（分析化学专业论文）取代酚类化合物对淡水发光菌q67的抑制毒性研究.pdf

桂林工学院硕士学位论文 中文摘要 已经发现具有明显生物和生态效应的污染物种类繁多，数量巨大，相互作 用复杂，而现在的化学分析手段十分有限，从而不能排除样品中未被检测出的 污染物的潜在毒性效应。人们利用生物毒性测试方法研究纯物质污染物和混合 物污染物的毒性效应，来弥补化学方法不足。 作者成功建立了测定环境污染物对青海弧菌发光强度抑制的微板发光毒 性测试发法。为环境污染物的监测提供了一个良好的平台。以剂量加和假想与 独立作用假说预测酚类化合物混合物联合毒性作用，剂量加和假想可产生准确 估计，独立作用产生过高估计。并以m e d v - 1 3 为基础，进行酚类化合物的定 量结构毒性相关( q s t r ) 研究。 本研究主要内容及研究成果如下： - 1 以新型淡水发光菌一青海弧菌q 6 7 ( m b r i o q i n g h a i e n s i $ s p q 6 7 ) 为检验 生物，以v e r i t a s t m 微孔板光度计为发光强度测试设备，建立了测定环境污染 物对发光菌发光强度抑制毒性的微板发光测试新方法。系统地研究了口h 值、1 菌密度、反应时间等实验条件对发光强度的影响。应用该方法成功地测定了 1 0 种取代酚和p b 2 + c u 2 + 、h ，增3 种重金属环境污染物q 6 7 的发光抑制毒 性效应。提出应用非线性迭代最小二乘拟合法模拟环境污染物对q 6 7 毒性的 剂量效应曲线( d r c ) ，拟合结果与实验结果之间的相关系数均大于0 9 9 。通 过拟合的d r c 参数，准确地计算污染物的半数效应浓度e c s o 。对比有关文献 方法，微板发光法具有更简便快捷，节省试剂药品，便于多次平行测定从而提 高准确度等优点。 2 以微板法为基础，系统研究了4 种、6 种和1 0 种酚类化合物混合物联合 毒性作用。引入w e i b u l l 、i x i g i t 等非线性拟合模型对总剂量效应曲线进行回 归拟合，考察了纯化合物等效应浓度比混合，纯化合物等母液体积比混合，这 样简单的混合物浓度比例的“一维”分布。且以均匀设计方法进行混合，综合 考察了实际混合物浓度比例的“三维”随机分布。得出剂量加和假说能对混合 物联合毒性进行准确估计，预测值与实验值相关系数) o 9 7 ；独立作用假说产 生过高估计。 桂林工学院硕士学位论文 3 以m e d v - 1 3 描述子为基础，建立了一种基于实际计算电荷和空间距离 的新有机分子结构描述子三维分子电性距离矢量( 3 d m e d v ) 。并借助多 元线性回归方法对酚类化合物对淡水发光菌的毒性与3 d m e d v 建立定量结 构一毒性关系( q s t r ) 模型，相关系数r 大于o 8 9 ，q ( l 0 0 的r 2 ) 大于o 8 3 。 结果表明所提出的3 d m e d v 具有结构选择性高，性质相关性好，所建立的 q s t r 模型相关系数高，稳定性好，预测能力强等优点。 以c h e m o f f i c e 程序计算分子理化参数作为描述子，表征酚类化合物的分 子结构，建立与酚类化合物的对淡水发光菌毒性相关的q s t r 模型，模型相 关系数r 大于o 9 2 ，具有较好的估计能力。 关键词：淡水发光菌；生物测试：取代酚；剂量加和；独立作用：q s t r 桂林工学院硕士学位论文 a b s t r a c t t h ep o l l u t a n t sw h i c hh a sc l e a rb i o l o g j i c a la n de c o l o g i c a le f f e c t sh a sb e e n f o u n dt ob ev e r yv a r i o u s ，l a r g eq u a n t i t i e sa n dw i t hc o m p l e xi n t e r a c t i o n s i ti s d i f f i c u l tf o rl i m i t e dc h e m i c a l a n a l y s i st od e t e c tt h ep o t e n t i a lt o x i ce f f e c t so f p o l l u t a n t s i nt h es a m p l e s b i o l o g i c a lt o x i c i t yt e s ti so d ew a yt om a k eu pf o r i n a d e q u a t ec h e m i c a lm e t h o d s c o n c e p t so fc o n c e n t r a t i o na d d i t i o na n di n d e p e n d e n t a c t i o n a r et w om a i nw a y st os t u d yj o i n ta c t i o no fm u l t i c o m p o n e n tm i x t u r ei n r e c e n ty e a r s b yu s i n gm