（分析化学专业论文）基于纳米金硫堇nafion自组装的新型电流型酶免疫传感器的研究.pdf

基于纳米金硫堇n a t i o n 自组装的新型电 流型酶免疫传感器的研究 分析化学专业硕士研究生卓颖 指导教师袁若、柴雅琴教授 摘要 生物传感器是由生物、医学、物理、化学、电子技术等多种学科相互渗透形成的新的 研究领域。生物传感器在临床医学、环境和食品工业等方面都有重要应用，并以其体积小、 专一度高、灵敏度高、检铡快速方便、成本低和容易实现实时在线活体检测等优点，成为当 前研究的热点之一。生物传感器主要由生物识别系统( 感受器) 和换能器组成，其中将生物分 子，如酶、抗原、抗体等，固定到换能器表面称为生物功能物质的固定化固定化技术是生 物传感器的研究和开发中晟为重要和关键的工作。本文从电子媒介体的选择，媒介体在电极 表面的引入生物分子固定方法的选择以及新型酶免疫模型的构建等方面就固定化技术进行 了探索和研究。主要研究了以下几个部分： 1 介体型酶生物传感器依靠电子媒介体提高了测定的灵敏度和准确性，因而目前已成 为生物传感器家族中的主角，研究工作主要集中在电子传递媒介体的选择和电极表面的修饰 方法等方面。利用吸附力强生物相容性好的纳米金颗粒与易成膜的聚乙烯缩丁醛口v b ) 及葡 萄糖氧化酶混合制成复合同酶膜基质制备了稳定性好寿命长的葡萄糖氧化酶生物传感器 并引入生物染色剂硫堇作为电子媒介体，增强了电子从酶的氧化还原中心到工作电极的表面 传输速率。加速了电极反应，降低了环境干扰，能够初步应用于临床检测。 2 电化学免疫传感器是一种将电化学分析方法与免疫学技术相结合而发展出来的具有 快速、灵敏、选择性高、操作简便等特点的生物传感器。电化学免疫传感器通常通过对抗原 或抗体进行酶标记来检测信号。但酶标操作费时且易导致生物分子失话。基于自组装技术和 静电吸附技术，研制了纳米金硫堇n a t i o n 膜修饰的无试剂电流型甲胎蛋白免疫传感器。该 方法根据抗原与抗体特异性结合形成的免疫复合物使敏感膜有效扩散截面积减小的特性，提 出了利用电子媒介体硫堇作为氧化还原探针间接检测甲胎蛋白( a f p ) 的新方法。与传统的免 疫物质测试方法相比，该方法具有无需对生物分子进行标记，不需竞争反应，测试液中亦不 需加入电活性物质，只需在传巷器表面进行常规免疫反应后将其转移至测量池中测量响应 电流信号即可，具有操作简单、响应快、特异性强等特点 3 酶免疫传感器将酶的化学放大作用与免疫物质的专一性识别相结合兼有电化学分 析的灵敏性和免疫反应的特异性。为进一步提高免疫传感器的灵敏度，免去传统酶标操作的 各种新型酶免疫传感器越来越受到人们的关注基于辣根过氧化物酶o i r p 用纳米金修饰的 新型的电流型免疫传感器用于乙型肝炎表面病毒的研究中提出了使用h r p 代替牛血清白蛋 白( b s a ) 封闭免疫电极上的非特异性吸附位点，并同时利用h r p 的化学放大作用放大响应电 流信号进而提高免疫传感器的灵敏度的新方法。经实验研究证明。该方法操作简单，切实 可行，大大提高了免疫生物传感器的灵敏。 4 利用层层自组装技术研制了基于纳米金，硫堇层层白组装的新型电流型酶癌胚抗原 免疫传感器。文中以带正电荷的硫堇染料与带负电荷的纳米金颗粒通过静电作用和共价键合 作用层层自组装到n a l i o n 膜修饰的电极表面与单层自组装的纳米金腻堇肭n o n 膜相比， 层层自组装膜具有高度有序、膜性能可控、操作简单、稳定性更高等优点，从而使该酶免疫 传感器的灵敏度线性范围和寿命进一步提高。 关键词：电流型免疫传感器酶纳米金硫茧n a t i o n 2 s t u d i e so nn o v e la m p e r o m e t r i c e n z y m e i m m u n o s e n s o r sb a s e do n a s s e m b l y o fg o l d n a n o p a r f i c l e sa n d t h i o n i n eo nn a t i o n m o d i f i e de l e c t r o d e s a n a l 蛳c a lc h e m i s t r ym a s t e rp o s t g r a d u a t e ：y m gz h u o s u p e r v i s o r ：p r o f e s s o rr u oy u a na n dy a q i nc h a i a b s t r a c t b i o s e u s o r s , w h i c hw e r ean e wf i e l db a s e do f fb i o l o g y ，i a t r o i o g y ，p h y s i c s ， c h e m i s t r ya n de l e c t r o n i ct e c h n o l o g y , h a v eb o c o m et h em a i na n a i y i c a im e t h o d si n c l i n i c a la n db i o c h e m i c a la n a l y s e sa n di no t h e ra r e a ss u c ha