a l l tp o s t t r a l l s l a t i o n “m o d m c a t i o n i nc e l l s ，a n dt h er e v e r s i b l ep h o s p h o r y l a t i o no fp m t e i n sr e g u l a t e sn c a r l ye v e r ya s p e c t s o fc e ul i f es u c ha sc e l lc y c l e ，d i 丘色r e m i a t i o na 1 1 dd e v e l o p m e m ，m e t a b 0 1 i s m ，n e r v e a c t i v i 觋 m u s l e c o n s t r i c t i o n ，a n dt r a n s c r i p t i o n a lr e g u l a t i o n s o d e t e c t i n g p h o s p h o p r o t e i n sa 1 1 dd e n n i n gt h e i rp h o s p h o r y l a t i o ns i t e s a r ev e r yi m p o r t a n tt ot h e u n d e r s t a n d i n go fm e c h a n i s mb yw h i c hp h o s p h o l y l a t e dp r o t e i na 虢c t sab i o l o g i c a l p a t h w a y a n a l y s i so ft h ee m i r ec o m p l e m e n t so fp h o s p h o r y l a t e dp r o t e i n si nc e l l s ，o r t h e “p h o s p h o p r o t e o m e ”，h a sb e c o m eak e yp a r to f 劬c t i o n a lp r o t e o m i c sr e c e n t l y h o w e v er ，b e c a u s et h es t o i c h i o m e 廿yo fp h o s p h o r y l a t i o ni sg e n e r a l l yl o w ，a n a l y s i so f p h o p h o p r o t e i n si sn o ts t r a i g h t f o r w a r d 眦dal a r g e s c a l ea n a l y s i so f p h o s p h o p r o t e i i l si n ac e l lo r t i s s u ei ss t i l la b i gt c c c a lc h a l l e n g ei np h o s p h o p m t e o m i cr e s e a r c h i nc h a p t e r2 ，t h ed i s s e r t a t i o nw a sf o c u s e do nm ea p p l i c a t i o n so fs b a 一1 5o ft h e 复旦土学硕士论文 e n r i c l l i n e n to fp r o t e i n sa n ds u b s e q u e n ti n - s i t u 姆p t i cd i g e s t i o n t h ee 血c 上u 1 1 e n ti s r 叩i d ，a i l dt h ei n c r e a s e m e n ti np r o t e i nc o n c e m m t i o np r i o rt od i g e s t i o n “s oi m p f o v e s m ek i n e t i c so ft