（分析化学专业论文）基于毛细管的磁珠微流控dna富集提取系统的研究.pdf

v 浙江大学硕士学位论文 摘要 新一代分析技术总的发展方向是更加微型化、自动化、快速化和集成化，而 近几年出现的微流控分析( m i c r o f l u i d i ca n a l y s i s ) 正是为实现这一目标服务的主要 领域之一。微流控分析在其发展过程中结合了越来越多的技术，而这些技术又 推动了微流控分析领域的不断发展。比如磁场和磁性粒子与微流控系统的结合， 虽然时间并不长，但己在分离分选、控制、捕获、传输和混合上得到很多应用， 遍及生物、医药、化学、物理、药物等各个领域。在微流控芯片上使用磁珠提 取d n a 已经有了很多的报道，集成化程度也很高，但是芯片系统加工比较繁琐。 本工作的主要内容是建立基于毛细管的微流控磁珠d n a 提取系统。 第一章介绍了在微流控领域利用磁性物质和磁场进行微流控操作的进展领 域结合产生的功能及其主要运用。 第二章中介绍了基于毛细管的微流控磁珠d n a 提取系统。系统基于毛细管 构建，结构简单，不需采用昂贵的微加工设备和复杂的微加工技术。系统采用 重力驱动液流，操作方便。系统被应用于全血中d n a 的提取。 关键词：微流控系统；d n a 提取；毛细管：磁珠 丫浙江人学硕七学位论文 a bs t r a c t s t u d i e so nm i c r o f l u i d i ca n a l y s i ss y s t e m sh a v eu n d e r g o n ear a p i dd e v e l o p m e n t d u et oi t sa d v a n t a g e so fs h o r ta n a l y s i st i m e ，l o wc o n s u m p t i o n ，m i n i a t u r i z a t i o n , a u t o m a t i o na n di n t e g r a t i o n i nr e c e n ty e a r s ，m a g n e t i s mt e c h n i q u e sh a v eb e e nc o u p l e d t om i c r o f l u i d i cs y s t e m st oa c h i e v es o r t i n g ，s e p a r a t i o n ，t r a p p i n g ，t r a n s p o r t a t i o n ， m a n i p u l a t i o na n dm i x i n gi na p p l i c a t i o n so nb i o l o g y ，m e d i c i n e ，c h e m i s t r y , a n d p h y s i c s m i c r o f l u i d i ec h i p - b a s e dd n a e x t r a c t i o ns y s t e m su t i l i z i n gm a g n e t i cb e a d s h a v ea l s ob e e nr e p o r t e d h o w e v e r ，m o s to ft h e s es y s t e m su s ec o m p l i c a t e ds t r u c t u r e s i nt h ef i r s tc h a p t e r , t h ea p p l i c a t i o no fm a g n e t i cm a t e r i a l si nm i c r o f l u i d i ca n a l y s i s s y s t e mw a sr e v i e w e d i nt h es e c o n dc h a p t e r , am i c r o f l u i d i cd n ae x t r a c t i o ns y s t e mw a sd e v e l o p e d b a s e do nm a g n e t i cb e a d si nac a p i l l a r y t h i ss y s t e mh a st h ea d v a n t a g e so fs i m p l e s t r u c t u r ea n de a s eo fo p e r a t i o nw i t h o u tt h en e e do fa n ym i c r o f a b r i c a t i o ne q u i p m e n to r t e c h n i q u e t h ep r e s e n ts y s t e mw a sa p p l i e di nt h ee x t r a c t i o no f d n af r o mb l o o d k e yw o r d s ：m i c r o f l u i d i c ；d n ae x t r a c t i o n ；c a p i l l a r y ；m a g n e t i cb e a d s ； 独创性声明 本人声明所里交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的 研究成果据我所知。