（果树学专业论文）柿子花发育相关的MADSbox基因的克隆与表达分析.pdf

摘要 植物典型的花器官发育包括形成萼片、花瓣，雄蕊、雌蕊四轮花器官，而柿子的花器官却是 单性花，大多表现为雌花型，其雄蕊退化；仅有少数授粉品种具有雄花( 如禅寺丸) 这与典型 花器官发育的成花机理不尽相同植物花器官发育过程中的大多数基因都属于m a d s - b o x 基因 本试验以雌花型柿子阳丰的花为试材，通过运用r t - p c r 技术及r a c e 法，克隆得到了一个与 其花发育相关的m a d s - b o x 基因。并对其进行了表达分析。为进一步了解柿子花发育的分子机制、 调控柿子的开花结实提供一定的理论依据 其主要结果如下：( 1 ) 克隆得到了柿子花发育相关的m a d s - b o x 基因删：托t d 酣的e d n a 全长，g e n b a n k 登录号为d q 4 1 2 0 5 8 。该基因包含起始密码子( a t g ) ，终止密码子( t g a ) ， 全长1 1 9 3 b p ，含有7 4 7b p 的开放阅读框，编码2 4 9 个氨基酸的蛋白序列。分子量2 9k d ，等 电点7 2 l ，是一个中性蛋白。该蛋白具有完整的植物m a d s - - b o x 蛋白的结构特征，包括保守 的m a d s 区、半保守的k 区、i 区和c 区( 2 ) n c b i 上经蛋白序列相似性分析，结果发 现，该蛋白与a g l 2 亚族m a d s b o x 基因具很高同源性，与矮牵牛的p m a d s l 2 和番茄的 t m 2 9 分别只有7 2 和7 0 “的同源性；系统进化聚类分析表明，该基因属丁植物m i k e 型 a g l 2 亚族m a d s - b o x 基因。( 3 ) r t - p c r 表达分析表明。d t 捌z 垮j 基因在柿子阳丰萼 片、花瓣、子房及禅寺丸的雄蕊中均表达，而在叶片中不表达( 4 ) s o u t h e m 杂交结果 表明，柿子基因组中存在d t 纠d 盯基因，而且d n 尉n 钳基因在柿子基因组中是单挎贝的 本实验克隆得到的柿子花发育相关的m a d s - b o x 基因。包括保守的m a d s 区，半保守的 k 区、i 区和c 区，符合植物m a d s b o x 基因的显著特征，则该基因应属于植物m a d s - b o x 基 因家族成员经同源性比对及系统进化树分析，将该基因预测的蛋白归类于a g l 2 亚族的 m a d s - b o x 基因家族。前人研究发现，不同物种中a g l 2 亚族m a d s - b o x 基因的数目，表达 部位、功能略有不同。如拟南芥中s e p i 2 3 基因、番茄中的t m 5 2 9 基冈等等。柿子中是否也 存在d k m a d s i 基因的同源基因。d k m a d s i 基因是否可以单独，或和它的同源基因一起行使 a g l 2 亚族m a d s - b o x 基因的作用，还有待于对其功能进行进一步研究。 关键词；柿子。花发育，相关基因，克隆与表达分折 a b s t r a c t t h ed e v e l o p m e n to f t y p i c a lp l a n tf l o w e ro 曜犁岱i st h ef o r m a t i o no f s e p a l ，p e t a z ，s t a m e n s ，a n d c a r p e l s h o w e v e r , i ti sc o m m o nt h a tt h ef l o w e ro r g a n so f p e r s i m m o ni sm o n n s e x i i a l t h e y 勰a l m o s t f e m a l ef l o w e r sb c c a o s o f t b ed e g r a d e d 鲥a m s o n l yaf e wp o l l a t i o nf l o w e r sc o n t a i nm a l ef l o w e r s , s u c h 勰z e n j i m a r u , w h i c ht h em o l c u a rm e c l m i s mo f t h ef l o w r a lf o r m a t i o ni sd i f f e r e n tf r o mt h e b i s e x u a lf l o w e r s m o s to f t h ef l o r a ld e v e l o p m e n tg e n e sb e l o n gt ot h em a d s - h o xg e n e s y e n g f e n g p e r s i m m o nf l o w e r sa r cc h o s e n 笛t h em a t e r i a li nr i d sp a 晦af l o w e r i n g - f e i n t e dm a d s - h o xg e n ei s c l o n e ds u