（应用化学专业论文）甲壳低聚糖类席夫碱的制备及其抗氧化活性的研究.pdf

摘要 甲壳低聚糖及其衍生物具有抗氧化、抗菌、防癌等方面的生物活性，近年来 一直是人们研究的热点。 本文采用正交实验法详细研究了中性条件下过氧化氢可控降解壳聚糖的反应 规律，并由此成功地制备了不同分子量范围的水溶性甲壳低聚糖。采用端基法测 定了甲壳低聚糖的数均分子量。并利用红外、紫外等仪器分析手段对甲壳低聚糖 的结构进行了表征。 首次用甲壳低聚糖分别与香草醛、邻香草醛、糠醛反应合成了三种新的甲壳 低聚糖席夫碱衍生物。并用红外、紫外仪器等分析手段对它们的结构进行了表 征。在此基础上，将各个衍生物与硫酸铜、硫酸锌反应制备了2 个系列的过渡金 属配合物。运用红外、紫外、原子吸收等仪器手段对它们可能的配位基团、配位 方式进行了分析。 以硝基蓝四唑( n b t ) 、核黄素、蛋氨酸为超氧自由基q 一产出、检测体 对自制的各个产物及其铜、锌配台物进行了清除超氧自由基0 2 一的活性研 实验结果显示，所有制备的产物包括甲壳低聚糖类席夫碱铜、锌配合物在中 性水溶液中具有一定的溶解能力，但不溶于常见的有机溶剂中。 对超氧自由基0 2 一的清除实验表明，这一系列的配体、配合物均具有一定的 超氧自由基晚一清除能力，并且清除能力随着质量浓度的增加而增加。各种铜配 合物可能由于铜元素的变价原因而使其比其他配合物和配体有更好的抗氧化活 性。 关键字：甲壳低聚糖，席夫碱，抗氧化，配合物 系究 a b s t r a c t c h i t 0 0 1 i g o s a c c h a r i d ea n d i t sd e r i v a t i v e sw e r ea l w a y st h ef o c u so f s t u d yd u et ot h e i rm u l t i a c t i v ep r o p e r t i e ss u c ha sa n t i o x i d a n t a c t i v i t y ，a n t i b a c t e r i a la c t i v i t y ，a n t i c a n c e ra c t i v i t y ，e t c t h ep r e s e n tp a p e rs t u d i e dt h ec o n t r o l l a b l ed e p o l y m e r i z a t i o no f c h i t o s a nb yh y d r o g e np e r o x i d eu n d e rn e u t r a lc o n d i t i o nu s i n go r t h o g o n a l t e s ti nd e t a i l ，a n dt h u sp r e p a r e dc h i t o o l i g o s a c c h a r i d es u c c e s s f u l l y t h en u m b e ra v e r a g em o l e c u l a rw e i g h to fc h i t o o l i g o s a c c h a r i d ei st e s t e d b yt e r m i n a lg r o u pm e t h o d ：t h es t r u c t u r eo fc b i t o o l i g o s a c c h a r i d ei sa l s o a f f i r m e db yi r u r v i ss p e c t r o s c o p y f o rt h ef i r s tt i m e ，t h r e ek i n d so fn o v e ls e h i f fb a s ed e r i v a t i y e so f c h i t o o l i g o s a c c h a r i d eh a v eb e e ns y n t h e s i z e db yc h i t o o l i g o s a c c h a r i d e r e a c t e dw i t hv a n i l l i n ，0 一v a n i l l i n ，f u r f u r a lr e s p e c t i v e l y t h e s t r u c t u r e so ft h e ma r ec h a r a c t e r i z e db yi r ，u v v i s s p e c t r o s c o p y f u r t h e r m o r e ，t w ot y p i c a lt r a n s i t i o nm e t a lc o m p l e x e sh a v eb e e np r e p a r e d b yc h i t o o l i g o s a c c h a r i d ea n di t ss c h i f fb a s e d e r i v a t i r e sr e a c t e dw i t h z i n c s u l f a t e c u p r i cs u l f a t er e s p e c ti v e l y t h ec o n f i g u r a t i o n so f t h e m a r ea l s oa n a l y z e db yi r 。