除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其 他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得逝江大雯或其他教育机 构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献 均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。 学位论文作者笔名：p 吻易 签字日期： 夕卵7 年7 月彦日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解堑望盘鲎有关保留、使用学位论文的规定 有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和 借阅。本人授权澎鎏蠢鲎可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库 进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权书) 学位论文作者签名： p 孕和 导师签名： 吻夏享 签字日期：川年7 月8 日签字日期：加1 年7 月 p 日 学位论文作者毕业后去向： 工作单位： 通讯地址： 电话：，刎a 御 邮编；，4 2o d v 浙江人学硕十学位论文 1 1 引言 第一章磁微流控的功能和应用 m a n z 和w i d m e r 在2 0 世纪9 0 年代初最早提出了“微全分析系统”( t a s ) 的概念1 。微分析系统以高度微型化和集成化为目标，具有极高的效率，试样试 剂消耗少，制作耗材少，把各操作单元集成或基本集成到仅几平方厘米甚至更 小的芯片上，最大限度地把分析实验室的功能转移到便携的分析设备中。发展 至今2 ，微流控领域在化学、生物各方面产生了越来越多的运用，如在细胞的操 控和分析、医学诊断、免疫分析、d n a 检测、蛋白质测定、环境监测等方面。 从近几年的发展情况看，微流控芯片的材料从原来的p d m s 芯片、玻璃芯片发 展到了各种生物材料和人造材料如热塑性聚酯等，甚至产生了“纸芯片 3 。微 加工技术进一步成熟，制作出结构更为复杂的三维芯片，微型化和集成化程度 更高，发展到了纳流控的尺度，芯片上不但制作出了各种泵、阀，还发展了色 谱和质谱，样品的预处理、引入、混合、反应、分离和检测都可以在一块芯片 上完成。微流控芯片结合了越来越多的技术，不断推动着该领域的发展，这里 主要介绍在利用磁场完成微流控功能方面取得的一些进展。 将磁场运用到微流控领域的时间并不长，但两者的结合已取得了不少的成 果。在w 曲o fs c i e n c e 以m a g n e t i c 和m i c r o f l u i d i c 为关键词搜索，从2 0 0 0 年到 现在共有1 6 2 篇文献。 磁场不受表面电荷、溶液的p h 值、离子浓度和温度的影响，可以不与通道 内的物质接触而实现控制，随着微机电加工技术的成熟，磁场在微流控领域的 应用越来越多，在分离分选、控制、捕获、传输和混合上都有着很多的运用， 丫浙江人学硕十学位论文 遍及生物、化学、物理、药物等各领域，还出现了商业化的产品。 1 2 常用磁性物质 1 , 2 1 磁性微球 磁性微球在微流控上的运用最为普遍，这些粒子的半径在几微米到几纳米之 间，磁核只占有粒子体积的小部分。磁性微球不受p h 等的影响，当外界有磁场 存在时即会做出相应的反应，利用磁场可以方便地聚集和释放磁性微球4 ，并在 芯片上形成各种构型。磁性微球的表面经过改性后还可以吸附d n a 、抗原及其 他生物分子( 如图1 1 ) ，甚至可以吸附在细胞表面使细胞具有磁性。目前已有 很多商业化产品，用于d n a 的提取和各种免疫反应。使用磁性微球提取d n a 可以避免常规试剂盒的离心步骤，而且提取的d n a 纯度更高。新型磁珠的发展 5 7 和表面改性8 。9 仍在进一步研究中。 a n t i b o d i e s a n t i g e n s s s d n a o l | 9 0d t 磷。专 a 嬲漪归绷海a y 誊 绚i l 骥啪 触懵铂_ 蕾 0 醐糟o l 毒呦 o 敝培o l 翻煳 o n a 毒蝴 m r n ai t m l a l k m 蕊 n a 雄例悯 图1 1 表面功能化的磁珠，可用丁各种生化反应 1 , 2 2 铁磁流体 铁磁流体是将磁性粒子加入水或者有机溶剂中形成的稳定的悬浊液。这些超 2 丫浙江大学硕+ 学位论文 顺磁性粒子的平均半径在1 0n l l a 左右，表面包有被膜以防止聚合。铁磁流体可 以在通道内流动，形成任意的几何形状，在强磁场中仍具有流动性1 0 。利用铁磁 流体的特性可制成铁磁流体泵( f e r r o f l u i d i cp u m p s ) 驱动液体，磁流体塞通过外 界磁场驱动，泵入的液体必须和铁磁流体不互溶- 1 4 。 