血浆EGFR突变检测.ppt

血浆EGFR突变检测,晚期非小细胞肺癌患者表皮生长因子受体酪氨酸酶抑制剂(EGFR-TKI)疗效评估中的价值研究,项目概述主要研究内容和目标预期取得的标志性成果技术、经济效益、市场风险分析立项意义和应用前景,目录,靶向治疗已成为非小细胞肺癌（NSCLC）临床治疗的重要手段。大量研究表明，EGFR基因突变状态与靶向药物吉非替尼、厄罗替尼疗效密切相关。该基因状态具有重要的临床意义，是决定患者是否能够应用EGFRTKI治疗的先决条件。,项目概述-EGFR检测,Shapiro,Koffler,D,Leon等研究分别表明健康人、肿瘤及免疫疾病、慢性炎症患者血浆均存在循环DNA。HeidiSchwarzenbach研究表明肿瘤细胞因受到免疫细胞攻击等造成凋亡、坏死、裂解、释放进入到外周血中。,项目概述-循环DNA,传统如测序等技术其灵明度较低，为20%-30%，在EGFR基因的检测过程中存在突变率较低等问题。,项目概述-检测技术,1、ARMS（amplificationrefractorymutationsystem）技术是目前临床检测的主要方法之一，该技术的敏感性在1%左右。,2、Rosell与TonyS.Mok等通过ARMS方法检测组织与外周血一致性分别为59.1%和66.3%，假阴性分别为40.9%57.7%。,3、dHPLC（denaturinghighperformanceliquidchromatography）、HRM（highresolutionmelting）等物理学方法具备高特异性和高灵敏度的特点。ChenHe等通过dHPLC方法检测组织与外周血一致性分别为78%，假阴性分别为18.8%。,三项结果显示若利用更加敏感的检测方法，假阳性率较低。,含有野生序列的核酸肽（PNA）和含有突变探针的锁核酸（LNA）被使用去构建PCR夹，能大大提高探针与目标序列的Tm值和灵敏性。,项目概述-基于LNA-PNA阻滞的技术,该法降低了对检测样本的要求，大大提高了突变检测的灵敏度。,因此，在ARMS技术上，结合LNA-PNA阻滞的手段及HRM技术，则大大提高检测的灵敏度和特异性，避免血浆样本因DNA片段化、拷贝数较少等不利因素，降低检测的假阴性发生的可能。,因为PNA引物只能结合在野生序列上而不能与突变序列结合，从而起到了选择性地阻止PCR引物扩增野生序列的作用，即“锁”的功能。,EGFR-TKI是EGFR突变的复发或转移非小细胞肺癌患者一线治疗方案。临床上，大部分B期或期的患者则通过活检和穿刺是进行EGFR基因检测，但可能存在因肿瘤异质性造成的检测假阴性。近年来，基于血液EGFR检测研究应用越来越广泛，非小细胞肺癌血液EGFR基因突变检测中国专家共识认为当肿瘤组织难以获取时，血液循环游离或肿瘤DNA（cf/ctDNA）检测是在突变分析合适的替代选择。,主要研究内容和目标,通过研究可以对血液补充替代临床小样本进行EGFR检测指导TKI治疗提供依据。本研究通过对组织EGFR检测的样本，同时进行血液EGFR检测。血液检测突变的患者进行TKI治疗并进行影像学观察，从而评判血液EGFR突变的TKI治疗效果。,主要研究内容和目标,试验总体设计如下：穿刺组织样本提取DNA后，检测EGFR基因，结果为阳性的患者行TKI治疗；EGFR检测阴性的患者再进行外周血EGFR检测，阳性患者进行TKI治疗。同时随访，根据结果判定组织阳性、组织阴性血浆阳性的患者生存差异，从而得出血液补充替代临床小样本进行EGFR检测指导TKI治疗的真实效应。,主要研究内容和目标,1、入组患者本医院病理诊断仅为B/期非小细胞肺癌患者，年龄为18-80岁，组织样本无坏死情况。2、组织样本采集方法若为穿刺组织或肿瘤切面很小，肿瘤组织的含量至少在50%以上，白片8张，厚度5um。一年以内的石蜡标本。样本常温保存,主要研究内容和目标-样本采集,3、血液样本入选标准与上述组织样本提供者为同一患者的术前血，离体1小时内分离血浆样本，-60保存；枸橼酸纳或EDTA抗凝；血浆澄清透明，无混浊。