h ee n z y m ed i g e s t i o n c o m p a r e dt om e i n - s o l u t i o nd i g e s t i o n ， d r 跚a 廿ci m p r o v e m e n t sf o rd i g e s t i o ne 筋c i e n c yi ns b a 1 5 、e r eo b s e r v e d i na d d i t i o n ， n y p s i nc a j lb ei m m o b i l i z e do n t o 血es b a 一15a n dr e t a i nah i 曲c o n c e m r a t i o n t h c r e s u l t i n gp e p t i d e m a s sm a p sh a v eb r o a d s e q u e c ec o v e r a g e sa n dl l i 曲s i g n a l i n t e n s i t i e s t h u s 血i sm e t h o d 叩e n s ap r a c t i c a l w a y t o也ed e t e c t i o na 1 1 d c h a r a c t e r i z a t i o no f t r a c ea m o u m so f p m t e i n sb ym a s ss p e c 订o m e t r y i n c h 印t e r3 ，w er e p o n h e r ea s i m p l ea n a l y t i c a l m e t h o do f e n r i c h i n g p h o s p h o p r o t e i n sb a s e do ni r o n ( i i i ) h y d r o l y s i s t h eo p t i m i z a t i o no fp hi sak e yt o s u c c e e d i n g i n血ee n r i c h e m e n to fp h o s p h o p m t e i n s a 1 1 d 廿1 er e m o v a lo f u n p h o s p h o p r 。t e i n s a tl a s t ，o n t a r g e tt r y p t i cd i g e s t i o na n dp r o t e i nm o l e c u l a rw e i g h t d e t e c t i o na r ea d o p t e dt o i d e n t i f yp h o s p h o p r o t e i n s t h en e wp r o c e d u r eo ft h e e i c h m e n to fp h o s p h o p r o t e i n sa n ds u b s e q u e ma n a l y s i si s v e r yf a s t ，s i m p l ea n d e 行b c t i v e ，a n dw i l ib eac o n t r i b u t i o nt op h o s p h o p r o t e o m e k e y w o r d s ：p r o t e o m i c s ，m e s o p o r o u ss i l i c a s ( m p s ) ，p r o t e i ne 血c l l i i l e ma i l di n - s i t u d i g e s t i o n ，m a l d i t o f t 0f ，p h o s p h o p r o t e i n s ，i r o n ( i i i ) h y d r o l y s i s 论文独创性声明 本论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。