（分析化学专业论文）多效唑与烟酰胺的分子印迹研究.pdf

摘要 摘要 分子印迹技术是制备具有分子识别能力聚合物的技术。它在印迹分子存在的 情况下，功能性单体与交联剂共聚制得高交联的聚合物网络，移去印迹分子后就 得到了对印迹分子具有分子记忆效应的分子印迹聚合物。作为一种新型的分离介 质，在分离、环境分析和催化科学等领域中极具发展潜力。全文共分四章。 第一章：介绍了分子印迹技术的原理、方法、应用及展望； 第二章：以烟酰胺为模板分子，采用本体聚合法制备了具有特定识别性能的 分子印迹聚合物，在水相中实现了对模板分子及其结构类似物的分离，比较了烟 酰胺在印迹和空白高聚物上的吸附，利用s c a t c h a r d 分析考察了其结合特性。 第三章：以农药多效哗为模板分子，采用原位聚合法制备了具有特定识别性 能的分子印迹聚合物，并用作高效液相色谱固定相实现了多效唑与其结构类似物 吡虫啉的分离。考察了流动相中有机溶剂含量、醋酸含量和流速对分离的影响， 论证了分子印迹聚合物选择性专一的作用机理。考察了多效唑分子印迹整体柱的 吸附和结合特性，并成功地将其用于痕量样品的富集检测，建立了一种新型的在 线富集方法。 第四章：建立了反相高效液相色谱法对叶酸及其相关物质的分离测定方法。 对叶酸原料药进行了测定，色谱柱为j a s c o c 1 8 柱( 2 5 0 4 6i n t oi d ，5 t _ 1m ) ， 流动相为0 0 5 mk h 2 p 0 4 ：0 ，1 mk o h ：甲醇= 7 8 ：2 ：2 0 ( v ：v ) ，流速为1 0 m l m i n ， 柱温为3 0 。c 。叶酸检出限为1 0 n g ，叶酸的含量为9 8 5 2 9 9 8 7 ；加标回收 率为9 5 2 2 1 0 0 8 3 。该法快速简捷、精密度高、重现性好，可为叶酸的质量 控制提供更为科学的依据。 关键词分子印迹技术；高效液相色谱；原位聚合 a b s t r a c t m o l e c u l a ri m p r i n t i n gt e c h n i q u e ( m i t ) i sap o l y m e r i z i n gt e c h n i q u et op r o d u c em o l e c u l a r r e c o g n i t i o nm a t e r i a l sw i t hh i g hs e l e c t i v i t ya n da f f i n i t y p o l y m e r i z a t i o ni so c c u r r e db e t w e e n f i m c t i o n a lm o n o m e r sa n dc r o s s l i n k e ra r o u n dat e m p l a t e e x t r a t i o no ft h et e m p l a t ef o r m s p o l y m e rw i t hm o l e c u l a rm e m o r yt ot h et e m p l a t e i th a sm a n ya p p l i c a t i o n so nt h ef i e l d so f a n a l y t i c a lc h e m i s t r y , c a t a l y s i sa n do r g a n i cs y n t h e s i s i nt h i sp a p e r , f o u rc h a p t e r s w e r e c o n s i s t e d i nc h a p t e ri ：t h ep r i n c i p l eo fm o l e c u l a ri m p r i n t e dp o l y m e r s ( m i p s ) ，p o l y m e r i z a t i o n m e t h o d s ，a p p l i c a t i o no f t h i st e c h n i q u ea n di t sf u t u r ed e v e l o p m e n t sw e r ei n t r o d u c e d i nc h a p t e ri i ：as y n t h e t i cp o l y m e rs e l e c t o rf o rn i c o t i n a m i d ei sp r e p a r e db ym o l e c u l a r i m p r i n t i n gt e c h n o l o g y c h r o m a t o g r a p h i ca n a l y s i ss h o w e dt h a tt h en i c o t i n a m i d e 。