se n v i r o n m e n t a lc o n t r o l ， f o o dq u a l i t yc o n t r o l ，e t c w i t ht h e i rp o t e n t i a lu t i l i t ya ss p e c i f i c ，s i m p l ea n dd i r e c t d e t c e f i o nt e c h n i q u e sa n dr e d u c t i o n si ns i z e ，c o s ta n dt i m eo fa n a l y s i s ，b i o s e n s o r s c o n t i n u et ob eav e r ya c t i v ea r e ao fr e s e a r c h t h en a l n eb i o s e n s o ri sad e v i c e c o m p o s e do fab i o l o g i c a lr e c o g n i t i o ne l e m e n ta n dat r a n s d u c e r i th a sb e e nr e p o r t e d t h a tt h ec r u c i a l a s p e c ti n t h e f a b r i c a t i o no fab i o s e a s o ri st h ed e p o s i t i o no f b i o r e c o g n i t i o nm o l e c u l e ，s u c ha sa ne n z y m e , a n t i b o d y ( a n t i g e n ) ，s e q u e n c eo fd n a ， e t c ，i nh i g ha m o u n t sw i t l lr e t e n t i o no ft h e i rs p e c i f i ca c t i v i t y f o rt h e s ei e l s o r sa i n c r e a s i n gn u m b e ro fd i f f e r e n ti m m o b i l i z a t i o np r o o c d m , e sh a v eb e e ni n v e s t i g a t e d t h e r e f o r et h es e l e c t i o no ft h ee l e c t r o n i cm e d i a t o r t h em o d i f i c a t i o no ft h em e d i a t o r o n t ot h ee l e c t r o d es u r f a c e ，t h em e t h o d so f t h eb i o r e c o g n i t i o nm o l e c u l ei m m o b i l i z a t i o n a n dt h ec o n s t r u c t i o no fan o v e le n z y m ei m m u n o s e n s o rm o d e lh a db e e nd e v e l o p e di n t l l i st h e s i sa n dd e s c r i b l e da sf o l l o w s ： 1 w i t hac o n t i n u e di n t e r e s ti ne l e c t r o c h e m i c a le n z y m eb i o s e n s o r s ，t h e r ea r c g r e a te f f o r t sh a db e e nm a d et of o c u so nt h es e a r c ho fn e wm e d i a t o r sa n dt h e 3 m o d i f i c a t i o no f t h ee l e c t r o d e 飘缸ei no r d e rt od e v e l o pn e we n z y m eb i o s e n s o r sw i t h h i g hs e m i t i v i t y ，s e l e c t i v i t y , a n ds t a b i l i t y an o v e lg l u c o s es c r s o rh a sb e e nc o n t r i v e d b ym i n ga uc o l l o i d ( n a n o - a u ) m o d l 五e de l e c t r o d ew i t ht h i o n i n e ( t h i ) a sam e d i a t o r g l u c o s eo x i d a s e ( g o d ) h a db e e na d s o r b e dt oc o l l o i d a lg o l ds o l sc o m b i n e