c c e s s f u l l yb yw a yo f r t - p c ra n dr a c em e t h o d s t h ee x p r e s s i o na n a l y s i sh a sb e e n c o m p l e t e d i tc 孤b ed o n et ou n d e r s t a n dt h em o l e c u l a rm e c l m i s mo f f l o w e r sd e v e l o p m e n ta n dt o p r o v i d et h ea c a d e m i cp r o o f so f c o n t r o l i n gt h ef l o r e s c e n c ea n db u r l i n e s so f t h ep e r s i m m o n t h er e s u l t sa ma sf o l l o w i n g ：( i ) am a d s - h o xg e n en a m e dd k m a d s iw a sc l o n e df r o m y a n g f e n g p e r s i m m o nf l o w e r s ( g e n b a n ka c c e s s i o nn o d q 4 1 2 0 5 8 ) t h es e q u e n c eo f c o m p l e t e d k m a d s ie d n ag e n ei s11 9 3 b p , w i t ha l lo r f e n c o d i n g2 4 9a m i n oa c i d s , w h i c hm o l e c u l a rw e i g h ti s 2 9 k da n d t h e p l i s 7 2 1 i t i s a n u t e r a l p r o t e i n a n dh a s t h e m a d s - b o x g e n es t r u c t u r a lc h a r a c t e r s , i n c l u d i n gc o n s e r v a t i v em a d sd o m a i n , s e m i - c o n s e r v a t i v ekd o m a i n , i n t e r v e n i n gr e g i o na n dcd o m a i n ( 2 ) t h e n c b is e q u e n c ea n a l y s i sh a s b e e n c a r r i e d o u t a n d t h er e s u l t ss h o wa s f o l l o w s ：t h e d e d u c e d p r o t e i nw a sh i g h l yh o m o l o g yt ot h ea g l 2f a m i l yo f m a d s - h o xp r o t e i n s ；i th a s7 2 a l l d7 0 i d e n t i t i e st ot h ep m a d s l 2 o f p e t u n i aa n dt m 2 9o f l y c o p e r s i c o ne s c u l e n t u m p h y l o g e n e t i ca n a l y s i s a l s o i n d i c a t e d t h a t d k m a d s i b e l o n g s t o t h e a g l 2 f a m i l y ( 3 ) r t - p c r a n a l y s i ss h o w e d t h a t d k m a d s ig e n ew a se x p r e s s e di ns e p a l ，p e t a l ，o v a r yo f y a n g f e n 8 p e r s i m m o na n ds t a t l e no f z e n j i m a r u p e r s i m m o n , e x c e p t f o r l e a v e s ( 4 ) t h er e s u l t s o f s o u t h e r n b l o tr e v e a l e d t h a t d k m a d s i g a n ew a s i nt h eg e n o m eo f d i o s p y r o s 麟a n do n l yo n e s i n g l ec o p yi nt h i sg e n o m e am a d s b o xg e n ea b o u tp e s i m m o nf l o w e rd e v e l o p m e n tw a sc l o n e di nt h i se x p e r i m e n t i t c