论文中除 了特别加以标注和致谢的地方外，不包含其他人或其它机构已经发表或撰写过的 研究成果。其他同志对本研究的启发和所做的贡献均己在论文中作了明确的声明 并表示了谢意。 作者签名： t 趣 论文使用授权声明 日期： 2 口0 66 本人完全了解复旦大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留 送交论文的复印件，允许论文被查阅和借阅；学校可以公布论文的全部或部分内 容，可以采用影印、缩印或其它复制手段保存论文。保密的论文在解密后遵守此 规定。 作者签名： 萑垫导师签名： 日期：一：皇 复旦太学硕士论文 第一章前言 1 1 噩白质组学的研究进展 1 1 1 基于生物质谱的蛋白质缢学研究方法 a ) 生物质谱篾分 生物质谱( b i o m a s ss p e c 【r o m e t r v ) 在最近2 0 年间得到了迅猛发展。由于具 有迅速、灵敏、准确的优点，并能进行蛋白质序列分析和翻译后修饰分析，质谱 已经无可争议地成为蛋白质缀学中分析与鉴定肽移蛋自质的最重要的手段。 生物质谱技术在离子化方法上主要有两种软电离技术，即基质辅助激光解吸 电离( m a t r i x - a s s i s t e dl a s e rd e s o r p t i o ni o n i z i a t i o n ，m a l d i ) 和电喷雾电离( e l e c t r o s p r a yi o n i z a t i o n ，e s i ) 。m a l d i 是在激光的激发下，使样品从基质晶体中挥发 并离子化，它可测的分子量高达3 0 万，对盐和表面活性剂有较强耐受力，适于分 析简单的肽混合物，通量较高，因此在利用肽指纹图谱高通量鉴定蛋白质方面有 极其广泛的应用；e s i 使分析物从浴液相中电离，适合与液相分离等手段( 如液 褶色谱和毛细管电泳) 的在线联用( l c e s i m s ) ，适合复杂样品的分析。 软电离技术的出现太大拓展了质谱的应用空间，而质量分丰厅器的改善也大大 推动了质谱仪器技术的发展。对于生物质谱来说，最重要的性能是灵敏度、分辨 率、质量精度和串级质谱能力。生物质谱的质量分析器主要有四种：离子阱( i o n 廿印，i t ) 、飞行时间( 百m eo f f l i g h t ，t o d 、四极轷( q u a d n l p o l e ，q ) 和付立叶变 换离子回旋共振( f o u r i e rt m s f o h ni o nc y c l o t r o nr e s o h a n c e ，f t l c r ) 。它们的结构和 性能各不相同，每一种都有自己的长处与不足。它们可以单独使用，也可以互相 组合形成功能更强大的仪器。 离子阱质谱灵敏度较高，性能稳定，具备多级质谱能力，因此被广泛应用于 蛋白质组学研究，不足之处是质量精度较低。最近发展起来的线性( 或称两维) 离子阱与传统的三维离子阱不同，离子可储存在一个圆柱状的空间内，显著改善 了离子阱质谱的灵敏度、分辨率和质量精度。与离子阱相似，傅立时交换离子回 旋共振质谱也是一种可以“捕获”离子的仪器，但是其腔体内部为嵩宾空和高磁 场环境。它具有高灵敏度、宽动态范围、极好的分辨率和质量精度( 质量准确度 可很容易地小于l p p m ) 。这使得它可以在一次分析中对数百个完整蛋自质的分 子进行质量测定和定量。f t i c r m s 的一个重要功能是多元串级质谱。与通常的 一次只能选一个母离子的串级质谱方式不同，f t i c r m s 可以同时选择几个母离 子进行解离，这无疑可以大大增加蛋白质鉴定工作的通量。但是它的缺点也很明 显：操作复杂、肽段断裂效率低、价格昂贵等。这些缺点限制了它在蛋白质组学 中的广泛应用。但最近市场上出现了l t 。f t m s 极好的综合了离子阱和傅立叶变 复旦土学硕士论文 换离子馘旋共振的优点，这必将极大促进蛋白质缀学的发展，见图卜l 。 