dw i t h p o l y v i n y lb u t y r a l ( p v b ) ，w h i c hw e r ei m m o b i l i z e do n t ot h e $ 1 r f s g x ：o fap l a t i n u m e l e c t r o d e t h eg o di m m o b i l i z e do nc o l l o i d a lg o l dw 勰s t a b l ea n dr e t a i n e di t s f u n c d o n a la c t i v t y t h i o n i n ei su t i l i z e da sam e d i a t o rt of a c i l i t a t ee f f i c i e n te l e c t r o n t r a n s f e r sb e t w e e nt h ee l e c t r o d es u r f a c ea n dg l u c o s eo x i d a s e t h ea n t i i n t e r f e r e n c ea n d a p p l i c a t i o no f t h eb i o s e n s o ri nh u m a ns e r t l mw e r ee x c e l l e n t 2 1 1 1 ei m m l l n o s c n s o r sc o m b i n et h es e l e c t i v i t yo ft h ei m m u n o l o g i c a lr e a c t i o n 溺t ht h es e n s i t i v i t ya n dc o n v e n i e n c eo fe l e c t r o c h e m i c a lt e c h n i q u e s , w h i c hh a v e s e v e r a la d v a n t a g e ss u c ha sh i g hs e n s i t i v i t ya n dt h el o wc o s to ft h er e s u l t i n gs e n s o r s a n di n s t r u m e n t a t i o n h o w e v e r , m o s to fa m p e r o m c t r i ci n t m u n o a s s a yt e c h n i q u e sa 尬 r e l i e d0 1 1t h el a b e lo fe i t h e ra n t i g e no ra n t i b o d y ，w h i c hr e q u i r e sh i g h l yq u a l i f i e d p e r s o n n e l ，t e d i o u sa s s a yt i m e ，o rs o p h i s t i c a t e di n s t r u m e n t a t i o n i nt h i se x p e r i m e n t ，w e d e s c r i b e dan e ws t r a t e g yf o rd e v e l o p i n gar e a g e n t l e s sa m p e r o m e t r i ci m n l u n o s e n s o r f o ra f pb a s e do nn a n o - a u t h i n a f i o n - m e m b r a n e - m o d i f i e dg o l de l e c t r o d e t h i s s t r a t e g yh a ss e v e r a l a t t m c f i v ea d v a n t a g e s ，s u c ha sh i g h s t a b i l i t yo fn a n o - a u m o n o l a y e rf o r m e d , e a s i l ya d s o r p t i v e i m m o b i l i z a t i o no fa n t i b o d yo nn a n o - a u m o n o l a y e r 。