4、剔除样本标准提取DNA的质量不能满足检测的样本；5、经综合考虑样本收集和临床试验所需时间，约8个月。,主要研究内容和目标-样本采集,1、石蜡穿刺样本DNA提取（QIAGEN56404）石蜡块固定至切片机上，调整切片机切片厚度设置为10m或者用刀片手动切，首先切除表面的2-3片，以去除表面氧化层（使用刀片自己手切时，请注意不要切太厚，也要保证蜡块完整性）。切取10m厚度的组织片5-6片（如果组织块过小，需要多切几片），然后放入EP管中，加入1ml二甲苯振荡混匀，以充分溶解组织周围石蜡，14000rpm离心2min吸去上清去除石蜡，如果石蜡过多，可以用二甲苯再洗一次。加入无水乙醇1ml（去除二甲苯），14000rpm离心2min吸尽上清后开盖直至残余乙醇全部挥发（大约10min）。加入180lATL和20l蛋白酶K，震荡混匀。,主要研究内容和目标-检测方法,561h（期间可以适当摇晃颠倒样品，使之混匀裂解充分）。901h（注意管盖，由于90高温可能会导致开盖，以致液体被蒸发；时间不要太长1小时足够；一个水浴锅时，56到90之间应该将样本置于室温中）。短暂离心使液体聚于管底，加入200lAL，震荡混匀，然后加入200l无水乙醇，震荡混匀。短暂离心使液体聚于管底，将整个液体全部移入收集柱中，然后8000rpm离心1min，丢弃收集管后将收集柱至于新的收集管中。,主要研究内容和目标-检测方法,加入500lAW1漂洗液，离心8000rpm，1min，丢弃收集管后将收集柱至于新的收集管中。加入500lAW2漂洗液，离心8000rpm，1min，丢弃收集管后将收集柱至于新的收集管中。离心14000rpm，3min，以去除收集柱中的残余液体。开盖后放置5-10min，以去除残余乙醇。加入洗脱液20l，然后室温静置5min离心14000rpm，1min，收集洗脱液。测DNA浓度,主要研究内容和目标-检测方法,2、血浆样本DNA提取准备20ulQIAGENProtease（或者蛋白酶K）放于1.5ml离心管管底。添加200ul样本到离心管中（全血，血浆，血清，体液，5106以上淋巴细胞在200ulPBS中）。加入200ulbufferAL到样本中，振荡混匀15秒。56水浴10分钟。微离心使液体聚于管底。,主要研究内容和目标-检测方法,加入200ul无水乙醇到样本中，振荡混匀15秒，微离心使液体聚于管底。小心的将第六步的混合液加入到QIAampMinispincolumn，不能润湿管口边缘。盖上管盖，8000rpm离心1min，丢掉收集管，将QIAampMinispincolumn置于新的2ml收集管中。小心打开QIAampMinispincolumn管盖，添加500ulbufferAW1，不能润湿管口边缘。盖上管盖，8000rpm离心1min，丢掉收集管，将QIAampMinispincolumn置于新的1.5/2ml收集管（不提供）中。,主要研究内容和目标-检测方法,14000rpm离心1分钟。丢掉上一步的收集管，将QIAampMinispincolumn置于一个新的1.5ml离心管中，小心打开QIAampMinispincolumn管盖，添加100ulbufferAE或者水，室温放置1-5分钟，然后8000rpm离心1分钟。测DNA浓度。,主要研究内容和目标-检测方法,3、组织检测方法为获取CFDA批文的人EGFR基因突变检测试剂盒（Taqman-ARMS法），试剂盒性能如下：检测分别含有20种突变类型的20份阳性参考品，阳性参考品符合率应为100%。检测10份野生型阴性参考品，阴性参考品符合率应为100%，检测除了对应突变点以外的其他突变点阳性参考品，应不得检出。在10ng野生型基因组DNA背景下，对突变DNA含量为5%的检测限参考品能准确检出。,主要研究内容和目标-检测方法,对同一份重复性参考品进行重复检测，结果应一致，均为阳性。临床研究以测序对照，研究表明本试剂盒检测结果与测序结果的总符合率为98.79%。