（应用化学专业论文）二（2吡啶甲基）胺为识别基团Zn2荧光分子探针的研究.pdf

大连理工大学博士学位论文 摘要 由于锌离子在生命过程中起着许多重要作用，分析和检测细胞中的锌离 子成为近年来的研究热点。但普通的分析方法，如紫外一可见光谱、核磁共振 光谱、电子顺磁共振光谱等都不能用于检测这种生物体系中特殊的金属离子。 荧光分子探针检测法不仅简便，而且灵敏度、选择性、时间分辨、实时原位 检测方亟均有突出优点。因此，应用荧光探针体系在一个比较宽的浓度范围 内定量检测和反映z n 2 + 的流量和水平，对进一步了解z n 2 十在生物体系内的作 用具有重要意义。 基于碳酸酐酶( c a ) 芳香磺酰胺抑制剂相互作用的原理，设计合成了3 个化合物d l 、d 2 和d 3 。其中，在生理条件下( p h7 4 ) ，d 2 与z n 2 + 结合后， 九。从5 4 0 n m 蓝移到5 2 0 n m ，荧光强度增大近4 倍。表观解离常数( k d ) 在纳 摩尔范围内，在生物应用中具有足够的敏感性。另外，多种生物体中重要的 金属离子( 如c a 2 + 、m 9 2 + ) 等对d 2 的荧光没有影响。 基于p e t 原理，设计合成了以4 一氨基1 ，8 - 萘酰亚胺为荧光圈的化合物 n 1 、n 2 和n 3 。在t r i s h c i 中性缓冲溶液中，n 2 的最大吸收和发射波长都在 可见光区，加入z n 2 + 后，荧光强度增大5 倍，翰为0 8 n m ，活细胞中的显微 成像表明，n 2 能够很好地进入细胞中并对z n 2 + 表现出荧光增强。 设计合成了三个以酰胺n 原子为反应位点的1 ，8 萘酰亚胺化合物n 4 、 n 5 和n 6 。水溶液中p h7 4 时，n 4 和n 5 的荧光量子产率均为0 0 0 4 ，加入饱 和z n 2 + 后，m 分别增大4 3 和2 3 倍；p h5 时，加入z n ”后，m 分别增大3 0 和 1 0 倍。这样，n 4 和n 5 相对h + ，对z n 2 + 表现出良好的选择性荧光增强。理论 计算表明，分子内氢键可抑制h + 对荧光强度的影响，这为p e t 探针克服h + 的影响提供了一个全新的思路。 基于p e t 原理，设计合成了l ，3 ，5 ，7 一四甲基8 苯基化硼为荧光基团、d p a 为识别基团的z n 2 + 荧光分子探针b 1 。中间体2 分子模型的二吡咯甲基硼是平 面结构，而b l 的这部分结构表现弯曲的构型。加入z n ”前后的荧光量子产率 增大1 1 倍，达到o 8 5 7 。p k 。低至2 1 ，是目前发现p k a 最低的z n ”荧光探 针。b 1 z n 2 + 络合物的荧光强度在p h 宽达3 1 0 范围内不受h + 的影响。活细 胞内荧光显微成像表明该探针能够穿透细胞并反映细胞内z n ”的分布状况。 关键词：荧光，荧光分子探针，光诱导电子转移，z n ”，二( 2 一吡啶甲基) 胺 氢质子 二( 2 一吡啶甲基) 胺为识别基团z n2 + 荧光分子探针的研究 a b s t r a c t a n a l y s i sa n dd e t e c t i o no fz n 2 + i nc e l l s i s v e r ys i g n i f i c a n ta s i th a sm u l t i p l ea n d i m p o r t a n tr o l e si nl i v i n gp r o c e s s b u tm a n yn o r m a la n a l y s i st e c h n i q u e s ，f o re x a m p l e s ， u v - v i ss p e c t r u m ，n m ra n de p rc a n n o tb eu s e dt od e t e c tt h es p e c i a lm e t a li o n si n l i v i n gt h i n g s t h ef l u o r e s c e n c em e t h o di s n o to n l ys i m p l eb u ta l s oe x c e l l e n ti nr e a l s p a c e ，r e a lt i m e ，h i g hs e n s i t i v i t ya n ds e l e c t i v i t y t h e r e i s i m p o r t a n ts i g n i f i c a n c et o u n d e r s t a n dt h em u l t i p l er o l e so fz i n cw i t ha v a i l a b i l i t yo ff l u o r e s c e n tp r o b es y s t e m s p e r m i t t i n gq u a n t i t a t i v ed e t e r m i n a t i o na n di m a g i n go fz i n cf l u x e sa n dl e v e l so v