o n t a i n e dc o n s e r v a t i v em a d sd o m a i n , s e m i - c o n s e r v a t i v ekd o m a i n , i n t e r v e n i n gr e g i o na n dc d o m a i nt h a ta r ei d e n t i t yt om a d s - b o x g e n e s ot h i sg a n es h o u l db e l o n g st om a d s - b o xg e n ef a m i l y o f p l a n t s t h ed e d u c e dp r o t e i nw a sc l a s s f i e dt oa g l 2s u b - f a m i l yo f m a d s - b o xg e n ef a m i l yb y h o m o l o g ya n dp h y l o g e n c t i ca n a l y s i s i tw a s d i f f e r e n tt h a tt h eg e n en u m b e r s , e x p r e s s i o ns i t e s ，a n d f u n c t i o n s i n v a r i e ds p e c i e s f o r e x a m p l e ，s e p i 2 3 i n a r a b i d o p s i s t h a l i a n a a n d t m 5 t m 2 9 i n l y c o p e r s i c o ne s c u l e n t u m ，e t c w h e t h e ro rn o tt h ed k m a d s ig e n eh a v eh o m o l o g i cg e n e sa n de a n a c t i n gt ot h ef u n c t i o no f a g l 2s u b - f a m i l yo f m a d s - b o xg e n eb yi t s e l f o rt o g e t h e rw i t l li 扭 h o m o l o g i cg e n e s ，i tw i l lb ei n v e s t i g a t e di nf u t u r e k e yw o r d s ：d i o s p y r o sk a k i ，f l o w e rd e v e l o p m e n t , r e l a t e dg e n e ，c l o n i n ga n de x p r e s s i o na n a l y s i s n 缩略词 英文缩写英文名称 中文名称 a m p b m e b p b s a e d n a c i c m d e p c d t t e b e d t a r r g m r n a m s o r f p c i p c r p v p r a c e r t 霉c r s d s s s c 1 h | x _ g a l a m p i c i l l i ns o d i u ms a l t m e r c a p t o e t h a n o l b a s ep a i r b o v i ns e r u ma l b u m i n c o m p l g x n c n t a r yd n a c h l o r o f o n n - i s o a m l y a l c o h o l c c t y l t r i m e t h y ll a m m o n i u mb r o m i d e d i e t h y lp y r o c a r b o n a t e d i t h i o t h r e i t o l e t h i d i u mb r o m i d e e t h y l e n ed i a m i n et e t r a a e e t i ca c i d s o p r o p y l - t l - d - t h i o g a l a c t o s i d e m e s s a g er n a m u r a s h i g ea n ds k o o gm e , d i m o p e n i n gr e a d i n gf r a m e p h e n o l - c h l o r o f o r m - i s o a m l y a l c o h o l p o l y m e r e a s ec h a i nr c f l c t l o n p o l y v i a y l p y r r o l i d o n e r a p i da m p l i f i c a t o no f e d n a e n d s r e v e r s et r a a s c r i p t a s ep c r s o d i u