u v v i sa n da a s t h es u p e r o x i d ea n i o nr a d i c a ls c a v e n g i n ga c t i v i t yo f c h f t o o l i g o s a c c h a r i d ea n di t s d e r i v a t i v e sa n dt h e i rc o m p l e x e sw i t h c u ( i i ) ，z n ( i i ) w a si n v e s t i g a t e d t h en b t i l l u m i n a t i o nm e t h o dw a s a p p l i e d w h e r em e t h i o n i n ea n dr i b o f l a v i nw e r eu s e da sp r o d u c i n gr e a g e n t a n dn b ta sd e t e c t i n gr e a g e n tf o rs u p e r o x i d ea n i o nr a d i c a l t h ee x p e r i m e n t a lr e s u l t si n d i c a t e dt h a ta l l t h en e wp r o d u c t s i n c l u d i n gc h f t o o l i g o s a c c h a r i d es c h i f fb a s em e t a lc o m p l e x e sa r e a l la b l e t 0d is s o l v ei nn e u t r a lw a t e rs o l u t i o n ( i n s o l u b l ei no r d i n a r yo r g a n i c s o l v e n t s ) t h er e s u l t so fa n t i o x i d a n ta c t i v i t ye x p e r i m e n ts h o w e dt h a t t h e a b i1i t yo fs c a v e n g i n gr a d i c a lo ft h e s es e r i e so fc o m p l e x e si n c r e a s e s w i t hi n c r e a s i n gt h e i rm a s sc o n c e n t r a t i o n t h ec u c o m p l e x e ss h o w e da b e t t e ra b i l i t yo fs c a v e n g i n gr a d i c a lt h a nt h a to fo t h e r sd u et o c h a n g e a b l ev a l e n c eo fc u p r i c i o n k e yw o r d s ：c h i t o o o l i g o s a c c h a r i d e ，s c h i f fb a s e ，a n t i o x i d a n t ，c o m p l e x 3 第一章文献综述 第一章文献综述 1 1 甲壳素，壳聚糖1 1 甲壳素又名甲壳质、几丁质、壳多糖、明角质，英文名称是c h i t i n 。主要 存在于虾、蟹、蛹、昆虫等甲壳动物的外壳，以及菌类、藻类植物的细胞壁 中。地球上每年由生物合成的甲壳素达到数百亿吨，是产量仅次于纤维素的纯 天然高分子化台物。它的单体是n 乙酰2 氨基2 一脱氧一d 一葡萄糖，单体之 间以b 1 , 4 糖甙键连接。 分子结构如图1 1 ： 图1 1 甲壳素的分子结构示意图 甲壳素为白色的固体，比重为o - 3 ，常温下能稳定的存在。由于甲壳素分 子间存在着强烈的氢键作用( 主要表现为一o h o 一型及一o h n h 型氢键) 使甲壳素具有高度的结晶结构，从而导致其既不溶于水及绝大多数 的有机溶剂，也不溶于一般的稀酸、稀碱中，只溶于部分浓酸及一些特定的介 质中。 壳聚糖又名甲壳胺或者脱乙酰甲壳素，英文名称是c h i t o s a n 。是甲壳素经 脱乙酰化反应制得的产物，也是甲壳素最重要、最基本的衍生物。其分子结构 如图1 2 ： f o h io hlj o h 沁h ：i ；一0i j n h ：纠0 。n h r ：；爿0 o h n h 2 lo h n h 2 n o h n h 2 图1 2 壳聚糖的分子结构示意图 壳聚糖为白色带珍珠光泽的片状或粉末状固体，由于其分子上具有活性的 氨基基团，所以壳聚糖的溶解性相比甲壳素有所改善，可以溶于稀酸之中，但 仍不溶于永及大多数的有机溶剂。 