e ra b r o a dc o n c e n t r a t i o nr a n g e b a s e d0 1 1c a r b o n i ca n h y d r a s e ( c a ) - s u l f o n a m i d ei n h i b i t i o n ，t h r e ef l u o r e s c e n tp r o b e s d 1 ，d 2a n dd 3w e r ed e s i g n e da n ds y n t h e s i z e d ，u n d e rp h y s i o l o g i c a lc o n d i t i o n s ，t h e e m i s s i o nm a x i m u mw a v e l e n g t ho fd 2w a sb l u es h i f t e df r o m5 4 0 n mt o5 2 0 n m u p o n a d d i t i o no fz n ”，a n dt h ef l u o r e s c e n c ei n t e n s i t ye n h a n c e dn e a r l y4 - f o l d t h ea p p a r e n t d i s s o c i a t i o nc o n s t a n t ( k d ) i si nt h es u b n m r a n g e ，a n d i t sf l u o r e s c e n e ew a sn o t i n d u c e d b y o t h e r b i o l o g i c a l l yi m p o r t a n t c a t i o n ss u c ha sc a 2 + a n dm 9 2 + u n d e r p h y s i o l o g i c a lc o n d i t i o n s t h r e e c o m p o u n d sn 1 ，n 2 a n dn 3b a s e do n 4 - a m i n o 1 ，8 - n a p h t h a l i m i d e w e r e d e s i g n e d a n d s y n t h e s i z e d i n t r i s - h c ln e u t r a l b u f f e r s ，b o t ht h ea b s o r p t i o n a n d e m i s s i o nm a x i m u mw a v e l e n g t ho fn 2a r ei nt h ev i s i b l er a n g e u p o na d d i t i o nz n ”， t h ef l u o r e s c e n c ee n h a n c e m e n ti s5 - f o l da n d k d i s 0 8 n m u s i n g f l u o r e s c e n c e m i c r o s c o p y ，t h ep r o b ei ss h o w n t ob ec a p a b l eo f i m a g i n gi n t r a c e l l u l a rz n ”c h a n g e s as e r i e so ff l u o r e s c e n tp r o b e sn 4 ，n 5a n dn 6b a s e do np e tw e r ed e s i g n e da n d s y n t h e s i z e dw i t hi m i d ea sr e a c t i o np o s i t i o no f1 ，8 - n a p h t h a l i m i d e i np h 7 4a q u e o u s s o l u t i o n ，b o t hq u a n t u my i e l d so fn 4a n dn 5a r e0 ，0 0 4 ，u p o na d d i t i o no fs a t u r a t i n g z n ”，t h eq u a n t u my i e l d si n c r e a s e d4 3a n d2 3 一f o l d ，r e s p e c t i v e l y a tp h5 ，t h e ya r e3 0 a n d10 - f o l d ，r e s p e c t i v e l y s o ，c o m p a r e dt o h + ，t h ef l u o r e s c e n c ei n t e n s i t y c a nb e e n h a n c e d s e l e c t i v e l yb y z n ”t h e o r e t i c a lc a l c u l a t i o n ss h o wt h a ti n t r a m o l e c u l a r h y d r o g e nb o