i m p r i n t e d p o l y m e ri sc a p a b l eo fr e c o g n i z i n gt h ef u n c t i o n a ld i f f e r e n c eo ft h et w oa n a l o g u e si na q u e o u s p h a s e f u r t h e r m o r e ，t h ea d s o r p t i o ni s o t h e r m so fn i c o t i n a m i d ew e r ed e t e r m i n e du s i n gs t a t i c m e t h o d t h eb i n d i n gc h a r a c t e r i s t i c so ft h en i c o t i n a m i d eo nt h ei m p r i n t i n gp o l y m e rw e r e e v a l u a t e db ys c a t c h a r da n a l y s i s i nc h a p t e ri i i ：p a c l o b u t r a z o lh a sb e e ne m p l o y e da st e m p l a t ef o rt h ep r e p a r a t i o no f i n s i t um o l e c u l a r l yi m p r i n t e dp o l y m e ra n dt h ec o n t i n u o u sr o dh a sb e e na p p l i e da sl i q u i d c h r o m a t o g r a p h i cs t a t i o n a r yp h a s e sf o rt h es e p a r a t i o no fp a c l o b u t r a z o la n di t sa n a l o g u e s t h e c h a r a c t e r i s t i c so fa d s o r p t i o na n dt h e r m o d y n a m i c so fp a c l o b u t r a z o l - m i pw e r ei n v e s t i g a t e d t h ea d s o r p t i o ni s o t h e r m so f p a c l o b u t r a z o lw e r es t u d i e db ys t a t i cm e t h o d s c h a t c h a r da n a l y s i s i n d i c a t e dt h a tt w oc l a s s e so fb i n d i n gs i t ew e r ep r e s e n ti nt h ei m p r i n t e dp o l y m e r s t h er e s u l t s s h o w e dt h a tt h em i ph a ds i g n i f i c a n tm o l e c u l a rr e c o g n i t i o na b i l i t ya n di th a dh i g ha f f i n i t ya n d s e l e c t i v i t yf o rp a c l o b u t m z o li na q u e o u ss y s t e m ，b yw h i c hm o l e c u l a r l yi m p r i n t e ds o l i dp h a s e e x t r a c t i o n ( m 1 s p e ) w a ss t u d i e df o rt r a c ea n a l y s i so f p a c l o b u t r a z o li nw a t e r i nc h a p t e ri v ：am e t h o df o rt h ed e t e r m i n a t i o no ff o l i ea c i da n dr e l a t e dc o m p o u n d sw i t h 1 1 i g hp e r f o r m a n c el i q u i dc h r o m a t o g r a p h yh a sb e e ne s t a b l i s h e d f o l i ca c i da n d i t sr e l a t e d c o m p o u n d sw e r es u c c e s s f u l l ys e p a r a t e do naj a s c oc 1 8c o l u m n ( 2 5 0 x 46 r a mi d ，5 肛m ) w i t h i nl2m i n u t e sb yu s i n gm e t h a n o l p h o s p h o r i cb u f f e ra sm o b i l ep h a s e t h ed e t e c t i o nl i m i t o ff o l i ca c i dw a s1 0n g t h