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四川大学硕士学位论文 叶绿素钾盐的电致化学发光研究和钌络合物氧传感器的研究 分析化学专业 研究生：李岚指导教师：周在德 中文摘要 本论文分为两个部分，第一部分研究了叶绿素钾盐的电致化学发光，第二部 分研究了混合配体联吡啶钌的合成及其在荧光氧传感中的应用。 电化学发光或电致化学发光( e l e c t r o c h e m i l u m i n e s c e n c e ，简称e c l ) 分析是将 电化学手段和化学发光方法相结合的一种新技术。它直接利用电化学反应形成 激发态发光体而发光或通过电解产物之间、电解产物与体系中某组分之间进行 化学反应产生光辐射而实现分析物测定的发光分析技术。其电化学参数及其他 影响因素很多，提高方法的选择性与可靠性是该方法广泛被应用的前提条件。 国内外很多研究者近年来在e c l 方面做了大量工作，己报道的e c l 物质 包括鲁米诺，光泽精，吡啶钌等，关于叶绿素e c l 的报道并不多。叶绿素分子 是光合作用吸能、传能和转能的分子基础，因此叶绿素电化学行为的研究对我 们进一步了解上述功能是十分必要的，特别是电子转移机理及其影响因素。 由于叶绿素分子是脂溶的，所以早期关于叶绿素的电化学研究多是在非水 介质中进行的，到后来才有人采用含有微量丙酮或乙醇的水溶液进行叶绿素的 电化学行为研究。而叶绿素的e c l 的报道则很具争议，相同的条件下能否观察 至i j e c l 都有不同的报道，甚至需要苛刻的条件如需要除氧，溶剂需要除杂质等 才能观察到。叶绿素电致化学发光体系的机理也还不是很清楚。 本文报道用丙酮浸泡菠菜叶后，再用乙醚萃取，用氢氧化钾直接皂化提取 液成叶绿素钾盐，钾盐在水溶液中与有机相分离，很容易就得到混合叶绿素a ，b 的钾盐。用循环伏安法对叶绿素钾盐进行电化学扫描，观察到很强的e c l ，并 且很稳定，也不需要对溶剂进行纯化，同时观察到氧气和二氧化碳对叶绿素钾 四川大学硕士学位论文 盐的e c l 起抑制作用，氮气起增强作用。 钌的二亚胺类物质是应用最广泛的一种氧敏感材料，关于气态氧和溶解氧 的检测都有很多文献报道。我们想合成一种新的混合配体的钌的化合物作为氧 传感器的敏感材料。于是，联吡啶n ，n 一二氧化物( 0 2 b p y ) ，4 ，7 - 二苯基1 ，1 0 邻菲咯啉( d p p ) 作为混合配体被合成了，然后再接到两个2 ，2 联吡啶配体的 r u ( b p y h c l 2 上，形成了混合配体i 扮 r u c o p y ) 2 ( 0 2 b p y ) c l z r u c o p y ) 2 ( d p p ) c 1 2 。 r u ( b p y ) 2 ( d p p ) c h 成功的合成了，并掺杂在m t e o s 作先驱体制备的溶胶凝胶 膜中制成了氧传感器。经测定，该氧传感器具有良好的重现性和线性范围，说 明 r u ( b p y ) 2 ( d p p ) c h 作为敏感材料具有很大的应用价值。 关键词：电致化学发光( e c l )叶绿素钾盐传感器混合配体钌溶胶 凝胶 i i 四川人学硕士学位论文 e l e c t r o c h e m i l u m i n e s c e n c es t u d i e so fc h l o r o p h y l l ( a + b ) p o t a s s i u ms a l t i na q u e o u ss o l u t i o na n da l lo p t i c a lo x y g e ns e n s o rb a s e do nt h e q u e n c h i n g o ff l u o r e s c e n c ef r o mar u t h e n i u m ( i i ) c o m p l e x r u ( b p y ) 2 ( d p p ) 2 + l a nl i ( k n a l n c a l c h e m i s t r y ) d i r e c t e db yp r o f e s s o rz a i d ez h o u t w op a r t sa r ei n c l u d e di nt h i st h e s i s i nt h ef i r s t p a r t o ft h i st h e s i s ，t h e e l e c t r o c h e m i l u m i n e s c e n c e ( e e l ) b e h a v i o ro fc h l o r o p h y l lp o t a s s i u ms a l ti na q u e o u s s o l u t i o nw a ss t u d i e du n d e rc o n v e n t i o n a lc y c l i cv o l t a m m e t r y ( c v ) i nt h es e c o n dp a r t o ft h i st h e s i s ，w em a i n l yc o n