1 2 3 磁性细胞 有些细胞具有天然的磁性1 5 ，如红细胞因含有顺磁性的血红蛋白呈磁性，白 细胞则具有较弱的反磁性。有些细菌还可以在细胞内合成超顺磁性微粒，因而 能感知地磁，沿磁力线运动。目前已对其分离培养、菌体特性、基因遗传等方 面进行了大量研究。此类细菌在传感技术、临床医药、废水处理等方面也有了 一定应用。 1 2 4 反磁性物质 反磁性物质在磁场中向磁场最弱处运动。反磁性物质的运用相对较少。大部 分的物质具有弱反磁性，如水、蛋白质、d n a 、铜等，微流控领域运用最多的 是聚苯乙烯微球。k i m u r a 等1 6 将铝片和铁片相互叠加后放置在lm t 的均匀磁场 中，得到一个固定周期的磁场，反磁性物质就会聚集在铁片上方，利用此法可 以捕获聚苯乙烯微球。 1 2 5 磁铁 永磁体的磁性比较强，微流控装置中使用的通常是小的钕铁硼磁体，即使 磁铁离通道几毫米仍有较强的磁性，因而可以有效控制通道内的磁性物质。不 丫浙江人学硕十学位论文 同的装置使用的磁条大小不同，在磁流体动力泵中，整个通道必须处在均匀磁 场中，就需要几厘米长的磁铁1 8 。但如果只需在某处固定磁珠1 9 ，所需的磁铁直 径只需几毫米。在一些微系统中，微磁条可以同定在储液池2 0 或通道内2 1 。磁 场也可以用各种方式进行调整。比如将铝片和铁片相互叠加，放在磁场中，就 可以得到周期性变化的磁场临1 7 。 电磁铁可以通过电信号快速丌关，磁场强度也可以方便地调整。常规的电 磁铁通常制作成锥形2 2 ，以达到较高的磁场梯度。但是较之永磁体，电磁铁产生 的磁场仍然较弱，而且体积相对庞大，产生的焦耳热也会限制其使用。 在芯片上制作微磁体步骤比较繁琐，而且价格昂贵，其方法和微通道的制 作类似，可通过溅射、电镀、蒸发等方法覆盖一层金属膜，将平板印刷和刻蚀 等技术相结合。平板电磁铁可以由简单的通电导线构成，复杂的电磁铁需用镍 铁导磁合金和镍等铁磁性物质作为核心，外面绕导线，并且要尽量使得电磁铁 和通道接近，在通道内得到较大的磁场强度2 4 。 r a m a d a n 等2 4 对平板电磁铁的几何构型参量进行优化，制作了三种不同形 状的微电磁装置：单一弯曲导体，网格状及圆形弯曲结构，分别从理论上计算 磁场强度和磁场梯度的变化，并将计算机模拟和实际测量得到的数据进行比较。 r w i r i x s p e e t j e n s 等2 5 和s m i s t r u p 等2 6 将电磁铁制作在s i s i 0 2 的通道内，c h o i 等”则将c u f r i 电极集成在微通道内，这些制作对微加工技术要求较高。s i e g e l 等2 8 在硅烷化的p d m s 通道内灌入熔融的金属，冷却后就得到了金属丝电磁铁， 磁场强度可达2 8m t 。使用这种方法可以一次性制作多个电磁铁，简单快速， 并且可以使金属丝和样品流经通道非常接近。 4 v 浙江人学硕十学位论文 1 3 磁场在微流控系统中的功能 1 3 1 泵和阀 1 3 1 1 磁流体动力泵 磁流体动力泵( m a g n e t o h y d r o d y n a m i c ( m h d ) p u m p s ) ，是压力泵或电渗 泵的一个替代手段。相互正交的电场和磁场加在导电溶液上时，通道内的溶液 就如同一段通了电的导体而受到一个沿着通道方向的洛伦兹力，这个力就能驱 动液体流动。m h d 泵适用于任何导电液体，而不需要任何机械传动部件，既可 用于直通道，也可用于弯通道。改变电流强度、磁场强度或者离子浓度均可方 便的控制液体流速。 m h d 泵应用简单，使用直流电和均匀磁场就可以实现，j a n g 等2 9 用永磁体 钕铁硼磁铁产生的4 4 0m t 的磁场，磁场和沉积在硅通道里的铝电极一起构成了 磁流体微泵，这个微泵能驱动海水产生2 5i l l m $ 的流速。z h o n g 等3 0 使用永磁 流体微泵驱动汞柱和盐溶液，去离子水，分别可以达到2 0 0 ，1 2 ，0 5m l l l $ 的线 速度。但是普通的m h d 泵仍存在着一些问题，电极工作时溶液会因电解而产生 气泡，其使用寿命不长。h o m s y 等1 8 将电极置于泵驱动通道旁的专用通道内， 再通过小通道连接到驱动通道，这样就避免了在驱动通道内产生气泡，但是电 极专用通道必须与大气相通。a r u r n u g a m 等通过采用在溶液中加入氧化还原 剂的方法，减少气泡的产生并延长电极的使用寿命，水性和非水性的溶液都可 以被驱动，这种泵需要的电压比普通直流m h d 泵低。电解也可以通过使用交流 电消除，只要同步变换电流和磁场的方向，就可以保持流体所受洛伦兹力的方 向的恒定，因此交流m h d 泵需使用电磁铁提供磁场。 l e m o f f f 等3 2 利用小型的电磁铁和硅通道上沉积的铂金电极构成微泵，通过电 路配合，同时改变电流方向和磁场方向，制作了交流磁流体微泵。该泵用于驱 动浓度为0 0 1m o l l 和1m o l l 的n a c l 溶液，能分别产生o 3n l m s 和1 5m m s 的流 5 v 浙江大学硕士学位论文 速。w e s t 等”则制作了循环磁流体微泵并用于芯片上的p c r ，泵由一对沉积在通 道壁上的p t 电极和穿过芯片的自制电磁铁( 1 1r o t ) 构成。