er e s u l t so ft h ee x p e r i m e n t ss h o w e dt h a tt h i sm e t h o dw a s a c c u r a t e ，r a p i d ，s i m p l ea n dr e p r o d u c i b l e ，a n du s e f u lf o rt h eq u a l i t yc o n t r o lo f f o l i ca c i d k e y w o r d s ：m o l e c u l a r i m p r i m i n gt e c h n o l o g y ；h i g hp e r f o r m a n c e l i q u i d c h r o m a t o g r a p h y ；i n - s i t up o l y m e r i z a t i o n 1 1 河北大学研究生学位论文存档材料 学位论文独创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师指导下进行的研究 工作及取得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方 外，论文中不包含其他人已经发表或撰写的研究成果，也不包含为获得河 北大学或其他教育机构的学位或证书所使用过的材料。与我一同工作的同 志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了致谢。 专业： 导师签 签名：妇避卜 兰堕 学位论文使用授权声明 本人完全了解河北大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有 权保留送交论文的复印件，允许论文被查阅和借阅；学校可以公布论文的 全部或部分内容，可以采用影印、缩印或其他复制手段保存论文。 ( 保密的论文在解密后应遵守此规定) 专业： 导师签 签名：到越盎； 趁i ： 河北大学学位办公室制 舛占月3 - 。日 第1 章综述 第一章综述 1 1 分子印迹技术原理 在自然界的生物进化中，分子识别常常起着决定性的作用，分子结构上的细微差 别可以决定某个生物化学反应是否能够顺利进行，所以分子识别的的重要特征就是选择 性。而化学家们也在致力于研究像受体、酶和抗体一样的高选择性识别系统。印迹聚合 物就是这样种合成的人工受体：它具有形状与底物分子相匹配的空腔，而且有着特定 排列的功能基团可以与底物分子产生识别作用。 分子印迹技术( m o l e c u l a r l yi m p r i n t e dt e c h n o l o g y , m i t ) 起源于免疫学的发展。2 0 世纪4 0 年代著名的诺贝尔奖获得者p a u l i n g 1 1 提出了抗体形成的“模板学说”。该理论认 为，抗原物质进入机体后，蛋白质或多肽链以抗原为模板进行分子自组装和折叠形成抗 体。尽管这学说最终被“克隆选择学说”所取代，却激发了人们以抗原或待测物作为 模板合成抗体模拟物的设想。在分子印迹技术发展初期，主要采用共价结合方式制备分 子印迹聚台物( m o l e c u l a r l yi m p r i n t e dp o l y m e r s ，m i p s ) ，这项技术中可供选择的材料十分 有限，故在9 0 年代以前一直很少被人问津，发展缓慢。9 0 年代以来，m o s b a c h 报道了 非共价分子印迹聚合物的合成和应用”：，极大地拓展和促进了分子印迹技术的研究领域 和应用范围。 分子印迹技术之所以吸引了如此众多的研究与开发兴趣，主要是因为它的三大显著 特点：构效预定性( p r e d e t e r m i n a t i o n ) 、特异识别性( s p e c i f i cr e c o g n i t i o n ) 和广泛实用性 ( p r a c t i c a b i l i t y ) 。并且基于m i p s 具有亲和性和选择性高、抗恶劣环境能力强、稳定性好、 使用寿命长、应用范围广等突出优点。因此，分子印迹技术在许多领域，如色谱分离、 固相萃取、仿生传感、模拟酶催化、临床药物分析、吸附、膜分离等i 。”得到同益广泛的 研究与开发，有望在生物工程、临床医学、天然药物、食品工业、环境检测等行业形成 产业化规模的应用。 1 1 1基本原理 分子印迹技术的基本原理是：( 1 ) 在含有大量交联剂的溶液体系中，印迹分子与功 1 河北大学理学硕士学位论文 能单体之间通过共价键或非共价键形成复合物：( 2 ) 复合物与交联剂的混合溶液经引发 聚合，将复合物固定在高交联的聚合物中，得到含有印迹分子、功能单体和交联剂的聚 合物。；( 3 ) 将印迹分子抽提出来，在聚合物基质上留下对其有“预定”选择性的分子 识别位点。其制各过程如图1 所示。 魃+ 旦 模板分干 单体 蹬+ 模板分子 豳兰磨 图1 分子印迹过程示意图 f i g 1s c h e m a t i c so f m i pp r e p a r a t i o n m i p 上的识别位点，可形象地描述为近似均匀分布的“空穴”。