c e n t r a t e do nt h es t u d yo fa l lo p t i c a lo x y g e ns e n s o r b a s e do nf l u o r e s c e n c eq u e n c h i n go fr u ( b p y ) 2 ( d p p ) ”i m m o b i l i z e do ns o l - g e l d e r i v e d p o r o u ss i l i c ac o a t i n g s e l e c t r o c h e m i h m i n e s c e n c e ( e c l ) i san e wa n a l y t i c a lt e c h n i q u e ，w h i c hi s d e v e l o p e db a s e do nt h ec o m b i n a t i o no fe l e c t r o c h e m i s t r yw i t hc h e m i l u m i n e s c e n c e i t n o t o n l y h a sh i g h s e n s i t i v i t y , b u ta l s o i se a s i e rt oc o n t r o lt h e p r o c e s s o f c h e m i l u m i n e s c e n c eb ya d j u s t i n gt h ep o t e n t i a l s t h e r e f o r e ，i th a sb e e na t t r a c t e db y m o r ea n dm o r ec h e m i s t s s i n c et h eh m i n o l - b a s e de c lp h e n o m e n aw a sf i r s t l yo b s e r v e db yh a r v e yi n 1 9 2 9 ，t h ee c lw a sp a i dm u c ha t t e n t i o nb yt h ea n a l y s t s ，a n dal o t so fa n a l y t e sh a d b e e nd e t e c t e dw i t he c la n a l y t i c a l t e c h n i q u ed u r i n gt h e 1 9 8 0 sa n d1 9 9 0 s t h i s a p p r o a c hh a sm a n yo b v i o u sa d v a n t a g e so v e ro t h e ra n a l y t i c a lm e t h o d s ，a n di th a s b e e na p p l i e ds u c c e s s f u l l yt om a n yf i e l d s ，s u c ha sl i f es c i e n c e ，c l i n i c a lm e d i c i n e ， e n v i r o n m e n t ，i m m u n o a s s a y sa n dd n ap r o b ea n a l y s i se t c n o w a d a y s ，a n a l y s t sa r e w o r k i n go nb i o l o g i c a lc h i pa n de x p l o i t i n ge c l s u b s t a n c ee t c e c lm e a s u r e sr e l a t i v ed y n a m i cl u m i n e s c e n c ea n de l e c t r o c h e m i c a lp a r a m e t e r s 1 1 1 四川大学碗= 学位论文 d u r i n gt h ep r o c e s so f e l e c t r o c h e m i c a lr e a c t i o n t h e r ea r em a n yf a c t o r s ，w h i c hw o u l d a f f e c tt h er e s u l to fm e a s u r e m e n t ，a n dt h ep r e c o n d i t i o n so fa n a l y t i c a la p p l i c a t i o nc a n b eo p t i m i z e dt o i m p r o v et h es e l e c t i v i t ya n dr e l i a b i l i t yo ft h em e t h o d t h o u g h c o m b i n i n gf l o wi n j e c t i o na n a l y s i s ( 眦) w i t he c lr e d o u n d st or e p