e f f i c i e n ta c t i v i t yr e t e n t i o no f l o a d i n gi m m u n o r c a c7 t a n t sa n dt h eu s co f t h i ， n a t i o nc o m p o s i t em e m b r a n et ot r a n s f e re l e c t r o n se f f i c i e n t l yw h i c hm a k c si tp o s s i b l e t oc o n s t r u c tan e wr e a g e m l e s sa m p e r o m e l a i ci m m o n o s e n s o r 3 a l t h o u g ht h el a b e l - f r e ci m m u n o s e n s o r sa l ea b l et od e t e c tt h ep h y s i c a lc h a n g e s d u r i n gt h ei m m u n ec o m p l e xf o r m a t i o n , w h e r e a st h ee n z y m e l a b e l e di m m u n o s e n s o r s u s es i g n a l - g e n e r a t i n gl a b e l sw h i c ha l l o wm o f s e n s i t i v ea n dv e r s a t i l ed e t e c t i o nm o d e s w h e ni n c o r p o r a t e di n t ot h ec o m p l e x w h e r e a s ，h o wl a b o r i o u st h ee n z y m el a b e l i n g p r o c e s si ti s ! t h u s ，t h e r ei s a l li n c r e a s i n gd e m a n df o rl a b e l - 舶e ，i n e x p e n s i v e ，r a p i d a n dr e l i a b l ee n z y m ei m m u n o s c r s o l sf a b r i c a t i o nf o ri m m u n ep r o t e i nd e t e r m i n a t i o n a na m p e r o m e t r i ci m m u n o s e n s o rb a s e do ht h en a n o - a ua n dh o r s e r a d i s hp e m x i d a s e ( h r p ) - m o d i f i e dg o l de l e c t r o d ef o rt h ed e t e r m i n a t i o no fh e p a t i t i sbs u 由c ea n t i g e n 4 o m s a g ) h a sb e e nd e v e l o p e d t h en o v e l t yo f t h em e t h o d o l o g yw a s t h ef i r s tu s eo f m e h r p ，i n s t e a do f b o v i n es 疆衄a l b u m i nf b s a ) , t ob l o c kt h ep o s s i b l e 疆蠲西虹d ga c t i v e s i t e so ft h eg o l dn a n o p a r t i d e sm o n o l a y c r , a v o i dt h en o n s p o c i f i c a d s o r p f i o ua n d a m p f yt h er e s p o n s e o ft h ea n t i g e n - a n t i b o d yl 毪l g t i o l la tt h es a m et i m e t e s t s p e r f o r m e dw i t ht h i si m m 删r s h o w e dg o o dl i n e a r i t ya n ds 黜i t i v i t yw h e ni tw a s e v a l u a t e do ns e v e r a lc l i n i c a ls a m p l e s 5 a san o v e lt e c h n i q u ep r o p o s e db yd e c h e ra n dk u n i t a k e ，l a y e r - b y - l a y e r ( l b l ) h a sb e e ni n t r o d u c e dt of a b r i c a t em u l f i l a y e rf i l m s ，a n di tr e p r e s e n t sap r o m i s i n ga n d e n v i r o n m e n t a lp r e p a r a t i o nm e t h o db e c a u s en oc o m p f i c a t e di n s t r u m e n t so rc h e m i c a l n 冶c t i 佃sa 北i n v o l v e d , a n du l t r a t h i nm u l t i c o m p o n e n ta r c h i t e c t u r e 锄b ec o n s t r u c t e d o n l yb y a l t e r n a t ea d s o r p t i o ni nc a t i o n i ca n da n i o n i ce l e c t r o l y t e s t h ep r e s e n t i n v e s t i g a t i o nt r i 。