这些“空穴”的三 维网格结构和印迹分子相匹配，并排列着与印迹分子相对应的功能基团。当印迹分子进 入m i p 之后，就会与这些识别位点相互作用，其结构和功能基团均和“空穴”相匹配； 而非印迹分子则因为体积大小和功能基团不匹配而不能有效地进入“空穴”，因而对之 不具有特殊的识别作用。显然，“空穴”中作用位点越多，作用部分性质和类型越广泛， 则m i p 与印迹分子之间的亲合能力和选择性就越高。印迹分子及其结构类似物在m i p 上表现出较强的亲和作用，保留能力强；相反，其他化合物亲和能力和保留能力均较差。 这些特点常被用来进行色谱分离、固相萃取、生化分析等。借助色谱学，光谱学方法， 热力学和量子力学的原理、方法可对m i p 与印迹分子之间的作用力进行定性或定量研 究。 1 1 2 分子印迹技术分类 根据印迹分子与功能单体之间结合方式的不同，分子印迹技术可分为预组织法和自 组装法两种基本方法。 ( 1 ) 预组织法( p r e o r g a n i z a t i o n ) 又称共价法，此方法中，印迹分子和功能单体以 可逆的共价键相互连接，交联聚合，然后再通过化学途径使共价键断裂除去印迹分子， 从而得到分子印迹聚合物。在分子印迹聚合物的应用过程中，以条件的变化使共价键形 第t 章综述 成和断裂，从而实现对模板分子的吸附与解附。其优点是聚合中能获得在空间精确固定 排列的结合基团，且所得复合物稳定性好，在进行分子识别时选择性高。然而，由于共 价键作用一般较强，在印迹分子自组装或识别过程中结合和解离速度馒，难以达到热力 学平衡，币适于快速识别，而且识别能力与生物识别相差甚远，因此，此种方法发展缓 慢。 ( 2 ) 白组装法( s e l f - a s s e m b l i n g ) 又称非共价法。此方法中，印迹分子与功能单体之 间自组织排列，以非共价键作用( 如氢键、静电引力、金属螫合作用、电荷转移、疏水 作用及范德华力等) 自发形成具有多重作用位点的单体模扳分子聚合物。然后抽提出 印迹分子，当印迹分子再扶进入时，就会通过非共价作用与结合位点再结合。该法一定 程度上依赖印迹分子与功能单体是否能通过弱的相互作用形成比较稳定的复合物，其优 点是操作简单，亲和性和选择性较高，类似于抗体；可选择的功能单体更为广泛，可以 使用多种单体同时印迹；合成方法多样，极大地拓宽了m i p s 的应用。 ( 3 ) 混合型w h i t e e o m b 等人”1 综合了共价和非共价分子技术的优点创建了一种新 型的分子印迹技术。模板分子同聚合物单体以共价键作用。洗脱时发生水解反应，失去 个c o ：分子，得到分子印迹聚合物。这种聚合物在以后的分离应用过程中则是以非共 价键的方式同模板分子再结合。近年来p i l e t s k y 等“o3 发展了一种分子预组装和分子自组 装相结合的混合印迹方法。首先以硅酸为模板与乙烯基苯基硼酸发生醑化反应，形成第 一个分子复合物，然后该复合物与另一功能单体丙烯基胺自发形成第_ 二个分子复合物， 加交联剂甲基丙烯酸乙撵酯为共聚形成硅酸m i p ，最后抽提出硅酸。当印迹分子进入 m i p 时，两种单体都能以非共价作用与之结合。 1 2 分子印迹聚合物的制备 1 21 制备过程 分子印迹聚合物的制各通常包括以下几个步骤： ( 1 ) 功能单体的选择根据印迹分子的性质以及单体与印迹分子作用力的大小预 测，合理的设计、合成或选择带有能与印迹分子发生作用的功能基的单体。 印迹分子又称为模板分子，在制各非共价型m i p s 时模板分子的结构和性质没有严 格限制。迄今为止，碳水化合物“”1 、氨基酸及其衍生物“。21 、有机胺“”“、羧酸类。”2 “、 甾类“、核酸”、维生素。”、蛋白质“3 以及金属离子1 等均已制各出m i p s ，通常分子 甾类“、核酸”、维生素”、蛋白质“3 以及金属离子1 等均已制各出m i p s ，通常分子 一一 河北大学理学硕士学位论文 中含有强极性的基团( 如羧基和氨基) 的化合物更易于制备出高性能的m i p s ，因为强极 性基团能够和功能单体形成更为稳定的分子复合体系。 单体的选择主要由印迹分子决定，它首先必须能与印迹分子成键，且在反应中它与 交联剂分子处于合适的位置才能使印迹分子恰好镶嵌于其中。常用的共价单体主要是含 乙烯基的硼酸或二醇以及含硼酸酯的硅烷混合物等。常用非共价键单体主要有羧酸类 ( 甲基丙烯酸，m a a ：三氟甲基丙烯酸，t f m a a ；乙烯基苯甲酸等) 、丙烯酰胺类、 磺酸类、杂环碱类( 乙烯基吡啶、乙烯基咪唑) 。 ( 2 ) 聚合反应 在印迹分子和交联剂存在的条件下，在合适的溶剂中对单体进行聚合。聚合方式有 本体聚合、悬浮聚合、原位聚合、乳液聚合、表面印迹等。分子印逊反应大多是通过自 由基引发制备的，般以偶氮二异丁腈( a i b n ) 或偶氮二异庚腈为引发剂。 影响聚合反应的因素包括浓度、温度、压力、光照、溶剂种类和极性等。 溶剂在分子印迹过程中发挥着重要作用，这种作用在自组织体系中尤为重要。聚合 时溶剂控制非共价键结合的强度，同时也影响聚合物的形态。由于非共价键作用的强 弱主要取决于溶液的极性，故非共价法一般在有机溶剂如甲苯、氯仿中进行，而共价法 一般在极性较强的水、醇等溶液中进行。