e i j k e l 等3 3 - 3 4 报道了一 种由金电极和5 个1 0 0 m t 的自制电磁铁构成的泵，目的是用于电色谱的分析，但 是目前对1m o 儿的k n 鸥溶液只能达到4 0 l l l t v s 的流速，还不能真正用于电色谱的 分析。 1 3 1 2 铁磁流体泵( f e r r o f l u i d i cp u m p s ) 铁磁流体泵就是利用铁磁流体的磁性和液体的流动性来制作微泵。通过外磁 场驱动磁流体塞，磁流体塞驱动与之不相溶的液体流动，因此可以用疏水的磁 流体来驱动水溶液。 h 甜c h 等”设计制作了一个由两个钕磁铁和两个磁流体塞构成的循环磁流体 微泵，原理如图12 所示，一个流体塞在入口和出口间，由一个固定的磁铁m 吸 住不动，如同一个关闭的阀，另一个则由另一个安装在环形通道内侧的磁铁带 着作顺时针绕环运动，流体塞运动时抽取右边入口的溶液同时泵出左边通道的 溶液，循环速度最高可达8r p m ，可得到42m m s 的流速。 ti 飞a 歹、? 矿 j 过i - ! - t 二二 图l2 铁磁流体泵，利用碰铁m 可控制铁磁流体塞在微通道内的循环运动 澎 澎 v 浙江人学硕士学位论文 c h o i 和a h n3 6 通过转动外界磁场( 3 4 0m t ) 在铁磁流体上方泵入小体积液体 ( 7 6 0n l ) 。h a r t s h o m e 等3 7 利用带有三个铁磁流体塞的t 型网络结构，可以泵 入气体和液体。两个塞子用作阀，利用外界磁场把铁磁流体从边上的小槽吸入 主通道就可以将阀关闭。另外个塞子用作活塞，通过转换主通道内的阀和垂 直通道内活塞的位置，气体就可以从空气泵入芯片外的压力传感器。由于磁流 体的高度黏性，活塞的移动速度很慢，只有3 0 5 0o m s ，因此每一循环需要3 0m i n ， 且只能泵入3 0 0n l 的空气。使用该装置泵水时，通道表面要进行硅烷化处理，防 止渗漏到铁磁流体塞中。也有报导采用数学仿真方法来模拟微电磁阵列如何控 制微通道内的铁磁流体娜。 利用铁磁流体加热到临界温度t c 时会失去磁性这一点，将热和磁场结合，可 制成磁热泵。常规的铁磁流体t c 温度太高，液体在磁性消失前就开始沸腾。研 究发现，含m n 和z n 组成的铁磁流体的t c l k 氏于8 0 。在这种铁磁流体上结合一 个均一稳定的磁场和温度梯度就可以实现磁热泵。当温度达n z c 时，铁磁流体 对磁场的吸附消失，热流体所在的位置就会被冷流体代替，这样液体就可以被 驱动3 9 ，流速可以达到2r m v s 。 1 3 1 3 其它类型泵 在芯片储液池内放入小块磁铁，转动时也能驱动微通道内的液体，达到泵 的效果。在通道内装入微型搅拌磁子4 3 ，利用常规的搅拌盘就可以旋转。 a t e n c i a 和b e e b e 铝1 作了基于漩涡的仿生泵加。置于微通道内的磁铁由于受到 通道壁的限制，当外界磁场旋转时会发生振荡，这种振荡产生的漩涡可以使液 体产生3 6 0 0p u m i n 的流速。 1 3 1 4 流体开关阀 基- j ：磁流体塞的阀在介绍h a t c h 的工作时已经提到，通过一个固定的磁铁来 7 丫浙江人学硕十学何论文 固定一个流体塞，就可以阻断液体的流动，起到阀的作用，h a r t s h o m e 等3 5 采用 这一原理，用2 8 0m t 的磁铁制作了既可用于液体也可用于气体的阀，该阀可以 抵抗0 5b a r 的背压，使用5 8 0m t 的磁铁则可以抵抗1 2b a r 的背压。 磁改性的p d m s 也可以用来制作磁阀，在p d m s 中掺杂进铁粉就可以得到既 有弹性又有磁性的材料，j a c k s o n 等4 1 用磁性p d m s 制作了51 1 1 1 1 3 长的微通道，将此 通道粘在安装有电磁铁的电路板上，当电磁铁通电时，通道就会关断，起到阀 的作用。 磁流体动力流也可以起到开关阀的作用，l e m o f f 等4 2 报道了利用集成在y 型 通道里的两个m h d 泵来达到对液体的控制，当一个泵打开而另一个泵反向开启 时，液体即可流向第三个通道，这个切换器没有任何机械装置，但是需要精确 的电子控制设备，并且不能抵抗较高的背压。b a u 等4 3 使用m h d 泵实现了微通道 内流体的控制。在两个相反方向的通道两端分别安装金电极，整个装置放在n d 磁铁( 4 0 0r o t ) 的均一磁场下。通过电极位置的优化，荧光染料可以在这一微 流控装置中流动，流速可达数c r n s 。 1 3 2 混合 最简单的有效混合是把小磁子安置在储液池2 0 或微通道内2 1 - 4 4 ( 如图1 3 ) 。 l u 等2 1 在微通道内安装小磁条，利用外界磁场带动磁条旋转以混合溶液，转速 在1 0 0 6 0 0r m p 间，计算机模拟和实际观测两种有色溶液的混合，都得到了很好 的效果。但将4 0 0p a n 的磁子放在7 5 0p , m 的通道内，边缘部位接触不到，影响了 混合效果。r ”等“将通道尺度进行了缩减，4 0 0 岬的磁子可以在4 2 0 岬的通道 内旋转，解决了这一问题。磁子也可以以阵列形式安装在微室内促进混合。