f i g u r e1 一l s c h e m a t l co tah y d n di i n e a rl o nt r a p o r b l t r a pm a s ss p e c t r o m e t e r m a l d i 通常与t o f 质量分析器联用，以获得肽段的精确质量，而b s i 常与 离子阱或三级四极杆质谱联用通过碰撞诱导解离( c 0 1 1 j s i o n i n d u c e dd i s s o c i a t i o n ， c 渺) 获取肽段的碎片信息。近年来新型的质谱技术层出不穷，对蛋自质组研究 将产生潜在的深远影响m a l d i q 。t o f 这一先进平台的出现，为自动化高通量的 应用提供了广阔的前景。0 一t o f 优异的质量精度、灵敏度和碰撞伴随电离( c a d ) 能力改善了数据库搜索结果，并饺其成为手工( d en o v o ) 测序的有力工具。 b ) 双向凝胶电泳一质谱技术 双向凝胶电泳( t w o _ d i m e n s i o n a lg e le l e c 仃o p h o r e s i s ，2 d e ) 在19 7 5 年由 o f a r r e l l 以及k l o s e 和s c h e e l e 等人提出。2 d e 的基本原理是，第一狸为等电聚焦， 基于蛋白质等电点的不同进行分离，第二相为s d s 一聚丙烯酰胺凝胶电泳，按分 子量的不同进行分离。样品经过电荷和质量两次分离后，可以得到分子的等电点 和分子量两方面的信息，把复杂混合物中的蛋白质在二维平面上展开，这是目前 所有分离技术中分辨率最高，信息量最多的技术。 对分离蛋白质组所有蛋白质的两个关键参数是高分辨率和可重复性。高分辨 率使更多的不同种类的蛋白质得以分开：而可重复性才能使不同批次的实验数据 之间，以及不同实验室在相两条件下得到的数据可以相互比较。早期双相电泳中 第一相翊载体两惶电解质产生p 梯度，国相p h 梯度( i p g ) 等电聚焦技术，即 i p g 胶条的商品化，从根本上解决了双向凝胶电泳重复性的问题。 为了提高电泳的分辨率，发展了窄i p g 技术，即把i p g 胶条的p h 梯度范围 缩小至l 1 5p h 单位，通过多个连续p h 范围的窄i p g 代替单个宽范酮的i p g 。 利用这耪技术，对于高等真核细胞，可以得到超过l o ，o o o 个蛋白质点。k l o s e 报 道了用增加分离距离的方法提高双向凝胶电泳的分辨能力。2 4c m 长的m g 胶条 已经得到成功应用，用2 4c m 的窄i p g 胶条可以得到非常高的分辨率。另一种增 复旦土学硕士论文 加分辨率的策略是对群品进行预分组。可以颈先分离甄细胞结构或利用蛋白质的 溶解性差异用不同溶解能力的提取液分步提取，也可以用溶液等电聚焦进行预分 离。 在目前情况下，双向凝胶电泳的的一块胶板( 1 6 2 0c m 2 ) 可分出3 4 于个， 甚至上万个可检测的蛋自质斑点，使得双向凝胶电泳真正成为了蛋白质组分析的 支撑技术之一。蛋白质样品经双向凝胶电泳并定量分析，对选择的蛋白质点进行 切胶、酶解而后质谱鉴定，通常采用m a l d i t o f 的肽质量指纹谱和e s i m s m s 的肽段序列分析来鉴定蛋白质( 觅图卜2 ) 。 但是双向凝狡电泳技术仍然存在诲多不足。超前对双向凝胶电泳技术的改进 主要集中在憎水性蛋白质样品的制备，分离能力的改善，以及染色方法等方面。 图卜2 常媲2 d e 埘s 蛋鑫鉴定实验流程 1 1 2 多维色谱分离技术 液相色谱( 1 i q u i dc 1 1 r o m a t o g r 印h y ，l c ) 、毛细管电泳( c a p i i l a r ye l e c t ! r o p h o r e s i s ， c e ) 等高效分离技术具有多种分离模式，其分离度高，耗样量少，且易予和质 涛检测技术实现在线联用，已成为生物大分子快速分离鉴定的有利工具。 色谱技术近年来有了飞速的发展，亲和色谱、反向色谱等技术随着色谱柱技 术的完善，其分离时间和分离效率均有显著的改善。