另外，聚合物的形态学也受溶剂的影响。溶剂 使聚合物溶胀，从而导致结合部位三维结构的变化，引起弱的结合，通常，使别用溶剂 最好与聚合用溶剂相一致，以避免任何溶胀问题。 ( 3 ) 印迹分子的去除 采用萃取等手段将占据在识别位点上的绝大部分印迹分子洗脱下来。通常采用乙 腈、水、甲醇一乙酸( 或三氯乙酸) 、乙腈一乙酸等高极性溶剂反复洗涤分子印迹聚合物 以彻底除去印迹分子。 1 2 2 制备方法 分子印迹聚合物制备方法的研究主要围绕这两个问题展开，是对材料的性能加以 改善( 如提高交换容量、提高材料韧性) ，以适应大规模生产和应用的需要；另一方面 是在水溶液体系中进行分子印迹，以解决对水溶性分子，特别是生物大分子的印迹，从 而扩大分子印迹的应用领域。迄今为止，分子印迹聚合物的制备主要有以下几种方法： ( 1 ) 本体聚合法：将功能单体在溶液中排列在印迹分子周围，交联干燥之后将其研 第1 章综述 磨、破碎、筛分得到一定粒径的分子印迹介质，最后洗脱除去模板分子。此法的优点是 合成阶段受限制少，简便、直接。但本体聚合法在研磨筛选等后期处理阶段操作复杂， 费时费力，且所得无定形颗粒作为色谱固定相时柱效较低。 ( 2 ) 原位聚合法：将合适比例的模板分子、功能单体、交联剂、引发剂和致孔剂充分 作用后，在色谱柱中直接进行聚合。该法简单、直接，且可以获得较好的柱体结构，有 助于降低柱压降。同时由于孔径分布均匀、比表面积相应增大，可用于识别的位点数量 多，有利于提高柱效、改变分子识别中的选择性”1 。 ( 3 ) 扩散聚合：将模板分子、功能单体、交联荆溶于有机溶剂中，然后将溶液移入水 中，搅拌，乳化：最后加入引发剂交联、聚合，可直接制备粒径较均一的球形分子印迹 介质。 ( 4 ) 悬浮聚合：采用全氟化碳液体作为悬浮介质，代替传统的有机溶剂一水悬浮介 质，从而消除了非共价印迹中存在的不稳定的预组织体“。 ( 5 ) 表面印迹：先将模板分子与功能单体在有机溶剂中反应形成加合物，然后将此 加合物与表面活化后的硅胶、聚t r i m 粒子和玻璃介质反应嫁接，这样获得的分子印迹 聚合物解决了传统方法中对模板分子包埋过深或过紧而无法洗脱下来的问题“5 “。 1 2 3m i p s 的表征 分子印迹聚合物的表征目前还没有个统一的理论描述，主要是由于分子印迹聚合 物的应用范围广泛，比较现实的途径是，根据不同的应用领域采用不同的表征方法。如 在色谱固定相、手性分离和固相萃取应用中，一般用分离因子、分离度、保留时间、结 合常数、离解常数、富集常数等来表征；而在化学传感器的应用中，则采用各种电化学 参数_ 以及各种光学参数和质量参数来表征。 对其结构的表征，仍沿用传统的对聚合物的表征方法，如通过吸附试验进行比表面积 的测定、孔容测定、孔径大小及其分布测定、孔形状测定等。对分子印迹聚合物的成分 分析，仍沿用传统的对有机化台物特别是高分子聚合物的分析方法，如元素分析、重量 分析、热分析、核磁共振光谱、红外光谱、荧光探针等。 1 3 吸附等温线和结合位点分布 吸附等温线可以为小分子配体与受体之间的结合能，结合方式，位点分布方面提供 重要的信息“，在m i p s 中，可溶性的溶质与固体吸附位点相互作用，其吸附等温线由 一5 一 河北大学理学硕士学位论文 平衡时被吸附的浓度对自由配体浓度作图得到，吸附等温线可以用不同的模型拟合，最 简单的是理想的l a n g m u i r 吸附等温线模型( e q ( 1 ) ) ，该模型假设吸附剂只有一种吸附 位点，被吸附物质之间的相互作用可以忽略“： 日。c 口2 可i 忑 a c 4 ，c 口3 丽+ 丽 尚- 七a 鲁 f n cj k l 托 f 2 1 f 3 t ( 4 ) + l 式中，a 和r i 为数值常数参量，q 为饱和容量( 吸附位点密度) ，b 为吸附能。 此外b i l a n g m u i r ( e q ( 2 ) ) 吸附等温线模型，假定吸附剂表面是不均一的，且具备两 种结合位点；f r e u n d l i c h 等温线模型( e q ( 3 ) ) 假定没有饱和吸附容量，但具有不同结合能 的结合位点平均分布；s c a t c h a r d ( e q ( 4 ) ) 分析则用于静态平衡吸附测定，可判断有几类 结合位点，并计算平衡离解常数和饱和吸附量。在m i p s 中，根据不同的功能单体，不 同的溶质浓度，可以选择不同的等温线模型拟合”。“。“。由于其特有的机理，分子印迹 聚合物常常能表现出较高的选择性，但由于单体和印迹分子在自组装过程中的不完全， 会产生一些非特异性吸附位点，此外分子印迹固定相在制备过程中所使用的研磨过筛浮 选工艺，使得这种固定相具有较慢的传质速率和较低的柱效，因而在分子印迹聚合物为 固定相的色谱图中，经常会出现峰展宽和不对称峰的情况”。解决以上问题的关键或者 是获得较窄吸附位点的分布，或者是提高吸附位点的可接近性，f j 者需要对聚合物表面 进行修饰，因而操作比较复杂，后者可以通过改善聚合物的形态而实现，为了更好的理 解这一关系，聚合物表面的热力学研究是必要的手段，其中包括吸附等温线的测定。 1 4 分子印迹聚合物的应用和进展 由于分子印迹技术具有构效预定性、特异识别性和广泛实用性，基于该技术制备的 分子印迹聚合物具有亲和性、选择性高、稳定性好和应用范围广等特点。