,主要研究内容和目标-检测方法,4、血液检测方法为获取CFDA批文的EGFR基因突变检测试剂盒（荧光PCR法）苏州工业园区为真生物医药科技有限公司研发出上述两种试剂盒，该技术存在如下特点：准确性：检测含有29种突变类型29份阳性参考品，阳性参考品符合率应为100%。分析特异性：检测10份野生型阴性参考品，阴性参考品符合率应为100%，检测除了对应突变点以外的其他突变类型阳性参考品，应不得检出。,主要研究内容和目标-检测方法,最低检测限：在10ng/l野生型基因组DNA背景下，对突变DNA含量为5%的检测限参考品能够准确检出；在突变DNA含量为10%背景下，对DNA浓度为1ng/l的检测限参考品能够准确检出。精密度：对同一份阴性参考品进行重复检测20次，阴性符合率为100%；对29份弱阳性参考品进行重复检测20次，阳性检出率为100%；对29份高浓度参考品进行重复检测20次，阳性检出率为100%且CV15%；,主要研究内容和目标-检测方法,血浆的用量要求不高，一般大于200uL即可。灵敏度小于0.1%，最低检测至0.5%突变。,主要研究内容和目标-检测方法,以上两种检测方案均参考CFDA批准的检测步骤进行，详细步骤（略）,3.3临床治疗方案组织或血液检测EGFR突变患者均进行TKI患者，进行随访。3.4疗效评价标准参照实体瘤治疗疗效评价标准RECIST，同时随访CEA等预后指标3.5检测量至少30例血液EGFR突变患者3.6统计分析对检测的结果进行统计分析，对根据检测结果给予治疗的患者的治疗效果进行跟踪。,主要研究内容和目标-检测方法,本次方案将在真实世界揭示血浆样本独立于组织样本或补充组织样本在EGFR-TKI的治疗意义为临床医生进行TKI治疗进一步提供指导意义形成国内核心期刊一篇（SCI）,预期取得的标志性成果,血浆EGFR基因“液体活检”为非侵人性检查，可以避免组织标本量少的问题，有利于提高临床实践中EGFR基因突变的检测率。ARMS法是一种高度敏感的检测肿瘤EGFR突变方法，通过检测晚期NSCLC患者配对的肿瘤组织和血浆标本的EGFR突变状态，预测ARMS法检测血浆EGFR突变在患者EGFR-TKI疗效评估中存在重要的应用价值。,技术、经济效益、市场风险分析,基于LNA-PNA阻滞的技术可以有效地提高突变检测的灵敏度，能大大提高“锁”的功能。该法降低了对检测组织的要求，大大提高了突变检测的灵敏度。在ARMS技术上，结合LNA-PNA阻滞的手段及HRM技术，则大大提高检测的灵敏度和特异性，避免血浆样本因DNA片段化、拷贝数较少等不利因素，降低检测的假阴性发生的可能。,技术、经济效益、市场风险分析,血浆EGFR精确的检测出患者的EGFR状态，为晚期非小细胞肺癌患者是否使用酪氨酸酶抑制剂的靶向治疗提供了科学的用药指导目前临床使用酪氨酸酶抑制剂的靶向药物价格昂贵，有效避免了错误用药造成的患者经济负担和治疗副作用，大大减低了社会医疗资源的浪费。,技术、经济效益、市场风险分析,血浆EGFR基因检测，因其检测的无创性和采样的方便性，在晚期非小细胞肺癌患者用药指导上具有重要的科学意义。项目的实施风险主要存在于标本检测过程中的假阳性和假阴性检测结果，同时再采用多种检测技术验证能够有效避免以上风险。,技术、经济效益、市场风险分析,肺癌在确诊时超过7O%患者为、期大部分不能手术，此时的治疗手段有限，靶向治疗是其中一项。靶向治疗前必须进行基因突变检测，以明确是否可以进行靶向治疗。肺癌晚期，多数患者肿瘤组织较难获取。多项回顾性和前瞻性研究表明，当肿瘤组织难以获取时，血液循环游离或肿瘤DNA检测是突变分析合适的替代选择。,立项意义和应用前景,ctDNA是位于细胞外的游离DNA片段，由细胞死亡或凋亡后释放进入血液循环，这些游离DNA片段反映了机体的遗传特征。肿瘤患者体内的游离DNA具有肿瘤细胞DNA的特征，可以检测到同样的癌基因突变，与原发肿瘤一致。血液样品测试能够与侵人性组织活检一样有效地监控癌症，并且能够有助医生更好地开药治疗。此外血液检测也