i c r o p l a t el u m i n o m e t r y , t h ea u t h o rs u c c e s s f u l l ye s t a b l i s h e dan e w b i o a s s a yo n0 6 7 ，w h i c hp r o v i d e dag o o dm e t h o di nm o n i t o r i n go fe n v k o n m e n t a l p o l l u t a n t s a n d f r o mp r e d i c t i n gt h ej o i n tl u m i n e s c e n tb a c t e r i u m s t o x i c i t yo f p h e n o l sm i x t u r ew i t hc o n c e p to fi n d e p e n d e n ta c t i o na n dc o n c e p to fc o n c e n t r a t i o n a d d i t i o n , w ek n e w , c o n c e p to fc o n c e n t r a t i o na d d i t i o np r o d u c e da c c u r a t ee s t i m a t e s ， i n d e p e n d e n ta c t i o nh a v eo v e r e s t i m a t e d a n ds t u d i e dq u a n t i t a t i v es t r u c t u r e - t o x i c i t y r e l a t i o n s h i p s ( o s t r ) b a s e do nm o l e c u l a re l e c t o r o n e g a t i v i t y d i s t a n c ev e c t o r1 3 ( m e d v - 1 3 ) m a i nc o n t e n t sa n ds o m ec o n c l u s i o n sa r ea sf o l l o w s ： 1 an e wm i c r o p l a t el u m i n o m e t r yf o rt h et o x i c i t yb i o a s s a yo fe n v i r o n m e n t a l p o l l u t a n t o no n eo ff r e s hw a t e rl u m i n e s c e n tb a c t e f i u m s ，v i b r i o q i n g h a i e n s l s s p - q 6 7 ，w a sd e v e l o p e du s i n gv e r i t a s r “m i c r o p l a t el u m i n o m e t e rt om e a s u r et h e l u m i n o u si n t e n s i t yo fq 6 7 e f f e c t so fp h ；b a c t e r i a ld e n s i t ya n dr e a c t i o nt i m eo nt h e b i o a s s a yw e r es y s t e m a t i c a l l yi n v e s t i g a t e d t h em e t h o dw a ss u c c e s s f u l l ye m p l o y e d i nt h et o x i ce f f e c tt e s to f 7p h e n o l sa n d3h e a v ym e t a l ss u c ha sp b “c u 2 + a n dn g + o nq 6 7 u s i n gn o n - l i n e a ri t e r a t i v e l e a s ts q u a r et e c h n i q u e ，t h ed o s e r e s p o n s e c u r v e sp r c ) o fa l lp h e n o l sa n dh e a v ym e t a l sw e r ea c c u r a t e l yf i t t e dw i t ht h e c o r r e l a t i o nc o e f f i c i e n t sb e t w e e nt h ef i t t e da n do b s e r v e dr e s p o n s e sb e i n gg r e a t e r t h a n0 9 9 t h em e d i a ne f f e c t i v ec o n c e n t r a t i o n ( e c s o ) o fa l l p h e n o l sa n dm e t a l s w e r ea c c u r a t