1 1 1甲壳素壳聚糖的历史回顾 对甲壳素成分提取的研究可以追溯到1 8 1 1 年，法国人h b r a c o r m o t 首次从 蘑菇中分离得到这种物质并将其命名为f u n g i n e ；1 8 2 3 年，法国人a d d i e r 第一章文献综述 发现在昆虫的外壳中也大量含有此类物质，并考虑其来源把它用希腊语改名为 c h i t i n ；后来，法国人c r e u g e t 用浓氢氧化钠处理甲壳质，使其脱乙酰化， 得到能溶于稀有机酸的物质；1 8 9 4 年德国人f h o p p e s e i l e r 将这种脱乙酰化 的物质命名为壳聚糖( c h i t o s a n ) 。尽管甲壳素的研究历史有百年之久，但由 于甲壳素本身的难溶性，很大程度上限制了它的研究与利用。真正甲壳素研究 时代的到来是本世纪8 0 年代以后，1 9 7 7 年在美国召开了第一届国际甲壳质壳 聚糖学术研讨会。1 9 8 2 年在日本召开了第二届国际甲壳质壳聚糖会议。此后 平均每两年就召开一次国际专题学术会议，至今已召开了六届国际学术会议。 亚洲也于1 9 9 4 和1 9 9 6 年召开了两届甲壳质& 壳聚糖学术会议。 我国海岸线长，甲壳素资源丰富。为了更好地利用这些宝贵的资源，我国 很早就开展了这方面的研究。早在1 9 5 8 年，我国就出版了包光迪编写的甲壳 质的利用一书，并从那时起开始生产壳聚糖并用于印染业。但由于历史原因 而进展缓慢。自上世纪9 0 年代以来，甲壳素的研究走上了一条飞速发展的道 路，众多科研院所投入了大量的人力物力进行研究，开发应用领域亦逐步拓 宽，发表了许多文章，出版了一定数量的专著。并于1 9 9 6 1 l ，1 9 9 9 6 ， 2 0 0 i 1 1 分别在大连，武汉大学，浙江玉环连续召开了三届以甲壳素壳聚糖 为专题的化学与应用研讨会。这一切都大大的加速了我国甲壳素研究的进程， 并有相当数量的研究成果转化成为产品，成功的应用于医药、环境、食品、化 妆品、化纤、印染、造纸等工业领域。 1 1 2 甲壳素壳聚糖及其衍生物的制备 1 1 2 1 甲壳素，壳聚糖的制各 目前，甲壳素主要是从虾、蟹壳中提取得到21 。分析研究表明，虾、 蟹壳的主要成分是钙质、蛋白质、甲壳素及少量色素。所以简单的甲壳素制备 工艺也就由以下几步组成：1 脱除碳酸钙2 脱除蛋白质3 脱除色素。下面以蟹 壳为原料的简单工艺流程如图1 3 ： 蟹扣选 牡垡蛆脱钙蝗塑蚪脱蛋占塑漂白脱色 - 烘干一包装一成品 图1 _ 3 甲壳素制各的工艺流程图 而壳聚糖的制备则是在制得甲壳素的基础上再脱除2 一n 上的乙酰基。虽 然脱除乙酰基的反应既可以在强酸环境中又可以在强碱环境中进行。但由于强 酸极易导致甲壳素壳聚糖的1 , 4 糖甙键断裂从而使分子量大幅度下降，所 以反应介质一般采用强碱条件。 常规的脱乙酰基反应是将l 份质量的甲壳素加入2 0 份质量的5 0 氢氧化钠 第一章文献综述 溶液中，在1 1 0 下均匀搅拌2 小时，产物脱乙酰度为8 5 。为了减少碱的用 量，可用1 份质量的甲壳素，1 0 份质量的5 0 氢氧化钠溶液或更多的回收碱液 在1 1 0 下反应1 小时，然后放掉碱液，再加入1 0 分质量的5 0 的氢氧化钠在 l l o 下反应1 小时，过滤、水洗，得到的产物脱乙酰度可达7 5 一9 0 。 文献31 采用最优设计法系统地研究了n a o h 质量分数、碱处理时间及 碱处理温度这三个主要因素对壳聚糖制备的影响：当碱液质量分数增加时，壳 聚糖的脱乙酰度增加，但其增加速度却在减小，当碱液质量分数达到4 0 时脱乙酰度出现峰值，约为9 0 ，而后增加碱液质量分数时，脱乙酰度反而 下降；随着反应温度的升高，其脱乙酰度几乎线性递增，当温度达到200 附近时，曲线趋于平直并且脱乙酰度达到最大；随着反应时间的增加，脱乙酰 度开始呈线性增加，当反应时间超过50 m i n 后，脱乙酰度有下降趋势。 为了制备更高脱乙酰度的产品需采用分步多次脱乙酰化工艺41 。甲壳 素在4 7 的氢氧化钠溶液中1 1 0 下处理1 小时，然后8 0 下水洗至中性，将 水洗后产物再用新鲜碱液1 1 0 下处理1 小时，过滤、水洗。如此重复多次， 可得到高脱乙酰度的壳聚糖。经实验证明分步处理l h 、2 h 、3 h 、4 h 的壳聚糖产 品脱乙酰度为7 8 、9 1 、9 6 、9 9 。而且难能可贵的是制得的壳聚糖的分 子量保持在5 0 万以上。 为了减少操作，有些研究者使用溶解沉淀工艺1 即使用含有氢氧化 钠的9 5 乙醇溶液代替氢氧化钠水溶液。三个反应物的质量比为：壳聚糖：氢 氧化钠：乙醇= 1 ：3 ：1 6 。回流反应3 小时( 8 0 ) ，可制得脱乙酰度为 9 5 的产物，而且产物色泽好易粉碎分子量高。此外通过强化物理、机械措施 也可以促进脱乙酰化反应例如文献6 采用微波处理既缩短反应时间又减 少了碱的用量。为了更好地避免大分子键的断裂还可以采用加入i n a b o 。或者 通入惰性气体的办法。