md o d e c y l s u l p h a t e s t a n d a r ds a l i n ec i t r a t e t r i s h y d r o x y m c t h y la m i n om e t h a n e 5 - b r o m o - 4 - c h l o r o - 3 - i n d o l y l g a l a c t o s i d e i i i 氨卞青霉素钠盐 b - 巯基乙醇 碱基对 牛血清白蛋白 互补d n a 氯仿，异戊醇= 2 4 i 溴代十六烷基三甲胺 焦碳酸二乙酯 二硫苏糖醇 溴化乙锭 乙二胺四乙酸 异丙基硫代阻m 半乳糖苷 信使r n a m s 培养基 开放阅读框 酚，氯仿异戊醇= 2 5 2 4 i 聚合酶链式反应 聚乙烯吡咯烷酮 快速末端e d n a 扩增 反转录p c r 十二烷基硫酸钠 标准柠檬酸盐溶液 三羟基氨基乙烷 5 溴4 氯- 3 吲哚1 3 1 3 - 半 乳糖 独创性声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究 成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已 经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得中国农业大学或其它教育机构的学位 或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文 中作了明确的说明并表示了谢意 研究生签名： j 、书、 时间； 。f 年，月彩e l 关于论文使用授权的说明 本人完全了解中国农业大学有关保留，使用学位论文的规定，e p ：学校有权保 留送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或扫描 等复制手段保存、汇编学位论文。同意中国农业大学可以用不同方式在不同媒体上 发表、传播学位论文的全部或部分内容。 ( 保密的学位论文在解密后应遵守此协议) 研究生签名： 时间：) 。衫年，月彩日 导师签名：乃o 帆御年f f 月“日 中国农业大学硕仁论文文献综述 i 量量皇曼曼皇目| 曼皇曼曼曼曼曼曼曼曼皇詈曼目量皇曼曼鼍! 曼曼量皇曼曼皇曼曼曼曼! ! 置量量曼曼置邕曼置量曼量! 曼曼! 曼喜曼曼墨皇曼曼曼曼詈墨一 文献综述 1 植物花发育相关基因的研究进展 植物花发育是一个十分复杂的过程典型的花器官具有四轮基本结构，即花萼、花瓣、雄蕊 和心皮这些花器官是由分生组织发育而来的，植物首先要经过一段营养生长时期，由营养分生 组织形成花序分生组织，花分生组织，然后形成花器官原基，从而逐步分化成花器官( c o l a s a n t i 等，1 9 9 6 ：r a y 等，1 9 9 6 ) 在这一过程中，既受内在一系列基因表达的调控又受外界环境因 素的影响 1 1 成花诱导的遗传控制 高等植物的生殖启动是从花的诱导开始的，花诱导是植物内源发育的感受状态和环境因素相 互作用所决定的( 刘华清，2 0 0 3 ) 植物只有经过一定阶段的营养生长，当具有生殖潜能时，在 适宜环境条件下才可以进入生殖生长阶段，进而开花结果 综合目前的研究成果，已经建立了调控开花基因表达的四种途径。一是，光周期诱导途径 通过对拟南芥突变体的研究，克隆出了一些与光周期依赖的基因，如g 扎f d ，f e ，f t l 4 ，刀， h y 4 ，埘y c c a i ，f w a 等( p a r d 等，1 9 9 9 ；s c h a f f e r 等，1 9 9 8 ；w a n g 等，1 9 9 8 ) 光周期途 径的下游基因c o 是开花关键调节基因之一，编码锌指蛋白转录因子，在光周期途径中起促进作 用，是感受外界光与开花之间的桥梁( p u t t e r i l l 等，1 9 9 5 ) 。c o 的表达与花期直接相关，其表达量 在长日下比短日下高( p i n e i r o 等，1 9 9 8 ) 二是，春化作用。f r 、f l c 是春化作用的两个关键基 因用：隗春化应答反应中起中心作用。它可抑制植物开花。f r _ i = 调f l c 的表达，进而抑制开花 ( m i c h a e l sa n d a m a s i n o ，1 9 9 9 ；2 0 0 1 ；s h e l d o n 等，1 9 9 9 ：2 0 0 0 ；j o h l t s o n 等，2 0 0 0 ) 另外两 个与春化作用相关的基因v r n i v r n 2 能够保持凡c 的抑制作用( g e n d a l l 等，2 0 0 1 ) ：三是，自 主促花途径，是指即使在条件不适宜的情况下也能开花。只是花期略晚。该种类型的突变体比野 生型及光周期促进开花的迟花突变体中f l c 的表达量高( m i c h a e l 等，1 9 9 9 ：s h e l d o n 等，1 9 9 9 ) ， 由此推测自主促花途径是由于增加了f l c 的表达引起的该途径与光周期途径相独立，其晚花现 象能被春化作用所补偿( a m a s i n o ，1 9 9 6 ) 。