n a l l a n i 等4 5 制作了三维的铁磁性微转子，转动时可引起液流的三维扰动，实现微尺度下 的快速混合，与微磁条相比混合效率提高了近2 0 。 y 浙江人学硕十学位论文 刀 o u t i e i 图13 磁子安装在微通道内，由常规搅拌器转盘控制转动。 使用磁性粒子促进混合的报道比较多。磁性粒子的随机运动即可用于溶液 的混合。鼬妇等4 6 将两磁铁锥形磁极相对，固定在y 型通道的主通道两侧。利 用外界交互的磁场调整通道内的磁场，磁珠并不固定，也不形成塞子，而是在 极短的距离内随机移动，以此达到促进不同溶液混合的目的。4 0 0m 长的通道 在0 5c m s 的流速下，荧光素和水的混合效率达9 5 。s u z u k i 等47 在流体通道 的横向植入导体作为电磁铁当磁场随时间变换时利用曲折的几何构型就可 以达到有效混合。 还有报道利用顺磁性的胶状粒子连接成链做为微磁搅拌予促进混合。b i a w a l 等4 8 设计了有三个通道汇入一个流出通道的通道网络，两对可旋转的电磁铁通正 弦交流电，可产生15m t 的磁场强度。当一路染料和两路缓冲溶液同时进入主通 道时，流体内的磁性微粒链在旋转磁场作用下转动，使得溶液达到快速混合。液 流的混合效率随着转动频率的增加而增加，但存在一个最大频率，一旦超过， 磁性粒子链就不再有促进混合的效果。c a l h o u n 等钾使用仿真方法计算液流和顺 磁性粒子在旋转磁场的相互作用，发现调整磁性粒子链的黏性和磁力比可以提 高混合效率。 曼 y 浙江大学硕士学位论文 磁流体动力泵也可用于混合。q i a n d 等5 0 在通道侧壁制作了多个电极，当两 相对的电极通电时，就可以达到泵的效果驱动液体流动，当对角线上的电扳也 通电时，就会驱动第二个m h d 泵，从而产生无序流动以达混合的目的。 1 3 3 捕获和操控 芯片上捕获和操控磁性物质一般使用弯曲的导线、环、网格，或在芯片上集 成电磁铁来进行操控。 d e n g 等5 1 在硅基片上制作弯曲的金导线，通电时磁性粒子沿着导线传输( 如 图13 a ) 。w a n g 等4 5 则在芯片上制作铜导线，当通过几百毫安电流时，碰性粒子 从边缘逐步移动到芯片中间，通过控制铜线电流还可以选择性地操控单个磁珠。 w i r i x s p e e t i e n e s 等5 2 将导线制成锯齿状( 如图14 b ) ，单个磁珠可以在磁场梯度晟 高处被捕获。当导体问电流的切换频率为02h 2 时，磁珠可以2 0 “州s 的速度在棘 齿间运动。l e e 等5 3 制作了金导线环，可从液滴中有效捕获磁性微粒。加工网格 状的金导线阵列( 如图1 3 c ) 还可控制粒子移动到设定的位置。r a r n a d a m 等”在 芯片上设计了一系列不同形状的微线圈，控制不同区域的磁场分别及强度，磁 珠就可以不同形式捕获并组合。 ( a ) 丫浙江大学聊十学位论文 圈i4 c 陶14 磁珠在随时间变换的电磁场控制r 的运动。 a 沿弯曲金导线运动，b 沿棘齿利金导线运功，c # 金导线网格运动 利用磁场不但能操控磁性微粒，还能在油相或超疏水的表面操控含有磁性 物质的液滴。使用液滴可以减少试剂残留带来的污染，近年来这方面的研究越 来越多5 。s h i k i d a 等5 8 在芯片上设计一系列的微井，包含有磁珠的液滴悬浮在 微井的油相内，用外界永碰体控制磁珠移动，依次经过含有样品、反应液液滴 的微井，完成反应并检测。也可以控制外界磁场”，实现液滴在二维芯片上的移 动、合并、混合和分离。利用这种方法可以实现d n a 提取”( 如图l5 所示) 及 p c r 操作。e g a t z g 6 m e z 等”在超疏水性表而控制含有顺磁性物质的液滴通过 移动外界永磁体，可使液滴移动速度达到7cm s ，并实现液滴的合并。 1 r 浙江大学硕士学位论文 铷 j 阜毒 = 芝i 1 l ： 产l 口 。含有破珠的液滴经过恩j 5 徽黎装燃? 譬气篡漱经过含有洗脱液的：。= 处进行洗涤，除去杂质，c 液浦经过5 、6 两赴实现d n a 洗脱随后碰珠引出芯片。 反磁性物质在磁场中受到磁场强度最小方向的力，同样可以利用磁场进行 控制。如将铝片和铁片相互叠加后放置在均匀磁场中，得到一个固定周期的磁 场，以此捕获聚苯乙烯微球1 6 。c h e t o u a n i 等”利用反磁性物质的特性，控制其 在磁性槽内的运动，实现了在磁性微井中的悬浮和捕获。h a g u e t 等“使用一块 小的磁铁悬浮含有反磁性微球的液滴，液滴不但可以悬浮在磁性微井内，还可 以进行混合，同时避免液滴和壁接触时带来的交叉污染，而且具有检测方便的 特点。3 0 “m 的液滴可以悬浮在1 5 0 岬的槽内，并沿着槽的轴向移动。 ；气一落川 丫浙江火学硕十学位论文 1 3 4 分离和分选 利用磁场梯度来分离磁性物质是微流控领域一种具有特色的方法。 c h o i 等6 2 在芯片上集成螺旋型磁铁和半封装的镍铁导磁合金，当导体通过3 0 0 m a 的直流电时，顺磁性的微球就可以被吸附固定从而达到分离。运用这一技术 可以成功地把细胞和绑定在微球表面的蛋白质、酶等从溶液中分离。s m i s t r u p 等 6 3 采用类似的的方法，将微电磁铁和微通道集成在同一硅片上，有效分离了流体 中的磁性粒子。 