e l ym e a s u r e df r o mt h ed r c m o d e l s c o m p a r e dw i t hs o m el i t e r a t u r e s ， t h i sb i o a s s a yi saf a s te a s y - o p e r a t ea n dc o s t - e f f e c t i v e m e t h o dw i t hh i g ha c c u r a c y 2 s y s t e m a t a c i a l l ys t u d i e dt h ej o i ml u m i n e s c e n tb a c t e r i u m sq 6 7t o x i c i t yo f 一一 桂林工学院硕士学位论文 t h em i x t u r e so f4p h e n o l sc o m p o u n d s ，t h em i x t u r e so f6p h e n o l sc o m p o u n d sa n d t h em i x t u r e so f1 0p h e n o l sc o m p o u n d st h r o u g hu s i n gt h em i c r o - p l a t e sb i o a s s a y w i t hn o n l i n e a rf i t t i n gm o d e l s ，s u c ha sw e i b u l l ，l _ z i 百la n d s oo n , f i tt h et o t a l d o s e - e f f e c tc u r v e ，i n v e s t i g a t e dc o n d i t i o no f ”o n e - d i m e n s i o n a l 。d i s t r i b u t i o no f i n c l u d i n gb o t ht h em i x t u r ew h i c hm i x e db yt h ep r o p o r t i o no fe q u a lt o x i ce f f e c t s c o n c e n t r a t i o n ，a n dt h em i x t u r em i x e db yt h ep r o p o f l i o no fe q u a lv o l u m eo fp u r e c o m p o u n d ss o l u t i o n f u r t h e r m o r e ，i n v e s t i g a t e d t h ec o n d i t i o no f3 dr a n d o m d i s t r i b u t i o nw h i c ht h em i x t u r em i x e db yu s i n gh o m o g e n e o u sd e s i g n t h ec o n c e p t o fc o n c e n t r a t i o na d d i t i o np r o v i d e da c c u r a t ee s t i m a t i o nf o rt h ej o i n tt o x i c i t yo f m u l t i t u d em i x t u r e ，w i t hh i g hc o r r e l a t i o nc o e f f i c i e n tb e t w e e ne x p e r i m e n t a lv a l u e s a n dp r e d i c t e dv a l u e ，ri s0 9 7 t h eh y p o t h e s e so fi n d e p e n d e n ta c t i o nh a v e o v e r e s t i m a t e d 3 b a s e do nm o l e c u l a re l e c t r o n e g a t i v i t y d i s t a n c ev e c t o r1 3 ( m e d v - 1 3 ) a n d m o p a cc a l c u l a t i n gp r o g r a m ，at y p eo fn o v e l3 d s l r u c t r a l d e s c r i p t o r s c a l l e d t h r e e d i m e n s i o n a lm o l e c u l a re l e t r o n e g a t i v i t y d i s t a n c ev e c t o r 佑d r c m d v ) a r e d e v e l o p e d q u a n t i t a t i v es t r u c t u r e t o x i c i t yr e l a t i o n s h i p s ( q s t r ) b e t w e e nt