用特殊的方法还可以制得脱乙酰度为1 0 0 的壳聚糖 【7 】 0 1 1 2 2 甲壳素，壳聚糖的主要化学反应 甲壳素由于存在乙酰氨基的，分子间的氢键作用很强，所以在溶剂中溶解 及进行反应较为困难。而壳聚糖则由于活泼的游离氨基和羟基的存在，其反应 性比甲壳素高，现就常见反应类型分述如下： 羧甲基化反应8 , 9 , 1 0 , 1 1 , 1 2 , 1 3 1 4 1 是指用氯代乙酸或乙醛酸，在甲壳素或壳 聚糖上的羟基或c 一2 氨基上引入羧甲基基团。由于产物中含有亲水性的羧基， 所以此类衍生物均为水溶性的。由于还有相当数量的氨基存在，最后得到可溶 于水的两性聚电解质物质。此类物质对牛血清白蛋白具有很强的吸附能力，同 时还可以用来制取人造血红细胞。 酰化反应通过与脂肪族或芳香族的酰氧或酸酐反应，在甲壳素或者壳聚 第一章文献综述 糖基体上导入脂肪族或者芳香族酰基。所得产物在有机溶剂中的溶解度可大大 改善。酰化反应可在c 6 羟基进行，也可在c 2 氨基上进行。如想控制反应只 在羟基上进行，可采用文献”硒方法实现。而文献71 报道的方法则完 全是n 一乙酰化制各方法。酰化衍生物的溶解性般大大增加，在多个领域中都 有广泛应用1 8 , 1 9 1 。 环氧化合物的反应2 0 0 ，2 2 1 甲壳素与壳聚糖的碱性溶液与环氧乙烷或 2 一氯乙酸反应可得到羟乙基化的衍生物，此反应也称为醚化反应，得到的羟乙 基衍生物可溶于水。选择合适的环氧化合物，如缩水甘油可与壳聚糖反应生成 水溶性良好的产物。 硫酸酯化和氧化2 31 是指用含氧无机酸作酯化剂与甲壳素或壳聚糖反应 得到酯类衍生物。无机酸一般选择硫酸，经硫酸酯化后可引入n h s 0 3 、 c o o h 、c h 2 c o o h 、c h 2 0 s 0 3 h 等基团，由于产物具有与肝素相似的骨架， 故而与肝素一样显示出抗凝血活性。产物一般在非均相的条件下进行。 甲壳素壳聚糖的氧化同样也是引入新官能团的重要方法，最典型的是壳 聚糖的选择性氧化。壳聚糖首先与高氯酸反应成盐，保护氨基，用三氧化铬进 行氧化，可使c 6 上的羟基氧化成羧基。再与硫酸酯化反应结合，可得到与肝 素结构更加接近的产物t “，。 按枝共聚与胶联2 5 _ 2 6 1 壳聚糖的接枝共聚反应是指壳聚糖与丙烯腈、 甲基丙烯酸甲酯( m m a ) ，丙烯酸乙酯( e a ) 、丙烯酸甲酯等物质在引发剂引 发下发生的共聚反应。经过这种处理，可得到含有多糖的半合成聚合物，从而 使这些天然聚合物与合成聚合纫的某些性质相结合以满足特殊的需要。例如， 苯乙烯用6 0 c o 照射，室温下与甲壳素壳聚糖反应生成接枝共聚物。 甲壳素壳聚糖还可与双官能团的醛或者酸酐发生交联( c r o s s l i n k e d ) 反应，这样制得的胶联产物溶胀、溶解性变差，性质非常稳定，可作为吸附柱 的填充剂。胶联主要是在分子间发生醛基与多糖的羟基发生反应。常用的陵 联剂是戊二醛和乙二醛2 7 ”1 。 席夫碱反应壳聚糖分子中活泼的氨基与羰基化合物反应，得到的亚胺双 键多糖。 降解反应壳聚糖的分子量一般为数十万到数百万，经过降解反应可使壳 聚耱b 一( 】，4 ) 糖甙键发生断裂而得到分子量较低、可溶于水的产物。降 解反应可以在酸性介质，如盐酸、磷酸、三氯乙酸、甲酸等介质中进行，也可 以在碱性介质中进行，如氢氧化钠。但碱性介质中反应速度慢，产率低。实用 的壳聚话的降解方法有很多，目前国内外学者提出的降解方法大体分为化学降 解、物理降解和生物降解三大类。 其他反应e l 壳素壳聚糖还可以发生季铵化2 91 ，烷基化o1 、卤 第一章文献综述 化3 、氰乙基化3 21 等反应生成具有相应结构性能的衍生物。 1 1 3甲壳素，壳聚糖及其衍生物的应用 1 1 3 1 在食品工业中的应用1 ，琊4 ，3 5 3 6 1 甲壳质壳聚糖本身是一种很好的功能性保健食品，它具有免疫强化、抑 制老化、预防疾病、促进病后康复、调节人体生理机能的多种生理功能；除此 之外由于壳聚糖是带有氨基的聚阳离子电解质，在溶液中对有机悬浮颗粒有 明显的絮凝效果，可用作酒类及饮料的除浊剂：由于壳聚糖及其衍生物对细 菌、霉菌、酵母菌均有较强的抑制作用，可用于食品、水果及其他农产品的防 腐保鲜；经过一定的加工，还可以用作食品包装膜和固定化酶的载体。 1 1 3 2 在医药方面的应用 由于甲壳质壳聚糖具有与人体良好的生物相溶性和生物可降解性，并且 降解产物可被人体吸收，在体内不蓄积，故在医药领域有着广泛的应用 ”。例如，制造医用纤维和膜材料用于手术缝合线81 壳聚糖涂层纱布 9 1 止血海绵，进而用于制造人造皮肤：作为药物的载体可以稳定药物中的 成分4 01 ，促进药物吸收4 ，延缓控制药物的溶解速度4 2 4 31 ，帮助 药物到达靶器官4 41 ，本身可以单独抗酸，减轻了药物对胃肠及消化道的刺 激。 壳聚糖能有效地增加巨噬细胞的吞噬功能和增加水解酶的活性，通过增强 机体非持异性免疫系统的功能而抑制肿瘤的生长。巨噬细胞激活后，除了本身 吞噬杀灭肿瘤细胞功能增强外，又能分泌多种免疫因子调节其他细胞免疫与体 液免疫4 61 。除此之外壳聚糖还对大肠杆菌有一定的抑制作用 l4 74 8l o 也有实验证明壳聚糖能有效降低血清胆固醇4 91 。 