毛细管电泳是另一种高效的 分离技术，因其分离度离、分离速度快且易予和电喷雾离子化质谱技术( e s i 州s ) 实现在线连接，在蛋白质分析中的应用也极为广泛。确定蛋白质分子的性质，尤 其是面对其复杂多变的翻译后修饰作用，就使得一维的分离手段显褥力不从心。 h a l l c o a i ( 等探讨了以h p l c 、h p c e 两维分离技术，m s 检测的方法用于蛋白质 复旦土学硕士论文 组的研究亦有爝两维滚相色谱联用分离蛋自质，m s 在线检测。两维分离的结果 明盟优于一维，在复杂的生物大分子的分析中具有应用前景，见图1 3 。毛细管 等电聚焦电泳。电喷雾质谱已被认为是取代二维凝胶电泳法的最有效的技术。 图l 。3 全二维i e c r p l c 装置示意圈 1 1 3 蛋白质芯片技术 蛋白质芯片是将蛋f ! j 质摊捌在玻璃片( g l a s ss l i d e s ) ，多孔胶片( p o r o u s g e lp a ds l i d e s ) 或微井( m i c r o w e s ) 上，将标记后的探针靶分子与微点阵 ( m i c r o a r r a y s ) 进行杂交，用合适的检测系统即可确定蛋白质之间是否存在交 互作用。确定蛋白质问的相互作用，可以对细胞活动机制及功能有更深一层的了 解。个生命活动的发生，常常是多个蟹自质共同作用的结果。酵母双杂交系统 是一种应用极为广泛的鉴定蛋白质相互作用的方法，但操作复杂，而新兴的蛋白 质芯片技术则是高通量分析蛋白质相互作用的有利工具。 蛋白质分离芯片是蛋白质芯片研究的另一个主要领域，是以玻璃、多孔硅或 一些高分子材料作为基质，通过一定的技术在基质上刻蚀出各种形式的孔道，通 过色谱、电泳不同的分离模式或不同方法和模式的组和，实现蛋白质或肽段的分 离。蛋白质芯片以其上样量小、分辨率高、设备简单、相对成本低等特点越来越 引起广大研究者的关注。 1 2 蛋白质组学中的蛋白富集方法研究 1 2 1 传统样品富集技术 复旦大学硕士论文 生物大分子在制备过程中往往需要浓缩富集，常见的蛋白富集方法包括真空 干燥、减压加温蒸发浓缩、空气流动蒸发浓缩、冰冻法、吸收法、超滤法和冷冻 真空干燥等。 超滤法目前正越来越受到重视。超滤法是使用一种特别的薄膜对溶液中的各 种溶质分子进行选择性过滤的方法。当液体在一定压力下通过膜时，溶剂和小分 子透过，大分子受阻保留。这是近几年来发展的新方法，最适于生物大分子尤其 是蛋白质和酶的浓缩和脱盐，并具有成本低，操作方便，条件温和，回收率高等 优点。通过超滤法，蛋白质和酶的稀溶液一般可浓缩到含量为1 0 一5 0 ，回收 率高达9 0 。应用超滤法，关键在于滤膜的选择。 冷冻真空干燥除利用真空干燥原理之外，同时增加了温度因素。在相同压力 下，水蒸气的压力随温度的下降而下降，故在低温低压时，冰很容易升华成气体。 操作时，一般先将待干燥的液体冷冻至冰点以下使之变成固体，然后在低温低压 时将溶剂变成气体而除去。此法干燥后的产品具有疏松、溶解度好、保持天然结 构等优点，适用于各类生物大分子的干燥浓缩。 1 2 2 亲和蛋白富集 根据蛋白质间不同的分子形状和相对分子质量大小、电离性质、溶解度和疏 水性、生物功能专一性等原理可以对其进行分离纯化。选择的分离纯化方法，必 须具有较高的专一性和重现性，才能实现生物样品中的蛋白分离。亲和分离就是 满足这一条件的很好的提取方法，它是基于生物分子的生物活性或独特的化学结 构，将可逆性专一性结合的生物分子体系中的一方连接到固相基质上，使之固定 化，实现分离纯化专一作用体系中另一方的目的。 亲和层析最大的优点是其具有高效率和操作方便。一旦固定化专一性相互作 用体系( 可逆性结合) 中的一方连接到圆相基质上后，操作非常方便。一般上样 后，洗去杂质，就可将所要提取的物质解吸下来，而且可以获得较高的纯度。亲 和分离具有富集作用，经过一次亲和分离就能从含量较低的原料中得到富集的物 质。目前用于蛋白的作用体系主要有：酶分子和底物或抑制剂的结合；抗原和抗 体的结合；一些维生素和血浆中的运载蛋白质的结合：凝集素和多糖或糖蛋白的 结合；核酸和互补碱基序列或核酸聚合酶的结合等。