dt oi m p r o v ep r e v i o u sr e p o r t e dw o r ka n dd e v e l o pam o 坞s i m p l ea n d s e n s i t i v es t r a t e g yf o rt h ed e t e r m i n a t i o no fc a r c i n o e m b r y o n i ca n t i g e n ( c e a ) a sa r e s u l t , an o v e la m p e r o m e t r i ce n z y m ei l n n n l n o s e n s o rw i t ha m p l i f i e ds e n s i t i v i t yh a s b e e nd e v e l o p e db a s e do nl a y e r - b y l a y e r ( l b l ) a s s e m b l yo fn a n o - a ua n dt h i0 1 3 n a t i o n f ) m o d i f i e de l e c t r o d es u r f a c eb ye l e c t r o s t a t i ca d s o r p t i o n c o m p a r e dw i t h t h en a n o - a u t h i n fm o n o l a y e rf i l m s ，t h e a u t h i + ) m u l t i l a y e rf i l m sh a ss e v e r a l a t t r a c t i v ea d v a n t a g e s ，s u c ha sh i 曲e l e c t r o a c t i v i t ya n dh i g hs t a b i l i t yw h i c hc o n t r i b u t e t ot h eh i i g hs e n s i t i v i t y ，g o o dl i n e a r i t ya n da n dl o n gl i f et i m eo ft h ep r o p o s e de n z y m e i m i l l l u n o s e i i s o r k e y w o r d s ：a m p e r o m e t r i ci m m u n o s e n s o r ；, e n z y m e ；g o l dn a n o p a r t i c l e s ( n a n o - a u ) ；t h i o n i n e ( t h i ) ；n a f i o n ( n 1 ) 5 独创性声明 y 9 0 167 2 学位论文题目：基王纳苤金煎堇鱼鲤自塑装煎堑型鱼速型睦免疰 佳盛墨鲮盈究 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工 作及取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的 地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不 包含为获得西南大学或其他教育机构的学位或证书而使用过的材 料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作 了明确的说明并表示谢意。 学位论文作者：牟叛 签字日期：彻占年西月彩日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解西南大学有关保留、使用学位论文的 规定，有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘， 允许论文被查阅和借阅。本人授权西南大学研究生院可以将学位论 文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩 印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权书，本论文：口不保密， 口保密期限至年月止) 。 a 一 学位论文作者签名：薛叛导师签名：移。侈吵 签字日期：加埠心月诱日签字日期：少t 形年j - 月2 日 学位论文作者毕业后去向： 工作单位： 通讯地址： 电话：f! 邮编： 1 1 生物传感器的简介 第一章绪论 生物传感器是近3 0 年发展起来的一项新型的分析测量技术，由具有分子识 别能力的生物活性物质( 如：酶、微生物、动植物组织切片、抗原或抗体、d n a 等) 与物理化学换能器相结合而构成，是近年来生物医学和电子学、工程学相互 渗透而发展起来的一种新型信息技术【l 工3 1 。 