n d i n g c a ni n h i b i tt h ef l u o r e s c e n c ei n t e n s i t y ，w h i c hp r o v i d e san e wi d e at o a v o i dt h ea f f e c t so fh + f o rp e tf l u o r e s c e n tp r o b e s ap e tf l u o r e s c e n c e p r o b e b 1f o rz n 2 + t h a tu t i l i z e s 1 ，3 ，5 ，7 一t e t r a m e t h y l 一8 一p h e r t y l - b o r o nd i p y r r o m e t h e n e a sa r e p o r t i n gg r o u p a n d d i ( 2 一p i c o l y l ) a m i n e a s ac h e l a t e rf o rz n ”w a s s y n t h e s i z e d a n dc h a r a c t e r i z e d i i 大连理_ 大学博= e 学位论文 m o l e c u l a rm o d e lo fi n t e r m e d i a t e2 g i v e s a p l a n a rc o n f o r m a t i o n o ft h e b o r o n d i p y r r o m e t h e n em o i e t y ，w h i l et h a t o fb 1e x h i b i t sac u r v e d c o n f o r m a t i o n u p o n a d d i t i o no fs a t u r a t i n gz n ”，t h eq u a n t u my i e l do fb 1i n c r e a s e d11 一f o l d a n du pt o o 8 5 7 w i t hp k ao f 2 1 ，u pt on o w ，b 1h a st h el o w e s tp k l ai na nt h ez n ”p r o b e st h e f l u o r e s c e n c ei n t e n s i t yo f b 1 一z n 2 + c o m p l e x i sp h i n d e p e n d e n ti nt h er a n g eo f p h 3 - 10 u s i n gf l u o r e s c e n c em i c r o s c o p y ，t h ep r o b ei ss h o w nt ob ec a p a b l eo fp e n e t r a t i n gi n t o l i v i n gc e l l sa n di m a g i n gi n t r a c e l l u l a rz n ”d i s t r i b u t i o n k e y w o r d s ：f l u o r e s c e n c e ， f l u o r e s c e n t p r o b e s ，p h o t o i n d u c e d e l e c t r o nt r a n s f e r ( p e t ) ，z n “，b i s ( 2 p i c o l y l ) a m i n e ，p r o t o n i i i 独创性说明 作者郑重声明：本博士学位论文是我个人在导师指导下进行的研 究工作及取得研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的 地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写的研究成果，也不包含 为获得大连理工大学或其他单位的学位或证书所使用过的材料。与我 一同工作的同志对本研究所做的贡献均己在论文中做了明确的说明并 表示了谢意。 作者签名：日期： 大连理工大学博士学位论文 1 。1 概述 第一章前言 化学、生物学和材料科学中至关重要的识别事件往往发生在一个为人们 所不熟知的微观世界里。但这些识别事件的信号可以通过建立具有特殊目的 的分子器件以光的形式表达出来。所以，人们设计、合成了大量能够将分子 识别事件通过分子的荧光信号来有效表达的复杂荧光分子，这些分子也就是 所谓的荧光分子探针【1 1 。 荧光分子探针( f l u o r e s c e n tm o l e c u l a rp r o b e ) 、荧光分子开关( f l u o r e s c e n t m o l e c u l a rs w i t c h ) 和荧光分子传感器( f l u o r e s c e n tm o l e c u l a rs e n s o r ) 是在荧光 分子识别( f l u o r e s c e n tm o l e c u l a rr e c o g n i t i o n ) 中经常使用的概念。