此外固相金属螫合胶( 如 n i 2 + - n r i a ) 与含有特定结构( 如6 h i s ) 片段的蛋白质的结合或金属蛋白质与连 接有亚氨基二乙酸等具有配位( 与金属离子螯合) 能力的分子的固定相基质的结 合。金属螯合亲和分离，又称固定化金属离子亲和分离( i m m o b i l i z e dm e t a li o n a 伍n i t yc h r o m 砒o g r a p h 弘i m a c ) 。免疫亲和分离( i m m u n o 棚n i t yc h r o m a t o g r 印h 弘 i a c ) 是一种将免疫技术与色谱方法相结合的分析手段。 复宴土学硕士论文 1 。3 磷酸化蛋囊的分离分析方法研究 蛋白质的磷酸化修饰时生物体内最重要的共价修饰方式之一。在哺乳动物细 胞生命周期中，大约有1 3 的蛋白质发生过磷酸化修饰，在脊椎动物基因组中， 有5 的基因编码的蛋白质是参与磷酸化和去磷酸化过程的蛋白激酶和磷酸( 脂) 酶。磷酸化修饰本身多具有的简单( s i m p l i c i t y ) 、灵活( 丑e x i b i l 匆) 、可逆 ( r e v e r s i b i l 妨) 的特性以及磷酸基团的供体a t p 的易得性，使得磷酸化修饰被 真核细胞所选择接受成为一种最普遍的调控手段，蛋白质的磷酸化和去磷酸化这 一可逆过程几乎调节着，l 乎包括细胞的增殖、发育、分化，信号传导，纲胞撰亡、 季申经活动、腿斑收缩和胂瘤发生等过程在内的多有生命活动，目前已经知道有许 多人类疾病是由于异常的磷酸化修饰多引起，而有些磷酸化修饰却是某种疾病所 导致的后果 ”。鉴于磷酸化修饰在生命活动中所具有的重要意义，探索磷酸化修 饰过程的奥秘及其对功能的影响已成为众多生物化学家及蛋自质组学家所关心 的内容。用蛋白质组学的理念和分析方法研究蛋白质磷酸化修饰，可以从整体上 观察细胞或组织中磷酸化修饰的状态及其变化，对以某种或几种激酶及其产物 为研究对象的经典分析方法悬一个重要的补充，并提供了一个全新的研究视角， 由此更派生出磷酸化蛋白质组学( p h o s p h o p r o t e o m i c s ) 这一新概念。尽管有关磷 酸化蛋自质组学的研究已有多篇报道，但是，真正规模化的识别和鉴定生物体内 磷酸化蛋白质的表达及其变化，在技术方法上还存在很大的问题，其中磷酸化修 饰蛋白质的识潮与检测时影响磷酸化蛋白质组学研究的关键技术问题之一。主要 原因在于生物体内磷酸化蛋白质的量通常很低，磷酸化修饰是一个耗能的过程， 而细胞是一个对能量使用效率最高的体系，即使实现功能的情况下消耗最少的能 量，因此细胞内多数蛋白质中仅有少部分被磷酸化，即使蛋白质的表达量处于相 对较高的东平，该蛋自质的磷酸化部分的分析也很困难。一般一个发生磷酸化的 蛋白质其磷酸化的部分仅占其总量的1 0 ，举例来说，如果一个蛋白质酶解后产 生四个肽段，其中一个肽段上有一个磷酸化修饰位点，假如该蛋白质百分之百磷 酸化，则酶解产生的每四个脓段中就有一个磷酸化修饰歇段，而如果该蛋白质仅 有l o 发生磷酸化修饰，则每| 鬻十个驮段中才有一个磷酸化修饰肽段卜j 。所以为 了检测到这一段修饰的肽，我们需要比攫定该蛋白质所需更大的蛋白量，而在蛋 白羹有限的情况下就需要更灵敏的检测手段。 目前磷酸化蛋白质分析所使用的多种技术包括传统的放射标记，抗体应用技 术及新兴的各釉磷蛋白肽的富集技术和高灵敏的质谱检测技术等，这些技术在 磷酸化蛋白质组学中的应用中发挥了重要的作用。 1 3 11 3 2 p 】放射性标记 复旦土学硕士论文 f 3 2 p 】放射 生标记法是最经典的磷酸化蛋白质检测方法，体内代谢培养蠲【3 2 p 】 标记磷酸盐作为磷酸基团供体，被 3 2 p 标记的蛋白质进行维或二维凝胶电泳分 离，用放射自显影或磷储屏检测磷酸化蛋白质。磷蛋白酸水解产物用二维磷酸肽 作图法分析可以确定蛋白质的磷酸化氨基酸类型。磷蛋白水解脓段经h p 己c 分 离，通过监测放射性活度收集到磷酸肽，用e d m a n 测序或串联质谱分析都可以 确定磷酸化位点，当然这需要有足够量的磷蛋白用于分析。