此外，壳聚糖还对多种中药材具有絮凝作用，可以用于中药的初步纯化分 离，既有效地保留药液中的有效成分，又保证了制剂的稳定性，还可虬作为絮 凝澄清利用于中药提取液的精制。 1 1 3 3 在化妆品工业中的应用”1 利用壳聚糖的保湿性、润湿性、以及对皮肤的无刺激性而制造的系列护胺 用品与某些化学合成护肤品相比无毒、无害。壳聚糖作为发型固定剂不但可以 在头发表面形成硬度适中的薄膜，而且可以长久的定型。利用壳聚糖可以中和 口腔链球菌所产生的有机酸，提高口腔的p h 值，作为疗效牙膏、漱口水、爽 口液，口香糖等的添加剂，达到预防龋齿和牙周溃坏，除去或减轻口臭的目 的。 第一章文献综述 1 1 3 4 在农业上的应用”1 甲壳素壳聚糖及其衍生物在农业上的潜力及优越性越来越被人们所认 知。例如，作为种子的包衣可以达到农作物早期防病、防虫和促进生长作用 跎1 ；作为各种禽畜的饲料添加剂5 31 ，可以使禽畜明显增重。作为猪饲 料的添加剂还可以提高瘦肉产出率；作为农业大棚或者覆盖地膜，由于其很好 的可降解性克服了其他化学地膜板结土壤，不利作物生长的缺点，并且避免 了白色污染。 1 1 3 5 环境化学中的应用 壳聚糖游离的氨基在酸性条件下可以结合氢离子而变成阳离子聚电解质。 在印染工业中产生含有大量阴离子性染料的废液，由于离子间的相互作用，壳 聚糖对阴离子染料有很大的亲和力，从而可用作染料废水的脱色剂。此外，游 离的氨基上本身具有孤对电子，可以投入到重金属离子的空轨道中，以配位键 形式与重金属离子形成稳定的螯和聚合物，用于污水处理，清除对人体有害的 重金属离子。壳聚糖的各类衍生物对金属离子的选择性吸收是现在研究的一个 热点，国内外的各类文献较多5 4 , 5 5 , 5 6 5 7 1 。此外，还可用作高分子絮凝剂，回 收利用食品加工过程中的蛋白质等物质。 1 2 水溶性壳聚糖的制各 由于前面提到的原因，一般情况下，甲壳素和壳聚糖都是难溶于水的，这 就大大限制了它的推广和应用。所以，改善壳聚糖的溶解性能，对壳聚糖进行 化学深加工，特别是制各水溶性的壳聚糖或其衍生物是壳聚糖改性研究中最引 人注目的方向之一。 水溶性壳聚糖的制各反应大致分为三种类型： 1 通过控制甲壳素脱乙酰化反应的条件和脱乙酰度的方法，得到分子量较 高的水溶性壳聚糖。 2 通过使用含有亲水基团的物质对壳聚糖进行化学修饰得到可溶于水的壳 聚糖衍生物。 3 在适当的条件下降解壳聚糖使它的b 一( 1 ，4 ) 糖甙键发生断裂而获 得分子量较低的水溶性产物。 1 2 1 控制脱乙酰化反应”1 甲壳素在均相条件下进行脱乙酰化反应，控制反应条件可得到不同脱乙酰 度的水溶性产物。此前研究成果表明，脱乙酰度高于6 0 或者低于4 0 的产物 不溶于水，在非均相条件下脱乙酰化反应所得产物也不溶于水，只有在均相条 件下脱乙酰度为5 0 左右的产物具水溶眭。同时还发现具有较高脱乙酰度的壳 聚糖在适当的条件下进行乙酰化，保持乙酰化后的乙酰度在5 0 左右也可以得 到水溶| 生产物。究其原因可能是因为脱乙酰度为5 0 左右的水溶性壳聚糖分子 第一章文献综述 链中乙酰氨基和氨基呈现无规律的分布( 但具体的反应机理目前仍无公论) 。 1 2 2 氨基，羟基上的化学反应8 ，1 m 加扎2 2 1 利用氨基和羟基的反应活性在壳聚糖母体上引入各种不同的亲水基团可以 得到水溶性壳聚糖。控制反应条件可以使氨基和羟基同时发生反应，或是选择 其中一种官能团参加反应，不同反应路线可以得到水溶性不同的壳聚糖衍生 物。由于可选择的反应路线很多，所以此类制备水溶性壳聚糖的方法较为多样 且灵活，具体方法可以参考前面关于壳聚糖的化学反应类型，选取合适的方 法。 1 2 3 降解壳聚糖 大量文献报道，当壳聚糖的分子量降解到一定程度以后可以很好地溶于 水。在这里我们把可以溶于水的低分子量的壳聚糖叫做甲壳低聚糖，英文名为 c h i t o o l i g o s a c c h a r i d e 。它是壳聚糖降解后的一类低聚糖，分子量相对较小，晶体 结构发生变化，水溶性大大改善。分子量小于1 0 0 0 0 的甲壳低聚糖具有许多优 于壳聚糖大分子的功能性质。为此。以下我们就针对降低分子量以达到水溶性 目的的制各方法加以综述。 1 2 3 1 酶解法 酶降解法是用专一性酶或非专性酶对壳聚糖进行生物降解而得到分子量 较低的甲壳低聚糖和单糖。 1 壳聚糖酶( e h i t o s a n a s e ) 5 9 , 6 0 , 6 1 1 壳聚糖酶是壳聚糖的专一性水解酶，自然界中的壳聚糖绝大部分是由壳聚 糖酶催化水解成小分子的。壳聚糖酶主要存在于真菌细胞中。壳聚糖酶咀内切 作用方式将壳聚糖分解为聚合度为2 8 的低聚物。但是具体的切断方式不一 样。文献“91 报道b a c i l l u s p u m i l u s b n 2 6 2 和s t r e p t o m y c e s s p n 1 7 4 产生的壳聚 糖酶降解后得到的寡糖还原端含有g l c n a c 或者g l c n 基团和非还原端含有 g l c n 基团，表明这些壳聚糖酶切断壳聚糖的g t c n a c g 1 c n 和g l c n g l c n 糖甙 键：b a c i l l l l u ss p n o 7 一i v l h 产生的壳聚糖酶降解部分乙酰化的壳聚糖后，寡糖的 还原端和非还原端都含有g l c n 基团，说明此种壳聚糖酶只可以特异性的切断 壳聚糖的g l c n g l c n 糖甙键。