h en e w v e c t o ra n dt o x i c i t yo fp h e n o l sa r eg e n e r a t e db ym u l t i p l el i n e a rr e g r e s s i o nm e t h o d , w i t hh i g hc o r r e l a t i o nc o e f f i c i e n t ，ri s0 8 9 i no r d e rt ot e s tt h ee q u a t i o ns t a b i l i t y a n d p r e d i c t i o na b i l i t yo ft h em o d e l ，i ti se s s e n t i a lt op e r f o r ma c r o s sv a l i d a t i o n ( c v ) p r o c e d u r e s a t i s f a c t o r yc vr e s u l t sh a v eb e e n o b t a i n e db yu s i n go n ee x t e r n a l p r e d i c t e ds a m p l ee v e r yt i m ew i t hh i 【g hc o r r e l a t i o nc o e f f i c i e n t s ，ri s 0 8 3 t h e s e r e s u l t ss h o wt h a tt h en e w3 dv e c t o rh a sh i g hs t r u c t u r a ls e l e c t i v i t ya n dg o o d p r o p e r t yr e l a t i v i t y , a n di ti se a s yt oc a l c u l a t et h ev e c t o r r e g a r d i n gt h ep h y s i c o c h e m i c a lp r o p e r t yp a r a m e t e r so fr p u r ec o m p o u n d sw h i c hc o m p u t e d b yc h e m o f f i c es o f t w a r ea st h ed e s c 6 p t o rt od & c r i b et h ep h e n o l ss t r u c t u r e s ，e s t a b l i s h e dq s t r m o d e l ，w i t hc o r r e l a t i o nc o e f f i c i e n t s ，ri s0 9 2 ，h a v i n gg o o dp r e d i c t i n ga b i l i t y k e y w o r d s ：f r e s hw a t e rl u m i n e s c e n tb a c t e r i u m s ；b i o a s s a y ；s u b s t i t u t e dp h e n o l ； c o n c e n t r a t i o na d d i t i o n ；i n d e p e n d e n ta c t i o n ；q s t r 桂林工学院硕士学位论文 独创性声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得 的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不 包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得桂林工学院或其 它教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所 做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。 签名：4 缴日期：血厶l f 关于论文使用授权的说明 本人完全了解桂林工学院有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有 权保留送交论文的复印件，允许论文被查阅和借阅；学校可以公布论文的全 部或部分内容，可以采用影印、缩印或其他复制手段保存论文。 ( 保密论文在解密后应遵守此规定) 签 名：瑙导师签名： j 日期：d 匝；2 名 桂林工学院硕士学位论文 1绪论 生物毒性测试方法是评价环境污染物及其混合物对生态风险和人类健康 影响的重要方法之一。本论文选择典型环境污染物之苯酚及其取代衍生物 为研究对象，淡水发光菌q 6 7 为检测生物，污染物对发光茵的发光抑制毒性 为生物标志物，研究建立环境污染物对发光菌生物毒性的微板测试方法、剂量 效应曲线模拟、酚类化合物之阃的毒性作用规律。本章将简要介绍生物毒性 测试方法、污染混合物研究、酚类化合物及o s a r 研究等方面取得的进展与 存在的问题，进而说明本文选题的立项依据、研究目标和主要研究内容。 