f l d ( h e 等，2 0 0 3 ) 、f c d ( m a c k n i g h t 等，1 9 0 7 ) 等基 因与自主途径有关，并己被克隆；四是，赤霉素诱导途径。赤霉素可以促进开花，在短日照条件 下，g a 通过一个不同于长日照途径的信号途径激活其下游基因( b l a z q u e z 等，2 0 0 0 ) ，但其作 用机制尚不清楚。光周期和春化两个促花途径是环境因子介导发生的，而自主促花途径却是植物 内源基因自发的。四种途径相互作用，共同诱导花的形成。 1 2 分生组织调控基因 植物完成成花诱导后，顶端分生组织分化为花序分生组织，雨后分化为花分生组织。拟南芥 中国农业大学硕十论文文献综述 i 中t f l i 和金鱼草中的c e n 是花序分生组织特性基因，它们在花序分生组织中央表达。有研究表 明e m f l 和e m f 2 基因可阻止植物由营养生长向生殖生长的转变。咖n 和e m f 2 突变体种子发芽 后经短暂的营养生长就会开花而且不能产生正常的莲座叶，只能产生由花芽裹着的茎生叶，花的 发育也不完全。点彻r 基因可能抑制生殖生长而促进营养生长( 吕晋慧等，2 0 0 4 ) 花分生组织特征基因用于控制指导不同花器官形成的基因。目前拟南芥中已克隆的花分生组 织特征基因有脚下，刎叮，c a , a p 2 ，f u l c a l 等基因。过量或异位表达脚叮u 2 妇p 1 会引起 转基因植物提早开花( c o e a 和m c y e r o w i t z ，1 9 9 1 ) 。工n 7 是目前发现的拟南芥中最重要的花分生组 织特征基因，在新形成的花原基中表达很早，说明它对于诱导花的形成是必需的，这也为转基因 植物所证实：l f y 基因在3 5 5 强启动子的驱动下，在转基因拟南芥中所有的侧芽全都转变为花， 主茎的顶端转变为一不正常的顶花。l f y 的过量表达能；i 起花分生组织的提前形成同样，在烟 草、白杨中也有类似发现( 田会玉。2 0 0 3 ) 口v 的突变会导致花部分逆转为花序枝( c o e n 等， 1 9 9 0 ；w e i g d 等，1 9 9 2 ) 。有遗传学研究显示， 尸在决定花的分生组织特性及第1 轮和第2 轮 花器官的正常发育中起作用( h a u e , h n 等，1 9 9 5 ) a p l 突变体的第一轮花萼转变成叶样器官( 有时 在其腋间产生类似的次生花，甚至三级花) ，花瓣畸形，但雄蕊发育正常( m a n d e l 和y a n o f s k y 1 9 9 s ) 。表明花分生组织特征基因的一个作用是作为开花时间调控途径的最终靶基因。花分生组 织特征基因另一个作用是直接决定花器官形成及不同类型器官的正常发育。这些基因发生突变都 会影响花器官的正常形成或多或少地出现花序代替花结构 1 3 花器官调控基因及a b c 模型 花器官的发育由器官特性基因控制，该类基因又称为同源异型基因。花的重要器官出现在本 不该出现的部位。使花的某一器官变成另一器官( 如花瓣变成拟心皮) ，这种现象称为同源异形 化，控制同源异型化的基因称为同源异形基因( 华志明，1 9 9 8 ) 。通过对拟南芥花同源异型突变 体的研究，已经形成一个统一的决定花器官特征的a b c 模型。该模型指出：控制花器官特征的 基因按功能可以划分为a b c 三大类a 组基因控制第1 、2 轮花器官的发育，其功能丧失会使第 l 轮萼片变成心皮，第2 轮花瓣变成雄蕊，从而形成心皮一雄嚣一雄蕊一心皮的花器官结构；b 组基因控制第2 、3 轮花器官发育。其功能丧失会使第2 轮花瓣变成萼片，第3 轮雄蕊变成心皮， 从而形成萼片一萼片一心皮一心皮的花器官结构；c 组基因控制第3 4 轮花器官发育，其功能 丧失会使第3 轮在雄蕊变成花瓣，第4 轮心皮变成萼片，从而形成萼片一花瓣一花瓣一萼片的花 器官结构( b o w m a n 等，1 9 9 1 ；c o e n 等，1 9 9 l ；m e y c r o w i t z 等，1 9 9 1 ) 。同一组基因控制相邻 两轮花器官的发育，花的四轮结构萼片、花瓣、雄蕊、心皮，分别由a 、a b 、b c 、c 组基因决 定。该模型还指出：a 、c 组基因互相拮抗，即a 抑制c 在l 、2 轮花器官中的表达，c 抑制a 在3 、4 轮花器官中的表达；b 组基因的表达同a 、c 组基囡的表达是独立的。拟南芥中，a 类 基因包括，重p 肼明刀，b 类基因包括a 和p i , c 类基因包括a g 基因( k o m a k i 等，1 9 8 8 ；b o w m a n 等，1 9 8 9 。1 9 9 l 。1 9 9 3 ；h i l l 等，1 9 8 9 ；k u n s t 等，1 9 明；圻s h 等，1 9 9 0 ；m a n d e l 等，1 9 9 2 ) 。其 中任何一个基因缺失或改变，都能导致花器官改变。目前在其它植物中也不断克隆出了 a p l ，a p 3 ，z a g 的同源基因，如金鱼草中a p i 同源基因s q 【朋( h u i j s 日等，1 9 9 2 ) ：a p 3 同源基 2 中国农业大学硕十论文 文献综述 因金鱼革中d e f ( s o m m e r 等，1 9 9 0 ) ；a g 同源基因烟草中b a g i ( m a n d e l 等，1 9 9 2 ) ，矮牵 牛中p m a o s 3 ( t s u e h i m o t o 等。