壳聚糖酶是酶降解法中降解壳聚糖的最理想 酶种，其优越性在制备聚合度比较小的低聚物时更为明显。 2 溶菌酶瑚1 ( 1 y s o z y m e ) 溶菌酶存在于鸡蛋蛋白、人的眼泪及唾液中。溶菌酶能催化一系列的反应 裂解b ( 1 ，4 ) 糖甙糖：对于不周来源的酶，其催化反应的重点不同。实 验表明，溶菌酶在一定条件下可有效地降解壳聚糖，并且初始速度相当快。若 对壳聚糖的乙酸溶液进行预期处理后，溶菌酶在3 7 温度下进行6 天左右的降 解，经分离可得到较高收率的2 至4 糖产物。注意溶菌酶的作用机理是断裂连 第一章文献综述 接d 一乙酰氨基葡萄糖和氨基葡萄糖的1 3 1 ，4 糖甙键。 3 脂肪酶( 1 i p a s e ) 脂肪酶是作用于水有机界面上不溶性物的脂酶，该酶对壳聚糖有一定的 降解作用，并己引起许多研究者的兴趣。夏文水“1 等人用麦胚脂肪酶对壳 聚糖及其衍生物进行降解研究发现，在微酸性条件下，这种酶能快速降解壳聚 糖，使甲壳低聚糖的平均分子量降低。p a n t a l e o n e ”1 等人用脂肪酶 ( l i p a s e a i e ) 降解壳聚糖研究发现，在一定的蛋白质与壳聚糖的比率下，壳 聚糖降解的达到1 0 0 。这说明脂肪酶对壳聚糖的降解效率很高，有待于产业 化的研究。 4 其他非专一性水解酶 除上述脂肪酶外，还有3 0 多种酶能够对壳聚糖进行降解。包括糖酶 6 、果胶酶6 61 、蛋白酶盯1 、木瓜蛋白酶6 81 等主要来源于微 生物、植物。它们在水解过程中有以下共同特点：在水解初期，壳聚糖溶液粘 度快速下降，说明酶主要以内切方式作用；反应不遵循m i c h a e l i s m e n t e n 动力学 方程；最终产品分子量在1 0 k d a 左右；从电泳结果来看，分子量分布较宽；各 种酶的最优化温度和p h 值各不相同，降解最合适的p h 值约为3 5 ，降解温 度一般为3 0 6 0 。 1 2 3 2 糖基转移法6 9 1 糖基转移反应又称为酶法合成，是一种利用低聚合度寡糖在参与反应的作 用下，延长糖链成为高聚合度的多糖。具有糖基转移能力合成甲壳低聚糖的主 要是溶菌酶。例如若用1 0 的二糖为底物，在含有醋酸胺的缓冲溶液中加入 1 的溶菌酶，在7 0 时进行反应，经分离后可以得到较高浓度的六、七糖。 利用这种方法合成低聚糖，可以调节聚合度，还可以通过改变底物合成一些特 殊结构的甲壳低聚糖衍生物。 1 2 3 3物理降解 1 超声波降解 7 0 , 7 1 l 超声波对壳聚糖的降解作用是十分明显的。选用适当频率和功率的超声波 降解壳聚糖，能有效地使大分子链断裂。有研究表明，延长超声波的作用时间 可以使降解产物的分子量分布明显变窄，从而得到较为均一的低分子量壳聚 糖；同时降解过程中氨基的含量不变。与化学降解相比，超声波降解的酸用量 明显减少，后处理过程大为简化，对环境的污染大大降低。但是这种方法的缺 点是收率太低，生产成本过高，实现工业化还有待于进一步的研究。 2 光降解1 7 2 1 用紫外线、可见光和红外线对壳聚糖进行照射也可以引起壳聚糖的降解反 应，俗称光降解。当辐照光的波长小于3 6 0 n m 时降解反应尤为明显。此前研究 第一章文献综述 表明，光降解过程中壳聚糖分子链上的乙酰胺基葡萄糖单元发生了脱乙酰化反 应，导致自由氨基数量增加，同时b 一( 1 ，4 ) 糖甙键断裂，但降解过程中 会生成羰基。 3 丫射线照射下的辐射降解”“ 壳聚糖在y 射线的照射下可发生降解反应。天津大学采用c 0 6 0 辐射源以 不同的辐射剂量分别在大气环境和真空环境下对相对分子量为2 7 4 万的壳聚糖 进行照射，得到了一系列低分子量壳聚糖。辐射降解产品的分子量与辐射剂量 的关系如图1 4 ： 口啪l 鞠瑚 雌蠢 图1 4 辐射降解产品的分子量与辐射剂量的关系图 从图1 4 中可以看出，y 射线的照射可显著降低壳聚糖的分子量。开始降 解速度很快，随着辐射剂量的增加，降解速度逐渐下降，当辐射剂量达到 1 0 0 k g y 以上，相对分子质量下降到5 万以下后降解速度变得十分缓慢。真空 环境下的负压破坏了壳聚糖的网络结构，有助于降解反应。辐射降解过程中没 有产生羰基，也没有使壳聚糖发生交联反应形成支链或网状结构。辐射降解是 无须添加剂的固相反应，成本较低，反应容易控制，无污染，产品品质高，降 解后的甲壳低聚糖的生物相容性不受影响，具有广阔的发展前景。 1 2 3 4 化学降解法 1 酸降解法 因为糖甙键对酸不稳定，可咀利用酸使壳聚糖发生水解以制备甲壳低聚糖 和单糖。水解时主要是主链上b 一( 1 ，4 ) 糖甙键断裂，主链的水解即使在 稀的弱酸溶液中也能缓慢进行。但要进行产品制各则需要提高酸的强度及浓度 或者采用加热的办法来加快反应进行。目前已有多种以酸为主要试剂的降解方 法。 