s i e g e l 等6 4 在y 型通道结点1c m 处的两侧安置电磁铁( 图1 6 ) 。磁珠悬浮 液以1 0g m h 的速度流入，当两侧电磁铁均关闭时，磁珠的流向是随机的，当右 边通道通电而左边通道不通时，磁珠都流往右边的通道，反之则流向左边的通 道。 图1 6y 型分离装置 两电磁铁安装在距节点l c m 处y 型通道两侧。a 电磁铁均关闭，b 上面的电磁铁关闭，下 面的电磁铁开启l s ，c 下面的电磁铁关闭，上面的电磁铁开启l s 。 与之相似，o s t e r g a a r d 等6 5 利用h 型通道实现磁性分选。直径为2 8 岬的 磁性微球从左侧通道流入，缓冲溶液从右侧通道流入，当左边的电磁铁开启而 右边的电磁铁关闭时，磁珠都被吸附到左边的通道上，然后切换电磁铁，磁性 颗粒就通过中间的平行通道进入右边的平行通道( 图1 7 ) 。 v 浙江人学硕t 学位论文 邑鞘卜玉 图i 7 h 型分离装置一 m a g n e t i c 卜1 1 - - - - _ - - - - _ 一 c h r o n i s 等6 6 将中间通道改成较粗的通道，并在通道的一侧放置磁铁。平行 通道的一端引入磁性粒子和非磁性粒子的混合液，另一端则引入缓冲溶液，当 汇合后流经中间通道时，磁性粒子偏向有磁铁的一侧进入缓冲溶液，最后在平 行通道下出口流出，而非磁性粒子则从上出口流出，由此实现分离( 如图1 8 ) 。 l 擦l r o n g 等6 7 制作了一种新颖的磁珠分离装置。如图1 9 所示，当左边的电磁 铁驱动时，磁性微球就受往左的磁场作用而进入左边的通道。在不同的时间驱 动不同的电磁铁就可以实现分离。 1 4 y 浙江人学硕士学位论文 0 舅 靛 图1 9 磁璩分离装置一 y e l l e n 等“在微流控芯片上设计了三种不同的微池，通过控常0 外界磁场和液 流来控制磁性微球的位置，可以在相邻的微池内填入不同的荧光标记微球。使 用微池可以避免液流在冲走外部微球的同时带走微池内的磁性微球，通过控制 微池的尺寸可以限制池内填充的微球数量( 图1 】0 ) 。 耻j c i 删衅蛐l 蹦 1 3 5 磁性粒子自组装 图1 1 0 磁珠分离装置二 磁性微球的自组装成型技术也在研究中6 9 ”。利用磁性微球的自组装可以在 通道内形成粒子塞或粒子链。但在均一磁场中。粒子一般不形成链，而是自组 成金字塔型7 。或小环”( 如图11 1 ) 。将聚苯乙烯微球的酒精悬液在储液池的一侧 以4 5 。角加入，微球就会在永面自组装形成单层的膜，尺度可达厘米级”。将基 片预先放在水相下，自组完成后将水放出至基片以下，单层膜就结合在基片上。 利用磁性粒子的自组装进行实验已有报道。磁性粒子在微通道内自组装成 柱时具有相当规则的柱间距离，这些距离可以通过改变粒子浓度的方法调节。 丫浙江大学硕士学位论文 在将d n a 分子的混和物泵入通道时，d n a 分子缠绕在柱上，分子越长，在柱上 缠绕的时间也越长，利用不同长度的d n a 在磁性粒子柱上缠绕的时间不同，就可 实现d n a 的分离似”。s 缸m a 等”在芯片上制作l5 岬l 直径的镍点六边形阵列，控 制磁性粒子自组装链的形成，可在几分钟内分离4 8 - 1 6 6 k b p 的d n a 并进行检测。 磁性自组装技术也被应用于蛋白质检测上7 。”。 圈11 l 磁性微球自组装形成的环形或金字塔结构 1 4 磁场在微流控领域的具体运用 磁微流控系统的最多应用是在生物分析，领域一般是将磁性微球用作生物 反应的固相载体，将微球表面改性后连接d n a 、蛋白质以及各类探针，或将磁 性微球吸附到细胞上。使细胞呈磁性。以下就其在生物分析上的应用作一分类 介绍。 1 4 1 免疫检测 免疫测定一般采用夹心法原理针对不同的标记物采用不同的检测方式，以 荧光和电化学检测为多。 h e y e s 等“在微通道外放置小型碰铁，在通道内形成l 3m m 的粒子塞，当含 丫浙江人学硕士学位论文 有样品的抗原溶液进入通道时，抗原就会与固定在磁珠表面的抗体结合，随后 采用荧光法进行检测。c h i o 等8 9 利用螺旋型磁铁固定磁珠实现酶的免疫测定，反 应产物用电化学传感器检测。f a n 等9 0 使用金标记抗体，利用电化学发光检测。 a y t u r , 等9 1 在芯片上加工一种金属氧化物半导体传感器，测定了人类的抗登革热 病毒基因。表面功能化的磁性微球通过抗原抗体的结合或核酸序列配对固定到 传感器表面，传感器通过检测固定在其表面的磁珠的量确定目标分析物的浓度。 f u f l a n i 等9 2 在微通道下植入软磁性物质，在外界偏转的磁场作用下磁化，从而在 通道内产生不均匀的磁场，表面固定有抗体的磁性微球引入后在通道内被捕获， 再引入抗原与抗体结合，最后撤去磁场释放捕获的物质进行检测。 1 4 2 蛋白质分析 磁性粒子在芯片蛋白质分析中的应用之一是用于蛋白质的酶解。用包被有 褐藻酸的磁性微球固定胰蛋白酶，在芯片上消化蛋白质，可获得很高的效率9 3 。 b i y a n i 等9 4 制作了一种新颖的r n a 蛋白质微阵列芯片。用直径为3g m 表面包被有 链球菌的顺磁性粒子作为固相载体填充在微阵列芯片的微井内，固定d n a 后再 与相应的m r n a 杂交，利用m r n a 上的遗传密码子吸附相应的蛋白质，最后利用 荧光法进行检测。