生物传感器利用生物物质作为识别元件，将被测物的浓度与可测量的物理化 学信号关联起来，因此主要由生物识别系统( 感受器) 和换能器组成。换能器通常 称为基础电极或内敏感器( 如：电流或电位测量电极、热敏电阻、压电晶体、场 效应晶体管、光纤等) ，是一个电化学或光化学检测元件。人们通常将生物识别 系统固定在薄膜上，再将其紧贴在换能器表面，即构成生物传感器【4 5 1 。生物传 感器的作用原理是：待测物质经扩散作用进入具有分子识别功能的感受器，为分 子识别后，发生生物化学反应，产生的信息再由换能器将其转化为与待测物质浓 度( 或活度) 有关的可定量或者可处理的物理化学信号，如电信号、光信号或者声 波信号等，再通过二次仪表放大并且输出信号，从而可实现对待测物质的检测。 由于生物传感器在临床医学、环境和食品工业等方面都有重要用途，以及其具有 体积小、精度高、专一度强、灵敏度高、检测快速方便、成本低和容易实现实时 在线活体检测等优点，已成为当前研究的热点课题之6 7 ，8 】。 1 1 1 生物传感器的发展过程 生物传感器的研究开端于2 0 世纪6 0 年代。1 9 6 2 年c l a r k l 9 1 等人报道了用葡 萄糖氧化酶与氧电极组合检测葡萄糖的结果，可认为是最早提出了生物传感器 r 酶传感器) 的原理。1 9 6 7 年u p d i k e f l 0 】等人实现了酶的固定化技术，研制成功酶 电极，这被认为是世界上第一个生物传感器。此后，酶电极的研究相当活跃。 2 0 世纪7 0 年代中期以后，生物传感器技术的发展更为迅速，其间主要集中 在对生物活性物质的探索、活性物质的固定化技术、生物一电信息的转换以及生 物传感器等研究，并获得了较快的进展。1 9 7 5 年，j a n a t a 1 1 研制出了电化学免疫 生物传感器，同年d i v i e s 1 2 1 发表了第一篇关于用固定化细胞与氧电极配合，组成 对醇类进行检测的电流型微生物传感器的论文。至此生物传感器技术逐渐形成了 自己独立的体系，并确立了它在生物工程和传感技术的地位。随后电位型微生物 传感器出现于1 9 7 7 年u l ；组织传感器出现于1 9 7 8 年4 1 ；线粒体电极则是1 9 8 0 年完成的1 1 5 】。 2 0 世纪8 0 年代后，以抗体为识别元件的免疫传感器开始受到关注。近年来， d n a 、r n a ，甚至人工识别元件都先后应用于生物传感器中。同时，换能器也 不断的被提高。1 9 8 3 年l o w e 和c o l d f i n c h 1 6 臻一次将光学换能器引入了酶传感 器领域；今年来新颖的光学检测转换元件如表面等离子共振( s p r ) 等都广泛应用 到现代的生物传感器中。1 9 8 0 年c a r a s 和j 锄a 0 1 7 1 首先研制成功可测定青霉素的 酶场效应晶体管 f e t 生物传感器，为离子敏场效应晶体管 i s f e t 开创了新的研 究领域。以上成果为生物传感器的微型化，全固态化，集成化和多功能化开辟了 一条新的途径，实现了生物传感器与微电子技术的结合，为生物传感器应用途径， 实现了生物传感器与微电子技术的结合，为生物传感器应用于医学领域的在体测 定奠定了基础。 1 1 2 生物传感器的分类 按生物识别元件的种类 生物识别元件( 即生物敏感膜) 主要是函具有分子识别功能的生物体成分或 生物体本身构成的，是生物传感器的关键部分，也是传感器进行选择性检测的基 础，它直接决定传感器的功能与质量。现已发现生物体内的许多物质如酶、抗体、 激素等都具有优异的分子识别功能，因此它们都可以构成相应的生物传感器。此 外，作为这些生物体物质的集合体，如生物细胞或组织，甚至生物体本身，如某 些微生物，也可作为分子识别部件。因此，若按分子识别元件分类，目前生物传 感器可分为酶传感器、免疫( 抗原或抗体) 传感器、微生物传感器、组织传感器、 细胞传感器等。同时根据生物传感器与底物作用机理的不同，可将生物传感器分 为催化型生物传感器和亲和型生物传感器两类，前者包括酶传感器、微生物传感 器、组织传感器等；后者利用分子问特异的亲和性，如免疫传感器、受体传感器、 d n a 传感器等。 圆圈 m g 1 1t h ec a t e g o r i e so f t h eb i o n s o r sa c c o r d i n gt ob i o l o g i c a lr e c o g n i t i o nm o l e c u l e s 按换能器的种类 换能器( t r a n d u c c r ) 是将感受器( 即具有生物功能活性的生物敏感膜) 上发生的 生化反应中的物理或化学变化转交成可测量信号的器件。因此根据测量信号的不 同，生物传感器主要有电化学生物传感器和光学生物传感器。电化学生物传感器 主要包括电位型、电流型、电导型和电容型生物传感器等。光学生物传感器主要 有荧光型( f h o r c n s c e n c cb i o s e n s o r ) 和化学发光型( c h c m i l u m i n s c c n c eb i o s e n s o r ) 等。 