荧光分子 探针是其中内涵最广的一个概念，一般说来，凡是在一定体系内，当某种物 质或体系的某一物理性质发生变化时，该分子的荧光信号能发生相应的改变， 这种分子就可称为某一物质或物理性质的荧光分子探针；荧光分子开关是指 在识别过程中荧光信号有明显强弱变化的荧光分子探针；荧光分予传感器是 指在识别过程中分子荧光信号能够快速、可逆响应的荧光分子探针。所谓分 子识别是指分子之间( 主体与客体或称之为受体与底物) 选择性地结合并产 生某种特定功能的过程。单纯的结合不是识别，识别是有目标的结合，它是 通过一系列结构确定的分子间相互作用而组成的模式识别过程。结合形成的 识剐体系的稳定性和选择性，是由形成过程中的能量和信息量来表征的胆一j 。 荧光分子探针的设计在分析化学、i 临床生物化学、医学以及环境科学等 众多学科中都占有重要的地位。很多化学和生物化学领域的被分析物都可以 用荧光方法测得，如阳离子( h + 、l i + 、n a + 、k + 、c a 2 + 、m 9 2 + 、z n 2 + 、p b ”、 a 1 ”和c d 2 + 等) ，阴离子( 卤离子、柠檬酸根、羧酸根、磷酸根和a t p 等) ， 中性分子( 糖类) 和气体( 0 2 、c 0 2 ，和n o 等) 4 1 。本论文主要研究的是阳离 子( 过渡金属离子z n 2 十、重金属离子以及氢离子) 的荧光探针，所以本章主 要介绍荧光分子探针的作用原理以及近年来报道的过渡余属、重金属和z n ” 二( 2 一吡啶甲基) 胺为识别基团z n 2 + 荧光分子探针的研究 荧光分子探针取得的最新进展。 k ，r u r a e k 对已有的过渡金属及重金属离子络合促进的荧光发射探针的原 理进行了如下描述”j ：在过去的几年中，利用荧光分子传感器，实时、原位 分析过渡金属和重金属离子的研究受到了广泛的关注。由于这类盒属离子多 数都对有机染料分子的荧光具有内在的淬灭作用，最近的许多研究多致力于 设计具有金属络合诱导荧光增强的探针分子。这种探针在增强选择性和敏感 性方面被寄予厚望。然而，到目前为止，虽然在这个研究领域中利用了多种 多样的光物理和光化学机理以及传感器分子的化学结构，但很少有关于建立 理性分子探针设计基本观念的尝试。e k i m u r a 认为理想的传感器分子应具有 以下特征：荧光探针分子自身稳定，对某种金属离子高选择性、高敏感性、 快速可逆响应( 实时) 、微米水平上原位响应并易于操作 6 ，”。荧光分子探针 的主要应用领域是生物、医学和环境监测，所以在水溶液中的识别更具有潜 在的广泛应用价值。另外，许多探针分子的荧光性质会受质子的影响，在水 溶液中可通过缓冲溶液控制稳定的p h 值，使识别研究的结果更可靠。但由于 水分子对金属离子较强的水合作用以及水分子和探针分子识别基团较强的结 合能力，使水溶液中的金属离子识别比有机溶剂中具有更大的难度 8 】。 综上所述，通常评价荧光分子探针的性能应主要考虑其灵敏性、选择性、 实时性和原位检测性能等四方面因素。其中，影响灵敏性的因素有许多：首 先，探针分子与被检测物的结合强度是识别灵敏性的前提；其次，识别信息 的荧光信号转换效率同样影响识别灵敏性，荧光增强的探针一般会比荧光淬 灭的探针灵敏性高；另外，荧光团的发射波长、量子产率、斯托克斯位移、 背景荧光干扰等也会影响探针的检测灵敏性；灵敏性还与仪器陛能有关。而 选择性则主要取决于探针与被检测物特异性的结合；有时某些被结合的客体 可直接影响荧光团的发射性能，这种情况下识别选择性还与被结合的客体性 质有关；专一选择性是最好的。实时性主要包括识别响应的速度和可逆性两 方面，如果可逆响应的速度快于或与被检测客体的变化速度相匹配，则可称 之为实时响应探针；原位检测性能主要取决于探针分子与被检测体系的相溶 性，探针能以独立的分子状态分散于被检测体系并发出识别信号；从目前的 大连理工大学博士学位论文 实际情况来看，水溶性探针比非水溶性探针好；在一定限度内，荧光探针检 测的空间分辨率取决于仪器t 9 。 1 2 荧光分子探针识别原理 1 21 光诱导电子转移1 ，1 o ，1 13 ( p e t ，p h o t o i n d u c e d e l e c t r o nt r a n s f e r ) u 腑十一 u 。洲。 _ 滞一啪 l 啊帕 h o 嘲o 器溜品稚斌器晶 礼责蒜蕊熊 卜t i o o 黜r m 悯土m 黼 。寇热、 图1 1p e t 荧光分子探钟识别金属离子的理论示意蹦 在各种阳离子荧光分子探针中以p e t 为设计原理的荧光分子探针是人们 最为广泛研究的。如图卜1 所示，典型的p e t 体系是由包含电子给体的受体 部分r e c e p t o r ，通过间隔基s p a c e r ( 如一c h 2 c h 2 ) 和荧光团f l u o r o p h o r e 相连 而构成的。其中荧光团部分是光能吸收和荧光发射的场所，受体部分则结合 客体，这两部分被间隔基隔开，又靠间隔基相连而成一个分子，构成了一个 在选择性识别客体的同时又给出光信号变化的分子体系。p e t 荧光分子探针 中，荧光团与受体单元之间存在着光诱导电子转移，对荧光有非常强的淬灭 作用。