n c l 等7 7 在通道内形成两个磁性粒子柱，上游的磁珠表面固定 蛋白酶k ，下游的磁珠表面则固定抗体，当样品溶液进入时，正常的蛋白质在上 游的粒子柱处消化，而病变的蛋白质则保留在溶液中，在经过第二个磁性粒子 柱时被捕获，随后引入缓冲溶液通过改变p h 值将其洗脱。s l o v a k o v a 等7 8 利用磁 性微球的自组装技术，在微通道的两侧放置磁铁，与通道呈一定夹角( 3 0 0 ) ，使 磁力线方向和液流方向平行，表面固定胰蛋白酶的磁珠引入后在磁场作用下会 在通道内自组装成柱，引入的人类生长激素就可以在此进行消化。此外，用于 蛋白质检测的磁性粒子也在进一步研究中9 5 。 1 7 y 浙江人学硕十学位论文 1 4 3 细胞分选及操控 利用磁场分离和操控细胞的方法，一般是使磁性微球选择性吸附在细胞表 面，使细胞具有磁性后进行操作，也有某些细胞具有天然的磁性，可直接利用 磁场进行操控，但也需要上述方法增加其磁性。 f u r d u i 等9 6 将表面改性的磁珠泵入微通道后，利用外界磁铁将其固定在主 通道内，血液引入后，t 淋巴细胞吸附到磁珠上，其他物质则随溶液冲走，以此 可实现分离。i n g l i s 等9 7 将微阵列磁条集成在微流控芯片上，磁场方向与流体方 向形成一定的夹角，当流体经过时，白细胞因为表面吸附大量磁性微球被磁场 吸引而偏离流体方向，从而从全血中分离出来。k o s e h w a n e z 等9 8 在p d m s 芯片 上直接沉积铁磁性的镍钴硼合金，微结构呈锥形，在芯片外放置一小型永磁体， 铁磁性物质就会被磁化，利用该装置可捕获单个细胞( 细胞表面吸附直径5 0 i _ t m 的磁珠) 。l e e 等9 9 把集成电路集成到微流控体系，利用磁场操控生物细胞。细 胞固定在磁性微球表面，悬浮在通道内，保持生物适应性。集成电路由一系列 微线圈构成，可快速调整磁场强度和模式，同时控制一个或多个细胞。x i a 等1 0 0 在通道一侧植入软磁性材料，通过外界固定的磁铁快速变化，可有效分离出吸 附在磁性微球表面的活体大肠杆菌。 利用细胞的天然磁性也可以分离细胞。h a n 等1 0 1 使用磁致微分离器，可从稀 释过的全血中在线分离出红细胞和白细胞，在5p l h 的流速下，红细胞的分离效 率达9 3 5 ，白细胞达9 7 4 。l e e 等1 0 2 利用网格状的金导线对单细胞进行操控， 不但成功捕获并定位趋磁性细菌，还使其破膜，最后冲走细胞膜等杂质，得到 磁性微晶。w a n g 等1 0 3 将磁带的磁头改进后用于捕获和分选磁性细菌，取得很好 的效果。 丫浙江人学硕十学何论文 1 4 4d n a 提取、p c r 扩增及检测 芯片上提取d n a 一般先将细胞破膜，释放出的d n a 被吸附在改性的磁珠表 面，利用外界磁场将磁珠固定，细胞膜及其他物质都被溶液冲走，而d n a 吸附 在磁珠表面，最后再将d n a 洗脱进行检测，或进行p c r 扩增后进行检测。目前， d n a 的提取、p c r 和检测操作可集成到一块芯片上完成。 图1 1 2 芯片结构示意图 c h u n g 等7 9 将磁珠固定在通道内，驱动溶液往复流动以达到充分混合，提取 大肠杆菌中d n a 的目的。l i u 等8 0 设计了一种集成化的装置，将全血和磁珠混合 后，目标细菌被选择性吸附到磁珠表面，随后将混合液泵入p c r 室，冲走杂质， 分离后进行p c r 扩增和d n a 检测( 如图1 1 2 ) 。l e g n e d e r 等8 4 将细胞裂解液和磁 珠引入微室内，混合后将杂质冲走，洗脱d n a ，随后进行p c r 扩增，这样就把 固相分离和p c r 扩增集成到了一个微室内，其中，p c r 扩增需要1 3 分钟，提取 1 9 丫浙江大学硕七学位论文 仅需5 分钟。l e e 等8 3 使用8 0 8n i i l 的激光照射使细胞破膜，简化了破膜的操作。 n a k a g a w a 等8 2 使用改性的细菌磁性微球提取全血中的d n a ，p c r 扩增后检测。5 此的全血可以提取1 6 5n gd n a ，洗脱约1 0 0n g ，萃取效率6 0 6 。y e u n g 等引在磁 珠上固定探针，只提取目标d n a 片断，使得d n a 提取可以有选择性地进行。d u b u s 等8 5 利用磁性微球预富集d n a ，再利用荧光聚合体生物传感器和荧光光度计进行 检测，可快速、灵敏地测定d n a 。对于量比较大的样品，直接用表面带荧光标 记d n a 探针的磁性微球捕获目标d n a ，无需扩增和标记，直接进行检测。也可 以将磁珠当作固相载体，直接将双链d n a 固定在磁珠上进行检测。 利用液滴进；f y d n a 提取的方法也有报道。l e h m a n n 等5 5 利用二维磁场控制含 有磁性微球的液滴，液滴在磁场驱动下依次经过固定位点，完成吸附、清洗、 洗脱等步骤，实现d n a 提取操作。 蜘8 一 八、，8 州铷嘲咖 、，嗍n 碉 图1 1 3d n a 杂交示意图 丫浙江人学硕士学位论文 a ，引入包被抗体( 连锁装球菌蛋白) 的磁珠：b ，捕获探针；c ，杂交；d ，在0 0 5 m o l l n a o h 溶液作用卜释放d n a 。 