r o d u c i b i l i t ya n d r e l a t i v ee a s i n e s st ob ea u t o m a t i c a l l yc o n t r o l l e d ，i ti sn o tp r o p i t i o u st ob i o l o g i c a la n d p h a r m i ca p p l i c a t i o n sd u et ot h es a m p l ev o l u m e sa n dr e a g e n tc o n s u m p t i o n t h e r e f o r e , t h es t u d yw a sf o c u s0 1 1s t a t i ce e li nt h ew h o l et h e s i s t h ee l e c t r o c h e m i l u m i n e s c e n c e ( e c l ) b e h a v i o ro fc h l o r o p h y l lp o t a s s i u ms a l ti n a q u e o u ss o l u t i o nw a ss t u d i e du n d e rc o n v e n t i o n a lc y c l i cv o l t a m m e t r y ( c v ) t h e e c l r e s p o n s eo fo za n dc 0 2 _ w a s4 0t i m e sa sw e a ka s t h a to fn 2 ap o s s i b l e m e c h a n i s mf o rt h eb e h a v i o rw a sp r o p o s e da n dt h ed i f f e r e n c eo fe c li n t e n s i t y b e t w e e nn 2 ，0 2a n dc 0 2i se x p l a i n e d i tg i v e sap o t e n t i a l l yf a s ta n di n e x p e n s i v e m e t h o df o rt h ea p p l i c a t i o ni ng a ss e n s o r s i nt h es e c o n dp a r t ，ad i s s o l v e do x y g e ns e n s o rb a s e do nt h eq u e n c h i n go f f l u o r e s c e n c e 的珥ar u t h e n i u m ( u ) c o m p l e xr u ( b p y ) 2 ( d p p ) “i m m o b i l i z e di na s o l - g e ls i l i c af i l mi sr e p o r t e d s o l - g c l d e r i v e d s i l i c af i l m sw e r ef a b r i c a t e db y d i p c o a t i n g o nt o g l a s ss u h s t r a t e s o r g a n i c a l l y m o d i f i e ds o l - g e l p r e c u r s o r s m e t h y l t r i e t h o x y s i l a n e ( m t e o s ) w a su s e di nt h es o l - g e lp r o c e s s t h er e s u l t si n d i c a t e t h a tt h em t e o s b a s e df i l md o p e dw i t hr u c o p y h ( d p p ) “h a sas e n s i t i v er e s p o n s et o d i s s o l v e do x y g e n i ts h o w sag o o dl i n e a rr e s p o n s ei nt h er a n g eo f0t o3 9 9 1p p mo f d i s s o l v e do x y g e n t h es e n s o re x h i b i mg o o dr e p r o d u c i b i l i t y , h i g hp h o t o s t a b i l i t y , n o h y s t e r e s i sa n dl o n gl i f e t i m e k e y w o r d s ：e l e c t r o c h e m i l u m i n e s c e n c e ，c h l o r o p h y l lp o t a s s i u ms a l t ，s e n s o r , f l u o r e s c e n c e ， d i s s o