1 1 生物毒性测试方法的发展及展望 1 1 - 1 生物毒性测试方法研究现状 随着人类活动能力的增强，科学技术的发展，越来越多的化合物被制造出 来，水环境作为工农业废物的最终排放点，污染现象越来越严重，超过了水体 的自净能力，从而影响水体的正常功能，造成水体污染。除了直接影响水生生 物的正常生活外，也直接或间接地威胁人类的健康和生产活动。为了保护水源 和水生生态系统，控制污染，常采用多种方法对水质进行监督和评价，并因此 建立了基于化学和生物学的水质评判标准( 或基准) 。即化学方法和生物测试 法。 ， 化学方法是指，直接分析测定水体中有害物质的种类和它们的浓度，以及 与之有关的参数，如色度、c o d 、b o d 等，以此为依据制定出污染物浓度控 制标准。这类方法执法依据充分、管理界限明确、不仅能确定有害物质的种类， 对其中部分污染物还能准确地测定它们的浓度或含量，因此是常采用的方法。 但是化学方法也存在许多不足【1 ，2 】，如只凭借对污染物剂量的测定不能 完全评价其对环境尤其是生态环境的潜在危害作用。而且即使所测定的污染物 能够表示水体被污染的性质，由于不能预测毒物之间的相互作用，拮抗或加和 桂林工学院硕士学位论文 或协和，因此也难从不同污染物的浓度分析数据来预测被污染水体的真正危 害。换言之，化学分析的数据并不能从整体上反映水质的优劣，或反映污染物 对生物和生态系统的影响。就污染物所产生的生物毒性而言，某一种污染物对 水生生物的毒性，并非完全取决于含量等化学参数的超标。由于环境条件的复 杂性，与污染物共存其他物质咀及环境条件如：p h 、氧化还原状态等的变化， 同时在很大程度上影响了其生物有效性。因此需要结合另一类方法，包括生物、 生态、和毒理学方法等来评价。 生物评价基准( b i o c r i t e r i a ) 就是利用敏感生物来测试化学污染物的毒性影 响。最早是一些生物学家针对污染的生物评价提出可行的方法，例如h a r t 利 用淡水鱼评价工业废水、化学物质和其它物质的毒性，d o u d o r o f f 进行了工业 废水对鱼急性毒性的生物评价【1 ，2 】。到了1 9 7 0 年代，生物评价越来越普遍， 不但采用鱼，也采用无脊椎动物和藻类等。 ，一 早期采用的生物毒性测试手段主要是单指标生物毒性实验，即将一种生物 暴露于两个或更多浓度梯度的有毒物质中，保持其他条件恒定，以观察生物效 应( 死亡或抑制；生理改变；行为改变等) 。这种试验能够较准确地反映出某种 化合物对某一特定生物产生的特定毒性作用。而且，单种生物毒性试验方法条 件容易控制，终点比较明确，重现性较好，结果便于比较，时间较短，因此得 到广泛应用【3 】。然而，水体中有成千上万种生物，对毒物的敏感程度存在极 大的差别，因此很难从一种生物的毒性效应推测对另一种生物的影响。因此， 单种生物毒性测试结果与自然实际存在一定距离，直接研究复杂的自然生态系 统往往很难得到明晰的结论。由此从1 9 7 0 年代初开始，发展了多指标生物测 试( m u l t i s p e c i e sb i o a s s a y ) ，是利用同一营养级的几种生物同时对某个环境样品 或污染物进行生物毒性实验，在一定的统计学规律上其结果能够说明该样品或 污染物对这一营养层次生物的平均毒性效应。针对不同营养层次，发展了成组 生物检验( b a t t e r yb i a a s s a y ) ，即利用不同营养级的有代表性的生物进行生物毒 性检验。在统计学意义上，测试结果能够部分反映污染物对生态系统的影响 【4 】。这种成组检验的方法对污染物的整体生态效应机理和变化趋势作出评估， 但效应终点不太明确，目前还没建立标准试验方法。为不同的目的，不同的管 理机制往往制定了不同的标准【5 】。美国环保局推荐至少使用3 种( 如鱼、无脊 桂林工学院硕士学位论文 椎动物和一种植物1 。也有报道认为应选用至少4 种不同营养级有代表性的生 物，包括：微生物、植物、无脊椎动物和鱼。 除了需要对环境样品或污染物进行毒性测试外，还有必要对它们进行快速 毒性评价( t o x i c i t ys c r e e n i n g ，毒性筛选) 。在进行快速毒性评价时，有必要选 择一些有显著代表性的毒性测试方法和生物作为早期毒性指标，常用的是鼠 类、鱼类和水生节肢类动物。在毒性分析方面，新的检测不断建立，其指示物 包括细菌f 5 】、藻类【4 】、底栖软体动物【4 】、和鱼【4 】等，其中发光菌因其独特的 生理特性、与现代光电检测手段相匹配的特点，更由于其相比于其他生物的快 速、经济、节省空间且可靠等优点而备受关注。 1 1 2 发光细菌毒性测试方法 发光菌属革兰氏阴性、兼性厌氧菌，宽约0 4 - 1 0 岸m ，长约1 0 2 5 胛。 无刨子、荚膜、有端生鞭毛一根或数根，最适生长温度2 0 3 0 ，最适生长 d h 为6 0 9 0 。常用于生物毒性测试的海洋发光菌，其生长介质中含3 的n a c l 和0 3 的甘油对发光反应很有利。 对发光菌的分类，目前普遍采用的是美国学者p b a u m a m m 的分类方法【4 】 见表1 - 1 。 由表可见，大部分发光菌的栖息地是海洋。在发光菌毒性测试中应用较多 的是明亮发光杆菌，在正常条件下经培养后能发出肉眼可见的蓝绿色荧光。