微流控装置内利用磁珠进行快速d n a 杂交也早有报道。w a n g 等1 0 4 使用电化 学标记来进行d n a 的杂交与检测，具体操作如图1 1 2 所示。 f a n 等8 6 将磁珠用目标d n a 标记后泵入具有8 个平行通道的微流控芯片中， 利用外界6 0 0m t 的永磁铁捕获形成不到1m i l l 长的塞子，泵入互补的d n a ，使 之在磁珠表面反应，随后用荧光法进行检测。捕获的d n a 探针加热到8 0 释 放，如此循环，磁珠可重复使用1 2 次。k w a k y a 等9 7 将- d , 型永磁体放在通道 附近，磁珠用探针标记，实验检测了登革热病毒特殊的r n a ，相对于常规传感 器具有相当高的灵敏度。 参考文献 1 方肇伦等，微流控分析芯片，微流控分析芯片，科学出版社 2p s d i t t r i c h ，k t a c h i k a w a , a m a n z ，m i c r ot o t a l a n a l y s i ss y s t e ml a t e s t a d v a n c e m e n t sa n dt r e n d s ，a n a l y t i c a lc h e m i s t r y , 2 0 0 6 3a w m a r t i n e z ，s t p h i l l i p s ，m j b u t t e ，gm w h i t e s i d e s ，p a t t e r n e dp a p e ra ss p l a t f o r mf o ri n e x p e n d i v e ，l o w v o l u m e ，p o r t a b l eb i o a s s a y s ，a n g e w a n d t e ，2 0 0 7 ，4 6 ，1 4d yj u , p b i a n d e v e l o p m e n to ff e r r i t em a g n e t i cm a t e r i a l sw i t hh i g hs t r e n g t hb ya l o w t e m p e r a t u r es i n t e r i n gm e t h o d ，s c i e n c eo fe n g i n e e r i n gc e r a m i c s i i i k e y e n g i n e e r i n gm a t e r i a l s2 0 0 6 ，3 17 318 ：8 9 3 5h i h s i a n g ，r q y a o ，s y n t h e s i so f3 b a o 2 c o o 12 f e 2 0 3p o w d e ru s i n gc h e m i c a l c o p r e c i p i t a t i o n ，j o u r n a lo fm a g n e t i s ma n dm a g n e t i cm a t e r i a l s2 0 0 6 ，3 0 7 ，2 7 3 6n l y , n t a o ，s c a l a b l ed o p e c o d e db i o s e n s i n gp a r t i c l e sf o rp r o t e i nd e t e c t i o n ， a p p l i d ep h y s i c sl e t t e r s ，2 0 0 6 ，8 8 ，0 4 3 9 0 1 7a r s t u d a r t ，e a m s t a d ，l j g a u c k l e r , c o l l o i d a ls t a b i l i z a t i o no fn a n o p a r t i c l e si n c o n c e n t r a t e ds u s p e n s i o n s ，l a n g m u i r2 0 0 7 ，2 3 ，10 81 2 l v 浙江人学硕士学位论文 8b p b i n k s ，a d e s f o r g e s ，s y n e r g i s t i cs t a b i l i z a t i o no fe m u l s i o n sb yam i x t u r eo f s u r f a c e a c t i v en a n o p a r t i c l e sa n ds u r f a c t a n t ，l a n g m u i r2 0 0 7 ，2 3 ，10 9 8 9s h u t z l e r , d w e a i r e ，ee l i a s ，e j a n i a u d ，j u g g l i n gw i t hb u b b l e si nc y l i n d r i c a l f e r r o f l u i df o a m s ，p h i l o s m a g l e t t