因此在未结合客体之前，探针分子不发射荧光或荧光很弱。一旦受体 与客体相结合，光诱导电子转移作用受到抑制，甚至被完全阻断，荧光团就 会发射荧光。由于与客体结合前后的荧光强度差别很大，呈明显的“关”、“开” 状态，这类探针又被称作荧光分子开关p e t 分子探针设计原理明确，特别 是对于碱金属、碱土金属和氢离子，、通常都可获得荧光增强效果。p e t 荧光 二( 2 一吡啶甲恭) 胺为识别基团z n2 + 荧光分于探针的研究 分子探针的作用机制可由前线轨道能量来说明( 图1 1 ) ，具体工作过程如下： 激发荧光团，具有电子给予能力的识别基团能够将其处于最高能级的电子转 入激发态荧光团因电子激发而空出的电子轨道，使被光激发的电子无法直接 跃迁回原基态轨道，导致荧光团荧光淬灭。识别基团结合金属离子后，其氧 化还原电位升高致使相应的最高能级能量低于荧光团，也就降低了识别基团 的给电子能力，p e t 过程被减弱或不能发生，荧光团的荧光恢复。 很多研究小组包括c z a r n i k 1 2 , 1 3 l ，f a b b r i z z i 1 4 16 1 ，t s i e n l l 7 ，18 1 ，k u h n 1 9 1 ： d e s v e r g n e 和b o u a s l a u r e n t 2 。，2 ，s h i n k a i 2 2 , 2 3 】以及d es i l v a l l ，2 4 。2 6 1 等对p e t 荧 光探针的研究都作出了贡献。己报道的p e t 荧光开关分子中，多数是以脂肪 氨或氮杂冠醚作为受体单元。式1 1 中所示的四个分子都是以蒽作为荧光母 体，亚甲基或酰胺键作为间隔基连接不同的受体所构成的p e t 荧光分子探针。 1 在甲醇中和k + 络合后，荧光量子产率从o 0 0 3 增加至0 1 4 2 。化合物2 能 和c u 2 + 及n i 2 + 络合，并把它们从二价氧化到三价，葸荧光的淬灭是由于一个 电子从还原态的二价金属转移到葸上【2 8 1 。d es i l v a 利用类似e d t a 结构的氮 羧酸基设计的化合物3 1 2 9 】是一种螯合型的p e t 探针分子，识别基羧酸基团形 成的空穴可以有效地螫合碱土金属c a ”和m g ”。 1 23 4 式1 - 1p e t 荧光探针 sc he m e1 1f o u rp e tf lr i or c s c e b c tpr o b e s 大多数p e t 荧光探针分子的设计是基于受体与客体的结合，使光诱导电 4 大连理工大学博士学位论文 子转移受到抑制，荧光团荧光恢复的原理设计的( 图1 1 ) ( “o f f o i l ”开关) ， 但对于过渡金属，其它的p e t 机理也可能起作用。由于过渡金属离子的3 d 电子的氧化还原行为，可以发生从荧光团到键合的过渡金属的电子转移，或 者从过渡金属向荧光团的电子转移，因此可以通过无辐射能萤转移导致荧光 淬灭。化合物4 t 3 0 l 的受体为硫杂冠醚。虽然硫杂冠醚与c u 2 + 之间有很强的亲 和能力，该分子的设计也是基于p e t 过程，但不同的是，与c u ”配位后，产 生了从荧光团到金属离子的p e t 过程，导致荧光淬灭。这也是d es i l v a 所介 绍的p e t 过程的另一种表现形式，“o n o f f ”开关。值得注意的是，4 与2 在 和c u 2 + 络合后，都是发生荧光淬灭，它们淬灭的机理就是上述所描述的两种 反p e t 行为。 p e t 探针不仅可以识别阳离子，也越来越多地用来识别中性分子。n a g a n o 等设计了识别单线态氧及n o 的p e t 荧光分子探针。d a m b o ph 【引1 荧光量子 产率是o 0 0 2 ，这是由于光激发后，电子从氨基转移到毗咯环，荧光淬灭。当 d a m b o p ”和n o 反应后，光诱导电子转移不能发生，荧光恢复，d a m b o p h t 的荧光量子产率达到0 7 4 。 、扩矽 r 奄将印旨螺一“ d a m b o p h a l m o s t1 1 0 1 1 - f l u o r e s c e n t d a m b o p h t h i g h l yf l u o r e s c e n t 式1 - 2 识别n o 的p e t 荧光探针 s c h e n l e1 - 2p e tf l u or e s c c n tpr o b ef o rn o 二( 2 毗碇甲基) 胺为识别基团z n2 + 荧光分予探针的研究 1 2 2 分子内共轭电荷转移1 1 ，1o ，川( i c t ，i n t r a m o l e c u l a rc h a r g et r a n s f e r ) 文献中将这一原理也称为光诱导电荷转移( p c tp h o t o i n d u c e dc h a r g e t r a n s f e r ) 。典型的i c t 荧光分子探针是由荧光团与识别基团直接相连构成。在 荧光团的两边分别连有吸电子基团( 电子受体) 与供电子基团( 电子给体) ， 并且供电子基或吸电子基本身又充当识别基团或识别基团的部分。