因此，分子印 一6 一 第1 章综述 逊技术在传感器、分离纯化以及催化等诸多领域具有重要的应用前景。 1 4 1 色谱分析和分离 分子印迹聚合物可用来制备色谱分离的固定相，以建立固相萃取、高效液相色谱或 毛细管电泳分析法进行手性物质的分离，也可用于样品的预处理。 m p s 作为手性拆分固定相在药物对映体拆分中已被广泛应用，如糖苷衍生物、氨 基酸衍生物、非甾类抗药等，能实现对映体的完全分离。l i n 等8 ”采用m i p s 毛细管电 泳法分离了d ，l 一苯丙氨酸。k r i z 等1 采用m i p s 的细小颗粒作为薄层色谱的固定相，对 印迹分子及其光学异构体进行分离和测定。 1 4 2 模拟酶催化 化学模拟酶催化剂与天然的生物酶催化剂相比，具有抗恶劣环境的能力，表现出 高度的稳定性和长的使用寿命，而分子印迹技术则是设计新型人工模拟酶材料的最有 效手段之一。 由于分子印迹聚合物能形成如同酶的活性中心的空腔，因而可被用作天然模拟酶催 化剂的替代品。m o r i h a r a 等“”分别以( r ) 和( s ) n - b e n z y l - 一m e t h y l b e n z y l a m i n e 为模板在硅胶表面形成了一个分子印迹的空穴，这种材料对苯甲酸的乙酰基有催化转移 功能。 1 4 3 生物传感器 分子印迹聚合物用作传感器的敏感材料是分子印迹技术的一个重要研究方向。由于 分子印迹聚合物敏感材料与近年来研究较热的生物敏感材料相比，具有耐高温、高压、 酸碱和有机溶剂，不易被生物碱破坏，可多次重复使用，易于保存等优点，而且较生物 材料易得，可以用标准的化学方法合成出来，因此，有望成为取代生物材料的理想替代 品。 自1 9 8 7 年t a b u s h i 首次使用分子印迹聚合物作为敏感材料”“，对维生素k l 、k 2 和 e 进行了测定以来，分子印迹聚合物传感器已引起了人们极大的兴趣。 p i l e t s k y 等。3 3 用m i p s 膜电导传感器检测莠去津( 阿特拉津) ，检测范围0 0 1 0 0 5 m g l ，响应时间3 0 m i n 。k r i z 等”用吗啡印迹的m i p s 成功地研制了竞争型电流传感器，检 测浓度可达1 0 g l 。k r i z 等”还用丹酰一l 一苯丙氨酸m i p s 研制了光纤传感器。 河北大学理学硕士学位论文 1 4 4 膜分离和固相萃取 将分子印迹聚合物用作膜分离的物质有氨基酸及其衍生物、肽、莠灭津、阿特拉津、 茶碱等。由于m i p 可选择性地同混合物中的某一个或某一族结构相似的化合物结合非常 适用于色谱分析前的样品富集，因此，近年来m i p 在固相萃取( s p e ) 的应用 6 6 1 也与日 俱增。1 9 9 0 年，p i l e t s k y 6 7 1 采用原位聚合法首次制备了m i p 膜，实现了对模板分子腺苷 酸( a m p ) 的特异识别和分离。m i p 分离膜的制备为分子印迹技术走向规模化开辟了道 路。这种分离膜不仅具有处理量大、易放大的特点，且对目标分子的特异吸附具有高选 择性、高收率的优点。 m i p s 固定相用作固相萃取，称为m i p s p e 或m i s p e ，自从首次应用于尿样中 p e n t a m i d i n e 的在线富集”，已经应用于多种类型多种形式( 从纯净的生物流体到蛋白沉 淀样品以及溶剂提取样品等) 的化合物，其中包括生物组织“”7 “，烟草”3 1 和发酵的肉汤 i 43 等。 作为一项新技术，多数报道是利用其高选择性，合成选择性的m i p s ，然后优化实 验条件，以获取样品的定量萃取和小体积的洗脱液，因为m i p s 对印迹分子或者其类似 物表现出较高的亲和性，有时需要选择有机洗脱剂以获得目标分子的定量沈脱，但这种 洗脱方式不适合水溶样品或者生物样品。此外由于聚合物的疏水性特征，有时会遇到非 特异性吸附问题，这可以通过减少m i p s 吸附剂的用量和选择合适的淋洗液得到解决。 m i p s 在液相色谱中存在的问题比如印迹分子的泄漏问题在m i p s p e 中也存在，这 可以导致浓度定量时的不确定性，解决的方法之一是选择替代的印迹分子“，这样印迹 分子的遗失可以不影响待分析物的分析分离，第二个方法是对聚合物进行热处理，并辅 以强溶剂洗脱”。 1 4 5 展望 自1 9 7 2 年w u l f f 等人首次报道了人工合成的m i p 以来，短短三十年间，m i t 得到了 蓬勃的发展。目前全世界至少有一百多个学术机构和研究团体在从事分子印迹技术的研 究。从每年关于m i p s 的论文成指数上升这一现象可以看出人们对这一技术表现出越来 越高的兴趣m i p s 更逐渐从一种学院感兴趣的现象逐渐成熟，已经作为一种新技术在 分析领域表现出很大的潜力，这一领域的研究进程将会继续，今后将在如下领域表现出 很好的研究前景：关于m l p s 的基础研究，是能够更好地认识其本质，从而对m i p s 的 一r 一 第1 章综述 合成和利用进行优化，研究分子印迹的形成和位点识别机制；将化学现象应用于该技术， 尤其是非共价印迹中；建立一种系统使能够更好的选择单体，交联剂和聚合条件；此外 还要研究如何消除印迹分子的泄漏，批与批之间的可重现性：发展能够用于水溶性样品， 例如血浆，血清和地下水等的分子印迹聚合物。 