1 9 9 3 ) ，金鱼草中p l e ( d a v i e s 等，1 9 9 6 ) 等等这些不同物种中 同源性基因的表达模式及功能不甚相同。如拟南芥中a p 3 在2 、3 轮花器官中表达，且在第l 轮 中也有表达( j a c k 等，1 9 9 2 ：w e i g e l 等，1 9 9 3 ) ，而金鱼草中的d e f 主要在2 、3 轮中表达，第4 轮中也有少量表达( s c h w a r z - s o m m e r 等，1 9 9 2 ) 。玉米中a g 的同源基因有两个即z a g l 与z m m i ， 二者共同作用行使4 g 基因一样的功能( s c h m i d t 等，1 9 9 3 ；m e n a 等，1 9 9 6 ；t h e i l k n 等，1 9 9 5 ) 矮牵牛中a g 同源基因p m a d s 3 的异位表达，并不能造成象在拟南芥中异位表达，t g 那样，使第 l 、2 轮完全同源异形突变说明还可能存在着另外的彳g 的同源基因( t s u c h i m o t o 等，1 9 9 3 ) ， 后来a n g e n e n t 等( 1 9 9 3 ) 又克隆到了第二个g 同源基因f b p 6 虽然不同物种问花发育的基因表达模式及功能基因数目不甚相同，但是a b c 模型作为基本 的遗传机制来解释花器官发育是普遍适用的，随着不同物种中越来越多的花发育基因的发现，植 物的多样性及花结构的复杂性，使得该模型得到不断的验证和补充( 贾红武，1 9 9 9 ) 2 植物m a d s - b o x 基因的研究进展 m a d s - b o x 家族是转录因子的主要分支之一，广泛存在于真核生物中它是由4 种蛋白因子 m c m i ( 酿酒酵母) ，a g a m o u s ( 拟南芥) 、d e f l c l e ：n s 金鱼草) 和s r f ( 人类) 的酋写字 母构成( s c h w a r z 等，1 9 9 0 ) 。它们具有共同的保守序列，编码含有这种保守序列的蛋白因子的 基因，称为m a d s - b o x 基因。它是广泛存在于动植物体中的调节基因家旗，是编码多种具有重要 生物学功能的转录调节因子。 2 1 植物i 呐d s - b o x 基因结构 m a d s - b o x 基因编码的蛋白有3 种不同类型，即m e f 2 型、a r g 8 0 型和m i k c 型，前2 种 仅存在于动物和真菌，而m i k c 型局限于植物( f i s c h e ra n ds l r a t e r ，1 9 9 5 ) 植物中的m a d s - b o x 基因具有相似的内含子和外显子结构，一般包括6 个内含子和7 个外显子( t h e i b e n 等，1 9 9 5 ) 。m i k c 也揭示了m a d s - b o x 基因的序列特征即包括m a d s 。i n t e r v e n i n g ( 1 ) ，k e r a t i n - l i k e ( k ) ，和c - t e r v e n i n g ( c ) 域。m a d s 结构域是存在于所有m a d s - b o x 基因5 端的一高度保守区域，由5 6 5 8 个氮基酸残 基组成，是与d n a 结合的主要决定因素。k 结构域是一中度保守的序列，是转录因子的结构特 征序列，由7 0 氨基酸残基组成，能够作为二聚体基元。形成卷曲螺旋结构，调节蛋白质与蛋白 质之问的相互作用( p o l l o c ka n dt r e i s m a n ，1 9 9 1 ) ，至今在动物和真菌中还未被发现。在m a d s 结 构域和k 区域之间存在一段3 1 3 5 氨基酸的i 区域，含有较多亲水残基的非保守区域，帮助转录 因子蛋白二聚体与d n a 结合形成复合体，在决定哪个二聚体可以结合d n a 方面具有重要作用 ( s c h w a r z 等，1 9 9 2 ) k 结构域下游的非保守的c 端主要由疏水氨基酸组成，约3 0 个氨基酸长 度的富含疏水残基的非保守区域，可能作为m a d s b o x 基因的转录激活区域，与m a d s - b o x 多 聚体高级结构有关( h o n m a 等，2 0 0 d 此外，还具有n 末端。它是位m a d s 区上游富含碱性氨 基酸的亲水结构域( s c h w m - z 等，1 9 9 2 ) 。 3 中国农业大学硕十论文文献综述 2 2 植物m a d s - b o x 基因作用机制 植物体内，m a d s - b o x 基因的调节作用是通过形成同源或异源二聚体，与靶基因的特异位点 相结合，从而实现对发育过程的调节( m a r t i n 等，2 0 0 2 ) m a 等( 1 9 9 1 ) 发现与m a d s - b o x 蛋 白因子结合的d n a 序列不仅可以是一般的结构基因，而且也可以是m a d s - - b o x 家族基因。