当荧光 团被光激发后，会进一步增加分子内从电子给体到电子受体的电荷转移。当 识别基团与客体结合后，会对荧光团的推拉电子体系产生影响( 增强或减弱 电荷转移) 。随之发生的荧光团偶极距的变化，会导致荧光光谱的变化，主要 表现为荧光光谱红移或蓝移( 如图1 2 所示) 。一般情况下，i c t 荧光分子探 针对荧光强度的影响不如p e t 探针那么显著。 蝴t i e h i t i t 州 哪毛t 图1 - 2 c t 荧光分子探针在金属离子与其电子给体或电子受体结台作削扁荧 光光谱移动方向 f i g u r e 1 - 2 s p e c t r a d i s p l a c e m e n t s o fp c ts e n s o r sr e s u l t i n gf r o mi n t e r a c t i o no fab o u n dc a t i o n w i t h8 n e l e c t r o n d o n a t i n go re l e c t r o n w i t h d r a w i n gg r o u p 6 大连理工大学博士学位论文 5 是典型的i c t 荧光探针 3 2 1 ，氮杂冠醚既是推拉电子体系中的电子给体， 又是探针分子中的识别基团。当冠醚与碱土金属离子如c a ”络合时，由于会 属离子的拉电子效应，降低了氮杂冠醚中氮原子的供电子能力，因此发生荧 光蓝移，并且荧光增强。识别基团是电子受体的i c t 荧光探针如化合物6 【”】， 分子中二甲氨基与氮杂冠醚均为电子给体。当冠醚与碱土金属c a 2 + 结合后， 冠醚的拉电子能力增强，使整个体系成推一拉电子体系，因此荧光发生红移。 化合物7 】中的苯并冠醚与香豆素之间有氧桥相连，在乙腈中与c a ”结合后吸 收光谱显著红移，荧光略有下降。这种现象可解释为由于桥基的长度，使键 合后的金属离子有可能以种更接近予羰基氧的构型存在，促进了荧光团向 苯并冠醚的电荷转移。多数i c t 荧光分子探针在结合金属离子后，荧光强度 的变化不如p e t 探针分子明显，但8 p 4 是一个特例，它与l i + 络合后荧光强度 增大9 0 倍，而与m 9 2 + 络舍后荧光强度增大2 2 5 0 倍。 5 6 7 8 式1 3i c t 荧光探针 s c h e m e1 - 3i c tf l u o r e s c e n tp r o b e s 在i c t 中，有一种情况被称为扭曲的分子内电荷转移( t i c t ，t w i s t e d i n t r a m o l e c u l a rc h a r g et r a n s f e r ) 。具有推一拉电子共轭体系的荧光分子中，如果 推电子基( 如二甲亚胺) 通过可旋转的单键与荧光团相连，当荧光团被光激 发时，由于强烈的分子内光诱导电荷转移，连接电子给体与荧光团的单键会 二( 2 吡睫甲基) 胺为识别基团z n 2 + 荧光分子探针的研究 发生扭转，使原来与芳环共平面的电子给体与芳环平面处于正交状态，原来 的共轭体系被破坏，部分电荷转移变为完全的电子转移，形成t i c t 激发念， 原有的i c t 荧光则被淬灭。t i c t 态往往无荧光或者发射非常弱的长波长荧光， 少数情况下出现i c t 与t i c t 双重荧光现象 3 5 , 3 6 。 c n 毒 式1 - 4t i c t 荧光探针 s e l a e m e1 4t i c tf lk 1 0 1 e s c e l l tp r o b e s c n r f l l 乙nh n h h n 化合物9 t 3 6 是典型的能够发生双荧光的t i c t 荧光分子探针，以该化合物 为母体的衍生物被广泛地用于t i c t 双荧光现蒙的各种研究中【”l ，多年来该 化合物一直倍受关注【38 1 。化合物l o 表现为单重荧光 3 9 1 。化合物l l l 4 0 3 表现为 双重荧光，短波发射带是局部激发态产生的，长波发射带来源于t i c t 态，与 阳离子结合后，由于氮杂冠醚与阳离子的相互作用，长波吸收带强度下降。 化台物1 2 4 l 表现出非常特殊的三重荧光。第三重荧光的产生取决于溶剂、p h 和键合阳离子的微扰作用。 1 2 3 激基缔合物4 2 l ( e x c i m e r ) 当两个相同的荧光团，如多环芳烃萘、蒽和芘等连接到一个受体分子的 合适位置时，其中一个被激发的荧光团( 单体) 会和另一个处于基态的荧光 团形成分子内激基缔台物，它的发射光谱不同于单体，表现为一个新的、强 而宽、长波、无精细结构的发射峰。由于形成这种激基缔合物需要激发态分 洲杰y 八 大连理工大学博士学位论文 子与基态分子达到“碰撞”距离3 5 a 因此荧光团问的距离是激基缔合物的 形成和被破坏的关键。所以可以利用各种分子闯作用力改变两个荧光团之间 的距离，如用结合客体前后单体激基缔合物的荧光光谱变化表达客体被识别 的信息。萘、蒽等荧光团由于具有较长的激发单线态寿命，易形成激基缔合 物，常常被用于此类探针中。 