酸降解法 酸降解法是研究较早的壳聚糖降解方法，早在5 0 年代就有研究报道。这也 是至今制各单糖最直接并且技应用最广泛的方法。除了经典的盐酸降解法 o-叠囊彘誊霉 第一章文献综述 “1 已用于工业生产外，最近几年还有多种其他的酸降解法见诸报道。如醋 酸法 1 ，过醋酸法7 61 。虽然这几种方法简单易行，但由于产品的分子 量分布宽，产物分离提纯困难，生产成本高，污染严重，而逐渐被其他方法所 取代。 亚硝酸法 将壳聚糖溶解于质量分数为1 0 的乙酸( 盐酸) 溶液中，在搅拌下缓缓滴 入定量的亚硝酸钠溶液，于4 下静置一段时间，使一n h 2 发生重氮化反 应，脱去一分子n 2 引起分子内的重排使大分子链断裂，再用硼氢化钠还原端 基，完成降解反应”“。运也是一种传统的化学降解方法，降解产物的分子 量可以通过改变亚硝酸钠的反应加入量和反应的时间来控制，国内常用此法降 解壳聚糖并提取产物中的单糖组分。该法的主要缺陷在于：( 1 ) 产品的分子 量分布太宽，均一性差：( 2 ) 降解过程中消耗了大量的活性氨基基团，理论 上来说每加入摩尔的亚硝酸钠就要消耗掉一摩尔的氨基这是很不可取的， 因为我们所需要的各类生物相容性主要是由氨基提供的，同时分子链上存在足 够数量的氮基也是壳聚糖进一步改性的重要前提。这种方法降解的产物势必使 壳聚耱的应用范围受到限制。( 3 ) 生产的三废污染严重。 2 氧化降解法 氧化降解法是目前研究得最多的一种降解壳聚糖的方法而且是一种普适 反j 立，很多的氧化剂都可以将其氧化降解。主要方法如下： n a b 0 3 法7 6 7 8 7 这种方法是将壳聚糖与n a b 0 3 水溶液进行非均相降解 反应，反应的最终产物色泽纯白或者微黄，水溶性良好。这种方法的最大优势 就在于降解反应仅通过断裂壳聚糖的p 一( 1 ，4 ) 糖甙键，反应前后壳聚糖 的自由氮基含量不发生任何的变化。 c 1 0 ：法7 6 瑚1c 1 0 2 具有强氧化性，是一种优良的氧化剂。将o 0 5 的c l 0 2 溶液加到壳聚糖的醋酸溶液中，在6 0 下进行降解反应即可以得到无 色的低聚糖产品。 过氧化氢氧化法。过氧化氢是一种氧化能力很强的氧化剂，选用 它对壳聚糖进行氧化降解无毒，无副产品。并且在酸碱和中性条件下进行都可 得到低分子量的壳聚糖。相对其他氧化剂而言，它在反应过程中引入的无机盐 相对减少，大大降低了分离提纯的难度。 作为反应物的过氧化氢的用量无疑直接影响壳聚糖的氧化降解速度和产 率。一般来说，随着过氧化氢用量的增加，所得的甲壳低聚糖的分子量逐渐降 低。这说明选择适当过氧化氢的用量，是控制降解得到特定分子量壳聚糖的关 键。 由于壳聚糖本身的溶解| 生质，反应介质的选择对降解的结果影响很大。在 第一章文献综述 酸溶液中，壳聚糖分子溶解，分子间与分子内的氢键断裂，分子伸展，整个分 子上的基团对过氧化氢来说都是可及的，降解为均相反应，因而起始反应速度 较在非均相中为快。但也不是说酸度越强就越好，因为在强酸的体系中，壳聚 糖上的大部分氨基与h + 结合生成r - n h 3 + ，形成缺电子的体系，而过氧化氢的 氧化降解多发生在那些氨基未结合h + 的糖单元的b ( 1 ，4 ) 糖甙键上， 可以看出降解到一定程度后，分子变小，自由氨基的数量大大减小，导致后来 降解困难。故而选取一定浓度的弱酸，使壳聚糖既可以溶解又不大量形成 r - n h 3 + ，降解速度快，所得降解产物分子量低。就分子量的分布而言，一般说 来均相条件下所得水不溶性的产物的分子量分布较非均相降解反应所得产物 的分子量分布要窄。但有文献引1 报道，反应在醋酸的均相条件下降解到一 定程度后，体系中会出现黄色的颗粒状沉淀。此颗粒并不溶于水和酸，估计是 反应过程中形成了网状大分子，从而导致沉淀析出，所以选择介质条件时应加 以考虑。 另外一个重要的影响因素就是温度的影响。整体来说壳聚糖的过氧化氢氧 化降解是一个吸热反应。升高温度有利于降解，但是随着温度的升高产物的颜 色也逐渐加深。在温度高于7 5 后，长时间反应产物会出现褐色沉淀。这些可 能归结为氧化过度，不但氧化了6 ( 1 ，4 ) 糖甙键，而且断裂了糖环。 在过氧化氢氧化降解的方法中，壳聚糖的脱乙酰越高，完全降解为水溶性 产物的时间就越短。这可能归结为过氧化氢作用点只是近靠连有自由氨基的糖 环的0 一( 1 ，4 ) 糖甙键。 综述以上的几个主要影晌因素可以看出，各个因素对降解反应有着不同的 影响，最终产物的得到却是上述因素共同作用的结果。 过氧化氢衍生法8 2 , 8 3 8 41 采用n a o c l h 2 0 2 为混台氧化剂，以协同氧化方 式对壳聚糖进行氧化降解可得到不同分子量大小的甲壳低聚糖。反应是在液固 非均相体系、口h 值为偏酸性的条件下进行的。反应的机理可能是在壳聚糖颗 粒的表面主要是由o c i 一发生氧化作用，而在体系中添加适当的过氧化氢可产 生大量的活性氧，它比o c i 一更易渗透进入壳聚糖内部，起到加强o c i 一氧化 的作用。这种内外结合的方法可加快降解速度，而且协同氧化降解反应可得到 很好的控制，使反应的转化率及降解产物的氨基含量得到保证。 基于过氧化氢氧化壳聚糖9 ( 1 ，4 ) 糖甙键位置和空间结构的考虑。 