其 具体过程是位于m a d s 区的反向平行的螺旋形成特定的二聚体结构，与靶基因d n a 的小沟 相互作用结合( c h e n g ，1 9 8 3 ) 尽管每个蛋白因子都具有各自不同的d n a 结合特异性，但大多数 m a d s - b o x 蛋白都结合于具有核心序列c c ( a t ) 6 g o 的相似位点上核心序列c c ( a t ) 6 0 0 亦称 为c a r o ( c c - a - r i c h - g g ) 盒( m e n a ，1 9 9 5 ) 。如a g 蛋白m a d s 区域特异结合的d n a 序列已被 鉴定为57 t t ( a t r g ) c c ( a t r ) 6 g g ( a n c ) a a 3 ( s h i r a i s h i 等。1 9 9 3 ) 核心序列及其两侧的 序列在_ a g m a d s 区域与d n a 结合中都具有非常重要的作用大量的实验证明m a d s 结构域是 m a d s - b o x 蛋白与d n a 结合所必需的( r i e c h m a m 等， 9 9 6 ) 同时，蛋白质的d n a 结合结构域 越相似，所结合的d n a 的序列组成也越一致( d a v i e s ，1 9 9 6 ) 2 3 植物m a d s b o x 基因功能 调控植物花发育的基因大部分都属于m a d s - b o x 基因，这些m a d s - b o x 基因主要在花分生 组织和花器官形成过程中作用a b c 模型中，除a 组魄正尸2 基因外，其余皆为m a d s - b o x 基因， 它们彼此问相互作用共同决定花器官的特异形成( 同1 3 ) a n g e n e n t 等( 1 9 9 5 ) 从矮牵牛中分 离出两个m a d s - b o x 基因f b p 7 和f b p l ，对胚珠的特异形成起作用 m a d s - b o x 基因功能多样。除主要在花发育中起作用外。m a d s b o x 基因还在种子形成 ( b u c h n e r 等，1 9 9 8 ) 、营养器官的发育( k a n g 等。1 9 9 5 ：c a r m o n a 等，1 9 9 8 ) 、果实成熟，等发 育阶段起作用。此外m a d s - b o x 基因的表达也与抗逆境有关( k o u 等，1 9 9 7 ) 。v r e b a l o v 等( 2 0 0 2 ) 发现番茄中的一个c l a d s b o x 基因与果实的成熟密切相关当番茄中的r i p e w l n h i b i t o r ( r i n ) 位点发生突变。西红柿果实不能成熟通过定位克隆发现该位点上存在2 个串联的m a d s - b o x 基 因，其中- - + l e m a d s - r i n 调控果实成熟。拟南芥中f u l 基因发生突变果实不能正常生长、正常 开裂，在过量表达的f u l 转基因植株中，最明显的表型变化是在裂片的边缘和胚座框的外部的细 胞都转化为裂片化的细胞。而在正常的情况下。离层应该在裂片的边缘形成但在这些转基因植 株中，却发现不能形成，使得植株形成没有离层的果实，从而使果实不能开裂( f e r r a n d i z 等。2 0 0 0 ) 。 a g l l 5 ( a g a m o u s - i i k e l 5 ) 在胚胎发生过程中优先表达，并在种子早期发育过程中积累，推测它 可能在胚胎各组织形成的前期起到调控的作用( s h a r y n 等，1 9 9 6 ) 。而z h a n g 和f o r d e ( 1 9 9 8 ) 在 拟南芥中发现了一种根特异表达的m a d s - b o x 基因( a n r i ) 。其表达受外源n 0 3 的诱导。r i c h a r d 等( 1 9 9 9 ) 从矮牵牛中分离到p f g 基因，它几乎能在植株的所有部位( 根、雄蕊和幼苗除外) 或发 育时期表达。同样，在其它植物中也分离到许多不同作用类型的m a d s b o x 基因但大多数植物 的m _ a d s - b o x 转录因子的功能尚未鉴定，也许它们是通过与那些在遗传上已经鉴定的蛋白质之间 相互作用，来增强发育信号，或者来调节靶基因控制的专一性。p i l 鳐鲫等( 1 9 9 5 ) 认为，从 进化的角度来说，m a d s - b o ，c 基因从不同的侧面或层次对植物发育产生不同作用。 4 中同农业大学硕十论文 文献综述 3a g l 2 组m a d s - b o x 基因的研究进展 3 1a g l 2 组g a d s - - b o x 基因的成员 植物m a d s - b o x 基因按其亲缘关系远近分成了不同亚族其中有一类称为a g l 2 亚族的 m a d s - b o x 基因在植物生长发育中起着重要的作用( t h e i pc n 等，1 9 9 6 ) m a 等( 1 9 9 1 ) 利用 花发育的同源异型基因为探针，从拟南芥中分离出了a g l i a g l 6 。随后。