1 31 4 式1 - 5 基于激基缔合物原理的探针 sc h e me 1 5t h epr ob c sb a s e do nt r i o n o m er e x c i m e tm e c h a n is m 1 5 化合物1 3 43 1 具有双芘荧光发色团氮杂冠醚络合k + 或b a 2 + 后，荧光强 度增大，同时单体激基缔合物的荧光强度比发生变化。化合物1 4 ”，通过酰 胺连接了四个蔡分子，在乙腈中以质子化的形式存在_ 并表现出激基缔合物荧 光光谱。络台c d 2 + 或p b 2 + 后荧光强度降低。化合物1 5 t 4 5 , 4 6 是识别，链 状二铵离子的一个非常好的双识别配体设计。当向1 5 的甲醇溶液中加入 h 3 n + ( c h 2 ) 7 n + h 3 2 c 1 后，单体荧光强度增强，激基缔合物发射消失。 1 2 4 荧光共振能量转移 4 2 , 4 7 , 4 8 ( f r e t ，f l u o r e s c e n c e r e s o n a n c e e n e r g y t r a n s f e r ) 二( 2 毗啶甲差) 胺为识别基团z n 2 + 荧光分予探针的研究 当能量给体荧光团d 与能量受体荧光团a 相隔的距离远大于d a 的碰撞 直径时，只要d 与a 的基态和第一激发态两者的能级问能量差相当，或者说 d 的发射光谱与a 的吸收光谱能有效重叠，就可能发生从d 到a 的非辐射能 量转移，又称为长距离能量转移( 甚至相距远达7 0 i o o a ) 。实际上d a 发生 能量转移时，两者除了光谱重叠外，还必须以适当的方式排列。a 可以是荧 光团，也可以是荧光淬灭团。前一种情形，激发d 时，由于能量转移，将观 察到a 的荧光发射。而后一种情形，则只能观察到d 的荧光变化，多用于核 酸的检测。 胁。，、。，、，、n 1 6 0 式1 - 6 有两种香豆素构成的f r e t 荧光探针 s c h e m el 6af r e tf l u o r e s g e n tp r o b ew i t ht w ok i n d so fc ：o u m af i i l $ 化合物1 6 t 4 9 】由两种香要素分子通过醚链连接。香豆素基团测距离较远， 能量共振转移效率低。当用短波激发时，只能观察到d 香豆素的荧光，加入 p b 2 + 时，p b 2 + 与开链聚醚形成络合物，拉近了d a 距离，f r e t 效率得以提高， 激发d 时，能够观察到较强的a 的荧光发射。 化合物1 7 5 0 】由萘酰亚胺与蒽通过烷基链相连，二者间距离较远，f r e t 效率低，当用长波激发时，只能观察到d 萘酰亚胺在5 5 0 r i m 发射的荧光。当 用短波激发时，可以同时观察到葸在4 0 0 4 5 0n m 和萘酰亚胺在5 5 0 r i m 处两个 荧光发射峰。随着p h 的增加，葸的发射峰强度急剧降低，而萘酰亚胺的荧光 强度变化很小，可以用于氢质子的识别。 舔 大连理工大学博士学位论文 1 7 n h 2 式1 7 由葸与蔡酰皿胺构成的f r e t 荧光探针 s ch e i l le1 7af r e tf l u or e s c c n tp r o b ew i t ht w ok i r i d s0 ff l u o t c s c c r lc g r o uos f r e t 类型荧光分子探针还广泛地应用于生物大分子的动态分析中。生 物大分子不仅结构复杂，而且多变，用x 射线衍射法或- h n m r 法都不能满 足生物大分子的多样性和动态研究的要求。当生物功能大分子，比如酶，引 入d a 荧光团后，观察二者的能量转移可以间接检测功能激活前后的结构变 化f 5 ”。 1 2 5 基于其它原理的荧光分子探针 大多数金属离子荧光分子探针是基于上述几种原理设计合成，但有些分 子探针是按照其它原理设计，甚至是意外所得，但效果却常常很好。 化合物1 8 的乙腈溶液中加入汞离子后荧光强度显著增强( 3 4 倍) 并伴有光 谱红移，用质子检测发现生成了脱硫产物1 9 。化合物1 8 是对汞离子有选择性 的化学反应荧光分子探针，这类不可逆的化学计量型的识别分子也被称为化 学计量计( c h c m d o s i m e t e r ) 1 5 2 l 。 毋。且辩弋警伊* 飞 1 8 式1 - 8 一种反应性荧光探针 1 9 二( 2 吡嚏甲基) 胺为识别基团z n 2 + 荧光分子探针的研究 化合物2 0 在乙腈溶液中对铅离子具有选择性荧光增强识别效果。识别过程 中荧光增强4 0 倍并伴有1 5 r i m 的荧光光谱红移，这种识别现象是铅离子配位时 影响了探针分子的光诱导分子内电荷转移及分子的构象刚性的结果1 5 3 1 。 2 0 式1 9 酮氪基香豆素荧光探针 有些荧光分子开关是通过结合某些过渡金属离子的氧化或还原态( n i l | 1 n i “，c u “c u 。) 淬灭或恢复荧光分子的荧光。在配合物2 2 中，三价镍离子通 过激发态丹磺酰胺荧光团向金属离子的电子转移将荧光淬灭；还原n i 3 + 后， 相应的二价配合物2 3 则不与荧光团间发生电子转移，荧光处于“开”的状态。 铜等金属离子也广泛存在这种现象1 5 4 1 。 4 0 0 n m ) ，以避免紫外光对生命有机体的伤害。