此外，热敏电r e ( t h e r m i s t o r ) 、场效应晶体管、压电晶体o i c z o c l c c t r i cq u a r t zc r y s t a l ) 、 表面声波换能器( s u r f a c 贮a c o u s t i cw a v eu a n s d u c e r ) 和表面等离子共振( s u r f a c e p l a s m o nr e s o n a n c e ) 等也已被用作为生物传感器的换能器。目前，最受人们关注的 还是电化学生物传感器，这是由于电化学换能器具有测定选择性好、灵敏度高、 可在有色甚至浑浊试液中进行测量并且容易微型化等优点，另外，所用的仪器简 单、便宜，而电极体系的连续操作可以在线测定物质的变化。 电化学换能器根据不同的电信号，其结构亦有所差异。其中电位型生物传感 器换能器主要有离子选择性电极i s e s ( i r o n - s e l e c t i v ee l e c t r o d e s ) 和气敏电极( g a s e l e c t r o d e ) 。电流型电化学生物传感器的换能器主要包括惰性金属电极、碳电极等。 惰性金属电极中，铂电极因其对酶反应产物h 2 0 2 有较灵敏的响应值应用较为多 f 4 j 。金电极则多用于自组装( s e m ) 技术瞄1 。碳电极主要包括石墨电极、碳糊电极、 玻碳电极、碳纤维电极和多孔玻碳电极。碳电极的主要优点在于良好的化学惰性 和较宽的电势窗口。 1 2 生物分子的固定方法 为了研制高灵敏度、高选择性、低成本和长寿命的生物传感器，生物敏感膜 的固定方法一直是生物传感器研究的重要课题。固定化方法多种多样，但是不论 采用何种方法制备生物感受器，都必须兼顾生物物质的活性保护与制备稳定性。 以下对生物分子识别物质的固定化方法作简单介绍。 1 , 2 i 包埋固定法 包埋法一般不需要与生物物质的残基进行结合反应，很少改变生物活性物质 的高级结构，因而生物活性损失很少。传统的包埋法主要是将生物分子包埋到凝 胶或膜中，再固定到电极上。所用凝胶主要有聚丙烯酰胺、聚氯乙烯( p v c ) 、聚 乙烯醇( p v a ) 、光敏树脂、聚碳酸酯、尼龙、多肽、醋酸纤维等合成高聚物及海 藻酸、明胶、胶原等溶胶状高聚物。这种方法一般宜于作用于小分子底物和产物 的生物活性物质，而作用于大分子底物和产物的生物活性物质因传质阻力过大而 不宜采用。一般酶易从传感层渗漏，该方法比较适于细胞器类脂质及微生物的包 埋。 十几年前人们开始用一些人工合成的聚合物如n a t i o n e a s t m a na q 等将酶 直接包埋到电极表面【l 刖，这些膜不但能包埋生物分子，还可以抗干扰、抗毒化 且膜比较致密酶分子不易渗漏流失，是比较好的包埋周定化材料。另外，含有氧 化还原中心的水凝胶已成功地固定氧化还原酶( 如葡萄糖氧化酶) 。近些年来。低 温溶j 犯凝胶( s 0 1 g e l ) 生物包埋法则是最受关注的固定化方法之一【哼l 。金属醇盐等 原料经水解得到三维网状结构，能牢固地固定酶等生物大分子，且能最大程度地 保持其活性和特异性。另外，由于其载体为无机多孔材料，具有许多高分子材料 所不可比拟的特性。 1 2 2 共价键合固定法 将电极表面进行化学处理和修饰，然后将生物分子识别物质以共价的方式结 合固定于电极表面。电极表面的共价键合较吸附困难，但提供了较稳定的固定化 生物敏感膜，因此目前被较多地被研究。 4 人们常使用含有双功能基团或多功能基团的试剂，与生物分子和电极基质之 闽发生共价键合从而周定生物分子，该方法也称交联法。参与偶联的生物活性物 质的功能团有制h 2 ，- c o o h , - - s h ，- o h 和咪唑基、酚基等，但这些基团不能是活 性中心及其附近的基团。最常使用的交联剂是戊二醛。它是一种双功能试剂，其 末端有两个醛基基团，它们能和酶或蛋白质的氨基发生反应。形成类似s c h i f f 碱的衍生物。此外，巯基乙胺，半胱胺酸等双功能试剂也常被用作交联剂，一方 面一s h 可以与金电极表面形成共价键合作用，另一方面残余的_ s h 和- c o o h 也 为电极的下一步组装提供了活性基团。 超分子自组装膜、物理吸附和凝胶，聚合物包埋法中常辅以交联法来防止酶 的泄露。该固定化方法的程序简单，且能形成强的生物分子化学键联。因此被广 泛地使用。但是由于难于控制交联反应，重复性仍是戊二醛交联法最主要的问题。 另外，该方法需要大量的酶。形成的蛋白质层呈凝胶状( 缺乏刚性) ，固定的酶具 有相对较低的活性口o 】。 当向电极表面共价键合生物组分时，需考虑许多因素。附着过程通常包括三 个步骤：基底电极表面的功能化，生物分子的耦联及除去键合疏松的生物分子。 例如采用聚苯胺表面修饰的金电极，可以直接将氧化酶共价键合固定到聚苯胺高 分子膜t - j 2 ”。该方法固定的优点在于生物分子无泄露且能与基底稳定地结合， 有利于满足大规模生产和商业化的需要。但是该方法操作复杂，应条件苛刻，会 引起蛋白高级结构变化，破坏部分活性中心，使固定的生物敏感膜的生物活性受 到影响。 1 2 3 电化学聚合法 电化学聚合法是将聚合单体和生物分子( 通常是酶) 同时混合于电解液内，通 过恒电位或电位循环扫描法使单体电氧化或还原聚合在基础电极表面同时由于 吸附或静电作用可以将生物分子及其相关物质包埋于高分子膜内，直接固定于电 极表面。这种方法具有快速、简便、可控、便于实现自动化操作的特点。