文献研究”1 报道，首先在酸溶液中溶解壳聚糖，再加入适量的金属盐溶 液，通过控制壳聚糖与金属离子摩尔数的比例控制配位点的个数，使配位节点 在壳聚糖高分子链中均匀分布，保证配位节点之间未配位耱甙链中糖数的均一 性。采用过氧化氢对配合物进行氧化降解，壳聚糖中的葡萄糖氨从配位节点或 在优势掏象处断裂石，经过脱金属离子等后续步骤处理后得到窄分子量分布的 第一章文献综述 低聚壳聚糖。使用这种方法在相同的降解条件下，壳聚糖配合物的降解速度踞 显高于壳聚糖，且降解产物分子量分布较壳聚糖直接降解要窄。 1 2 4降解产物分离纯化方法 甲壳低聚糖的分离纯化过程大致如图1 5 所示： 分离纯化 调节p h 值离心( 过滤) l 一 混糖 甲壳低聚耱的反应液一一1 分级纯化 1 l 一不同聚合度的寡糖一 l 干燥( 真空或冷冻) l 图1 5 甲壳低聚糖的分离纯化 如上所述，根据甲壳低聚糖制备方法的不同，目的要求的不同，相应的分 离纯化方法也不相同，但通常都会经过如图1 5 所示的步骤。很多时候需要具 体情况具体对待，例如，酶法降解的产物中有部分乙酰化的寡糖，很难用色谱 法将其分离，先将降解产物全部乙酰化，得到相应聚合度的几丁寡糖，再用阳 离子交换树脂或活性炭柱色谱分离，可达到很好的效果“1 。酸法水解所得 的低聚糖混合物经阳离子交换树脂吸附，用盐酸梯度洗脱可得到不同聚合度的 寡糖8 71 。高压液相色谱( h p l c ) 法也是分离和纯化甲壳低聚糖行之有效 的方法。此外还有纸色谱法8 81 ，薄层分析法8 91 ，超滤膜法9 01 等 等。 1 2 5 分子量的测定及表征方法 1 2 5 1 分子量的测定。 甲壳低聚糖的分子量测定可以采用凝胶渗透色谱法( g p c ) 1 、端基 法“1 、光度法9 21 等方法进行。不同的测定方法得到不同的均分子量。 一般说来，g p c 法可得到重均分子量和数均分子量，端基法和光度法可得到数 均分子量，而且g p c 法还可以知道分子量的分布图。但就一般实验室的条件来 说光度法是最容易满足的实验方法。 1 2 5 2结构鉴别和表征方法 甲壳低聚糖的结构鉴别及表征可采用纸层析、薄层层析、紫外吸收光谱、 核磁共振、元素共振、游离氨基含量等方法。1 1 1 2 6 甲壳低聚糖的应用 1 _ 2 6 1 医药 甲壳低聚糖可以有效的提高机体的免疫能力。1 9 8 6 年，s u z u k i 等9 31 通 过对b a l b c 小白鼠腹腔注射聚合度为4 7 的甲壳低聚糖发现腹膜渗出液的绍 胞( p e c ) 数量明显增加，其中p e c 主要是由多型核白细胞( p m n ) 组成， 并认为p n i n 表面存在n 一乙酰d 葡萄糖胺残基受体，甲壳低聚糖和受体结台 第一章文献综述 后激活p m n 从而激活机体免疫系统，在抗肿瘤、抗感染等方面显示重要作 用。 甲壳低聚糖在抗肿瘤方面也有不俗表现，1 9 8 5 年，s u z u k i 等就甲壳低聚糖 特别是甲壳六糖的抗肿瘤作用作了报道。他们在移植了s 1 8 0 的d d y 鼠上静脉注 射甲壳低聚六糖，结果七天后发现产生了明显的肿瘤细胞抑制作用。1 9 9 0 年， q u c h i t 等”1 研究发现三个壳寡糖通过六亚甲基空间通道与5 一氟尿嘧啶共 轭结合后，其抗肿瘤作用强于5 氟尿嘧啶。在动物实验的过程中发现注射了壳 寡糖衍生物的生物的生存时间延长，而且体内产生了对肿瘤的生长抑制作用。 国内王中和等9 51 用甲壳低聚糖口服液对临床患者进行辅助治疗，结果发 现白细胞、淋巴细胞的总数保持稳定，t 淋巴细胞的数量显著上升，说明低分 子壳多糖能调整机体免疫机能，减少放化疗对患者免疫力的影响，有较好的抗 肿瘤辅助疗效。杜昱光等研究发现，聚合度为扯7 的甲壳低聚糖对 s a r c i m a 1 8 0 、m m - 4 6 、m e t h a 等癌细胞的生长有完全的抑制效果。由于这些多 糖无毒无副作用，不发生变态反应，及对机体非常温和的免疫刺激影响，使它 们在作为降血脂、降胆固醇药物方面具有一定优势”。 1 2 6 2 食品 甲壳低聚糖具有柔和甜味，可作为功能食品加以利用。坂井等研究 了肠道内细菌利用甲壳低聚糖的情况，发现不同菌株对不同甜味的甲壳低聚糖 有不同程度的吸收，因此甲壳低聚糖有望作为乳酸菌的增值促进剂应用于食品 领域。而且还有望改善食品结构、提高食品保水性能。在添加剂方面，把甲壳 低聚糖作为添加剂添加到食品中利用其抗菌活性防腐。夏文水等9 81 研究表 明，甲壳低聚糖对食品中的一些常见细菌、霉菌、酵母菌有抗菌作用，并且抗 菌作用随着甲壳低聚糖浓度的增加而逐渐变强。加于苹果原汁中可以有效的延 长保藏时限。刘艳如等9 91 对壳聚糖进行降解改性，制备了具有一定抑菌能 力的甲壳低聚糖，成功的运用于食用调味海带的傈鲜防腐。以上的研究结果都 表明，一定浓度的甲壳低聚耱的抑菌机理归因于甲壳低聚糖分子具有质子化 铵，质子化铵与细菌带负电荷的细菌膜作用，吸附和聚沉细菌，同时水溶性壳 聚糖可能穿过损伤的细胞壁进入细胞内部，与细菌内的物质进一步作用，扰乱 细菌的合成和代谢，从而显示出抗菌作用。 1 2 6 3 农业 在农业方面，它具有促进