l v e do x y g e n , r u t h e n i u m ( i i ) c o m p l e x ，s o l g e lf i l m 四川大学顾上学位论文 声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下迸行的研究工作及取得的 研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含 其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得四川大学或其他教育机 构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡 献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。 本学位论文成果是本人在四川大学读书期间在导师指导下取得的，论文成 果归四川i 大学所有，特此声明。 学生签名：考钪 导师签名： 四川大学硕士学位论文 一叶绿素钾盐的电致化学发光研究 1 引言 1 1 电致化学发光 1 1 1 电致化学发光的历史进展 早在1 9 世纪人们己经发现电解可以产生发光现象。1 9 2 9 年，h a r v e y 在碱 性介质中电解鲁米诺时，发现在阴极和阳极附近都有发光现象，揭开了电致化 学发光研究的序幕【1 1 。然而，在其最初发展的三十多年间，由于研究手段的缺 陷，电致化学发光的发展速度缓慢，只有f r a y m a n n 2 1 ，b e m a s e l 3 l 和v o j i i ： j 等 人不足十篇有关电致化学发光方面的研究论文报道【5 l 。 到了2 0 世纪6 0 年代，随着电子技术的迅猛发展，使得高灵敏度的光电传 感器得以诞生，为化学发光和电致化学发光的研究提供了有力的工具，使电致 化学发光研究得到了发展的机会。1 9 6 3 年，美国的k u w a n a 等人率先利用脉冲 电压研究了铂电极上鲁米诺电致化学发光的动力学和发光机理1 w 】，使人们对鲁 米诺电致化学发光，乃至电致化学发光反应的机理有了更进一步的认识和了解。 与此同时，人们发现除鲁米诺外，一些稠环芳香烃也可以在合适的条件下电解 产生发光现象，此发现激起了一股研究稠环芳香烃电致化学发光的浪潮1 9 1 。红 莹烯、呋喃、吲哚类以及葸和它的衍生物等的电致化学发光现象先后被揭示 【1 0 ，1 1 】，对这些电致化学发光体系发光机理的研究是6 0 年代电致化学发光研究的 热点之一。b a r d 小组在有机溶剂中研究了葸及其衍生物的电致化学发光反应机 理和磁场对葸电致化学发光体系的影响【l 。”1 。 进入2 0 世纪7 0 年代，随着电子技术水平的提高，集成电路的广泛使用， 极大的推动了电化学仪器的发展，这期间除了在脉冲信号发生器的线路上有所 改进外，己经开始使用多种脉冲信号，如线性扫描、正矩形扫描、双阶跃脉冲 等，这为电致化学发光的研究提供了更为有力的工具，使电化学方法在研究电 子转移等方面更加得心应手【“l 。仪器的发展提高了检测的灵敏度和信噪比，使 仪器能检测到更微弱的光信号，拓宽了电致化学发光的研究领域。此外电极系 统也得以改进，除应用传统的固定电极外，旋转环盘电极也开始被用于电致化 学发光的研究f 1 7 捌l 。电致化学发光反应是一类电位控制的电极氧化还原反应， 婴型盔兰堡主兰垡堡苎 利用旋转环盘电极可使电极上产生的物质迅速扩散并与其他物质发生反应，反 应速率增加，灵敏度提高。另外，这时期除了研究各种芳香化合物的电致化学 发光外【扯捌，还发现了许多新体系，如在h 2 s 0 4 和h c l 0 4 中1 3 0 2 2 + 的电致化学 发光和h 2 s 0 4 中1 妒+ 、d y 3 + 的电致化学发光【2 4 - 2 7 1 。此期闻b a r d 小组也开始了 对吡啶钉的电致化学发光比较深入的研究 2 8 , 2 9 。同时一些新的技术和方法被引 入电致化学发光研究，如应用计算机进行数据处理和机理研究i l 叫；利用磁场对电 化学影响的磁光效应进行了三重态湮灭的研究 3 0 - 3 3 】；利用光谱电化学和电子自 旋共振( e s 鼬研究电极表面的产物【3 4 筇】；激光也被应用于电致化学发光的研究， 有人对其应用前景进行了评论【3 6 1 。这些技术和方法在电致化学发光机理的研究 方面起到了常规电化学方法不可替代的作用。 2 0 世纪8 0 年代，电致化学发光研究的力度不断加强、范围不断扩展，有 关电致化学发光研究的报道逐年增加，电致化学发光开始进入实际分析应用之 中。在这一时期电致化学发光的理论和研究的技术手段也得到了进一步的发展 和深化。电致化学发光分析方法与流动注射分析( f i a ) ，高效液湘色谱( h p l c ) 和 毛细管电泳f c e ) 等技术联用，提高了发光信号的重现性和稳定性，为其实际应 用打下了良好的基础 3 7 , 3 8 1 。毗啶钌电致化学发光用于草酸、有机酸、胺类化合 物、氨基酸、n a d h 及吡啶钉的测定也是这个时期的重大发现之一【3 9 j 。固定于 n a t i o n 修饰电极的毗啶钌的电致化学发光也开始得到研究【4 0 , 4 1 】。