其 光谱带在4 9 0n m 附近，细菌的发光是荧光素酶所致。发光反应是减少的还原 型黄素单核苷酸( f m m t 2 ) ，分子氧( 0 2 ) 和一长链的醛发生催化还原反应，并伴 随光的释放： f m n h 2 ( 黄素单核苷酸) + 0 2 ( 分子氧) + r c h o ( 长链醛) 型遒型i f m n ( 黄素单核苷酸) + r c o o h + h 2 0 + 光 由于这个过程与微生物代谢过程有关，因此能够显示有毒物质对生物体的 毒性作用【3 j 。即当发光细菌接触到环境中有毒污染物时，可影响或干扰细菌 的新陈代谢，从而使细菌的发光强度下降或熄灭，这种发光强度的变化可以用 桂林工学院硕士学位论文 测光仪定量地测定出来。有毒物质的种类越多，浓度越大，抑制发光的能力也 越强，对于气体中可溶性有毒物质可以通过把它吸收溶解到液体中，然后测试 其对发光细菌发光的影响。影响用相对抑制率表示： 表1 - 1 发光菌的分类 d n a 的 属栖息地发光菌名称发光菌英文名 g + c ( ) 哈维氏弧菌 h a r v v e y i 海洋 美丽弧菌i 型甲跆批i 弧菌属 4 5 4 8 费氏弧菌 v f i s c h e r i m r o 火神弧菌 i f 1 0 9 e i c h l o e r a e 非海洋霍氏弧菌以及变种 v a r a i b e l l i s 明亮发光杆菌 p p h o s p h o r e u m 发光杆菌属 3 9 _ 4 4 海洋鱼发光杆菌 只1 w o p g n a t h i l l d t o b a c t e r i u m 曼达帕姆发光菌 只m a n d a p a m e n s i s 异段杆菌属 4 3 4 4非海洋发光异短杆菌zl u m i n e s c e n s x e n o r h a b d u s 相对抑制率- 型里考嚣茅1 0 0 o - x ) 在一定的浓度范围内，有毒污染物浓度与发光强度呈一定的线性关系，因 此可利用发光细菌来监测环境中的有毒污染物。 发光菌发光的光谱范围约4 2 0 6 7 0n l n ，2 m a x 在4 7 5 4 8 5n l n 左右，为单一 发射峰，z , m a x 和半高峰宽度有种属差异。发光菌生长初期发光很弱，对数生 长中期发光强度达到高峰，稳定期后发光强度下降。已有研究发现细菌细胞合 成的“自诱导物”( a u t o i n d u c e r ) 在对数中期大量积累，因此导致发光迅速增强 【4 】。 发光菌在二十世纪3 0 年代首先用于快速评价药物的毒性作用【6 】。2 0 世纪 5 0 年代，由于工业污染日益严重，因此其在环境中的应用开始受到重视。由 于研究水生生态系统复合污染的潜在影响越来越依赖毒性实验，需要发展一种 短期、经济、快速的测试体系来代替传统的长期毒性检验。1 9 7 8 年美国b e c k m a n 仪器公司发展了一种生物发光光度计，即m i c r o t o x 固系统，功能较为完备( 尤 桂林工学院硕士学位论文 其可控温，这对稳定发光度极为重要) ，所用菌种是明亮发光杆菌 但p h o s p h o r e u m ) 。测试采用细菌冻干粉或菌悬液，接触受试样品所引起的发 光强度的变化由光电倍增管及放大器组成的测试仪上记录。此后，各国的环境 监测和研究机构采用该法快速测试环境样品生物毒性【7 1 1 】。我国也建立了应 用发光细菌进行水质毒性测试的国家标准 1 2 1 ，在我国，中国科学院南京土壤 研究所长期以来一直推广类似的测试方法，并设计制造了专用发光测定仪 ( g d j 系列) 。发光菌毒性测试主要有以下几方面应用： 测定纯化合物( 包括有机物、无机金属离子) 和工业排放废水毒性 1 9 8 1 年，c h a n g 等人 1 3 1 用m i e r o t o x 0 测定了许多有机化合物、农药、呼 吸抑制剂、炼油厂排放废水的毒性。1 9 8 2 年，c u r t i s 等人 1 4 1 用同法测定了有 机化合物对鱼体的急性毒性。1 9 8 3 年顾宗濂、谢思琴等人【1 5 】用国产g d j 2 型生物分光计测定了六种重金属离子毒性和八种重金属离子混合液毒性，还测 定了各类排污厂排放的废水毒性，证明发光菌光度与重金属离子浓度呈显著负 相关，发光度随离开排污口的距离增加而增高。1 9 8 4 年，i n d o r a t o 等人 1 6 1 用 m i c r o t o x 筛选那些至今无急性毒性资料的化合物，发现许多化合物的e c s o 值( 半数效应毒物浓度) 与被这些化合物污染的水体l c s o 值( 鱼体半致死毒物浓 度1 存在正相关性，证明该法是一种可满足环境水样毒性测试的方法。1 9 8 4 年 m a l l a k 等1 1 7 1 用m i c r o t o x 测定了某些金属加工液的毒性，也认为该方法极为 敏感，可与鱼体9 6 小时毒性测试媲美。2 0 0 1 年j e n n i n g s 等人【1 8 】用三种发光 菌测试系统( t o x a l e r t l 0 ( r ) ，m i c r o t o x 僻) a n dl u m i s t o x ：( r ) ) 测定了8 0 多种化合 物的毒性并将结果进行了比较，认为三种测试系统有很好的相关性。