早在1 9 9 1 年，a r r i g o a p 和m i c h e lm r 就采用 3 2 p 】代谢标记和二维凝胶电泳分析的方法观察了细胞在 耐热处理后细胞在热藉激稆脖瘸坏死因予刺激下所引起的h s p 2 8 磷酸化程度的 变化，发现热处理后细胞在热刺激和肿瘤坏死因子刺激下所弓l 起的h s p 2 8 的磷 酸化程度会显著降低 3 】。 3 2 p 放射性标记可以非常灵敏、直观地检测磷蛋白，尤 其是与二维凝胶电泳结合后可以从蛋白质组的角度整体观察细胞内蛋自质磷酸 化程度的变化，它的缺点是不能标记组织样本，并且存在放射性污染的翔题，虽 然在诲多有经验的实验室里这是一个常用并很有效的方法，但在相当多的实验室 却不适用。 1 3 2 免疫印记和免疫沉淀 通过抗磷酸氨基酸抗体与磷酸化蛋白质的免疫印迹反应( 、e s t e mb l o t t i n g ) 来检出磷酸化蛋白质也是较常用的方法。在真核细胞中最常见的磷酸化修饰是在 蛋自质的缝氨酸、苏氨酸和酪氨酸残基侧链羟蘩磷酸佬。已经有商品化的抗酪氨 酸、丝氨酸和苏氨酸磷酸盐j 壳体，其中抗酪氨酸磷酸盐抗体的特异性最好，也最 为常用。磷酸化丝氨酸和苏氨酸的抗原决定簇较小，抗原抗体结合位点有空间障 碍，所以抗体的结合力较差【”。与功能相关的磷酸化蛋白质组研究工作较多使用 抗体免疫印迹法，主要研究在各种生长因子等因素的刺激下，细胞内蛋白质磷酸 化状态的变化，进而探讨有关的信号转导途径或生理机理。 免疫印迹法与免疫沉淀相结合，可以在电泳之前先丰富集目的蛋白质，但这 样也有可能丢失部分低丰度的目的蛋白质，同时免疫沉淀技术对抗体的要求更 高，抗磷酸酪氨酸抗体具有较好的亲和性可以进行免疫沉淀实验【7 j ，抗磷酸丝氨 酸和苏氨酸抗体由于亲和力低多年来一直没有很好地用于免疫沉淀。 1 3 3 磷酸化蛋白质的荧光检测 p m q d i a m o n d 是m o l e c u l a r p r o b e s 公司近年新推出的一种磷酸化蛋白质的 荧光染料9 1 ，通过荧光扫描仪检测可以直接显示出一+ 维或二维凝胶电泳胶上分离 的磷酸化磺白质，对非磷酸化蛋白质的反应性很低，荧光强度会随着蛋自质磷酸 化程度的不同丽呈现出一定的量的变佬。该染料可以与其它检测总蛋白的荧光染 复旦土学硕士论文 料配合使用，同时展示出胶上的总蛋臼藩和磷酸化蛋白谱。这种染料还与质谱兼 容，胶上的蛋白质点可以通过胶上酶切进行质谱鉴定。但是对于磷酸化程度不周 的磷鬣白检测的灵敏度是不同的，对于有5 个磷酸化位点的b c t a 酪蛋白可以检 测到1 2 n g 的量，有一个磷酸化位点的胃蛋白酶可以检测到8 n g 的量。该方法在 研究磷酸化蛋白质的差异表达谱方硬有一定的应用前景。 1 3 4 质谱技术识别磷酸肽及磷酸化位点确定 应用严p 放射性标记和抗体技术可噬规模化地识别磷酸他蛋白痪，但对每 个磷酸化蛋白质个体需要更进一步了解其确切的磷酸化位点，质谱技术的发展为 这一研究任务提供了多种解决方案。 a ) 以m a l d i t o f m s 为基础的方法 ( a ) 磷酸酶法磷酸化蛋白质酶解敢段用磷酸酶水解失去一个 诤o s ，相对默 段质量减少8 0 d a ，分析磷酸酶作用前后肽谱的差异，可确定磷酸化肽段及磷酸化 位点的数目，酶解还可以直接在m a l d i m s 的样品靶上进行【l o j 。 ( b ) 磷酸肽豫稳离子法m a l d i t o f m s 离子源内产生的离子在真空无场飞 行管道飞行过程中会发生结构断裂，丢失中性分子产生碎片离子，碎片离子具有 与其前体离子相同的飞行速度，成为亚稳离子。用反射式( r e n e c t o r ) t o f 检测 器通过源后衰变( p s d ) 分析母离子产生减少9 8 或8 0 的峰可判断是否为磷酸肽 ”j ，需要注意的是如果发生硫酸化修饰则同样会产生类似的碎片离子，霹以结 合磷酸酶水解帮助判断。藏接罔反射式t c l f 检测器也可发现磷酸肽亚稳离子， 甄稳离子表现为一种峰较宽，分辨率很低的峰，使其很容易与其他高分辨率的肽 谱峰区分。亚稳离子峰的表观质荷比并不代表其真实的质量l l3 “j ，而与前体离 子质量、质谱仪的构造、加速电压、反射电压值均有关【i 。