日本的佐腾等 人用鲁米诺的重氮盐衍生反应成功的测定了l 苯丙氨酸，获得了很高的灵敏度 4 2 1 。此外，印度的i s m a i l 等人开辟了e c l 的新领域电生物发光 ( e l e c t r o b i o l u m i n e s c c n c e ) 4 3 琊】，使人们可以用电致化学发光手段研究生物体系的 一些问题。8 0 年代末，有人提出了电致化学发光成像法( e c li m a g i n g ) 的新概念， 并用电致化学发光手段直观的研究了非均相电极表面电化学活性物质的浓度分 布情况【删】。此后，还有人应用该方法研究了盘电极上非均匀性电流密度的分 布特性m ，5 0 l ，为用电致化学发光方法研究电化学反应机理提出了新的思路。 2 0 世纪9 0 年代以后，电致化学发光的仪器装置、电极材料和光信号的传 导材科等，都得到进一步的发展，电致化学发光分析的应用范围得到进一步拓 宽。铟锡氧化物电极( f r o ) 的使用及其与光导纤维波导技术的结合使光信号的检 测更为简便【5 1 j 2 1 。微电极及超微电极的使用使其更适合于生物活体分析1 5 3 1 。阵 列电极( b a n da r r a ye l e c t f o d c s ) 技术【5 4 】以及超声技术等在电致化学发光分析研究 2 四川大学硕：b 学位论文 之中的使用【5 5 l ，使电致化学发光分析的特性得到了进一步的提高，为电致化学 发光分析技术的实际应用奠定了基础。扫描电化学显微镜( s e c m ) 及光谱技术的 应用为电致化学发光机理的研究提供了更有力证据【5 ”。电致化学发光的应用 范围延伸到免疫分析、p c r 分析、d n a 单分子检铡、药物分析、生物活性物 质分析及活体分析等领埘5 蹦引。电致化学发光也开始用于发光器件的研制【酬。 在电致化学发光理论研究方面，表面活性剂等在电致化学发光中的增敏作用也 得到了研究，为提高电致化学发光分析方法的灵敏度提供了新思路瞰1 。b a r d 小 组在氧化物覆盖的稀有金属电极表面开始了阴极电致化学发光的研究i ”t 6 7 】。另 外，液液界面的电致化学发光反应也得以研究【鲫。一些难以发生电致化学发光 反应和电致化学发光信号较弱的化合物通过改变化合物的结构提高检测灵敏度 【删。如氨基酸与二乙烯基砜反应后，将一级胺转化为三级胺，可提高检测的灵 敏度。通过酶的作用将酰胺或芳香胺转化为脂肪胺，用于酰胺或芳香胺的测定。 进入新世纪，电致化学发光越来越成为一个比较活跃的研究领域。电致化 学发光除了原有方法和技术更进一步发展外，还拓展了更多研究领域，使其应 用范围更广、性质更完善、对反应机理的认识更深入。如一些具有特殊性质和 结构的发光物质被合成，并对其发光特征进行了研究 7 0 - 7 2 1 。一些半导体纳米晶 体的电致化学发光也开始得以研究【7 。7 6 】。b a r d 小组和r i c h t e r 小组应用吡啶钉 的衍生物灵敏的测定一些非电活性金属离子，进一步拓宽了电致化学发光的应 用范围i 钾铘l 。电致化学发光分析技术被用于微流控分析系统、微阵列光化学传 感器、电致化学发光成像和量子点电致化学发光等领域。 1 1 2 电致化学发光的基本原理 1 1 2 1 电致化学发光的定义 电致化学发光f 又称电致化学发光，f c l ) ，是指通过电化学的方法在电极 表面产生一些特殊的物质，这些物质之间或与体系中其它组分之间通过电子传 递形成激发态，由激发态返回到基态产生发光现象，是电化学与化学发光方法 相结合的产物。 1 1 2 2 电致化学发光的基本过程及类型 电致化学发光反应经历两个过程：电化学反应和化学发光反应。电化学反应 婴型查兰堡主兰丝堡苎 过程提供发生化学发光反应的中间体，而化学发光反应是这些中间体之间或中 间体与体系中其它组分之间发生化学反应产生激发态的物质，激发态的物质返 回基态时伴随的发光现象。最简单的化学发光反应是由两个关键步骤组成：激发 和发射。化学发光反应可以简单的分为两种类型，两种物质a 和b 经化学反应 生成种激发态产物c ，当c 返回到基态时，以光子形式释放能量，产生发光 现象。基本反应式： a + b _ + c + d c _ c + h v 另一种类型是能量转移化学发光，它主要由三个步骤组成。首先，物质e 和f 通过反应形成一种激发态中间体g ，接着g 。迅速将能量转移给另一能量 接受体i ，i 接受能量跃迁到激发态，形成激发态的i ，i + 返回基态产生化学发 光。基本反应式： e + f _ g + h g + i _ i + + j i i4 - h v 1 1 2 3 电致化学发光反应的基本条件 电致化学发光过程中除要求对电极施加一定的电化学信号使电化学反应发 生外，必须提供一定的条件使随后的化学发光反应发生。化学发光反应的必须 条件概括起来有以下几方面： ( 1 ) 化学反应必须释放出足够的能量，使发光体处于激发态。根据经典的光 化学理论【删，化学发光反应的自由能变化与发光波长的关系可用如下公式表示： g h c 懿 其中，h 是普朗克常数，其数值为6 6 2 2 x1 0 3 4 焦耳秒。c 为光速，其数值 为2 9 9 8 1 0 8 米秒。 e x 是激发态分子发射的最大波长。 