2 0 0 2 年 w a n g 等1 1 9 用发光菌方法测试了多种染料废水的毒性，认为发光菌法可以有 效的用于评价印染废水的生物毒性，但对深色染料废水的测定存在定局限 性。 测定污染土壤毒性 w i n g e r 等1 2 0 1 用m i c r o t o x 对美国g e o r g i a 州氯碱厂污染土壤进行分析， 发现其中主要毒性来自甲基汞和多氯联苯。f d s c h e 2 1 用- - - 种发光菌测试体系 测定了土壤水提液中三硝基甲苯( ，m ) 的毒性和致突变性，认为土壤毒性和 桂林工学院硕士学位论文 耵盯显示明显相关性。 。 进行大气环境监测和其他毒性监测 进行大气研究方面比较少，只有吴自荣等【2 2 】，利用发光菌毒性测试技术 快速分析大气污染，发现汽车尾气、香烟烟雾、氨气等对细菌发光有不同程度 的抑制作用，时间效应、剂量效应明显。发光菌除了在空气、土壤、水的监测 中发挥越来越重要的作用外，还被用于其它类型污染的分析。例如，在食品污 染检测中，y a t e s 等【2 3 】对黄曲霉毒素b 1 、桔霉素等8 种菌毒素进行了发光菌 毒性测试，结果发现8 种毒素的毒性顺序与哺乳动物细胞毒性试验结果一致。 明亮发光杆菌毒性测试方法虽然有着应用范围广、灵敏度高、反应速度快、 方法简便等特点，但是也存在着一些不足之处： 重现性较差。d u k t a 等【2 4 】用三种细菌( 迂回螺菌、荧光假单胞菌、嗜 一水气单胞菌) 与明亮发光杆菌对比重金属和有机化合物的毒性，明亮发光杆菌 最为敏感，但其再现性欠佳。三人用同种仪器测同样的六种毒物，只有其中二 人测得二种毒物的e c 5 0 值相近。 明亮杆菌为海洋菌，测定时需要把样品n a c i 含量调整到3 ，才能正 常发光。这对海洋污染的毒性测试比较合适，但对淡水体系样品也需要加入 3 n a c i 。如此高浓度的a 的存在会影响水样品中的一些污染物，尤其是重金 属污染物的生物可利用性和毒性顺序【4 】，目前该菌已经被广泛应用于各种淡 水样品，其局限性是十分明显，对样品的真实效应测定有很大误差。 p h 适应范围窄，必须将样品p h 调至7 3 7 5 后才能测定，影响了样品 中有毒组分毒性的真实性。 由此可见，海水和淡水体系的测试结果存在差异，因此有必要发展一种更 适合于淡水体系的发光菌测试体系。 1 9 8 5 年我国学者从青海湟鱼体表分离出一种淡水发光菌并定名为v i b r i o q i n g h a i e n s i ss p 1 1 0 v 【2 5 卜根据采集地点将该菌命名为青海弧菌( v i b r i o q i n g h a i e n s i ss p n o v ) ，典型菌株是q 6 7 ，如图1 - 1 。该菌不仅具备一般海洋发 光细菌的可应用特性，还具有海洋发光细菌所缺乏的功能：1 它不需n a c i 的 桂林工学院硕士学位论文 存在即可良好发光( 对n a + 的依赖性是海洋细菌的重要特征) ；2 温度适应范围 广，1 0 3 5 均能发光。1 9 9 0 年在日本大阪召开的国际会议上作过初步报道， 引起与会学者的极大关注。这是迄今为止正式报道的唯一的非致病的淡水发光 细菌。另一已知的淡水型发光菌为霍乱弧菌的白色变种，有致病危险，不宜在 环境监测中应用。青海弧菌对金鱼( c a r a s s i u sa u r a t u s ) 进行的感染实验没有发现 明显的病理改变 2 6 1 。国内有较多学者进行了研究【4 ，2 5 ，2 7 3 3 1 ，认为青海弧 菌作为生物毒性测试手段有很好的应用价值。本文也就是以q 6 7 为毒性指示 生物，研究毒性测试方法。 图1 - 1 青海弧菌菌株的显微照片 1 1 3 剂量- 效应曲线 生物测试中常常用到“剂量反应关系”或“剂量效应关系”这两个概念， 它们一般通用，都是指外源物作用生物时的剂量与所引起的生物学效应的强度 或发生率之间的关系，它反映毒性效应和接触特征这两个毒理学研究中最重要 的概念以及它们之间的关系。因此，剂量反应关系是评价外源物的毒性和确 定安全接触水平的基本依据，是毒理学所有分支领域的最基本的研究内容，是 现代毒理学中一条最基本的规律和应用最广泛的原理。下面介绍剂量反应关 系的评价和应用【3 4 1 。 1 1 3 1 半数致死剂量( 半数效应浓度) 和“剂量反应”曲线斜率 桂林工学院硕。士学位论文 对新化学物质进行毒理学评价，一般是先用实验生物测定受试物的半数致 死剂量( l d 5 0 ) 或半数效应浓度r e c k ) 。半数致死剂量( 半数效应浓度) 是指给予 单次剂量的受试物后，预期引起半数实验生物死亡( 半数效应抑制) 的剂量水 平，由实验观察数据经统计计算获得。如果用多个剂量水平，并且每一剂量组 有足够数目的实验生物，则可观察到一条典型的s 形曲线( 图1 2 - a ) 。这一正 态分布的s 形曲线随着“剂量”的减少，“反应”也会降至“0 ”：理论上即 使剂量再加大，“反应”也不会超过1 0 0 。作为正态分布，在此曲线的反应 率2 0 8 5 范围之间基本呈直线。曲线的这一区段代表平均值加减一个标准 差( m 1 s d ) 。