a n g e n e n t 等( 1 9 9 2 ) 在矮牵牛中又分离出了花器官发育的基因f b p 2 。p u n e l i 等( 1 9 9 4 ) 在番茄中又分离出了t m 5 ，它 们与拟南芥中a g l 2 基因有很高同源性。t h e i l 3 曲等( 1 9 9 6 ) 在该类基因进行系统分化，将其归 入植物a g l 2 组m a d s - b o x 亚家族随着研究的日益深入，在很多植物中都相继克隆出了a g l 2 亚族基因。棉花中的g h m a d $ - i 基因( 郑尚永，2 0 0 3 ) ，水稻中能j n _ , v j _ d d s - 3 ( 袁自强等，2 0 0 0 ) 、 o s m a d s ( a g r a w a l 等2 0 0 5 ) ，白杨中的p t m 3 4 6 ( c s e k e 等，2 0 0 5 ) ，马铃薯中的n t m a d s 4 ( j a n g 等， 2 0 0 2 ) ，大麦中s l s e p l 廖( m a t s u n a g a 等，2 0 0 4 ) 。菊花中的c d m 4 4 ( s h c h e n n i k o v a 等2 0 0 4 ) 等等。 都是近年来克隆出来的a g l 2 亚族基因，它们之间具有很高的同源性，其具体功能有待进一步研 究 3 2a g l 2 组m a o s - b o x 基因的作用机理 a g l 2 组m a d s b o x 基因可与其它花器官决定基因形成四聚体，从而指导花器官的形成。拟 南芥中，b 功能是由a p 3 p i 二聚体提供的，酵母双杂交的实验结果显示a p 3 p i 二聚体能与s e p 3 、 a p i 相互作用，a g 不能直接与a p 3 p i 作用，但是可以通过s e p 3 与a p 3 p i 作用，而a g 能与 s e p ! 、s e p 2 、s e p 3 ( r p a g l 2 、a g l 4 、a g l 9 ，属拟南芥a g l 2 亚族) 结合成为四聚体。因为m a d s 蛋白是以二聚体的形式与靶基因中的c a r g 元件结合，而四聚体的形成更增加了与c a r g 重复元件 的亲合力，因而认为这些基因编码的蛋白可能是以更为复杂的聚合体即四聚体的形式发挥作用 的，p i - a p 3 - a p i s e p 3 ，p i - a i 3 s e i 3 - a g ，a g - a g s e p 3 - s e p 3 可能是分别在第2 、3 、4 轮中发 挥作用的蛋白复合体。实验中还发现a p l 和s e p 3 的c 区有很强的转录激活活性，而p i 、a p 3 、 a g 没有非常明显的转录激活活性( 田会玉，2 0 0 3 ) 。k o t i l a i n e n 等( 2 0 0 0 ) 发现，大丁草a g l 2 亚族蛋白g r c d i 与c 功能蛋白g a g a i 或g a g a 2 形成异源二聚( g r c d l - g a g a i g a g a 2 ) ， 从而调控大丁草第三轮花器官的发育。金鱼草中也有相应实验证据，证明a g l 2 组m a d s - b o x 基 因可与其它花器官决定基因相结合，以四聚体形式发挥作用。 3 3a g l 2 组m a d s - b o x 基因的功能与a b c d e 模型的提出 1 1 1 c o e n 等( 1 9 9 1 ) 提出花发育的a b c 模型后，大量相关基因被克隆，a b c 模型得到了充分 的验证。直到1 9 9 5 年，a n g e n e n t 等在矮牵牛中分离到朋用和船p l l 基因。原位杂交显示这 两个基因在胚珠原基形成之前。雌蕊中心表达。之后只在胚珠内能检测到杂交信号。以反义技术 抑制这两个基因的表达，可导致胚珠被花柱类组织取代；f b p l l 的转基因的植株在花萼内侧和花 中国农业大学硕十论文 文献综述 瓣外侧形成胚珠状结构。据此，可确认这两个基因都属于决定胚珠中央分生组织的特征基因， c o l o m b o 等( 1 9 9 5 ) 将这类基因列为d 组基因。从此，a b c 模型的延伸为a b c d 模型。2 0 0 0 年， p e l a z 等发现，拟南芥中a g l 2 亚族的a g l 2 a g l 4 ，a g l 9 基因与花器官特异性决定有关。实 验发现，a g l 2 a g l 4 在萼片、花瓣、雄蕊、雌蕊中表达。且表达时间早于g ，五丹p i ：a g l 9 在花瓣，雄蕊、雌蕊中表达。应用突变体技术，三个基因中任何一个或任何两个发生突变。对花 器官特异性均无明显影响；而当三个基因同时突变时，所有花器官都只形成萼片状结构，呈现b 、 c 双突变的表现型。a g l 2 ，a g l 4 a g l 9 在a p 3 、a g 三突变体背景下仍能表达；反过来，a 丹、p f 和爿g 在踞p l 2 3 三突变体中也处于表达状态。说明两类基因中的任一方表达都不需要另 一方的启动。所以，a b c 模型中的同源异型基因对于花器官特性的维持是必需的，但并不是充 分的。事实上，这两类基因间的效应是通过产物间的互作实现的。这3 个基因已被重新命名为 s