由该公式可知，对于1 t o o l 反应生成物质而言： - g h c e x = 0 1 1 9 5 ae x 焦耳米 由该式知，4 0 0 姗7 0 0 咖的可见光发射所需要的自由能变g 的数值应 在1 7 1 2 9 9 千焦每摩尔之间。而氧化还原反应所提供的能量介于其中，所以大 4 叫川大学硕士学位论文 多数的化学发光反应为氧化还原反应。 ( 2 ) 反应历程应有利于激发态产物的形成而不至于将能量转化为热能。 ( 3 ) 激发态产物必须能辐射光或将能量传给另一种发光体而使此发光体被 激发。 ( 4 ) 由于化学激活的瞬时性，激活能必须由某一步骤单独提供，否则，前一 步反应所释放的能量将会因分子振动而被消耗掉。 i 1 2 4 电致化学发光分析的定量基础 由于化学发光反应经历两个过程：激发和发射。反应物质在激发过程中生成 激发态的产率中血定义为：生成激发态的分子数与参加反应的分子数之比。发射 过程的产率e m 定义为：发光分子数与生成激发态的分子数之比。而化学发光反 应的效率中c l 定义为，发光分子数与参加反应的分子数之比。即中c l _ 中c e 中e m 化学发光反应的发光强度i c l 与化学发光反应的效率o c l 及反应物浓度c 有下面关系： i c l ( t ) = 心c e 中e md c d t = 中c l d c d t 对于给定发光体的发光体系，o c l 为常数，即发光强度与分析物的浓度成 正比，这就是化学发光分析方法进行定量分析的基础。 1 1 2 5 电致化学发光反应的特点 n ) 时空可控性好 与化学发光反应相比，电致化学发光反应不是反应物之间简单的混合过程， 而是在电化学激发信号作用下，在电极表面附近发生的，所以，反应的速度、 方式、时间等是严格受电化学信号的激发控制的。另外通过改变电化学激发信 号的波形、强度、电极材料、电极的尺寸及位置也可实现对电致化学发光反应 的控制。 f 2 ) 灵敏度高、选择性好 在电致化学发光反应中，发光反应是在电极表面附近的扩散层中进行的， 由于在一定的电化学信号的激发下，使得电极表面扩散层中发光物质的浓度很 高，因此，电致化学发光的灵敏度高于化学发光。此外，也可改变电化学激发 信号及其他电化学参数来提高其灵敏度。发光反应的可控性，有利于对发光信 竖型查兰型主堂垡堡塞 号的检测和捕获，这也是电致化学发光灵敏度高的一个原因。 ( 3 1 仪器简单 与荧光或磷光相比，电致化学发光无需激发光源，也无需额外的装置来消 除激发光源所产生的散射光。与化学发光相比，电致化学发光是在电极表面现 场反应，所以无需混合反应物及输送反应物所需的泵。 ( 4 ) 分析速度快 由于激发态发光体的寿命很短，在1 0 6 1 0 1 2 秒之间【8 1 1 ，所以发光反应是个 瞬间过程。为了电化学反应和随后的化学发光反应速度匹配，要求电化学反应 的速度要快于化学发光反应，这样整个电致化学发光反应的速度受发光反应控 制。 ( 5 ) 分析应用广泛 参加发光反应的反应物在电极表面现场产生，因而，在一般化学发光反应 中不能获得的不稳定试剂，可以通过电化学手段获得。另外就被测组分的形态 而言，有些组分经电化学氧化或还原后，可以被修饰成具有发光活性或发光活性 更高的反应物，进一步拓宽了电致化学发光分析的应用范围。 ( 6 ) 同时获得多种信息，有利于研究快速发光反应和发光反应机理 电致化学发光反应中，在获得发光体系的光学信息的同时，还可以获得其 对应的电化学信息，有利于进行发光反应机理的研究。发光反应试剂是现场、 定时、定量产生的，而且其生成速度可以靠电化学方法控制，以快于发光反应 的速度进行，因而更有利于快速发光反应的研究和应用。 1 1 2 6 基本反应机理 ( 1 ) 湮灭电致化学发光机理 当对电极施加双阶跃正负脉冲电位时，分子a 和b 在电极表面分别被氧化 还原为a + 和b ，这两种物质在电极表面反应生成激发态的a ，a 返回基态发光。 这种反应一般被称作“湮灭”反应，机理如下1 8 2 j ： ， a c - + a + ( o x i d a t i o n ) b + e _ 1 3 。( r e d u c t i o n ) a + + b + 1 a + b ( e l e c t r o nt r a n s f e r ) ( e n e r g ys u f f i c i e n ts y s t e m ) 璺盟奎耋堡兰兰堡堡兰 a ”+ b _ 3 a + b ( e l e c t m nt r a n s f e r ) 3 a + 3 a _ 1 a + a ( t d p l e t - t r i p l e ta n n i h i l a t i o n ) ( e n e r g yd e f i c i e n ts y s t e m ) a 一a + h v( m i s s i o n ) 其中a 和b 可以是同种反应物分子，也可以不同。1 a 表示单重激发态分 子，3 a 表示三重激发态分子。当电生的氧化剂与还原剂的氧化还原反应能够产 生足够的能量以产生激发态分子时，发光反应按照单重激发态途径进行。大多 数芳香烃化合物的电致化学发光是按照这种机理进行的。