1 6 】。 ( c ) 正负离子检测m ay 等1 1 7 】报道在负离子检测模式下，磷酸肽的响应信号 要比正离子检测模式下的响应信号相对要强，通过比较正负离子检测模式得到的 脓谱信号相对强度的变化，作者能够明确指认出b 酪疆白酶解产物中的两个磷酸 肽，作者还用这一方法结合串联质谱测序鉴定了p k r 样内质谱激酶( p e r k ) 豹多 个自磷酸化位点。此外，j o h nm 等【：1 8 报道在基质溶液中加入铵盐，会磷酸肽的 响应信号明显增强，通过比较加入铵盐前后肽谱图的差异来确定磷酸肽。 b ) 以串联质谱各种扫接方式为基础的方法 串联质谱仪的母离子扫描、中性丢失扫描等分板方式可以通过分析磷酸肽产 生的特征离子直接从肽混合物种找到磷酸化肽段1 9 _ o 。2 “，三级四级串联质谱仪 是进行这类扫描分析最有效的质谱仪。 ( a ) 中性丢失扫描( n e u 圩a l l o s ss c a nm o d e ) 在三级瞎级串联质谱仪中，使 复旦上学硕士论文 第一个质量分析器( q 1 ) 和第三个( q 3 ) 质量分橱器同步扫描，但扫描范围保 持一个特定的电压差值，这个电压差所代表的质苟比m z 值为中性磷酸分子的质 量( m z9 7 9 或1 1 1 z4 9 ) 。q 1 输送过来的离子在q 2 内裂解后进入q 3 ，只有在q 2 中能产生磷酸分子的离子才会被q 3 传输到检测器阻2 3 】。此方法的优点是以正离 子模式进行扫描分辛斤，找到磷酸肢焉可以直接分析序列及磷酸化位点，但是该方 法的特异性不是很高，比较容易产生假阳性结果，需要从串联谱图中加以确认。 ( b ) 前提离子扫描母离子扫描( p r e c u r s o r p a r e n ti o ns c a l l i l i n g ) 在三级四级 串联质谱仪中，连续扫描第一个分析器q l ，锼各军中质荷比的离子依次通过q l ，q 2 为碰撞室，将q 3 分析嚣设定为只能传输某特定质荷比的子离子，如设定q 3 中仅能通过m z7 9 ( p q 3 。) 离子，这样得到的质谱图仅恩示会丢失州z7 9 的肽谱 峰。由于多肷产生的各种碎片离子几乎没有质量数在7 9d a 附近的，所以用这一 质量数进行磷酸歇母离子扫描的特异性很赢，缺点是必须在负离予检测模式下分 孝斤，进行序列分析较困难，通常在e s i 负离予检测时，为了提高信噪比，样品都 溶解在碱性溶液中，为了在正离子检测模式下进行序列分析，需要更换样品溶液 体系，或者将样品分威两部分，分别用不同的溶剂溶解【2 “。a 肺a nr s 【2 副等以这 种扫描方式为基础建立了一套分析磷酸放的系统方法，肽混合物先经l c m s 分 析，在负离子检测模式下经母离子扫描找出含有磷酸肽的液相馏份，收集该馏分 再次用母离予扫描方式确定磷酸肽，最后在正离子模式下对该磷酸肽进行序列分 析。该方法后来又优化为采用毛纲管液相质谱和微量馏分收集装豢，灵敏度有了 很大提高口刚。 如果能在正离子模式下进行磷酸肽的母离子扫描则分析步骤会简化很多，这 需要磷酸肽能够产生合适的特征离子。酪氨酸磷酸肽能产生质荷比为没在 2 1 6 0 4 3 驰特征离子，这是磷酸酪氨酸的亚铵离子( i m m o n i u mi o n ) ，选这一离子 进行母璃子扫描，可以在正离子检测模式下选择性检测酪氨酸磷酸肽。但是由各 种氨基酸残基产生的质量数在2 1 6 0 4 3 附近的碎片离子有不少，四极杆质量分析 器的分辨率又较低，如果用三级四级质谱仪进行母离子扫描，选择性会很低。 四级枰一飞芎亍时间审联矮潜仪( q 一f o f ) 具有高灵敏度帮高分辨率，可是飞行时 间质量分析器并不是扫描型分析器，所以q 。t o f 型质谱仪并不能实现真正意义 上的母离子扫描，但是如果在扫描四级杆的同时用飞行时间分析所有的碎片离子 谱，同样可以将碎片离子的质量数用于母离予检测。但是因为仪器对，l 、分子碎片 离子从碰撞室到t o f 分车厅器的离子传输率太低，只有5 【2 ”，这使季导q t o f 串 联质谱仪作母离子扫描的