河北火学理学硕士学位论文 第二章烟酰胺分子印迹聚合物的制备及其识别特- | 生的研究 2 1 引言 分子印迹聚合以其极高的分子识别能力和稳定性，最近几年引起了人们的广泛关 注。m i p s 有着极其广泛的应用，例如手性拆分旧1 、固相萃取“”、生物传感器“、免 疫分析”并且以其良好的专一性和卓越的分子识别能力可用于高效液相色谱( h p l c ) 、 毛细管电色谱( c e c ) 、薄层色谱( t l c ) 的固定相。第一个分子印迹聚合物是由诺贝 尔奖得主w u l f f 提出的单体和模板分子之间的共价作用的有机网状聚合物。最成功的非 共价印迹系统是基于丙烯酸和甲基丙烯酸类单体和乙二醇甲基丙烯酸酯为交联剂的聚 合物。模板分子多数情况下包含有极性基团如羧酸、羟基、氨基或芳基，因此，常采用 带有与模板分子功能基有分子作用的单体与模板分子反应，从而获得更有效的印迹分子 识别位点。 烟酰胺在自然界广泛存在，它不仅具有营养价值，且可以作为药物，促进体内物质 和能量代谢，对人体正常生长发育有重要作用：( 1 ) 有较强的血管扩张作用，改善体内供 血功能，对脑血栓、冠心病”、高脂血症有一定疗效；( 2 ) 防止皮肤病变和消化道疾病， 如皮肽炎呕吐，腹泻等，配合其他药物用于治疗各种黏膜性发炎和溃疡；( 3 ) 补充因 长期服用异烟肼及其类似物而造成的烟酸烟酰胺缺乏症。如缺乏可影响细胞正常呼吸和 代谢而发生糙皮病”7 1 等。 本文以烟酰胺为模板分子，乙腈为溶剂，以n 一甲基丙烯酸为功能单体，乙二醇二 甲基丙烯酸酯为交联剂，合成了对烟酰胺具有类似于酶或受体结合部位特征的具有特效 选择性吸附的一种新型的分子印迹聚合物。结果表明该聚合物对烟酰胺表现了较高的亲 和力，为其进一步应用奠定了基础。 2 2 实验部分： 2 2 1 仪器和试剂： j a s c o 高效液相色谱仪( 日本) ，p u 1 5 8 7 高压恒流泵，u v 一1 5 7 5 紫外可见检测器， 南京千谱色谱工作站，c s 5 0 1 一s p 超级数频恒温器( 重庆四达实验仪器厂) 。 第2 章烟酰胺分子印迹聚合物的制备及其识别特性的研究 烟酰胺，烟酸( 化学纯，北京芳草医药化工研制公司，结构见图2 ) ，a 一甲基丙烯 酸( m a a ，分析纯，天津市化学试剂一厂) ，乙腈( 分析纯，天津市密欧化学试剂开发 中心) ，乙二醇二甲基丙烯酸酯( e d m a ，n e wj e r s e y ，u s a ) ，偶氮二异丁腈( a i b n ， 化学纯，上海试四赫维化工有限公司) ，甲醇( 分析纯，北京益利精细化学品有限公司) ， 冰乙酸( 分析纯，天津市耀华化学试剂有限责任公司) 一些2 一。h n i c o t i n a m i d e n i c o t i n i ca c i d 图2 烟酰胺及其类似物烟酸的结构示意图 f i g 2c h e m i c a ls t r u c t u r e so f n i c o t i n a r n i d ea n dn i c o t i n i ca c i d 2 2 2 烟酰胺分子印迹聚合物的制备 称取1 0m m o l 烟酰胺溶于1 5m l 乙腈中，加入6 0m m o m a a 于超声波中超声1h ， 以便烟酰胺与m a a 充分作用，然后再加入3 0n m o le d m a 和0 0 6 5g a i b n 超声1 0m i n 后，通n 2 脱氧1 5m i n ，抽真空密封，置于5 5 水浴恒温槽内反应2 4h ，所得到本体聚 合物粉碎并过2 2 0 目筛，用水漂洗除去过细颗粒，再用1 0 乙酸甲醇溶液洗至无模板分 子，最后用甲醇除去乙酸，放入真空干燥箱中干燥，即得烟酰胺模板聚合物( n m i p ) 。 一4 2 + = 6 0 时，各物质之间难以达到有效分离：而当p h 5 0 时，各个色谱峰的保留时间增 一2 7 河北大学理学硕士学位论文 加；综合考虑保留时间和分离效率，选择流动相缓冲液的p h = 5 0 。 在上述色谱条件下，得到叶酸、a 和b 的分离谱图( 见图2 1 ) ，由图2 1 可见，三 种化合物在1 2 m i n 内获得很好的分离。 t 工口i n 图2 l 叶酸、a 和b 的分离谱图 f i g 2 1 c h r o m a t o g r a mo f f o l i ca c i da n d r e l a t e dc o m p o u n d s 4 3 2 方法考察 4 3 2 1 线性关系的考察 将系列浓度的各标准对照品溶液1 0 得结果见表3 。 024b8i 01 21 4 t m i n 图2 2 实际样品测定谱图 f i g 2 2c h r o m a t o g r a m o fr e a ls a m p l e ul 进样，以蜂面积对浓度进行回归分析，所 表3 线性测定结果 t a b l e3 t h er e s u l t so f l i n e a r i t y 4 3 2 2 精密度试验 分别配制0 2m g m l 叶酸，a ，b 标准对照品溶液，重复进样5 次，以测得的峰面 积为指标，其相对标准偏差r s d 分别为0 9 8 ，1 2 2 ，0 7 0 。 - - 2 8 第4 章反相高效液相色谱法测定叶酸及其相关物质 4 3 2 3 加标回收率 取叶酸样品适量，定量加入叶酸对照品，按照上述供试品溶液的配制方法配制溶液， 测定并计算叶酸的回收率；a ，b 测定方法与之类似，结果见表4 。 表4 方法的回收率与相对标准偏差( n = 3 ) t a b l e4r e c o v e r ya n dr e l a t i v es t a n d a r dd e v i a t i o n ( r s d ) o f t h em e t h o d ( n = 3 ) 4 3 3 样品测定 取三批供试样品溶液1 0ul 直接进样，样品测定谱图见图2 2 ，测定结果见表5 。 表5 样品测定结果( n = 5 ) t a b l e5d e t e r m i n a t i o nr e s u l t so fs a m p l e s ( n 2 5 ) 4 4 小结 与药典方法和其他方法相比较，本法操作简便快速，具有分离效率高，分析精度高 定量准确性及重现性好的特点，优于其他方法，更适合叶酸及其相关物质的分离测定， 可为叶酸的质量监控提供更为科学的依据。 河北大学理学硕士论文 参考文献 1 】p a u l i n gl a t h e o r yo f t h es t r u c t u r ea n dp r o c e s so f f o r m a t i o no fa n t i b o d i e s j a m c h e m s o c ，1 9 4 0 ， 6 2 ：2 6 4 3 2 6 5 7 2 】v l a t a k i sg a n d e r s s o nli ，m i l l e rr ，m o s b a c hk d r u ga s s a yu s i n ga n t i b o d ym i m i c sm a d eb ym o l e c u l a r i m p r i n t i n g n a t u r e ，1 9 9 3 ，3 6 1 ：6 4 5 - 6 4 7 3 m o s b a c hk ，h a u p tk s o m en e wd e v e l o p m e n t sa n dc h a l l e n g e si nn o n c o v a l e n tm o l e c u l a ri m p r i n t i n g t e c h n o l o g y j m 0 1 r e e o g n i t ，1 9 9 8 ，1 1 ( 1 6 ) ：6 2 6 8 【4 k e m p em ，m o s b a c hk m o l e c u l a ri m p r i n t i n gu s e df o rc h i r a ls e p a r a t i o n sj c h r o m a t o g r , 1 9 9 5 【5 】s h ihq ，t s a lw b ，g a r r i s o nmd ，f e r r a r is ，r a m e rbd t e m p l a t e - i m p r i n t e dn a n o s t r u c t u r e ds u r f a c e s f o rp r o t e i nr e c o g n i t i o n n a m r e ，1 9 9 9 ，3 9 8 ：5 9 3 5 9 7 f 6 1a n d e r s o nhs ，r a m s t r o m0 c r o w ne t h e r s a sat o o lf o rt h ep r e p a r a t i o no fm o l e c u l a r l yi m p r i n t e d p o l y m e r s j m 0 1 r e c o g n i t , 1 9 9 8 1 1 ( 1 - 6 ) ：1 0 3 - 1 0 6 【7 t a k e u c h it ，h a g i n a k aj s e p e r a t i o na n ds e n s i n gb a s e do nm o l e c u l a r l yr e c o g n i t i o nu s i n gm o l e c u l a r i m p r i n t i n gp o l y m e r j c h r o m a t o g r b ，1 9 9 9 ，7 2 8 ( 1 ) ：1 - 2 0 8 d i c k e r tfl ，h a y d e no i m p r i n t i n gw i t hs e n s o rd e v e l o p m e n to nt h ew a yt os y n t h e t i ca n t i b o d y f r e s e n