反之，如果氧化还原 反应产生的能量不足以产生单重激发态分子，就只能按照三重激发态途径进行， 单重激发态分子需要通过三重激发态分子之间继续反应来得到。 佗) 共反应剂电致化学发光反应机理 共反应剂是一些在氧化或还原时可以产生具有强还原性或氧化性中间体的 物质。产生的中间体能和电致化学发光体系的发光体反应生成激发态分子。如 三丙胺( t p r a ) 和草酸离子( c 2 0 4 2 - ) 为毗啶钌电致化学发光体系最常用的共反应 剂【8 3 8 4 l 。它们在水溶液中被电化学氧化时产生具有强还原的中间体c 0 2 。或 t p r a 自由基，这些被氧化产生强还原性中间体的共反应剂被称为氧化还原型 共反应剂。以吡啶钌草酸电致化学发光体系为例说明发光体和共反应剂的电致 化学发光过程1 8 3 】： c 2 0 4 。一e 一【c 2 0 门一c o 4 4 - c 0 2 r u ( b p y ) 3 “一c 一r u ( b p y ) 3 ” c 0 2 。4 - r u ( b p y ) 3 ：“_ r u ( b p y ) ： 2 + 4 - p r o d u c t s r u ( b p y ) 3 2 ”一r u ( b p y ) 3 2 。4 - h v 还有一类是被还原后产生具有强氧化性中间体的共反应剂，被称为还原氧 化型共反应剂。如s 2 0 8 2 为吡啶钌电致化学发光体系常见的还原氧化型共反应 剂，其反应过程如下【8 5 l ： r u ( b p y b + + e _ r u c o p y ) 3 + r u ( b p y b + + s 2 0 s 。一r u ( b p y ) 3 “+ s 2 0 ，。 s 2 0 s + s 0 4 + s 0 4 2 r u c o p y ) 3 “+ s o i 一r u ( b p y ) 3 ”+ s o ， r u ( b p y ) ：t + + r u ( b p y ) 3 3 - 一r u ( b p y ) 3 2 + + r u ( b p y ) 3 2 型业奎兰堡主堂竺丝苎 r u ( b p y ) 3 ”一r u ( b p y ) 3 “4 - h v 与湮灭电致化学发光反应不同，共反应剂电致化学发光反应只需对电极施 加单一方向的电位即可。 ( 3 ) 阴极电致化学发光 水溶液中的阴极电致化学发光最早报道于1 8 9 8 年【黼j 。当时b r a u n 发现电 解水溶液时，在氧化物覆盖的单向导电金属电极上施加较高电压时，可观察到 发光现象。阴极发光反应机理有过一些报道和综述【8 7 一。氧化物覆盖的半导体 金属电极在溶液中进行阴极极化时，可向溶液中注入热电子。由于热电子具有 极强的还原能力，能在半导体表面的特有微环境中与溶液中的氧化组分( 如过硫 酸盐、氧或过氧化氢等) 发生反应，产生具有化学发光反应活性的强氧化性的自 由基，而这些氧化性的自由基可与溶液中的其他物质进行进一步化学发光反应 【8 9 一。当没有共反应剂存在时，也会在电极表面形成f + 中心或阴离子空穴形式 的强氧化性物质，这些强氧化性物质可以氧化些物质产生发光现象。如在过 硫酸盐体系中，过硫酸根离子从电极的导电区得到一个电子，被还原成硫酸根 自由基离子： s 2 0 s 2 + e _ s 0 4 + s o , 2 。 用于此类氧化物覆盖的金属电极般有：a 1 ，t a ，m g ，g a ，i n 等。近年来，铟 锡氧化物( f r o ) 电极的阴极化学发光也受到了人们的重视。j a c h s o n 研究了i t o 电极的伏安及化学发光特性1 9 1 1 ，s a t o 等比较了经r u ( b p y ) j 2 + 十三链烷硫醇【9 2 ，3 l 和r u c b p y ) ，“1 1 溴代十一烷基二茂铁 9 4 1 等化合物修饰的i t o 合金电极的阴极发 光，并测定了草酸根离子。利用i t o 电极表面吸附h 2 0 2 并产生过氧化物自由 基离子，测定鲁米诺标记的蛋白质等免疫分析方面的应用也有报道嗍。也有利 用锡氧化物覆盖的硅电极在阴极脉冲极化时测定一些过渡金属的鳌合物的报道 9 6 1 。 1 1 2 7 电致化学发光实验装置 电化学发光研究所需基本仪器主要包括两部分：电化学信号激发系统和光 信号检测系统。电化学信号激发系统本实验室用西安瑞迈m p i - e 电化学分析仪。 光信号检测大部分采用光电倍增管来完成。电致化学发光反应池是发生反应的 场所，一般根据需要自行设计制作。电致化学发光反应一般采用三电极系统， 8 婴查茎堡主堂竺堡塞 即工作电极、参比电极和对电极。其中工作电极使最基本又最富于变化的电极。 它大概包括一下几种类型： ( 1 ) 常规电极：如铂电极、金电极和玻碳电极等。 ( 2 ) 微电极：它是常规电极微型化的产物，它具有不同于常规电极的一些特殊 的性质。 ( 3 ) 阵列电极及带电极：是一种集成电极，可以根据不同需要设计不同的阵列 结构。 “) 旋转环盘电极：可以加速扩散，从而提高电致化学发光效率。也可用于电 致化学发光机理研究。 ( 5 ) 半导体电极：具有提供热电子的独特能力。 ( 6 ) 修饰电极：不同的修饰材料和方法使电极具有不同的性质、不同的灵敏度 及电致化学发光行为。