尤其适 用于生物传感器的微型化构造。目前最常用于固定化的聚合物有：导电的聚毗咯 z 2 1 ，聚苯胺j ，非导电的聚苯酚渊，聚邻苯二胺1 2 5 】等。对于那些本身具有选择 渗透性的非导电聚合物，在构造性能优秀的安培生物传感器方面具有非常好的前 景网 但是用该固定化方法也存在固定的生物分子的量比较小，背景电流较大，且 大量的生物分子被浪费在电聚合的溶液中等问题。另外，基于该法所构造的生物 传感器的稳定性和贮藏寿命有待于进一步的提高。 1 2 4 吸附固定法 吸附周定法是一种较为简单的固定化方法，基于生物分子极性键、氢键、疏 水键以及静电等作用，将生物分子吸附于不溶性载体上。吸附固定法具有无需化 学试剂、活化和清洗步骤少、生物组分不易降解、对生物活性影响小等优点。刘 成霞等明采用角叉胶、溶胶一凝胶和碳粉构成具有强负电性的电极界面，以静电 吸附固定生物组分的方法，研制了转铁蛋白免疫传感器。由于该传感器通过非化 学键力的直接吸附法固定生物分子，其固定过程对免疫组分的活性影响较小，传 感器可获得较好的响应。 由于纳米金颗粒比表面积大、吸附能力强，可以很牢固地吸附免疫蛋白等生 物大分子m , 2 9 1 ，c r u m b l i s s 和h o r i s b e r g e r 等p o j l l 研究发现生物活性物质吸附在纳 米金属颗粒的表面上仍能保持其生物活性。所以，近年来科学工作者们做了许多 探索研究，将纳米粒子引入生物电化学传感器中以改善传感器的响应性能。在众 多的纳米材料中，金溶胶纳米颗粒由于吸附生物大分子后能保留其生物活性及其 优异的电化学性能，因而最广泛应用于生物分子的固定化中瞰】。 吸附具有操作简单，对生物活性影响小等优点，但是由于生物分子与载体相 互作用力弱故存在电极稳定性不佳，易脱落等缺点，同时吸附固定法对溶液的p h 变化、温度、离子强度和电极基底较为敏感，需对实验条件进行优化，但若能找 到适当的载体，这是很好的固定化方法。 1 2 5 层层自组装方法 层层自组装方法是近几年流行起来的利用静电作用固定带有相反电荷化合 物的一种固定化方法。现已应用于多种生物分子( 酶、d n a 、蛋白质、病毒) 的固 定中。以酶的层层组装为例，根据酶分子的等电点选择适当的p h ，使酶分子带 有过多的正电荷或负电荷。然后吸附酶到带有相反电荷的聚电解质上，接着重复 6 交替吸附聚电解质和酶通常是把酶当作聚阴离子靠静电作用和其它的聚阳离子 如聚赖氮酸，聚烯丙胺田垮。在电极表面一层一层地吸附沉积组装酶电极。此 外，还可以利用生物特异性结合的特点来实现层层组装。例如在一个酶分子上修 饰多个抗体( e n 珂m e 啪由u 础da n t i b o d y ) ，预先在电极表面上固定一层抗原，靠 抗原抗体的特异性结合一层一层地沉积组装酶电极 3 4 1 。类似地另一外一种层 层组装的方法，是用生物素( b i 咖) 把酶修饰，先在电极表面上固定一层抗生素 蛋t j ( a v i d i n ) ，靠生物素抗生物素的特异性结合一层一层地沉积组装酶电极。由 于自组装单分子层的有序性、稳定性、绝缘性和可调控性，使通过这种方法所构 建的传感器在生物技术领域中具有潜在的优势。但是，目前这些研究大多还停留 在实验室阶段，原因之一是受制作工艺的限制，通过自组装方法制备的传感器尚 无法迸行大规模工业化生产。 1 3 电化学酶传感器 由于酶分子结合了高度的化学特异性和固有的生物催化信号放大功能，生物 传感器发展至今酶仍然是最备受关注的生物识别元件【3 卯。与电化学方法特有的 优点相联合，使得酶电化学生物传感器一直是生物传感器研究的主流【3 6 3 7 3 8 1 。 1 3 1 酶传感器的检测原理 当酶传感器浸入被测溶液时。固定于电极表面的酶膜专一性的催化待测底 物，从而产生或消耗一种可被电极测定的物质，当反应达到稳态时，电活性物质 的浓度可以通过电位或电流模式进行测定。故酶生物传感器分为电位型和电流型 两类传感器【3 9 1 。电位型传感器是指酶电极与参比电极问输出的电位信号，它与 被测物质之间服从能斯特关系【帅l 。而电流型传感器是以酶促反应所引起的物质 量的变化转变成电流信号输出，输出电流大小直接与底物浓度有关j 。电流型 传感器与电位型传感器相比较具有更简单、直观的效果，且灵敏度也高，是生物 传感器领域中研究最多的一种类型【4 2 】。 最初的生物传感器采用酶的天然电子传递体氧来沟通与电极之间的电 子通道，直接检测酶的反应底物的消耗( 0 2 的减少) 或产物的增加( h 2 0 2 或h + ) ， 但是存在易受环境中氧分压波动的影响响应时问较长且难以进行活体分析，其 灵敏度不高等缺点( 4 3 1 。这是由于通常的氧化还原酶，它们都含有一个或几个氧 化还原中心，但其氧化还原中心一般处于内部，有的酶外部还有一层糖蛋白阻 2 2 l 。这种结构特点阻碍了反应中心与电极表面问的电子转移及还原性辅酶的有效 循环 2 3 1 。电子传递介体( m ) 的引入克服了这一缺陷，它的作用就是把葡萄糖氧化 酶氧化，使之再生后循环使用，而电子传递介体本身被还原，又在电极上被氧化。 因此自7 0 年代起人们开始用小分子的电子传递媒介体来代替氧沟通酶的活性中 心与电极之间的电子通道，通过检测媒介体的电流变化来反映底物浓度的变化， 构造了第