把图1 2 - a 转换成直方图，可见在最高剂量和最低剂量组，都 只是少数生物死亡，绝大多数生物的死亡是发生在最高剂量和最低剂量组之 间，最高死亡频率是在所给剂量的中间区段，呈“钟性”正态分布( 图1 2 一b ) 。 葶 v 褂 磊 嚣 b 7 代厚 图1 - 2 剂量效应曲线关系 剂量 这种正态频率分布的原因，是由于个体之间对外源的敏感性差异，即生物 变异( b i o l o g i c a lv a r i a t i o n ) 。低剂量区段( 曲线左侧) 出现反应的动物称“高度敏 感( h y p e r s u s c e p i b l e ) ”，高剂量区段( 曲线右侧) 出现反应的动物称“不敏感 ( r e s i s t a n t ) ”。把同一资料中的死亡率以概率单位表示，则上述s 形和钟形曲 线就转换成了直线。从概率单位5 0 作一水平线就是5 0 死亡率，交点处作垂 直线即半数致死剂量( l d 5 0 ) 。在这段范围内，剂量的改变最易引起反应的明显 改变，也就是说，剂量与反应的关系较为恒定。因此半数致死剂量( 半数效应 剂量1 是毒理学中最常用的表示剂量与效应之间定量关系的一个参数。用同一 桂林工学院硕士学位论文 原理和方法，还可求得9 0 生物致死剂量( l d 9 0 ) ，1 0 生物致死剂量( l d l o ) 等 其他毒性参数。 急性毒性测试过程中所获得的其他资料，如剂量反应曲线斜率，对于了 解外源物的毒性特征亦有重要的参考价值。首先，剂量反应曲线斜率可以用 来比较不同化学物质的毒性。一般地说，“平滑”的剂量反应曲线，“剂量” 的少量增加对“反应”影响不大，只有较大幅度地增大“剂量”，“反应”才 会有明显的增加；而较“陡直”的剂量反应曲线，即使剂量只是很小幅度的 变化，也会引起反应的显著增加。其次，比较同一化学物的剂量反应曲线在 不同区段的斜率，也可能提供有价值的信息。由于不同剂量会引起化学物转运 和生物转化途径的改变，或者使作用部位( 蛋白结合或受体) 的饱和或细胞内辅 助因子的耗竭等原因，同一化学物的剂量反应曲线斜率，在不同的区段可能 会有相当大的差别，有时甚至是本质上的差别。 1 1 3 2 “毒能”和“毒效”的比较 “毒能”( p o t e c y ) 指外源物诱发机体强烈生物效应的能力，即能够产生毒 性效应的剂量范围。“毒效”( t o x i ce f f i c a c y ) ：是指外源物在其理想条件下，可 以达到的对生物体的最大影响，即剂量反应曲线中生物体“反应”的上限。 毒能和毒效主要用于两种或两种以上化学物质的比较，旨在了解这些化学物质 对生物体影响的能力和特点。通常的做法是，先建立每一种化学物质的剂量 反应曲线，然后把这些剂量反应曲线在相同的坐标上进行比较，就可得到有 关化学物质产生毒性效应的剂量范围( 毒能) 和可诱发的对生物体的最大损害 作用( 毒效) 。 1 1 3 3 “阀剂量”和“无观察到有害作用剂量” “阀剂量”是指诱发机体某种生物效应显现的最低剂量，即引起超机体自 稳适应( h o m e o s t a t i ca d o p t i o n ) 极限的最低剂量，是剂量反应关系原理的另一 个非常重要的概念。由于生物个体间反应程度的差异，以及同一剂量可引起不 同的生物效应等原因，致使寻求任何外源物的“实际阀剂量”都十分困难。尽 管如此，急性毒性反应阀剂量的生物学基础已被确认，有关中毒机制方面的许 桂林工学院硕士学位论文 多研究也都证实和肯定，绝大多数外源物的毒性反应，尤其是急性毒性反应， 都存在着一个阀剂量。但某些慢性毒性效应，特别是化学致癌效应有无阀剂量， 还没有足够的证据。无论如何，在对外源物进行毒理学评价时，确定有无阀剂 量并可能地寻求“实际阀剂量”，不仅有重要的理论价值，而且对于确定安全 接触水平等具有十分重要的实际意义。 “无观察到有害作用剂量”( n oo b s e r v e da d v e r s ee f f e c tl e v e l ，n o a e l ) ， 简称无作用剂量，曾称为无明显毒作用剂量( n oo b s e r v e de f f e c tl e v e l ，n o e l ) 。 无作用剂量是指用最敏感方法未能检出外源物毒性效应的最大剂量，即阀剂量 下不出现毒性效应的最高剂量，是根据实验观察并经统计学处理而获得无作用 剂量可以从质效应毒性试验( 即计数资料) 获得，也可由“量效应”毒性研究( 即 剂量资料1 取得。实验研究中所得到的无作用剂量，可能是由于剂量过低不产 生毒性作用，也可能是因为动物数目少或观察时间太短而没有观察到有害作 用，它与所选择的动物种系和数目、观察指标的敏感性、染毒和观察时间的长 短等多种因素有关。因此严格地讲，用“无观察到有害作用剂量”更为全面和 确切，这点现已基本得到公认。但是，无观察到有害作用剂量并不意味着“零 危险度”( r i s k f r e e ) 。已有报道，从量效应终点( c o n t i n u e se n d p o i n t s ) ( 剂量反应 资料) 求得无观察到有害作用剂量，仍有5 的危险度，即平均反应率5 ；由 质效应终点( 计数反应资料) 获得的无观察到有害作用剂量，是危险度超过 1