如聚合物修饰电极、离子交换膜修饰电极、自组装膜修 饰电极，杂化材料复合物膜修饰电极及碳糊电极等。 基本的电致化学发光研究所用仪器的结构示意图如图1 - 1 所示： 厂 i 唾巫“ l l 图1 电致化学发光仪器结构示意图 1 2 常见电致化学发光体系及其反应机理 1 2 1 酰肼类化合物的电致化学发光 酰肼类化合物在化学发光和电致化学发光中得到广泛研究和应用，其代表 化合物为鲁米诺。早在1 9 2 9 年，h a v e r y 成功的观察到鲁米诺在碱性水溶液中 的电致化学发光现象i l j 。鲁米诺电致化学发光体系具有发光量子产率高、激发 电位低、试剂便宜且毒性小及反应在水相进行等优点。该体系是最早被研究的 体系之一，它己经被广泛的应用于过氧化氢分析、金属离子分析、药物分析、 四j i l * 学顾上学位论文 免疫分析及用作生物传感器的检测器。 1 2 2 多环芳香烃类化合物的电致化学发光 多环芳香烃类化合物中，9 ，1 0 二苯基葸( o p a ) 体系的电致化学发光效率相 对比较高，而且9 ，1 0 - - - 苯基葸比较稳定，所以它的电致化学发光收到广泛的关 注，其反应机理是典型的湮灭电致化学发光机理【1 删，l i p ： d p a - c 。- d p a + 。+ s 0 4 2 d p a + c - + d p a d p a + + d p a 1 d p a + d p a 1 d p a * d p a + h v 多环芳烃的电致化学发光大多需要非水介质，并且要求除氧和杂质，因而 在分析中的应用受到限制。多环芳烃主要是由工业废物、有机物的不完全燃烧 产生，是空气、水及土壤的环境污染物，能致癌或便基因发生突变。所以对多 环芳烃化合物进行检测显的非常重要。 近期，关于多环芳烃电致化学发光的文献主要集中在反应机理研究和新物 质测定方面。d c b a d 等人研究y a 苯基萘和十苯基萘的电致化学发光反应【1 0 ”。 结果表明，八苯基萘的电致化学发光反应中发光体不是激发态的八苯基萘，而 是在反应中产生的分解物。十苯基萘则显示出其单体的电致化学发光性质。 o y a m a 等利用双电解停流技术研究了二萘嵌苯阳离子、阴离子自由基与其他芳 烃化合物的电致化学发光反应，并研究了二萘嵌苯与芘在电致化学发光反应中 形成的激发态二聚体和激态复合物的n 络合作用和激发态的分子性质 1 0 2 1 。 1 2 3 过氧化草酸酯电致化学发光体系 过氧化草酸酯类化合物由于具有很高的发光效率，在化学发光分析方面得 到广泛的应用，但由于其水溶性差和在水溶液中稳定性差，而且它的电致化学 发光效率不如化学发光效率高，因此很少用于电致化学发光分析。其发光反应 机理大概如下【1 0 3 】： 过氧化草酸酯+ 过氧化氢一1 ，2 二氧四环二酮 1 ，2 二氧四环二酮+ r c 0 2 + r 1 0 坚型查兰堡主兰垡丝茎 r _ r + h v 其中r 为荧光试剂，这是一个典型的能量转移电致化学发光反应，过氧化 草酸酯通过将氧化还原反应产生的能量转移给荧光物质，使荧光物质处于激发 态，激发态回到基态导致发光。 1 2 4 金属络合物的电致化学发光体系 这类化合物主要为钉、锇和铬的吡啶以及其衍生物的络合物。代表物是毗 啶( j ( r u ( b p y ) 3 2 + ) 。由于吡啶钌具有较好的稳定性、电化学行为可逆，可以重复 激发、在水中又很好的溶解性，且水相中仍保持较高的发光效率以及可以作为 免疫分析、d n a 分析和药物分析等的标记物等特点，毗啶钌体系一直是电致化 学发光领域研究的热点，已经被广泛的应用于免疫、d n a 、蛋白质、药物、金 属离子及其它生物分子分析中。此体系也被用来研制发光器件和生物传感器。 1 3 叶绿素 1 3 1 光合作用的分子基础 植物的叶片是进行光合作用的主要器官，而叶片中叶肉细胞的叶绿体是进 行光合作用的细胞器。实验证明，离体叶绿体在适宜的介质中，在一定的条件 下，能完成光合作用的全部过程。所以说，叶绿体是一个完整的光合作用细胞 器。它化学成分的显著特点是其中含有色素，而这些色素分子正是光合作用吸 能、传能和转能的分子基础。 1 3 2 叶绿素的分类和结构 各种植物叶绿体中所含的色素有数十种之多。可分为3 大类：叶绿素类、 类胡萝h 素类和藻胆素类。在高等植物和多数藻类的叶绿体内参与光合作用的 色素有两类，即叶绿素和类胡萝h 素。 叶绿素类中常见的色素有a ，b ，c ，d 4 种。高等植物仅有叶绿素a 和b 。在高 等植物的叶绿体中，叶绿素的含量可占全部色素的2 3 ，而叶绿素a 又占叶绿索 含量的3 4 。叶绿素是一种双羧酸酯，它的一个羧基为甲醇所酯化，另一个羧 基为叶绿醇所酯化。它们不溶于水，但能溶于滔精、丙酮和石油醚等有机溶剂。 在颜色上，c h la 呈蓝绿色，而c h lb 呈黄绿色，它们的分子式及结构示意图见 璺坐查兰堕圭兰堡堡苎 下【1 叫。 如图2 所示，c l da 和c h lb 的基本结构相同，都具有一个卟啉环的“头部” 和一条叶绿酵链的“尾部”，c h la 分子中的c h 3 为c h o 所代替，即为c h lb 。 头部的卟啉环由4 个吡咯环和4 个甲烯基连接而成，环的中央有个镁原子与 氮原子结合。镁原子偏向于带正电荷， 极性，是亲水的，可以和蛋白质结合。 氮