在生物体外和生物体内 有溶解性和细胞穿透性。另外，p h 不敏感性也是需要考虑的一个重要因素 6 1 。 z n 2 + 荧光分子探针的设计原理一般是基于光诱导电子转移( p e t ) 或分子 内电荷转移( i c t ) 。另外，能量共振转移( f r e t ) 以及激发态分子内质子转 移等也在近年来有所发展。本论文将按荧光团和配体分类，介绍基于不同设 计原理的z n ”荧光分子探针。 1 4 1 经典的z n 2 + 荧光分子探针 6 甲氧基8 对甲苯磺酰胺喹啉( t s q ，2 4 ) 7 4 1 是第一例用于大脑、心 脏及其它组织切片中z n 2 + 浓度检测的荧光分子探针。t s q 虽然可用于在生理条 件下较高浓度的c a 2 + 和m 9 2 + 存在时z n 2 + 的检测，但t s q ，z n 2 + 络合物的结构和稳 定常数尚不清楚，t s q z n 2 + 可能以1 ：1 或2 ：1 的形式络合，并且荧光强度在不 同的介质中变化较大，所以用t s q 进行定量分柝z n 2 还有待于迸一步研究。 z a l e w s k i d x 组在t s q 的6 位上引入酯基后生成z i n q u i n 酯( 2 5 ) 7 5 】。当2 5 渗入到 细胞膜内后，在酶的作用下水解成羧酸根阴离子2 6 ，就可以长时间停留在细 胞内，从而考察z n 2 + 在细胞生长规律中的作用。2 m z i n q u i n 自身的荧光非常 弱，当游离z n 2 + 的浓度达到纳摩尔级后，荧光强度大大增强，当z n “达到饱和 浓度( 1 i x m ) 时，荧光强度增大2 0 倍，并且生物体中其它的重要金属离子( 如 二( 2 一毗啶甲基) 胺为识别基团z n 2 + 荧光分子探针的研究 c a “、m g ”、c u 2 + 、f e 2 十、f e 3 + 、m n 2 + 、c 0 2 + 等) 都不会影响2 6 z n 2 + 络合物的 荧光强度。2 6 能检测的z n 2 + 浓度范围在1 0 0 p m 1 0 n m 之间。但通过荧光计滴定 分析，2 6 与z n 2 + 形成1 ：l 或2 ：l 的混合络含物，在p h7 4 时，键合常数分别是70 1 0 6m 。1 和1 1 7 1 0 6m 。 e t 0 2 c , , 、 i 。w “琴h n 审 s 0 2 m em e t s q 2 4 0 2 c o m e 1 ) m e m b r a n ep e r m e a b l e 2 ) h y d r o l y s i sb y i n t r a c e l l u l a re s t e r a s e s 翠? 鼹 中由 m e m ie z i n q u i n z i n q u i na c i d 2 5 2 6 式1 - 1 1 早期的z n 2 + 荧光探针 2 m e t s o 2 7 为了进一步了解t s q 类荧光探针的化学结构，0 h a l l o r a n d 、组研究了2 甲 基一t s q ( 2 7 ) 7 6 1 ，结果表明，在中性d m $ o 水( 1 ：1 ) 的混合溶液中，2 7 z n 2 + 的2 ：1 四面体络合物是主要存在形式。x 衍射晶体分析进一步确定了络合物的 结构，即脱质子的酰亚胺n 及喹啉环上的n 原子与z n 2 + 配位。 1 4 2 由碳酸酐酶发展的z n 2 + 荧光探针 1 9 4 0 年，m a n n 和k e i l i n 报道了磺酰胺能够抑制畲有锌的碳酸酐酶( c a ) 的活性1 7 。1 9 6 7 年，c h e n 和k e r n o h a n 提出牛血红细胞c a 和等摩尔的丹磺酰胺 2 8 能形成1 ：1 的络合物，发出强烈的荧光【7 9 】。在水中，2 8 的发射波长为5 8 0n m ， 荧光量子产率仅为0 0 5 5 ，但结合了c a 后，2 9 的发射波长蓝移到4 6 8r i m ，而量 子产率增大到0 8 4 。荧光光谱的大幅度蓝移是由于丹磺酰胺的结合位点屏蔽性 好，疏水性强，并且磺酰胺在结合c a 时失去一个质子( 成为s 0 2 n h 。) 。所以 丹磺酰胺被认为是一种很好的碳酸酐酶荧光探针或者c a 凋亡后游离z n ”荧光 大连理工丈学博士学位论文 探针。磺酰胺荧光素结合物3 0 【7 9 1 和d a p o x y l f - 漠酰胺3 l 8 0 3 是这一类型荧光探针 的进步发展。3 0 和含有z n 2 + 的c a 络合( 解离常数k d = 2 3 n m ) ，荧光各相异 性和络合的z n 2 + 浓度在1 0 - 1 0 0 n m 范围内成比例。3 1 络合c a 后荧光强度增大9 0 倍，光谱从6 0 5 n m 蓝移到5 3 0 n m ( k a = 0 3 u m ) 。这样就可以通过计算化合物3 1 在5 3 5 n m 年16 8 5 n m 处的荧光强度实现对z n 2 + 的定量检测。 s 0 2 n h 2 d a n s y l a m i d e 2 8 h 2 n c a r b o n i ca n h y d r a s